一种风味脱毒玉米浆的制备方法与流程

本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种风味脱毒玉米浆的制备方法。

背景技术：

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称don)又称为呕吐毒素，是由某些镰刀菌产生的一种有毒次级代谢物，常常在谷物生长、收割、仓储、加工、运输、销售等环节发生霉变而产生，该毒素可导致畜禽食欲废绝、发育受阻、代谢紊乱、免疫失调、母畜不孕、孕畜流产、胎儿异常等繁殖性能障碍，对畜牧业造成严重破坏。

玉米赤霉烯酮(zearalenone，简称zen)又称f-2毒素，是由多数镰刀菌如禾谷镰刀菌、大豆镰刀菌、粉红镰刀菌等产生的非类固醇雌激素的次级代谢产物，zen对家畜特别是对雌猪体现出强雌激素效应，极易引起严重的生殖障碍；其对人体内分泌系统也具有干扰作用，fizzell等研究表明，当玉米赤霉烯酮浓度为100μmol/l时，雌二醇、睾酮、皮质激素的水平显著下降，zen和其代谢产物通过影响受体信号，改变激素的产生，是潜在的内分泌干扰物。此外玉米浆中由于含有大量的亚硫酸，会产生刺激性气味，影响了其适口性，降低了其在日粮中的添加量。

现有工艺所制备的玉米浆中普遍存在有don和zen两种毒素，但是现有技术中尚不具备有效去除玉米浆中该两种毒素的方法，对人和动物带来健康危害。

技术实现要素：

为此，本发明实施例提供一种风味脱毒玉米浆的制备方法，以解决现有技术中无法对玉米浆中存在的don和zen毒素进行有效脱毒的问题，并协同乳酸菌和酵母菌实现改善玉米浆风味的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种风味脱毒玉米浆的制备方法，在玉米浆中加入don降解菌或降解酶，生物法降解don毒素；

在玉米浆中加入zen降解菌或降解酶，生物法降解zen毒素；

在玉米浆中加入乳酸菌和酵母菌发酵，提高玉米浆中氨基酸和乳酸含量，改善玉米浆的风味，得到所述风味脱毒玉米浆。

优选的，所述don降解菌为枯草芽孢杆菌，其拉丁文名称为bacillussubtilis，该枯草芽孢杆菌于2018年08月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.16254，保藏地址为：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

所述zen降解菌为黑曲霉菌，其拉丁文名称为aspergillusniger，该菌种于2017年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14639，保藏地址为：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

优选的，所述乳酸菌为植物乳杆菌，其拉丁文名称为lactobacillusplantarum，该菌株于2018年08月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16256，保藏地址为：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

所述酵母菌为酿酒酵母，其拉丁文名称为saccharomycescerevisiae，该菌株于2018年09月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16469，保藏地址为：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

优选的，所述在玉米浆中加zen降解菌或zen降解酶，加入don降解菌或don酶降解的步骤具体包括：

将zen降解菌和don降解菌、zen降解菌和don降解酶、zen降解酶和don降解菌、zen降解酶和don降解酶、zen降解菌和don降解酶中的任意一种加入到所述玉米浆中，zen降解和don降解可分步进行或同步进行。

优选的，所述风味脱毒玉米浆中zen含量低于100μg/kg，don含量低于500μg/kg，益生菌含量≥10⁹cfu/ml，乳酸、谷氨酸和甘氨酸含量增加。

优选的，所述zen和don降解酶为固态酶制剂或液态酶制剂；

所述zen和don降解菌为固态菌制剂或液态活化种子液。

优选的，所述zen和don降解菌的活化方法是将所述zen和don降解菌分别接种于盛放有活化培养基的发酵罐中活化2～3h制得；

其中，所述发酵罐的转速为100-500r/min，温度为35～37℃，通风比为0.5vvm，溶氧量大于20％。

优选的，所述降解酶通过降解菌发酵制备或在宿主细胞中导入具有zen降解酶编码基因的重组表达载体后，再通过宿主细胞表达得到所述zen和don降解酶。

本发明实施例还提供一种风味饲料产品的制备方法，将通过上述所述的方法制备得到风味脱毒玉米浆喷到饲料产品上。

优选的，所述饲料产品包括玉米皮、小麦麸皮或玉米胚芽粕。

本发明实施例具有如下优点：

脱毒玉米浆利用zen降解菌和zen降解酶，don降解菌和don降解酶对玉米浆中存在的zen和don真菌毒素进行酶解处理，同时通过在玉米浆中加入乳酸菌和酵母菌发酵，即可获得具有风味的don和zen脱毒玉米浆，且对玉米浆的脱毒的效果好；同时，由乳酸菌和酵母菌在发酵的过程中，氨基酸含量显著增加，同时产生一定量的乳酸，从而使得玉米浆更加适口，不仅提高了玉米浆的营养价值，而且提高了玉米浆的风味，经过zen降解菌和/或zen降解酶，don降解菌和/或don降解酶处理过的玉米浆对玉米皮喷浆处理后，可进一步制备得到喷浆玉米皮，喷浆玉米皮对风味饲料制备具有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供的don降解菌的td-2菌落特征照片图；

图2为本发明实施例提供的don降解菌td-2的进化树分析图；

图3为本发明实施例提供的降解zen黑曲霉菌株fs-7菌落特征照片图；

图4为本发明实施例提供的降解zen黑曲霉菌株fs-7进化树分析图；

图5为本发明实施例提供的酵母菌菌株tm-3的菌落照片图；

图6为本发明实施例提供的酵母菌菌株tm-3进化树分析图；

图7为本发明实施例提供的乳酸菌菌株rs-5菌落的照片图；

图8为本发明实施例提供的乳酸菌菌株rs-5菌进化树分析图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外指明，本发明实施例中，所有百分比、份数和比率均以本发明的组合物的总重量计。有关所列成分的所有重量均基于活性物质的含量，因此除非另有说明，它们不包括在市售材料中的溶剂或副产物。

本发明实施例中，玉米浆是用二氧化硫溶液逆流浸泡玉米颗粒，最后泵出浸泡水含干物质6-7％的溶液，然后采用三效真空蒸发，将溶液浓缩到含一定干物质量的浓液，称为玉米浆。

本发明实施例中，所谓的“干物质”是指将玉米浆烘干后剩下的物质为干物质。

本发明实施例中，喷浆是将玉米浆和玉米皮混合后，管束干燥后，粉碎，制成喷浆玉米皮。

本发明实施例中，zen降解酶可以为本发明实施例中制备的zen降解酶，也可以是zen降解酶，zen降解酶的存在形式可以是液态、也可以是固体粉末。

本发明实施例中，枯草芽孢杆菌是指具有降解don毒素能力的菌株，具体的，该枯草芽孢杆菌可分泌一种有效降解呕吐毒素的胞外蛋白，对don毒素具有较高的降解率。

本发明实施例中，所用到的设备包括种子活化发酵罐1个，规格20l；发酵罐1个，规格1t；蒸发器1个，规格1t；管束干燥机1个；粉碎机1个发酵袋若干，规格50kg；饲料混合机1个。

实施例1、筛选降解don的枯草芽孢杆菌

1材料与试剂：筛选枯草芽孢杆菌的样品来源于污水处理池、污泥、谷朊粉生产车间、空地土壤、肥料生产车间、河边污泥、玉米加工车间、污水处理厂污水以及赖氨酸生产车间。

1.1试剂与培养基：色谱级甲醇、乙腈：thermal公司；don标准品：sigma公司。无机盐培养基(msm)：(nh4)2so40.5g，mgso4·7h2o0.2g，cacl20.05g，na2hpo42.44g，kh2po41.52g，加水至1l，调ph至6.8，121℃灭菌20min，固体培养基加1.5％的琼脂。lb培养基：10g蛋白胨，10gnacl，5g酵母提取物，加水溶解至1l，121℃灭菌20min。

1.2主要仪器与设备：高效液相色谱(e2695)、紫外检测器(2998)：美国waters公司；pcr仪：美国bio-rad公司；凝胶成像仪：美国bio-rad公司；

2.实验方法：don含量测定方法参照国标法gb5009.111-2016，高效液相色谱条件如下，色谱柱：c18(259mm×4.6mm，5μm，xbridge)；流动相：水/甲醇＝80/20(v/v)；流速0.8ml/min；柱温35℃；进样量50μl；紫外检测器：检测波长＝218nm。

2.2降解菌的分离和纯化：富集和初筛，取5g样品于50mlmsm培养基中，don浓度为20mg/l，30℃，220r/min培养10d，以10％的接种量转接3次，高效液相色谱检测don残留，选择具有don降解效果的样品进行下一步实验。将初筛获得的具有降解效果的样品经过适当稀释涂布于msm平板上，挑取不同形态的单菌落接到含有10μgdon的ep管中，在30℃，220r/min条件下培养6d，检测don残留，挑取具有降解效果的菌株进行下一步实验。

2.3降解菌的鉴定：将获得的菌株在msm平板上划线，30℃培养24-48h，观察菌落形态、大小、边缘、表面隆起形状、透明度等。对菌株进行革兰氏染色。

2.4分子鉴定：对获得的降解菌进行16srdna或18srdna鉴定，以菌液或单菌落作为模板，反应体系：模板1μl，taqmix12.5μl，16s上下游引物各1μl，ddh2o10.5μl。反应程序：98℃预变性10min，94℃变性50s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。pcr产物经核酸电泳检测后送到invitrogen公司测序，将测序得到的序列在ncbi上进行比对。其中，细菌通用引物seqidno：1，16sf(5’-attgaacgctggcggcaggcct-3’)；seqidno：2，16sr(5’-taacaaggtaaccgtagggga-3’)。真菌通用引物：seqidno：3，18sf(5’-gtagtcatatgcttgtctc-3’)；seqidno：4，18sr(5’-attccccgttacccgttg-3’)。

3降解菌的分离和纯化，根据上述方法对9个工厂样品进行筛选，得到1株对don有降解效果的菌株，该菌株命名为td-2。

3.1取该菌株发酵液上清液和发酵液破碎上清液500μl加入到含有10μgdon的ep管中，在37℃，220r/min条件下反应12h，以灭活的菌株发酵液破碎上清液作为对照，高效液相色谱测定don残留量并计算降解率，结果见表1所示，don降解菌活性物质降解率。

表1

3.2td-2don菌株的形态鉴定，如图1所示，菌株td-2特征为：菌落扁平，扩散状，边缘不规则，表面粗糙不透明，呈淡黄色，革兰氏染色成阳性。

3.3降解菌株的分子鉴定：以菌液作为模板，用16s通用引物进行基因扩增，将pcr产物进行测序，测序结果在genebank数据库中进行比对，结果表明，菌株td-2和bacillusamyloliquefaciensstrainmd1-51同源性高达99％。利用mega-5.0软件通过n-j法对td-2菌株构建系统进化树，结果如图2所示。根据菌株16srdna的相似性、系统发育树和菌落形态，初步鉴定td-2菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisstrain)。最终将获得的能够降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的菌株，加入甘油，在-70℃冰箱保存。该枯草芽孢杆菌的拉丁文名称为bacillussubtilis，该菌种于2018年08月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.16254，保藏地址为中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

3.4将枯草芽孢杆菌发酵培养2-3h后，向发酵菌液中投放30％陶土填料，得到枯草芽孢杆菌发酵液混合物，然后，将枯草芽孢杆菌发酵液混合物进行喷雾干燥，得到降解don的枯草芽孢杆菌菌剂。

实施例2、降解zen黑曲霉的筛选与鉴定

1材料与试剂，筛选降解zen黑曲霉的样品来源于污水处理池、污泥、谷朊粉生产车间、空地土壤、肥料生产车间、河边污泥、玉米加工车间、污水处理厂污水、赖氨酸生产车间、污水处理厂好氧池污水、肥料厂肥料、景观河污泥、谷氨酸生产车间、空地土壤。

1.1试剂与培养基：色谱级甲醇、乙腈：thermal公司；zen标准品：sigma公司。无机盐培养基(msm)：(nh4)2so40.5g，mgso4·7h2o0.2g，cacl20.05g，na2hpo4，2.44g，kh2po4，1.52g，加水至1l，调ph至6.8，121℃灭菌20min，固体培养基加1.5％的琼脂。

pda培养基：葡萄糖20g加水定容到200ml，121℃灭菌20min。200g马铃薯切丁后加水煮烂，用八层纱布过滤后，加水至800ml，115℃灭菌20min后加入灭菌的葡萄糖溶液。

1.2主要仪器与设备：高效液相色谱(e2695)、荧光检测器(2475)：美国waters公司；pcr仪：美国bio-rad公司；凝胶成像仪：美国bio-rad公司；agilent1200-6510q-toflc/ms液相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司；粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；气控操作架：北京华安麦科生物技术有限公司。

1.3实验方法：zen测定方法，zen含量测定方法参照国标法gb5009.209-2016，高效液相色谱条件如下，色谱柱：c18(259mm×4.6mm，5μm，xbridge)；流动相：水/乙腈/甲醇＝46/46/8(v/v/v)；流速1.0ml/min；柱温25℃；进样量10μl；荧光检测器：激发波长(ex)＝274nm，发射波长(em)＝440nm。zen降解率＝降解后培养基中zen含量/原培养基中zen的含量×100％。

1.3.1富集和初筛：取5g样品于50mlmsm培养基中，zen浓度为20mg/l，30℃，220r/min培养10d，以10％的接种量转接3次，高效液相色谱检测zen残留，选择具有zen降解效果的样品进行下一步实验。复筛：将初筛获得的具有降解效果的样品经过适当稀释涂布于msm平板上，挑取不同形态的单菌落接到含有10μgzen的ep管中，在30℃，220r/min条件下培养6d，检测zen残留，挑取具有降解效果的菌株进行下一步实验。

1.3.2降解菌菌株的形态鉴定：将获得的菌株在msm平板上划线，30℃培养24-48h，观察菌落形态、大小、边缘、表面隆起形状、透明度等。对菌株进行革兰氏染色。

分子鉴定：对获得的降解菌进行16srdna或18srdna鉴定，以菌液或单菌落作为模板，反应体系：模板1μl，taqmix12.5μl，16s上下游引物各1μl，ddh2o10.5μl。反应程序：98℃预变性10min，94℃变性50s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。pcr产物经核酸电泳检测后送到invitrogen公司测序，将测序得到的序列在ncbi上进行比对。其中采用上述所述的细菌通用引物序列如seqidno：1、seqidno：2所示；真菌通用引物序列如seqidno：3，seqidno：4所示。

2降解菌的分离和纯化，根据1.3.1的方法对18个工厂样品进行筛选，得到1株对zen有降解效果的菌株fs-7。

2.1取该种菌株发酵液上清液和发酵液破碎上清液500μl加入到含有10μgzen的ep管中，在30℃，220r/min条件下反应12h，以灭活的菌株发酵液破碎上清液作为对照，高效液相色谱测定zen残留量并计算降解率，结果见表2，菌株活性物质分泌特性的研究。通过表2可以看出，fs-7发酵液破碎上清液降解率达到70％以上，而发酵上清液的降解率仅为24％，说明活性物质主要分布在胞内。

表2

2.2fs-7降解菌形态鉴定，其菌丝发达呈黑褐色呈厚绒状布满整个平皿，表面附有黑色孢子，菌落不易挑取，如图3所示。

2.2.1分子鉴定：以菌液作为模板，用18s通用引物进行基因扩增，将pcr产物进行测序，测序结果在genebank数据库中进行比对，结果表明，fs-7菌株和aspergillusniger同源性高达99％。利用mega-5.0软件通过n-j法对fs-7菌株构建系统进化树，结果如图4所示。根据菌株18srdna的相似性、系统发育树和菌落形态，初步鉴定fs-7菌株为黑曲霉菌(aspergillusniger)，该黑曲霉菌的拉丁文名称为aspergillusniger，该菌种于2017年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14639，保藏地址为中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例3、筛选增加风味物质的酵母菌

1材料与方法：样品来源为食品厂、面粉厂、啤酒厂以及白酒厂。

1.1试剂与培养基：氨基酸标样，日本wako公司；盐酸(优级纯)，天津试剂公司；巯基乙酸，美国sigma公司；氨基酸分析仪配套的流动相(茚三酮溶液和缓冲液)，日本wako公司。富集培养基:葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏10g/l，青霉素100mg/l。ypd培养基:蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，葡萄糖20g/l。

1.2主要仪器与设备：l-8900型氨基酸分析仪，日本日立公司；电热恒温干燥箱，上海森信；浓缩仪，东京理化公司；氮吹仪，美国organomation公司

1.3实验方法：酵母菌的分离和纯化，富集：取1g样品于50ml富集培养基中，25℃振荡培养16h。分离纯化：将富集液梯度稀释至10-3、10-4和10-5，取0.1ml稀释液于分离培养基中，涂平板，30℃培养，观察菌落生长状况，等菌落长出后，对菌体为酵母菌的菌落进行划线纯化。

1.3.1样品处理：将5ml发酵液蒸干后用1ml超纯水溶解，加入浓盐酸2.0ml，苯酚2～3滴后混匀并抽真空，并且用氮吹仪吹入氮气，对玻璃水解管进行玻璃热熔封口，并将完成封口后的水解管放置于110℃烘箱中，水解24h后取出冷却至室温，将水解后的样品转移至25ml容量瓶中，用纯水反复清洗水解管后将容量瓶定容至刻度。定容后的样品过0.22μm微孔滤膜后放入进样小瓶中待测。

1.3.2形态学鉴定，观察菌落特征：大小，质地，颜色，表面是否光滑，边缘是否整齐，菌体细胞形状，排列是否规则，分裂方式等。

分子生物学鉴定，对获得的酵母菌进行5.8srdna鉴定，以菌液或单菌落作为模板，反应体系：模板1μl，taqmix12.5μl，16s上下游引物各1μl，ddh2o10.5μl。反应程序：98℃预变性10min，94℃变性50s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。将扩增得到的目的基因的单一条带进行pcr条带纯化，有非特异扩增条带的条带，进行切胶纯化。将所得的纯化5.8srdna进行sanger测序，将测序结果带到genebank比对，确定筛选得到的酵母菌种属，上下游引物如下：上游引物its1，seqidno：5，5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；下游引物its4，seqidno：6，5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。

1.3.3氨基酸的测定参照国标方法(gb5009.124—2016)测定氨基酸。

2降解菌的分离、纯化。根据1.3.1的方法对9个工厂样品进行筛选，得到3株酵母菌。

2.1产风味物质的研究：将分离纯化得到的三株酵母菌分别接到50mlypd培养基中，200r/min，30℃培养20h，取发酵液进行谷氨酸，丙氨酸和甘氨酸的分析，发酵前后的氨基酸变化量如表3，发酵前后氨基酸的变化情况，由表3可知，经过发酵后，与菌株tm-1和tm-2相比，tm-3菌株增加谷氨酸，丙氨酸和甘氨酸的含量较高，所以对该菌株进行鉴定。

表3

2.2tm-3菌落形态鉴定，其菌落特征为：菌落凸起呈白色，边缘规则，表面光滑湿润，如图5所示。

2.3.1分子鉴定：以菌液作为模板，用5.8s通用引物进行基因扩增，将pcr产物进行测序，测序结果在genebank数据库中进行比对，结果表明，菌株tm-3和saccharomycescerevisiaesty2-1同源性高达100％。利用mega-5.0软件通过n-j法对tm-3菌株构建系统进化树，结果如图6。根据菌株5.8srdna的相似性、系统发育树和菌落形态，初步鉴定tm-3菌株为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，该酿酒酵母的拉丁文名称为saccharomycescerevisiae，该菌株于2018年09月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16469，，保藏地址为中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例4、筛选增加风味物质的乳酸菌

1材料与方法：样品分别来源于酸粥样品、泡菜样品、酸菜样品、老酸奶样品、玉米副产物样品。

1.1试剂与培养基：mrs培养基：mrs预制培养基48g/l，固体培养基加1.5％的琼脂。

1.2主要仪器与设备：sba-40d型生物传感分析仪；pcr仪：美国bio-rad公司；凝胶成像仪：美国bio-rad公司；

1.3l-乳酸测定方法，取2ml乳酸发酵液经过离心去除发酵液中的碳酸钙沉淀，将样品稀释到线性范围内，等待测定。首先，将仪器自动清洗2遍，当电极平衡后，吸取25μl标样进行定标，等标定完成之后开始测定样品。利用进样针吸取已稀释相应倍数的上清液25μl注入反应池中，在仪器屏幕上读数，即所测定l-乳酸的产量。

1.3.1富集：取5g样品于50ml无菌mrs培养基中，37℃，静置培养2d。筛选：将富集获得的各样品发酵液10ml加入到装有90ml无菌水的三角瓶中，即为10-1稀释液，振荡混匀后吸取1ml转移至装有9ml无菌水的试管中，制成10-2稀释液，此后依次制得10-3、10-4、10-5和10-6稀释液，最后分别吸取0.2ml10-4、10-5和10-6稀释液涂布于mrs固体培养基上，将平板倒置于37℃培养48h后，挑取平板上生长数量占优势的乳酸菌株作为进一步研究。

1.3.2乳酸菌形态鉴定：将获得的菌株在mrs平板上划线，37℃培养24-48h，观察菌落形态、大小、边缘、表面隆起形状、透明度等。对菌株进行革兰氏染色。

分子鉴定：对获得的降解菌进行16srdna鉴定，以菌液或单菌落作为模板，反应体系：模板1μl，taqmix12.5μl，16s上下游引物各1μl，ddh2o10.5μl。反应程序：98℃预变性10min，94℃变性50s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。pcr产物经核酸电泳检测后送到invitrogen公司测序，将测序得到的序列在ncbi上进行比对。细菌通用引物序列如seqidno：1和seqidno：2所示。

2降解菌的分离和纯化，根据1.3.1的方法对7个样品进行筛选，得到8株乳酸菌菌株。

2.1取该8株菌株，挑取单菌落到50mlmrs发酵培养基中，厌氧静置2d后取发酵上清液，用1.3.1中的方法测定乳酸菌的含量，结果见表4，乳酸菌产乳酸能力，由表4可见，rs-5菌种产乳酸能力最高。所以选择rs-5菌种进行鉴定。

表4

2.2rs-5降解菌形态鉴定，其菌落特征为：菌落扁平，边缘规则，表面光滑，呈乳白色，革兰氏染色成阳性，菌落图片由图7所示。

2.2.1分子鉴定，以菌液作为模板，用16s通用引物进行基因扩增，将pcr产物进行测序，测序结果在genebank数据库中进行比对，结果表明，菌株rs-5和lactobacillusplantarumuruma-su11同源性高达99％。利用mega-5.0软件通过n-j法对rs-5菌株构建系统进化树，结果如图8所示。根据菌株16srdna的相似性、系统发育树和菌落形态，初步鉴定rs-5菌株为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，该植物乳杆菌的拉丁文名称为lactobacillusplantarum，该菌株于2018年08月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16256，，保藏地址为中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例5毕赤酵母产zen降解酶

本实施例中的zen降解酶的制备方法及过程以及对各个过程的结果验证内容均被申请号为201110082679.x的专利申请文件公开。

取100l上述毕赤酵母gs115表达菌株的发酵液加入100l水进行稀释，将稀释后的发酵液通入碟片离心机进行离心除菌，转速5000r/min。将除菌后的发酵液通入陶瓷膜过滤器进行精滤除杂，陶瓷膜孔径50nm，压力＜0.6mpa。将精滤后的液体通过超滤膜浓缩装置，超滤膜孔径50kda，浓缩到30l，获得黄色澄清zen降解酶液体。向黄色zen降解酶浓缩液中加入10-20％的麦芽糊精，充分搅拌后进行喷雾干燥，进风温度180-200℃，出风温度80-100℃，获得固体粉状zen降解酶制剂，如果不进行喷雾干燥，就是液体酶制剂

实施例6枯草芽孢杆菌产don降解酶

1.1实验材料：种子培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l；发酵培养基：玉米粉20g/l，玉米浆20g/l，豆粕粉20g/l。

1.2实验流程：

(1)一级种子液制备，挑取活化的降解don枯草芽孢杆菌单菌落到3.5l无菌种子液中，转速220rpm，温度37℃，培养16h。

(2)二级种子液制备：100l发酵罐中加入70l无菌种子培养基，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，培养12h。

(3)发酵准备：向1t发酵罐中加入700l玉米浆，灭菌，液氨调节ph7.0。

(4)发酵：将活化好的菌液通入到1t发酵罐中，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％

2don降解酶制剂的制备：取发酵液加入700l水进行稀释，将稀释后的发酵液通入碟片离心机进行离心除菌，转速5000r/min。将除菌后的发酵液通入陶瓷膜过滤器进行精滤除杂，陶瓷膜孔径50nm，压力＜0.6mpa。将精滤后的液体通过超滤膜浓缩装置，超滤膜孔径50kda，浓缩到30l，获得黄色澄清don降解酶液体。向黄色don降解酶浓缩液中加入10-20％的麦芽糊精，充分搅拌后进行喷雾干燥，进风温度180-200℃，出风温度80-100℃，获得固体粉状don降解酶制剂，若不喷雾干燥即为液态酶制剂。

实施例7、zen酶制剂降解玉米浆中zen毒素

1、实验材料：玉米皮：300kg；玉米浓浆(40％干物质含量)：400l；液氨；lb培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l；降解zen酶制剂。

2、实验流程：准备：向1t发酵罐中加入400l玉米浓浆，转速500r/min，温度37℃，液氨调节ph7.0；酶解：向发酵罐中投入220gzen酶制剂粉末，转速500r/min，ph7.0，温度37℃酶解2h，得到zen脱毒玉米浆。喷浆：将浓缩的脱毒玉米浆流加与玉米皮混合，管束干燥机进行干燥后粉碎；将粉碎后喷浆玉米皮装袋。

3、玉米浆中真菌毒素检测如表5所示。

表5

由表5可知，zen毒素由初始的5704.52μg/kg降解到47.93μg/kg，降解效果良好，符合国家饲料中真菌毒素标准。

实施例8、don酶制剂降解玉米浆中don毒素

1、实验材料：玉米皮：300kg；玉米浓浆(40％干物质含量)：400l；液氨；降解don酶制剂。

2、实验流程：准备：向1t发酵罐中加入400l玉米浓浆，转速500r/min，温度37℃，液氨调节ph7.0；酶解：向发酵罐中投入220g酶制剂粉末，转速500r/min，ph7.0，温度37℃酶解2h，得到don脱毒玉米浆；喷浆：将浓缩的脱毒玉米浆流加与玉米皮混合，管束干燥机进行干燥后粉碎；将粉碎后喷浆玉米皮装袋。

3、玉米浆中真菌毒素检测如表6所示

表6

由图表6可知，样品处理前后，don毒素由初始的6834.9μg/kg降解到83.43μg/kg，降解效果良好，符合国家饲料中真菌毒素标准。

实施例9、黑曲霉zen发酵降解玉米浆中zen毒素

1、实验材料：玉米皮：300kg；玉米浓浆(20％干物质含量)：700l；液氨；活化培养基：糖蜜20g/l，蛋白胨20g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，(nh4)2hpo40.4g/l，吐温-6015g/l，玉米粉5g/l；黑曲霉。

2、实验流程：菌剂活化，20l发酵罐中加入10l活化培养基，加入70g降黑曲霉孢子菌剂，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，活化2h；发酵准备：向1t发酵罐中加入700l玉米浆，灭菌，液氨调节ph7.0；发酵：将活化好的菌液通入到1t发酵罐中，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，得到zen脱毒玉米浆；玉米浆浓缩：将脱毒的玉米浆放入蒸发器中，蒸发浓缩到400l；喷浆：将浓缩的脱毒玉米浆流加与玉米皮混合，管束干燥机进行干燥后粉碎；将粉碎后喷浆玉米皮装袋。

3、玉米浆中真菌毒素检测如表7所示。

表7

由表7可知，zen毒素由初始的5629.43μg/kg降解到145.61μg/kg。降解效果良好，均符合国家饲料中真菌毒素标准。

实施例10、枯草don发酵降解玉米浆中don毒素

1、实验材料：玉米皮：300kg；玉米浓浆(20％干物质含量)：700l；液氨；活化培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l；枯草芽孢杆菌菌剂；酿酒酵母菌剂。

2、实验流程：菌剂活化，20l发酵罐中加入10l活化培养基，加入70g降don枯草芽孢杆菌菌剂，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，活化2h；发酵准备：向1t发酵罐中加入700l玉米浆，灭菌，液氨调节ph7.0；发酵：将活化好的菌液通入到1t发酵罐中，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，得到don脱毒玉米浆；玉米浆浓缩：将脱毒的玉米浆放入蒸发器中，蒸发浓缩到400l；喷浆：将浓缩的脱毒玉米浆流加与玉米皮混合，管束干燥机进行干燥后粉碎；将粉碎后喷浆玉米皮装袋。

3、玉米浆中真菌毒素检测如表8所示。

表8

由表8可知，don毒素由初始的6734.9μg/kg降解到107.11μg/kg。降解效果良好，均符合国家饲料中真菌毒素标准。

实施例11、黑曲霉zen发酵降解玉米浆中zen毒素，don酶制剂降解don毒素

1、实验材料：玉米皮：300kg；玉米浓浆(20％干物质含量)：700l；液氨；活化培养基：糖蜜20g/l，蛋白胨20g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，(nh4)2hpo40.4g/l，吐温-6015g/l，玉米粉5g/l；降解don酶制剂；降解zen黑曲霉菌菌剂。

2、实验流程：菌剂活化，20l发酵罐中加入10l活化培养基，加入70g降zen黑曲霉菌菌剂，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，活化2h；发酵准备，向1t发酵罐中加入700l玉米浆，灭菌，液氨调节ph7.0；发酵：将活化好的菌液通入到1t发酵罐中，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％；酶解，发酵培养18h后向发酵罐中投入220g降解don酶制剂粉末，转速500r/min，ph7.0，温度37℃酶解2h,得到zen和don脱毒玉米浆；玉米浆浓缩：将脱毒的玉米浆放入蒸发器中，蒸发浓缩到400l；喷浆：将浓缩的脱毒玉米浆流加与玉米皮混合，管束干燥机进行干燥后粉碎；将粉碎后喷浆玉米皮装袋

3、玉米浆中真菌毒素检测如表9所示

表9

由表9可知，样品处理前后，zen毒素由初始的5131.28μg/kg降解到74.15μg/kg，don毒素由初始的6362.42μg/kg降解到42.94μg/kg。降解效果良好，均符合国家饲料中真菌毒素标准。

实施例12、zen酶制剂降解zen毒素，枯草芽孢杆菌发酵降解玉米浆中don毒素

1、实验材料：玉米皮：300kg；玉米浓浆(20％干物质含量)：700l；液氨；活化培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l；降解zen酶制剂；降解don枯草芽孢杆菌菌剂。

2、实验流程：菌剂活化，20l发酵罐中加入10l活化培养基，加入70g降don枯草芽孢杆菌菌剂，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，活化2h；发酵准备，向1t发酵罐中加入700l玉米浆，灭菌，液氨调节ph7.0；将活化好的菌液通入到1t发酵罐中，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％；酶解，发酵培养18h后向发酵罐中投入220g酶制剂粉末，转速500r/min，ph7.0，温度37℃酶解2h，得到zen和don脱毒玉米浆；玉米浆浓缩，将脱毒的玉米浆放入蒸发器中，蒸发浓缩到400l；将浓缩的脱毒玉米浆流加与玉米皮混合，管束干燥机进行干燥后粉碎；将粉碎后喷浆玉米皮装袋。

3、玉米浆中真菌毒素检测如表10

表10

由表10，样品处理前后，zen毒素由初始的5289.74μg/kg降解到22.42μg/kg，don毒素由初始的6062.21μg/kg降解到72.34μg/kg。降解效果良好，均符合国家饲料中真菌毒素标准。

实施例13、枯草芽孢杆菌和黑曲霉发酵降解玉米浆中zen和don，酵母菌和乳酸菌增加风味物质

1、实验材料：玉米皮：300kg；玉米浓浆(20％干物质含量)：700l；液氨；活化培养基：糖蜜20g/l，蛋白胨20g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，(nh4)2hpo40./l，吐温-6015g/l，玉米粉5g/l；黑曲霉菌剂，枯草芽孢杆菌菌剂，酿酒酵母菌剂，乳酸菌菌剂。

2、实验流程：菌剂活化，20l发酵罐中加入10l活化培养基，加入70g降黑曲霉孢子菌剂，70g枯草芽孢杆菌菌剂，100g酿酒酵母菌剂，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，活化2h；发酵准备，向1t发酵罐中加入700l玉米浆，灭菌，液氨调节ph7.0；将活化好的菌液通入到1t发酵罐中，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，得到风味zen和don脱毒玉米浆；玉米浆浓缩，将脱毒的玉米浆放入蒸发器中，蒸发浓缩到400l；将浓缩的脱毒玉米浆流加与玉米皮混合，管束干燥机进行干燥后粉碎；将粉碎后喷浆玉米皮装袋

3、玉米浆中真菌毒素检测如表11示。

表11

玉米浆中风味物质检测如表12。

表12

由表11可知，zen毒素由初始的5421.36μg/kg降解到121.82μg/kg，don毒素由初始的6346.92μg/kg降解到163.82μg/kg。降解效果良好，均符合国家饲料中真菌毒素标准。如表12所示，通过对发酵前后的喷浆玉米进行水溶性蛋白、l-乳酸、l-谷氨酸钠、l-丙氨酸和l-甘氨酸进行检测，各指标均有显著增加。其中，水溶性蛋白的增加，使喷浆玉米皮作为动物饲料，更利于营养的吸收，而乳酸的显著增加，增加了喷浆玉米皮中的酸味物质，提高了喷浆玉米皮的适口性，而l-谷氨酸钠、l-丙氨酸和l-甘氨酸，均可以缓解喷浆玉米皮中的碱味，提升喷浆玉米皮中香味，使发酵喷浆玉米皮更具有诱食性，也利于蛋白质等营养物质的吸收。

实施例14、酵母菌，乳酸菌增加风味物质，zen，don酶制剂降解zen和don毒素

1、实验材料：玉米皮：300kg；玉米浓浆(20％干物质含量)：700l；液氨；活化培养基：糖蜜20g/l，蛋白胨20g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，(nh4)2hpo40.4g/l，吐温-6015g/l，玉米粉5g/l；酿酒酵母菌剂，乳酸菌菌剂，降解zen和don酶制剂。

2、实验流程：菌剂活化，20l发酵罐中加入10l活化培养基，加入100g酿酒酵母菌剂，100g乳酸菌剂转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，活化2h；发酵准备：向1t发酵罐中加入700l玉米浆，灭菌，液氨调节ph7.0；发酵，将活化好的菌液通入到1t发酵罐中，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％；玉米浆浓缩，将脱毒的玉米浆放入蒸发器中，蒸发浓缩到400l；酶解，向发酵罐中投入220g降解don酶制剂粉末和220g降解zen酶制剂粉末，转速500r/min，ph7.0，温度37℃酶解2h，得到风味zen和don脱毒玉米浆；喷浆，将浓缩的脱毒玉米浆流加与玉米皮混合，管束干燥机进行干燥后粉碎；将粉碎后喷浆玉米皮装袋。

3、玉米浆中真菌毒素检测如表13示。

表13

玉米浆中风味物质检测如表14示。

表14

由表13知，zen毒素由初始的5441.78μg/kg降解到70.02μg/kg，don毒素由初始的6306.22μg/kg降解到34.12μg/kg。降解效果良好，均符合国家饲料中真菌毒素标准。如表14所示，通过对发酵前后的喷浆玉米进行水溶性蛋白、l-乳酸、l-谷氨酸钠、l-丙氨酸和l-甘氨酸进行检测，各指标均有显著增加。其中，水溶性蛋白的增加，使喷浆玉米皮作为动物饲料，更利于营养的吸收，而乳酸的显著增加，增加了喷浆玉米皮中的酸味物质，提高了喷浆玉米皮的适口性，而l-谷氨酸钠、l-丙氨酸和l-甘氨酸，均可以缓解喷浆玉米皮中的碱味，提升喷浆玉米皮中香味，使发酵喷浆玉米皮更具有诱食性，也利于蛋白质等营养物质的吸收。

实施例15，固态发酵风味喷浆玉米皮的制备

1、实验材料：玉米皮：300kg；玉米浓浆(40％干物质含量)：400l；液氨；活化培养基：糖蜜20g/l，蛋白胨20g/l，kh2po40.2g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，(nh4)2hpo40.4g/l，吐温-6015g/l，玉米粉5g/l；黑曲霉菌剂，枯草芽孢杆菌菌剂；酿酒酵母菌剂；乳酸菌菌剂。

2、实验流程：菌剂活化，20l发酵罐中加入10l活化培养基，加入70g降黑曲霉孢子菌剂，70g枯草芽孢杆菌菌剂，100g酿酒酵母菌剂，转速500r/min，温度37℃，通风0.5vvm，溶氧大于20％，活化2h；发酵准备：将300kg玉米皮与400l玉米浆在饲料混合机混合，液氨调节ph7.0；接种：将活化好的菌液通入到饲料混合机中，将物料充分搅拌；发酵：将接菌后的喷浆玉米皮装入发酵袋中，封口后静置发酵4天；将发酵好的喷浆玉米皮管束干燥机进行干燥后粉碎；将粉碎后喷浆玉米皮装袋。

3、玉米浆中真菌毒素检测如表15所示。

表15

玉米浆中风味物质检测如表16所示。

表16

由表15所示，zen毒素由初始的5221.36μg/kg降解到820.32μg/kg，don毒素由初始的6246.81μg/kg降解到1063.23μg/kg。降解效果良好，均符合国家饲料中真菌毒素标准。如表16所示，通过对发酵前后的喷浆玉米皮进行l-乳酸、l-谷氨酸钠、l-丙氨酸和l-甘氨酸进行检测，各指标均有显著增加，使喷浆玉米皮作为动物饲料，更利于营养的吸收，而乳酸的显著增加，增加了喷浆玉米皮中的酸味物质，提高了喷浆玉米皮的适口性，而l-谷氨酸钠、l-丙氨酸和l-甘氨酸，均可以缓解喷浆玉米皮中的碱味，提升喷浆玉米皮中香味，使发酵喷浆玉米皮更具有诱食性，也利于蛋白质等营养物质的吸收。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>国家粮食和物资储备局科学研究院

<120>一种风味脱毒玉米浆的制备方法

<130>gg19624424a

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

attgaacgctggcggcaggcct22

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>19

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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