一种胶原蛋白基皮克林乳液的制备方法及应用与流程

本发明涉及乳液制备技术领域，更具体的说是涉及一种皮克林乳液的制备方法及应用。

背景技术：

皮克林乳液是一种用固体颗粒代替传统表面活性剂吸附在油水界面形成物理屏障阻止液滴聚集的乳化液，最早在1903年由ramsden发现并于1907年由pickering正式提出。与采用传统的表面活性剂制备乳化液相比，皮克林乳化技术具有乳化剂用量少、成本低、安全性高等特点，而且稳定性高，还具有稳定性时间长、泡沫出现少、可再生等特点，在结构改性、降低热量、包裹和传递生物活性化合物等方面具有优异的应用前景。目前，皮克林乳化主要用于食品的制备过程，如用于制备乳制品、冰淇淋、饮料等，使制得的产品质地均匀，口感好，稳定性更强；此外在肉制品中加入皮克林乳化液，可以替代动物脂肪，是控制脂肪摄入量的潜在的良好途径。

现阶段用于制备皮克林乳化液的固体粒子通常分为两类：无机粒子和有机粒子。其中，无机粒子主要包括改性二氧化硅、二氧化钛、黏土颗粒等。有机粒子主要包括蛋白质、多糖、纳米纤维素及具有生物活性的小分子物质如黄酮和植物甾醇等，并且由于其可降解、生物相容性好、可持续、无毒等特点，更适合绿色加工，尤其适合食品领域的应用。而在食品领域，用于皮克林乳液的稳定剂主要来自于淀粉、植物蛋白等，对于纤维状乳化剂用于制备皮克林乳液的研究相对较少。

因此，提供一种新的采用纤维状乳化剂制备皮克林乳液的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种胶原蛋白基皮克林乳液的制备方法及应用，由胶原纤维形成稳定剂，然后制备皮克林乳化液，采用的制备方法操作简单，并且制备得到的皮克林乳液具有优异的稳定性，呈现类凝胶状态，可以作为食品配料添加于饮料、乳制品、肉制品及焙烤食品等中，以及作为保油保水剂添加于化妆品中。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种皮克林乳液的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将胶原纤维制成悬浮液，再经过均质得到胶原纤维分散液；

(2)将胶原纤维分散液与分散相按比例混合形成油水混合物；

(3)将上述油水混合物经过乳化得到皮克林乳液。

上述优选技术方案的有益效果是：本发明将胶原纤维制成胶原纤维分散液，利用纳米级胶原纤维作为稳定剂，可以提高皮克林乳液的稳定性。

优选的，步骤(1)中胶原纤维溶解于醋酸溶液中形成悬浮液，所述悬浮液的ph为1～5，胶原纤维质量浓度为0.01～10％；所述醋酸溶液的浓度为0.1-1mol/l。

优选的，步骤(1)中所述胶原纤维是从经酸溶胀或未经酸溶胀的牛皮上机械剥离所得；或所述胶原纤维是酸提取或酶提取的胶原蛋白，所述胶原蛋白的形态呈纤维状。

优选的，步骤(1)中所述胶原纤维的长度为600～900nm，直径为20-100nm。

优选的，步骤(1)中所述均质压力为10～300mpa，次数为1～20次，所述胶原纤维分散液具有纳米尺寸。

优选的，步骤(2)中所述分散相为功能性脂肪酸或植物活性脂类化合物；所述功能性脂肪酸包括海藻油或鱼油；所述植物活性脂类化合物包括植物精油。

优选的，步骤(2)中所述胶原纤维分散液与分散相按照质量比为(10～99.9)：(0.1～90)混合。

优选的，步骤(3)中所述乳化包括均质、超声或微流射方式；所述均质压力为10-150mpa，次数为1-20次。

本发明还提供一种采用上述的方法制备得到的皮克林乳液在食品或化妆品中的应用。

上述优选技术方案的有益效果是：本发明制备的皮克林乳液可以全乳液方式或离心取乳化层作为食品配料添加于饮料、乳制品、肉制品及焙烤食品等中；并且可以作为保水剂添加于化妆品中，具有优异的使用效果。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种皮克林乳液的制备方法及应用，具有如下有益效果：

(1)本发明采用胶原纤维作为稳定剂，胶原纤维作为一种蛋白类纤维，具有良好的双亲性和柔韧性，与传统的球状固体粒子作稳定剂的方式相比，纤维状乳化剂具有较高的长宽比，结构更易调控，具有优良的皮克林乳化效果。

(2)本发明胶原纤维与其它蛋白类纤维相比，制备方法简单、方便、绿色，可实现大批量生产。

(3)本发明利用胶原纤维制备的皮克林乳化液，制备的乳化液稳定性高，应用范围广泛。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的原子力显微镜观察下胶原纤维形态图；

图2附图为本发明提供的胶原纤维的zeta电位随ph变化趋势；

图3附图为本发明提供的皮克林乳化液染色共聚焦扫描显微镜图像(尼罗红标记海藻油，尼罗蓝a标记胶原纤维)；

图4附图为本发明提供的不同浓度胶原纤维稳定的皮克林乳化液的直观观察图和光学显微镜图像；其中a为离心前，b为离心后；

图5附图为不同浓度胶原纤维稳定的皮克林乳化液的动态粘弹性随应力和频率的变化。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种皮克林乳液的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)胶原纤维溶解于醋酸溶液中形成ph为1～5、胶原纤维质量浓度为0.1～10％的悬浮液，胶原纤维的长度为600～900nm、直径为20-100nm；再经过均质得到纳米尺寸的胶原纤维分散液，均质压力为10～300mpa、次数为1～20次；

(2)将胶原纤维分散液与分散相按照质量比为(10～99.9)：(0.1～90)混合形成油水混合物；分散相为功能性脂肪酸或植物活性脂类化合物；功能性脂肪酸包括海藻油或鱼油，植物活性脂类化合物包括植物精油；

(3)将上述油水混合物经过均质、超声或微流射方式乳化得到皮克林乳液；均质压力为10-150mpa，次数为1-20次；

为了进一步的优化技术方案，其中胶原纤维是经酸溶胀或未经酸溶胀的牛皮上机械剥离所得；或所述胶原纤维是酸提取或酶提取的胶原蛋白，所述胶原纤维的形态呈纤维状。

实施例1

本发明实施例1公开了一种皮克林乳液的制备方法，包括如下步骤：

(1)去除脂肪和杂蛋白质的牛二层皮，用蒸馏水充分洗涤牛二层皮接近中性后，将牛皮剪切成5cm×5cm的碎块，随后按照牛皮与盐酸1：3(w/v)的比例添加0.5m的盐酸在4℃下溶胀24h后将盐酸洗净，从溶胀的牛皮上小心地撕下胶原纤维；

(2)将胶原纤维溶解于0.1m醋酸溶液中，配制浓度分别为0.01wt％的悬浮液，然后加入至高压均质机，并设定均质压力为80mpa、均质次数为4次，得到胶原纤维溶液；

(3)然后以油水体积比为3:7的比例加入海藻油，与胶原纤维溶液混合后形成油水混合物；

(4)油水混合物进行超声处理，超声波细胞破碎仪工作参数为：功率450w，超声3s，间隙3s，总时间10min，得到皮克林乳液。

实施例2

本发明实施例2公开了一种皮克林乳液的制备方法，包括如下步骤：

(1)去除脂肪和杂蛋白质的牛二层皮，用蒸馏水充分洗涤牛二层皮接近中性后，将牛皮剪切成5cm×5cm的碎块，随后按照牛皮与盐酸1：3(w/v)的比例添加0.5m的盐酸在4℃下溶胀24h后将盐酸洗净，从溶胀的牛皮上小心地撕下胶原纤维；

(2)将胶原纤维溶解于0.1m醋酸溶液中，配制浓度分别为0.05wt％的悬浮液，然后加入至高压均质机，并设定均质压力为80mpa、均质次数为4次，得到胶原纤维溶液；

(3)然后以油水体积比为3:7的比例加入海藻油，与胶原纤维溶液混合后形成油水混合物；

(4)油水混合物进行超声处理，超声波细胞破碎仪工作参数为：功率450w，超声3s，间隙3s，总时间10min，得到皮克林乳液。

实施例3

本发明实施例3公开了一种皮克林乳液的制备方法，包括如下步骤：

(1)去除脂肪和杂蛋白质的牛二层皮，用蒸馏水充分洗涤牛二层皮接近中性后，将牛皮剪切成5cm×5cm的碎块，随后按照牛皮与盐酸1：3(w/v)的比例添加0.5m的盐酸在4℃下溶胀24h后将盐酸洗净，从溶胀的牛皮上小心地撕下胶原纤维；

(2)将胶原纤维溶解于0.1m醋酸溶液中，配制浓度分别为0.1wt％的悬浮液，然后加入至高压均质机，并设定均质压力为100mpa、均质次数为5次，得到胶原纤维溶液；

(3)然后以油水体积比为3:7的比例加入海藻油，与胶原纤维溶液混合后形成油水混合物；

(4)油水混合物进行超声处理，超声波细胞破碎仪工作参数为：功率450w，超声3s，间隙3s，总时间10min，得到皮克林乳液。

实施例4

本发明实施例4公开了一种皮克林乳液的制备方法，包括如下步骤：

(1)去除脂肪和杂蛋白质的牛二层皮，用蒸馏水充分洗涤牛二层皮接近中性后，将牛皮剪切成5cm×5cm的碎块，随后按照牛皮与盐酸1：3(w/v)的比例添加0.5m的盐酸在4℃下溶胀24h后将盐酸洗净，从溶胀的牛皮上小心地撕下胶原纤维；

(2)将胶原纤维溶解于0.2m醋酸溶液中，配制浓度分别为0.3wt％的悬浮液，然后加入至高压均质机，并设定均质压力为100mpa、均质次数为4次，得到胶原纤维溶液；

(3)然后以油水体积比为3:7的比例加入海藻油，与胶原纤维溶液混合后形成油水混合物；

(4)油水混合物进行超声处理，超声波细胞破碎仪工作参数为：功率450w，超声3s，间隙3s，总时间10min，得到皮克林乳液。

实施例5

本发明实施例5公开了一种皮克林乳液的制备方法，包括如下步骤：

(1)去除脂肪和杂蛋白质的牛二层皮，用蒸馏水充分洗涤牛二层皮接近中性后，将牛皮剪切成5cm×5cm的碎块，随后按照牛皮与盐酸1：3(w/v)的比例添加0.5m的盐酸在4℃下溶胀24h后将盐酸洗净，从溶胀的牛皮上小心地撕下胶原纤维；

(2)将胶原纤维溶解于0.5m醋酸溶液中，配制浓度分别为0.5wt％的悬浮液，然后加入至高压均质机，并设定均质压力为120mpa、均质次数为4次，得到胶原纤维溶液；

(3)然后以油水体积比为3:7的比例加入海藻油，与胶原纤维溶液混合后形成油水混合物；

(4)油水混合物进行超声处理，超声波细胞破碎仪工作参数为：功率450w，超声3s，间隙3s，总时间10min，得到皮克林乳液。

实施例6

本发明实施例6公开了一种皮克林乳液的制备方法，包括如下步骤：

(1)去除脂肪和杂蛋白质的牛二层皮，用蒸馏水充分洗涤牛二层皮接近中性后，将牛皮剪切成5cm×5cm的碎块，随后按照牛皮与盐酸1：3(w/v)的比例添加0.5m的盐酸在4℃下溶胀24h后将盐酸洗净，从溶胀的牛皮上小心地撕下胶原纤维；

(2)将胶原纤维溶解于0.1m醋酸溶液中，配制浓度分别为1wt％的悬浮液，然后加入至高压均质机，并设定均质压力为100mpa、均质次数为4次，得到胶原纤维溶液；

(3)然后以油水体积比为3:7的比例加入海藻油，与胶原纤维溶液混合后形成油水混合物；

(4)油水混合物进行超声处理，超声波细胞破碎仪工作参数为：功率450w，超声3s，间隙3s，总时间10min，得到皮克林乳液。

实施例7

本发明实施例7公开了一种皮克林乳液的制备方法，包括如下步骤：

(1)去除脂肪和杂蛋白质的牛二层皮，用蒸馏水充分洗涤牛二层皮接近中性后，将牛皮剪切成5cm×5cm的碎块，随后按照牛皮与盐酸1：3(w/v)的比例添加0.5m的盐酸在4℃下溶胀24h后将盐酸洗净，从溶胀的牛皮上小心地撕下胶原纤维；

(2)将胶原纤维溶解于0.1m醋酸溶液中，配制浓度分别为2wt％的悬浮液，然后加入至高压均质机，并设定均质压力为80mpa、均质次数为10次，得到胶原纤维溶液；

(3)然后以油水体积比为3:7的比例加入海藻油，与胶原纤维溶液混合后形成油水混合物；

(4)油水混合物进行超声处理，超声波细胞破碎仪工作参数为：功率450w，超声3s，间隙3s，总时间10min，得到皮克林乳液。

实施例8

本发明实施例8公开了一种皮克林乳液的制备方法，包括如下步骤：

(1)去除脂肪和杂蛋白质的牛二层皮，用蒸馏水充分洗涤牛二层皮接近中性后，将牛皮剪切成5cm×5cm的碎块，随后按照牛皮与盐酸1：3(w/v)的比例添加0.5m的盐酸在4℃下溶胀24h后将盐酸洗净，从溶胀的牛皮上小心地撕下胶原纤维；

(2)将胶原纤维溶解于0.1m醋酸溶液中，配制浓度分别为5wt％的悬浮液，然后加入至高压均质机，并设定均质压力为80mpa、均质次数为4次，得到胶原纤维溶液；

(3)然后以油水体积比为3:7的比例加入海藻油，与胶原纤维溶液混合后形成油水混合物；

(4)油水混合物进行超声处理，超声波细胞破碎仪工作参数为：功率450w，超声3s，间隙3s，总时间10min，得到皮克林乳液。

效果验证

一、胶原纤维的表征

(1)原子力显微镜

通过蒸馏水将实施例1步骤(1)制备得到的胶原纤维配制成0.65％的悬浮液，然后用高压均质机，设定均质压力为80mpa，次数为4次，以形成纳米尺寸的胶原纤维分散液；

再通过原子力显微镜对胶原纤维形态及大小进行观察，先取2μl上述制备得到的胶原纤维分散液稀释10倍后均匀涂抹于云母片表面，室温下放置一天干燥后，在原子力显微镜下观察，得到的结果如附图1所示。

附图1结果显示，afm观察到的胶原纤维形态呈细丝状，长度主要在600-800nm之间，直径约20nm，高度约1.8nm可以得知，说明经过一系列的处理后提取的胶原纤维的粒径已经成功降低到纳米级。

(2)zeta电位的测量

通过zeta电位分析仪测定胶原纤维在不同ph(2-10)条件下的电位变化，每个样品平行测定三次，得到的结果如附图2所示

胶原与其他大多数蛋白质一样是聚两性电解质，胶原纤维在25℃时的zeta电位随ph的变化如图2所示，ph2.0时胶原纤维带正电荷(+24.52mv)，当升高到ph10.0时胶原纤维带负电荷(-4.16mv)，ph3.0时zeta电位为+18.37mv。在ph7-8之间出现一个零电荷点，通常称为等电点。胶原纤维随ph变化可能是由于胶原纤维分子每条肽链上的α-羧基和α-氨基的电离状态发生了变化。在低ph值时，这些基团(-nh3⁺和-cooh)的质子化使正电荷占主导地位，而当ph升高后，同样的基团(-nh2和-coo^-)的去质子化使负电荷占主导地位。

二、乳化液的表征

(1)共聚焦激光扫描显微镜观察

通过共聚焦显微镜对乳化液中油滴的分布、尺寸和界面层进行评价。将实施例制备得到的皮克林乳化液用混合染料(1mg/ml的尼罗红和尼罗蓝a溶解于异丙醇中)着色。将染色后的皮克林乳化液滴一滴于载玻片上，再用盖玻片覆盖液滴，使其均匀没有气泡，乳化液中的海藻油和胶原纤维会分别被尼罗红和尼罗蓝a染成红色和蓝色，然后置于共聚焦显微镜下观察。

通过激光共聚焦显微镜对影响乳化液形成和物理性能的微观结构(包括界面结构和液滴絮凝状态)进行评价，结果如图3所示，胶原纤维溶液与海藻油以7:3的体积比混合，乳化体系ph为3.0。海藻油用尼罗红染色后呈红色荧光，分布于球形液滴内部，胶原纤维用尼罗蓝a染色后呈蓝色荧光，分布于液滴周围，紧密包裹红色荧光，进一步说明形成的乳化液为o/w乳化液，其中胶原纤维均匀分散在油滴表面形成致密界面层，同时，相邻液滴堆积形成渗流网络结构，阻止液滴之间聚结，赋予乳化液粘弹性类固体状的特性和抗乳化、抗聚结的稳定性。

(2)乳化液离心前后宏观/微观形态观察

测定实施例1～8制备的不同胶原纤维浓度的皮克林乳液的乳化体积，评定胶原纤维的乳液效率。通过直观观察反映乳化的效率，记录存放24h后离心管中乳化液各层的体积；然后将乳液以8000g离心5min，再次记录乳化液各层体积，以观察离心稳定性。并且，使用光学显微镜对离心前后的乳化液微观形态变化进行观察。得到的乳化液离心前后宏观/微观形态观察结果如图4所示。

胶原纤维的浓度对乳化液的稳定性和液滴大小有重要影响。图4a中胶原纤维浓度在0.01～1.5％之间，样品中乳化液ph为3.0。在所有乳化液中，乳化液的ph值均为3.0。从图4a可以看出，在胶原纤维浓度在0.01～0.05wt％时发生了宏观相分离。离心后图4b，乳液体积逐渐增大，直至浓度达到1.0wt％。当浓度达到1.5wt％时，总体积略有下降，说明液滴发生了聚集。离心前后的光学显微镜图像进一步证实，在0.1～1.0wt％的浓度范围内，皮克林乳状液抗聚结稳定。同时，随着浓度的增加，液滴粒径逐渐减小。同样，当浓度达到1.5wt％时，液滴发生聚集。

(3)流变学观察

通过动态流变仪对皮克林乳液的流变性能在25℃条件下进行测量。取约1ml实施例制备得到的乳液均匀置于钢板上(直径35mm，间隙1mm)后进行测试。所有动态测试均在线性粘弹性区域内进行,包括振荡幅度扫描(应力＝0.1-100pa，频率＝1hz)和振荡频率扫描(0.1-10hz，应力＝1pa)。记录弹性模量(g')和粘性模量(g“)与频率和压力的关系。所有测量平行测定三次。

流变学对乳化液的外观、稳定性以及复杂结构等物理性能的分析起着至关重要的作用。实验过程中对乳化液进行了振荡幅度扫描和振荡频率扫描，探讨了乳化液的流变学和微观结构之间的关系。

乳液的振荡幅度扫描结果如图5a所示，结果表明：在较低振幅下，不同浓度胶原纤维浓度条件下的弹性模量(g’)都大于相应的粘性模量(g”)，随着振荡幅度的增加会出现一个交叉点，随后，粘性模量(g”)大于弹性模量(g’)，这种现象的出现可能是乳化液在较高应力下结构重排导致的，图中可以观察出，胶原纤维浓度低于0.5wt％的乳化液在较低振幅下即出现交点(约10pa)，当浓度在0.5-1.5wt％时，交点大约出现在40-80pa之间，说明适当增加胶原纤维浓度的乳化液更稳定。

乳化液的振荡频率扫描结果如图5b，乳化液在0.1～10hz的整个测量频率范围内，g’均高于相应的g”，这是一种典型的凝胶状行为。随着胶原纤维浓度的增加，胶原纤维吸附在油滴表面形成的对液滴保护效应增强，从而增加了粘弹性响应。

由上述结果综合分析得知，本发明高压均质制备的天然纳米胶原纤维和以其为原料制备的皮克林乳液进行了表征，原子力显微镜表明所制备的胶原纤维长度在600-800nm之间，直径约20nm。与海藻油混合(7:3，v/v)超声处理后能够形成稳定的水包油型乳化液，胶原纤维的浓度对乳化液的稳定性和液滴大小有重要影响，并且随着浓度的增加，液滴粒径逐渐减小。较低浓度的胶原纤维(＜0.1wt％)不能完全包裹油滴，形成明显分层，粘弹性较低，抵抗外力能力相对较低(～10pa)，增大胶原纤维浓度至0.1-1.5wt％后油滴能完全包裹在其中，抵抗外力能力增加(40-80pa)。适当浓度的胶原纤维作为乳化剂制备的乳化液稳定效果较好，可以作为一种新型的皮克林乳化剂应用在食品和化妆品领域。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。