本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种有机铁制剂的制备方法。
背景技术：
铁是生命体必需的微量元素之一。由于一般食物中铁利用率较低，难易满足需求，额外补充一定量铁制剂是预防铁缺乏的重要措施。制备一种高效、低毒的铁制剂是有效补充铁，减少铁中毒，降低铁污染的保障。利用特定微生物对铁的富集特性来生产稳定态或合成态铁是有机铁制剂生产的潜在途径之一。有专利曾利用酵母菌作为菌株，以啤酒废液作为发酵培养基制备酵母发酵态铁饲料添加剂；现有技术中有从农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录》规定可饲用的微生物中筛选微生物以生产发酵态铁饲料添加剂。也有专利报道利用微生物对其它微量元素进行发酵，从而生产相应的微生物发酵态微量元素。
从以上现有技术来看，生产的均为微生物发酵态铁（或其它微量元素），提供的产品是微生物对铁（或其它微量元素）发酵后的混合物，有效成分纯度较低，且并不确定是否将微量元素转化为“有机态”。尽管，也有些专利采用“微生物富集量”这一指标，但微生物富集微量元素的方式有很多，如吸附、结合、转化等。另外，以上专利技术均采用固体发酵方式，虽可以在高浓度下发酵，但产品品质不好控制，尤其是微生物富铁率不确定，难以制定产品标准。
为此，本专利旨在利用已经过耐铁强化的乳酸菌（lb022）和粪肠球菌（e2）联合富铁，生产一种有机铁制剂，并采用生物量、铁富集量、富集率和有机化率几个指标来反映产品的生产效率。本发明专利提供的产品，纯度高，铁含量达27.13%，其中有机铁含量超过78.61%，该产品容易实现工业化生产和产品标准规范。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明旨在提供一种有机铁制剂的制备方法，利用已经过耐铁强化的乳酸菌（lb022）和粪肠球菌（e2）联合富铁，生产一种有机铁制剂，本发明专利提供的产品，纯度高，铁含量达27.13%，其中有机铁含量超过78.61%，该产品容易实现工业化生产和产品标准规范。
本发明为解决上述技术问题采用的技术方案是：一种有机铁制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将耐铁乳酸菌和粪肠球菌分别接种于液体培养基中，调ph至5.5~6.5，培养16~24h，获得种子液；
步骤二、将耐铁乳酸菌和粪肠球菌按体积比为1:2~1:4混合均匀，按照种子液与铁发酵培养基的体积比为0.08：1~0.12:1，将混合后的种子液接种于铁发酵培养基中，得到发酵液；
步骤三、将发酵液装入发酵罐中，发酵温度为30~40℃；搅拌频率为：在时间段为0~5h时，搅拌速率为430~470r/min；在时间段为6~12h时，搅拌速率为230~270r/min；在时间段为12-24h时：搅拌速率为130~170r/min；发酵罐中发酵液的ph每降低“0.5”，分别流加碳源、氮源和矿物质；ph每降低“1”流加氨水将发酵液的ph调至5.5~6.5；
步骤四、发酵结束后，离心获得湿微生物菌体，用轻质碳酸钙，按照湿微生物菌体和轻质碳酸钙按照质量比为1:0.5~1:2混合均匀，然后在温度为70~80℃的条件下烘干至水分为8~12%，即得到有机铁制剂。
进一步的，步骤一中耐铁乳酸菌是以高产酸乳酸菌为出发菌株，经紫外线诱导后获得的可耐受≥2000mg/l铁水平的乳酸菌突变株；耐铁粪肠球菌是从铁矿山筛选的野菌株，并经铁浓度梯度驯化后获得的可耐受≥2500mg/l铁水平的菌株。
进一步的，步骤一中液体培养基包括以下质量份数的各组分：葡萄糖0.5~0.6份、可溶性淀粉4~5份、蛋白胨0.15~0.25份、豆粕粉0.7~0.9份、磷酸二氢钾0.08~0.13份、氯化钠0.1~0.2份，去离子水93~94份。
进一步的，步骤一中种子液中的乳酸菌不低于1.5×108cfu/ml，粪肠球菌不低于0.75×108cfu/ml。
进一步的，步骤二中的铁发酵培养基的制备方法为：将从板框收集的酒精工业黄水与以下质量份数的各组份：葡萄糖12~13份、次粉187~188份、尿素12~13份、豆粕粉37~38份、磷酸二氢钾1~2份、氯化钠2~3份，进行混合，然后再加入硫酸铁，搅拌均匀后调铁发酵培养基的ph至5.5~6.6，备用。
进一步的，步骤二的铁发酵培养基中铁浓度为780~820mg/l。
进一步的，步骤三中发酵液的体积与发酵罐的容积比为1:2.5~1:3.5。
进一步的，步骤三中的碳源为葡萄糖和次粉；氮源为尿素和豆粕粉；矿物盐类为磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铁。
本发明的有益效果主要表现在以下几个方面：本发明采用高耐性微生物对无机铁进行富集，并转化为有机态铁，该技术生产效率高，在24h培养时间后，每升培养液可产微生物菌体33.7克，每克添加剂铁富集量271.3毫克，铁有机化率达78.61%。从现有国内外文献报道来看，采用微生物技术生产相应微量元素制剂，均未突破在较高微量元素浓度下获得较高的微生物生物量和微量元素富集量，其微量元素富集量普遍低于10000mg/kg。与现有文献报道相比，采用本发明生产的微生物有机铁添加剂，铁富集量提高了27.13倍。且，现有文献中并未确定微生物富集的微量元素就是有机态的，本发明通过检测发现，本发明提供的有机铁其有机化率高达78.61%。而有机化是提高微量元素利用率的关键所在。
此外，由本发明制备的有机铁制剂在仔猪、繁殖母猪、肉仔鸡、产蛋鸡日粮中应用时，其添加量仅为nrc（1994）标准规定需要量的60%，且使用效果优于一水硫酸亚铁按照nrc（1994）标准的添加效果。
具体实施方式
结合实施例对本发明加以详细说明，本实施例以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种有机铁制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将耐铁乳酸菌和粪肠球菌分别接种于液体培养基中，调ph至5.5~6.5，培养16~24h，获得种子液；
步骤二、将耐铁乳酸菌和粪肠球菌按体积比为1:2~1:4混合均匀，耐铁乳酸菌和粪肠球菌复配关系确定采用三步法：首先，将2种益生菌按1:1混合接种于联合筛选培养基上，培养18h后，取一定量培养液，滴在载玻片上，显微镜下观察一定视野内每种益生菌的数量，重复10次，计算每种益生菌的生物量。其次，将2种益生菌按相同比例，分别接种于联合筛选培养基上，培养24h后，离心，获得菌体，测定每种益生菌菌体中铁含量。最后，根据第一步获得的生物量和第二步获得的菌体铁含量，计算出每种益生菌的铁富集效率，以铁富集效率确定菌种间的复配关系为：乳酸菌:粪肠球菌=1:3；按照种子液与铁发酵培养基的体积比为0.08：1~0.12:1，将混合后的种子液接种于铁发酵培养基中，得到发酵液；
步骤三、将发酵液装入发酵罐中，发酵温度为30~40℃；采用实时在线监测培养基ph变化，流加技术补充营养及调控ph值，分段控速发酵24h后，离心，获得湿菌体，搅拌频率为：在时间段为0~5h时，搅拌速率为430~470r/min；在时间段为6~12h时，搅拌速率为230~270r/min；在时间段为12-24h时：搅拌速率为130~170r/min；发酵罐中发酵液的ph每降低“0.5”，分别流加碳源、氮源和矿物质；ph每降低“1”流加氨水将发酵液的ph调至5.5~6.5；由该法制得的有机铁制剂，生物产量高，铁富集量及有机化率高，每升发酵液可产菌体33.7克，经与稀释剂混合制备后，每克添加剂含铁（以铁计）超过270毫克，其中有机铁含量达78.61%；
实时在线监测ph变化，指的是由本实验室自行研制的ph值监控系统，主要由监测探头、数据线、控制仪表组成，该系统灵敏度±0.01，反应速度快，准确度高；
本专利中发酵罐中发酵液的ph每降低“0.5”，分别流加碳源、氮源和矿物质，的具体操作为：本实验室通过大量试验所获得的ph变化与相关营养素消耗的变化参数，并依据这些参数计算相关营养素消耗量，本专利通过大量的实验获得了发酵液ph每降低“0.5”，发酵液中的相关营养素消耗的量为对应的值，通过测量ph值的变化，在发酵过程中以补充营养，使发酵液中铁发酵培养基的营养水平保持发酵最佳状态。
步骤四、发酵结束后，离心获得湿微生物菌体，用轻质碳酸钙，按照湿微生物菌体和轻质碳酸钙按照质量比为1:0.5~1:2混合均匀，然后在温度为70~80℃的条件下烘干至水分为8~12%，即得到有机铁制剂。
进一步的，步骤一中耐铁乳酸菌（lb022）是以高产酸乳酸菌为出发菌株，经紫外线诱导后获得的可耐受≥2000mg/l铁水平的乳酸菌突变株；耐铁粪肠球菌（e2）是从铁矿山筛选的野菌株，并经铁浓度梯度驯化后获得的可耐受≥2500mg/l铁水平的菌株。
铁浓度梯度驯化指的是将野菌株在不同含铁梯度培养基中进行培养，
含铁梯度培养基的制法是：按照上述含铁基础培养基的制法，将铁含量在100mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1l，依次配置梯度培养基备用；
进一步的，步骤一中液体培养基包括以下质量份数的各组分：葡萄糖0.5~0.6份、可溶性淀粉4~5份、蛋白胨0.15~0.25份、豆粕粉0.7~0.9份、磷酸二氢钾0.08~0.13份、氯化钠0.1~0.2份，去离子水93~94份。
进一步的，步骤一中种子液中的乳酸菌不低于1.5×108cfu/ml，粪肠球菌不低于0.75×108cfu/ml。
进一步的，步骤二中的铁发酵培养基的制备方法为：将从板框收集的酒精工业黄水与以下质量份数的各组份：葡萄糖12~13份、次粉187~188份、尿素12~13份、豆粕粉37~38份、磷酸二氢钾1~2份、氯化钠2~3份，进行混合，然后再加入硫酸铁，搅拌均匀后调铁发酵培养基的ph至5.5~6.6，备用。铁发酵培养基为结合耐铁乳酸菌和粪肠球菌生理特点进行配制的；
进一步的，步骤二的铁发酵培养基中铁浓度为780~820mg/l。
进一步的，步骤三中接种后的铁发酵培养基的体积与发酵罐的容积比为1:2.5~1:3.5。
进一步的，步骤三中的碳源为葡萄糖和次粉；氮源为尿素和豆粕粉；矿物盐类为磷酸二氢钾、氯化钠、无机铁源。
本专利中的生物量、富集量、有机化率，分别是指：（1）生物量，发酵结束后，干燥至水分10%左右，所获得菌体重量即为生物量；（2）铁富集率，指的是微生物体中所含铁量占培养基中总铁的比率。测定方法为采用湿法消化将微生物体消解，然后用电感耦合等离子体光谱仪测定其中铁含量，即为生物铁富集量；（3）铁有机化率，采用超声波破碎微生物体，用铁选择电极法测定破碎液中游离态铁。采用湿法消化消解微生物，用电感耦合等离子体光谱仪测定其铁含量，即为微生物总铁。用微生物总铁减去游离态铁，即为有机铁含量，用有机铁除以总铁，获得铁有机化率指标。
实施例2
一种有机铁制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将耐铁乳酸菌（lb022）和粪肠球菌（e2）分别接种于液体培养基中，调ph至6.0，培养18h，获得种子液；
步骤二、将耐铁乳酸菌和粪肠球菌按体积比为1:3混合均匀，按照种子液与铁发酵培养基的体积比为0.1：1，将混合后的种子液接种于铁发酵培养基中，得到发酵液；
步骤三、将发酵液装入10l的发酵罐中，发酵液的体积与发酵罐的容积比为1:3，发酵温度为35℃；搅拌频率为：在时间段为0~5h时，搅拌速率为450r/min；在时间段为6~12h时，搅拌速率为250r/min；在时间段为12-24h时：搅拌速率为150r/min；发酵罐中发酵液的ph每降低“0.5”，分别流加碳源、氮源和矿物质；ph每降低“1”流加氨水将发酵液的ph调至6.0；
步骤四、发酵结束后，离心获得湿微生物菌体，用轻质碳酸钙，按照湿微生物菌体和轻质碳酸钙按照质量比为1:1混合均匀，然后在温度为75℃的条件下烘干至水分为10%，即得到有机铁制剂。
进一步的，步骤一中耐铁乳酸菌（lb022）是以高产酸乳酸菌为出发菌株，经紫外线诱导后获得的可耐受≥2000mg/l铁水平的乳酸菌突变株；耐铁粪肠球菌（e2）是从铁矿山筛选的野菌株，并经铁浓度梯度驯化后获得的可耐受≥2500mg/l铁水平的菌株。
进一步的，步骤一中液体培养基包括以下质量份数的各组分：葡萄糖0.54g、可溶性淀粉4.5g、蛋白胨0.2g、豆粕粉0.8g、磷酸二氢钾0.11g、氯化钠0.15g，去离子水93.7g。
进一步的，步骤一中种子液中的乳酸菌不低于1.5×108cfu/ml，粪肠球菌不低于0.75×108cfu/ml。
进一步的，步骤二中的铁发酵培养基的制备方法为：取葡萄糖12.5g、次粉187.5g、尿素12.5g、豆粕粉37.5g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠2.5g，用1000ml板框收集的酒精工业黄水浓缩液（用前10倍稀释）混合，然后取硫酸铁一定量，用酒精工业黄水浓缩液（用前10倍稀释）定量至2500ml，使铁浓度达到800mg/l，调ph至6.5。
进一步的，步骤三中的碳源为葡萄糖和次粉；氮源为尿素和豆粕粉；矿物盐类为磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铁。
取0.5g有机铁添加剂，用湿法消化法消解，获得消解液，用电感耦合等离子体光谱仪测定铁含量，计算每单位干菌体铁富集量。另取0.5g有机铁添加剂，加5ml去离子水，混匀后，用超声波破碎仪破碎细胞，4500r/min离心，获得上清液，用铁离子选择电极法测定游离态铁，用上述测定的总铁减去游离态铁，即为有机铁，用有机铁除以总铁，即获得铁有机化率指标。
实施例3
一种有机铁制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将耐铁乳酸菌（lb022）和粪肠球菌（e2）分别接种于液体培养基中，调ph至6.5，培养18h，获得种子液；
步骤二、将耐铁乳酸菌和粪肠球菌按体积比为1:3混合均匀，按照种子液与铁发酵培养基的体积比为0.1：1，将混合后的种子液接种于铁发酵培养基中，得到发酵液；
步骤三、将发酵液装入10l的发酵罐中，发酵液的体积与发酵罐的容积比为1:3，发酵温度为35℃；搅拌频率为：在时间段为0~5h时，搅拌速率为450r/min；在时间段为6~12h时，搅拌速率为250r/min；在时间段为12-24h时：搅拌速率为150r/min；发酵罐中发酵液的ph每降低“0.5”，分别流加碳源、氮源和矿物质；ph每降低“1”流加氨水将发酵液的ph调至6.5；
步骤四、发酵结束后，离心获得湿微生物菌体，用轻质碳酸钙，按照湿微生物菌体和轻质碳酸钙按照质量比为1:1混合均匀，然后在温度为75℃的条件下烘干至水分为10%，即得到有机铁制剂。
进一步的，步骤一中耐铁乳酸菌（lb022）是以高产酸乳酸菌为出发菌株，经紫外线诱导后获得的可耐受≥2000mg/l铁水平的乳酸菌突变株；耐铁粪肠球菌（e2）是从铁矿山筛选的野菌株，并经铁浓度梯度驯化后获得的可耐受≥2500mg/l铁水平的菌株。
进一步的，步骤一中液体培养基包括以下质量份数的各组分：葡萄糖0.54g、可溶性淀粉4.5g、蛋白胨0.2g、豆粕粉0.8g、磷酸二氢钾0.11g、氯化钠0.15g，去离子水93.7g。
进一步的，步骤一中种子液中的乳酸菌不低于1.5×108cfu/ml，粪肠球菌不低于0.75×108cfu/ml。
进一步的，步骤二中的铁发酵培养基的制备方法为：取葡萄糖12.5g、次粉187.5g、尿素12.5g、豆粕粉37.5g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠2.5g，用1000ml板框收集的酒精工业黄水浓缩液（用前10倍稀释）混合，然后取硫酸铁一定量，用酒精工业黄水浓缩液（用前10倍稀释）定量至2500ml，使铁浓度达到800mg/l，调ph至6.5。
进一步的，步骤三中的碳源为葡萄糖和次粉；氮源为尿素和豆粕粉；矿物盐类为磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铁。
取0.5g有机铁添加剂，用湿法消化法消解，获得消解液，用电感耦合等离子体光谱仪测定铁含量，计算每单位添加剂铁富集量。另取0.5g有机铁添加剂，加5ml去离子水，混匀后，用超声波破碎仪破碎细胞，4500r/min离心，获得上清液，用铁离子选择电极法测定游离态铁，用上述测定的总铁减去游离态铁，即为有机铁，用有机铁除以总铁，即获得铁有机化率指标。
实施例4
一种有机铁制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将耐铁乳酸菌（lb022）和粪肠球菌（e2）分别接种于液体培养基中，调ph至6.2，培养18h，获得种子液；
步骤二、将耐铁乳酸菌和粪肠球菌按体积比为1:3混合均匀，按照种子液与铁发酵培养基的体积比为0.1：1，将混合后的种子液接种于铁发酵培养基中，得到发酵液；
步骤三、将发酵液装入10l的发酵罐中，发酵液的体积与发酵罐的容积比为1:3，发酵温度为35℃；搅拌频率为：在时间段为0~5h时，搅拌速率为450r/min；在时间段为6~12h时，搅拌速率为250r/min；在时间段为12-24h时：搅拌速率为150r/min；发酵罐中发酵液的ph每降低“0.5”，分别流加碳源、氮源和矿物质；ph每降低“1”流加氨水将发酵液的ph调至6.2；
步骤四、发酵结束后，离心获得湿微生物菌体，用轻质碳酸钙，按照湿微生物菌体和轻质碳酸钙按照质量比为1:1混合均匀，然后在温度为75℃的条件下烘干至水分为10%，即得到有机铁制剂。
进一步的，步骤一中耐铁乳酸菌（lb022）是以高产酸乳酸菌为出发菌株，经紫外线诱导后获得的可耐受≥2000mg/l铁水平的乳酸菌突变株；耐铁粪肠球菌（e2）是从铁矿山筛选的野菌株，并经铁浓度梯度驯化后获得的可耐受≥2500mg/l铁水平的菌株。
进一步的，步骤一中液体培养基包括以下质量份数的各组分：葡萄糖0.54g、可溶性淀粉4.5g、蛋白胨0.2g、豆粕粉0.8g、磷酸二氢钾0.11g、氯化钠0.15g，去离子水93.7g。
进一步的，步骤一中种子液中的乳酸菌不低于1.5×108cfu/ml，粪肠球菌不低于0.75×108cfu/ml。
进一步的，步骤二中的铁发酵培养基的制备方法为：取葡萄糖12.5g、次粉187.5g、尿素12.5g、豆粕粉37.5g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠2.5g，用1000ml板框收集的酒精工业黄水浓缩液（用前10倍稀释）混合，然后取硫酸铁一定量，用酒精工业黄水浓缩液（用前10倍稀释）定量至2500ml，使铁浓度达到800mg/l，调ph至6.2。
进一步的，步骤三中的碳源为葡萄糖和次粉；氮源为尿素和豆粕粉；矿物盐类为磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铁。
取0.5g有机铁添加剂，用湿法消化法消解，获得消解液，用电感耦合等离子体光谱仪测定铁含量，计算每单位干菌体铁富集量。另取0.5g有机铁添加剂，加5ml去离子水，混匀后，用超声波破碎仪破碎细胞，4500r/min离心，获得上清液，用铁离子选择电极法测定游离态铁，用上述测定的总铁减去游离态铁，即为有机铁，用有机铁除以总铁，即获得铁有机化率指标。
本发明选用经过耐铁驯化后的菌种乳酸菌（lb022）和粪肠球菌（e2），通过建立复配关系，然后接种于一定铁浓度的发酵培养基中，利用实时在线监测培养基成分变化，结合营养素流加技术和分段控速发酵技术，从而制备一种生物产量大、铁富集量高及有机化高的有机铁制剂。本发明专利提供的产品，纯度高，铁含量达27.13%，其中有机铁含量超过78.61%，可用于仔猪、繁殖母猪、肉仔鸡、产蛋鸡等的铁补充剂，在添加比例为nrc标准（1994）的60%~80%时，其应用效果优于一水硫酸亚铁按照nrc标准（1994）100%添加量的效果，该产品容易实现工业化生产和产品标准规范。
本专利旨在利用已经过耐铁强化的乳酸菌（lb022）和粪肠球菌（e2）联合富铁，生产一种有机铁制剂，并采用生物量、铁富集量、富集率和有机化率几个指标来反映产品的生产效率。本发明采用高耐性微生物对无机铁进行富集，并转化为有机态铁，该技术生产效率高，在24h培养时间后，每升培养液可产微生物菌体33.7克，每克添加剂铁富集量271.3毫克，铁有机化率达78.61%。从现有国内外文献报道来看，采用微生物技术生产相应微量元素制剂，均未突破在较高微量元素浓度下获得较高的微生物生物量和微量元素富集量，其微量元素富集量普遍低于10000mg/kg。与现有文献报道相比，采用本发明生产的微生物有机铁添加剂，铁富集量提高了27.13倍。且，现有文献中并未确定微生物富集的微量元素就是有机态的，本发明通过检测发现，本发明提供的有机铁其有机化率高达78.61%。而有机化是提高微量元素利用率的关键所在。
此外，由本发明制备的有机铁制剂在仔猪、繁殖母猪、肉仔鸡、产蛋鸡日粮中应用时，其添加量仅为nrc（1994）标准规定需要量的60%，且使用效果优于一水硫酸亚铁按照nrc（1994）标准的添加效果。
本发明所列举的技术方案和实施方式并非是限制，与本发明所列举的技术方案和实施方式等同或者效果相同方案都在本发明所保护的范围内。还需要说明的是，在本文中的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。