本发明涉及饲料添加剂
技术领域：
，更具体地，涉及一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
：猪炎性肠病近年流行广泛，其病因复杂，防控困难。一般以细菌和病毒引起的传染性疾病为主，包括猪流行性腹泻、痢疾、传染性胃肠炎等，表现形式主要为腹泻，同时还伴有体温升高、食欲不振、脱水等症状，引起猪的生长缓慢，饲料报酬下降，生产性能下降，甚至引起猪的死亡，严重影响了养殖业的经济效益。依赖抗生素的防控策略产生了抗生素残留和细菌耐药性增强等严重生态问题，亟待开发一种不依赖于抗生素的绿色、生态防控策略。现有技术CN105285508A公开了一种提高黄颡鱼抗病性的饲料，其配方中含有茶油和壳聚糖，但其针对的是黄颡鱼的肠炎病，且茶油成分是直接添加到饲料组合物中的，对于茶油成分的适口性并未有相关改善，抗炎成分也还包含大蒜粉。本领域所期待的是提高一种可以改善具有抗炎作用的茶树油成分的生物相容性和适口性，为猪饲料领域研发一种高效的抗炎性肠病饲料添加剂。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有抗炎茶树油生物相容性差，应用于饲料添加剂中适口性差的缺陷和不足，提供一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒。本发明的目的是提供一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒的制备方法。本发明的又一目的在于提供两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒在预防或治疗猪炎性肠病的饲料添加剂中的应用。本发明的又一目的在于提供一种猪饲料添加剂。本发明上述目的通过以下技术方案实现：一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，所述纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，所述两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸的壳聚糖，分子量为10～300kDa。本发明的两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒以壳聚糖和茶树油为原料进行制备得到，两种天然材料之间相互配合，发挥协同增效作用，安全可靠。壳聚糖提取于虾、蟹等海产品加工副产物，具有强大的粘膜修复活性和免疫调节功能，作为一种功能性生物材料本身固有生物相容性和生物可降解性，对生物体组织无毒性，以及具有抗菌，抗肿瘤活性等功能而且具有聚电解质反应官能团，一定的凝胶形成能力，高的吸附容量和生物降解的能力，被列入国家食品添加剂可使用的被膜剂(GB-2760)。茶树油是一种纯天然植物精油，具有强力抗菌活性和抗炎功能，但其难溶于水且具有特殊气味，影响适口性，不宜直接添加饲料。本发明通过对壳聚糖进行接枝改性，制得两亲性壳聚糖，本发明制得的两亲性壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以解决茶树油难溶于水且具有特殊气味影响适口性的问题，本发明制得的两亲性壳聚糖包载茶树油饲料添加剂既可作为固体拌于日粮中，也可溶于水中自由饮用。采用两亲性壳聚糖作为包载材料，对茶树油进行包载形成纳米颗粒，在不破坏茶树油生物活性的前提下，改善了茶树油难溶于水、特殊气味影响适口性的特点。此外，两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒饲料添加剂微粒较小，表面积大，易于动物吸收，同时，两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒饲料添加剂结合了壳聚糖和茶树油抗菌抗炎的特点并形成协同作用能够更好的用于猪炎性肠病的防控。优选地，所述纳米颗粒的粒径大小为120～500nm。优选地，所述纳米颗粒的茶树油载药量为20～55％。20％、50％或55％。其中，本发明的载药量的计算如下：载药量＝[被包埋的茶树油质量/(茶树油总质量+两亲性壳聚糖溶液质量)]×100％随着载药量的升高，粒径随之增大，但仍属于微小颗粒，易于动物吸收，粒径变化范围不影响治疗效果。更优选地，所述纳米颗粒的茶树油载药量为35～55％。优选地，所述纳米颗粒的茶树油包封率为78～96％。例如可以为78％、85％或96％。其中，本发明的包封率的计算方法如下：包封率＝(被包埋的茶树油质量/茶树油总质量)×100％。茶树油包封率和载药量的升高，说明单位质量内茶树油浓度随之升高，相对的茶树油生物利用度也提高，减少茶树油的浪费，提高治疗效率。更优选地，所述纳米颗粒的包封率为85～95％。优选地，所述两亲性壳聚糖的制备方法包括如下步骤：S1.配制1～5％的壳聚糖乙酸溶液和2～5％的脱氧胆酸乙醇溶液；S2.取等量的壳聚糖乙酸溶液和脱氧胆酸乙醇溶液，常温下搅拌催化反应，冷冻干燥得脱氧胆酸壳聚糖粉末；S3.在S2中的脱氧胆酸壳聚糖粉末溶于水中，加入N-乙酰-L-半胱氨酸和缩合剂，避光搅拌3小时，透析，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖，其中N-乙酰-L-半胱氨酸的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的10～25％，缩合剂的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的1～10％。其中，S1中的壳聚糖乙酸溶液和脱氧胆酸乙醇溶液的溶剂均优为1％的乙酸溶液。S2中的缩合剂可以为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和和1-羟基-苯并三唑，反应时间优选为24h。其中本发明的缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-苯并三唑按质量比3:1混合制得。优选地，所述搅拌速度为500～3500rpm。搅拌效果更好，可以促进反应完成且使得产物溶液更加均匀稳定。优选地，所述壳聚糖的粘度为50～200mPa.s。本发明优选选用粘度为50～200mPa.s的壳聚糖作为两亲性壳聚糖的制备原料。壳聚糖的粘度会影响制得的两亲性壳聚糖用于制备复合饲料添加剂时，纳米颗粒的形成和形态，粘度过大或过小都不利于纳米颗粒饲料添加剂的形成。粘度过小(小于50mPa.s)，壳聚糖和制得的两亲性壳聚糖的包载能力和生物相容性较差，不能形成纳米颗粒，粘度过大(大于200mPa.s)，形成的纳米颗粒容易粘在一起，分散性不好。本发明制备方法中，优选壳聚糖的粘度在50～200mPa.s时，最有利于两亲性壳聚糖包载茶树油纳米复合饲料添加剂的制备。本发明的脱氧胆酸的接枝率达到10～30％，N-乙酰-L-半胱氨酸的接枝率达到5～20％。更优选地，所述壳聚糖的粘度为100～200mPa.s。本发明的透析液为为1mM盐酸和含有1％氯化钠水溶液。本发明还保护一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：将两亲性壳聚糖配置成质量浓度为1～5％的两亲性壳聚糖水溶液，充分溶解后搅拌滴加茶树油，继续超声得到两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒胶束，洗涤抽滤，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒。本发明为了使两亲性壳聚糖在水中成分溶解，优选超声溶解，得到充分溶解、均匀分布且具有“核壳”结构的壳聚糖胶束，超声结束后缓慢搅拌滴加茶树油，继续超声使茶树油进入两亲性壳聚糖的疏水内核，得到两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒胶束。优选地，所述两亲性壳聚糖与茶树油的质量比为1:1～5。例如可以为1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，优选为1:2～5，更优选为1:4。其中本发明的超声功率100～250w，超声处理时间15～45min，超声频率为超声时间2～5秒，间歇时间3～6秒。搅拌速度优选为500rpm～3500rpm，搅拌效果更好，可以促进反应完成，以及使反应结束后得到的两亲性壳聚糖-茶树油纳米颗粒溶液更加均匀稳定。两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒在预防或治疗猪炎性肠病的饲料添加剂中的应用也在本发明的保护范围之内。通过制备两亲性壳聚糖，包载茶树油形成纳米颗粒，不仅消除了茶树油特殊气味，还为该病的绿色、生态防控奠定基础，是解决海产品加工副产物高值化利用的有效方法，是推动海洋经济发展的重要途径，具有明显的生态、社会和经济效益。本发明还保护一种猪饲料添加剂，所述饲料添加剂中含有两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒。本发明所述复合饲料添加剂各组分之间相互配合，发挥协同增效作用，安全可靠，对于猪炎性肠病具有很好的预防和/或治疗效果，可有效降低猪腹泻率的发生，可提高猪的生长效率。此外，所用原料价格低廉易得，且无残留、无抵抗药性和无毒副作用。与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本发明的两亲性壳聚糖复合茶树油纳米颗粒粒径较小，表面积大，易于动物吸收。(2)本发明采用两亲性壳聚糖作为包载物，对茶树油进行包载形成纳米颗粒，在不破坏茶树油生物活性的前提下，改善了茶树油的水溶性和适口性。(3)本发明的两亲性壳聚糖复合茶树油纳米颗粒统合了壳聚糖和茶树油抗菌抗炎的特点并形成协同作用能够更好的用于猪炎性肠病的防控，可将断奶仔猪和成年猪的腹泻率降低到10％，可广泛应用于饲料添加剂领域。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。实施例1一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，分子量为200kDa，纳米颗粒的粒径大小为200nm，纳米颗粒的载药量为50％，纳米颗粒的包封率为85％。实施例2一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，分子量为10kDa，纳米颗粒的粒径大小为120nm，纳米颗粒的载药量为20％，纳米颗粒的包封率为78％。实施例3一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，分子量为300kDa，纳米颗粒的粒径大小为500nm，纳米颗粒的载药量为55％，纳米颗粒的包封率为96％。实施例4一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，分子量为200kDa，纳米颗粒的粒径大小为200nm，纳米颗粒的载药量为50％，纳米颗粒的包封率为85％。两亲性壳聚糖的制备方法包括如下步骤：S1.配制3％的壳聚糖乙酸溶液和3％的脱氧胆酸乙醇溶液；S2.去等量的壳聚糖乙酸溶液和脱氧胆酸乙醇溶液，常温下搅拌催化反应，冷冻干燥得脱氧胆酸壳聚糖粉末；S3.在S2中的脱氧胆酸壳聚糖粉末溶于水中，加入N-乙酰-L-半胱氨酸和缩合剂，避光搅拌3小时，透析，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖，其中N-乙酰-L-半胱氨酸的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的15％，缩合剂的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的5％，壳聚糖的粘度为100mPa.s。实施例5一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，分子量为200kDa，纳米颗粒的粒径大小为200nm，纳米颗粒的载药量为50％，纳米颗粒的包封率为85％。两亲性壳聚糖的制备方法包括如下步骤：S1.配制3％的壳聚糖乙酸溶液和3％的脱氧胆酸乙醇溶液；S2.去等量的壳聚糖乙酸溶液和脱氧胆酸乙醇溶液，常温下搅拌催化反应，冷冻干燥得脱氧胆酸壳聚糖粉末；S3.在S2中的脱氧胆酸壳聚糖粉末溶于水中，加入N-乙酰-L-半胱氨酸和缩合剂，避光搅拌3小时，透析，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖，其中N-乙酰-L-半胱氨酸的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的15％，缩合剂的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的5％，壳聚糖的粘度为50mPa.s。实施例6一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，分子量为200kDa，纳米颗粒的粒径大小为200nm，纳米颗粒的载药量为50％，纳米颗粒的包封率为85％。两亲性壳聚糖的制备方法包括如下步骤：S1.配制3％的壳聚糖乙酸溶液和3％的脱氧胆酸乙醇溶液；S2.去等量的壳聚糖乙酸溶液和脱氧胆酸乙醇溶液，常温下搅拌催化反应，冷冻干燥得脱氧胆酸壳聚糖粉末；S3.在S2中的脱氧胆酸壳聚糖粉末溶于水中，加入N-乙酰-L-半胱氨酸和缩合剂，避光搅拌3小时，透析，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖，其中N-乙酰-L-半胱氨酸的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的15％，缩合剂的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的5％，壳聚糖的粘度为200mPa.s。实施例7一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，制备步骤如下：将两亲性壳聚糖配置成质量浓度为3％的两亲性壳聚糖水溶液，超声后搅拌滴加茶树油，继续超声得到两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒胶束，洗涤抽滤，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，两亲性壳聚糖与茶树油的质量比为1:1。两亲性壳聚糖的制备方法包括如下步骤：S1.配制3％的壳聚糖乙酸溶液和3％的脱氧胆酸乙醇溶液；S2.去等量的壳聚糖乙酸溶液和脱氧胆酸乙醇溶液，常温下搅拌催化反应，冷冻干燥得脱氧胆酸壳聚糖粉末；S3.在S2中的脱氧胆酸壳聚糖粉末溶于水中，加入N-乙酰-L-半胱氨酸和缩合剂，避光搅拌3小时，透析，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖，其中N-乙酰-L-半胱氨酸的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的15％，缩合剂的加入量为脱氧胆酸壳聚糖溶液体积的5％，壳聚糖的粘度为200mPa.s。实施例8一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，制备步骤如下：将两亲性壳聚糖配置成质量浓度为3％的两亲性壳聚糖水溶液，超声后搅拌滴加茶树油，继续超声得到两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒胶束，洗涤抽滤，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，两亲性壳聚糖与茶树油的质量比为1:2。两亲性壳聚糖的制备方法同实施例7。实施例9一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，制备步骤如下：将两亲性壳聚糖配置成质量浓度为3％的两亲性壳聚糖水溶液，超声后搅拌滴加茶树油，继续超声得到两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒胶束，洗涤抽滤，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，两亲性壳聚糖与茶树油的质量比为1:3。两亲性壳聚糖的制备方法同实施例7。实施例10一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，制备步骤如下：将两亲性壳聚糖配置成质量浓度为3％的两亲性壳聚糖水溶液，超声后搅拌滴加茶树油，继续超声得到两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒胶束，洗涤抽滤，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，两亲性壳聚糖与茶树油的质量比为1:4。两亲性壳聚糖的制备方法同实施例7。实施例11一种两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，纳米颗粒的壁材为两亲性壳聚糖，芯材为茶树油，两亲性壳聚糖为接枝脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸接枝的壳聚糖，制备步骤如下：将两亲性壳聚糖配置成质量浓度为3％的两亲性壳聚糖水溶液，超声后搅拌滴加茶树油，继续超声得到两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒胶束，洗涤抽滤，冷冻干燥即得两亲性壳聚糖包载茶树油纳米颗粒，两亲性壳聚糖与茶树油的质量比为1:5。两亲性壳聚糖的制备方法同实施例7。结果检测1、在断奶仔猪中的应用(1)试验方法：选取断奶仔猪90头，分为9组，一组为空白对照组，一组为对照组，其余组为试验组。空白对照组与对照组饲喂普通饲料，试验组饲喂的饲料中分别添加了两亲性壳聚糖、茶树油和不同浓度比制得的两亲性壳聚糖-茶树油纳米颗粒饲料添加剂。饲养方式为自由饮水，自由采食，24h后给对照组和试验组接种大肠杆菌，空白组不接种，记录120h患病情况。(2)试验结果：试验分组、饲喂的饲料种类，以及试验结果如表1所示。其中对比例1中仅添加两亲性壳聚糖，不添加茶树油；对比例2为仅添加茶树油，不添加两亲性壳聚糖；试验组中添加不同浓度比制得的两亲性壳聚糖-茶树油复合纳米颗粒饲料添加剂。表1从上述结果中可知，在预防仔猪腹泻的作用上，本发明所述复合饲料添加剂具有明显的作用，添加了复合饲料添加剂的仔猪腹泻率与对照组相比，腹泻率降低了至少50％；而对比单独添加两亲性壳聚糖或者茶树油，添加复合饲料添加剂对预防仔猪腹泻效果更加明显，当两亲性壳聚糖和茶树油质量比在1:4时制得的纳米颗粒饲料添加剂对仔猪腹泻的预防作用最显著。以上结果可说明，本发明所述复合饲料添加剂中各组分之间具有协同增效的作用，比单独添加两亲性壳聚糖或者茶树油的效果要好，而且使用由两亲性壳聚糖和茶树油质量比在1:4时制得的纳米颗粒饲料添加剂的效果最好，对仔猪的腹泻的防治作用最明显。2、在成年猪中的应用(1)除测试对象为成年猪外，其他的测试方法同断奶仔猪试验例。(2)试验结果：组别饲料饲料添加剂腹泻率(％)空白对照组普通饲料-无变化普通对照普通饲料-80对比例1普通饲料两亲性壳聚糖40对比例2普通饲料茶树油30试验1普通饲料实施例1添加剂20试验2普通饲料实施例2添加剂15试验3普通饲料实施例3添加剂20试验4普通饲料实施例4添加剂15试验5普通饲料实施例5添加剂15试验6普通饲料实施例6添加剂20试验7普通饲料实施例7添加剂20试验8普通饲料实施例8添加剂20试验9普通饲料实施例9添加剂20试验10普通饲料实施例10添加剂10试验11普通饲料实施例11添加剂20从上述结果中可知，在预防成年猪腹泻的作用上，本发明所述复合饲料添加剂具有明显的作用，添加了复合饲料添加剂的仔猪腹泻率与对照组相比，腹泻率降低了至少50％；而对比单独添加两亲性壳聚糖或者茶树油，添加复合饲料添加剂对预防成年猪腹泻效果更加明显，当两亲性壳聚糖和茶树油质量比在1:4时制得的纳米颗粒饲料添加剂对成年猪腹泻的预防作用最显著。以上结果可说明，本发明所述复合饲料添加剂中各组分之间具有协同增效的作用，比单独添加两亲性壳聚糖或者茶树油的效果要好，而且使用由两亲性壳聚糖和茶树油质量比在1:4时制得的纳米颗粒饲料添加剂的效果最好，对成年猪腹泻的防治作用最明显。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页1 2 3