本发明涉及发酵肉制品制备
技术领域：
，提供一种菌酶协同发酵制备酸肉的方法。
背景技术：
：酸肉是我国的传统发酵肉制品，加工过程中发生了复杂的物理、化学反应，再加上微生物的作用，最终赋予了产品独特的风味和营养价值。发酵过程中，内源酶和微生物酶的作用促使肌浆蛋白、肌原纤维蛋白发生降解，进而产生多肽、小肽和游离氨基酸。据报道，从酸肉中分离的肽具有抗氧化、辅助降血脂等功能；同时发酵还促进了大量游离氨基酸的产生，例如谷氨酸、丙氨酸等具有鲜味、甜味的氨基酸，异亮氨酸、亮氨酸等必需氨基酸，从而提高了酸肉的风味和营养品质。随着我国人民生活水平的提高，市场迫切需要一些风味独特且具有一定保健作用的肉制品，发酵酸肉可以满足这种消费需求。发酵剂对于控制发酵肉制品的生产周期、安全性、口感和质量稳定性起着关键作用。其中乳酸菌作为发酵剂，可在发酵过程中产生大量有机酸、细菌素等物质，有利于抑制腐败微生物、致病微生物的生长繁殖，保证酸肉的食用安全性。然而，由于乳酸菌产酸降低ph值，同时还可代谢产生细菌素等抑菌物质，除了抑制有害微生物，还会抑制其它产蛋白酶的有益微生物生长代谢。因此，与不添加发酵剂的自然发酵酸肉相比，单一乳酸菌发酵制备的酸肉虽然保证了食用安全性，但会导致肌肉蛋白降解程度较低，产品风味和营养品质有所下降。添加外源蛋白酶，可以有效降解肌肉蛋白，提高酸肉的风味和营养品质。然而，过量添加蛋白酶可能产生苦味肽，影响产品适口性；同时肌肉蛋白的过度降解产生的游离氨基酸，会中和有机酸提高ph值，不利于有害微生物的抑制。利用来源于自然发酵酸肉的乳酸菌作为发酵剂，通过乳酸菌与合适的蛋白酶协同作用，有利于提高酸肉的食用安全性、风味和营养品质。同时，由于发酵剂微生物本身来源于自然发酵的传统酸肉，而酶制剂为纯天然的生物蛋白质，在食品加工处理后就会失活，对于人体更为安全、无毒害作用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种发酵周期短、所制得酸肉食用安全、游离氨基酸含量高、风味良好的菌酶协同发酵制备酸肉的方法。本发明首先提供一种菌酶复合发酵剂，其含有植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)和蛋白酶，所述植物乳杆菌的保藏编号为cgmccno.9741。该菌株已于申请号为cn201410835061.x的专利申请中公开，该菌应用于制作风干肠，能够耐受高盐环境，促进亚硝酸盐的分解，改善产品感官品质，通过降低产品ph值对致病菌和腐败菌产生抑制作用，提升风干肠的食用安全性。所述蛋白酶为食品级酸性蛋白酶。本发明所述的食品级酸性蛋白酶的ph范围2.5-6.0，最适ph范围2.5-4.0，可市售获得。本发明所述菌酶复合发酵剂中含有植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)109-1011cfu/g，含蛋白酶30000-50000u/g。本发明进一步提供了一种菌酶协同发酵制备酸肉的方法，包括以下步骤：(1)将本发明所述的菌酶复合发酵剂加入已加添加剂的原料肉中混匀；或将保藏编号为cgmccno.9741的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)菌剂和蛋白酶分别加入原料肉中混匀；(2)进行发酵。所述加有添加剂的原料肉含有：食盐2％-6％；葡萄糖0.5％-2％，米粉4％-10％；优选含有4％食盐，1％葡萄糖，8％米粉，所述％为添加料与原料肉的质量百分比。本发明提供的上述方法步骤(1)中，按照每1000g原料肉添加2-10g的菌酶复合发酵剂进行添加。本发明提供的上述方法步骤(1)中，还可通过将保藏编号为cgmccno.9741的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)菌剂按照106-108cfu/g原料肉进行添加，蛋白酶添加量为300-500u/g原料肉。本发明的菌酶协同发酵制备酸肉的方法中，所述发酵条件为15-30℃发酵5-20天。优选发酵条件为25℃，15天。本发明的菌酶协同发酵制备酸肉的方法制得的酸肉属于本发明的保护范围。本发明提供了所述的菌酶复合发酵剂在发酵制备肉制品中的应用。本发明的有益效果在于，本发明利用一株具有优良发酵特性的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cgmccno.9741，将该菌株制备为菌粉后添加适量酸性蛋白酶干粉制成菌酶复合发酵剂，应用该发酵剂来生产酸肉制品，发酵周期仅为5-20天，与自然发酵周期30-60天相比大大缩短，并可获得ph值达4.5-5.0的酸肉，有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌等有害菌的生长；同时提高了游离氨基酸含量，增加了产品的营养价值、口感和风味，同时本发明提供的菌酶协同发酵制备酸肉的方法中原料及添加剂中均不含亚硝酸盐，也不含可能产生大量亚硝酸盐的前体物质，保证了食用安全性，具有良好的应用前景。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。肉类游离氨基酸含量计算参照李平兰，沈清武，等.微生物酶与肉组织酶对干发酵香肠中游离氨基酸的影响[j].食品与发酵工业，2005，31(5)：134-138.中所提供的方法。大肠埃希氏菌检测参照gb4789.38-2012。金黄色葡萄球菌检测参照gb4789.10-2016。沙门氏菌检测参照gb4789.4-2016。单核细胞增生李斯特菌检测参照gb4789.30-2016。mrs肉汤培养基的组成成分为(1l)：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.1g，醋酸钠5.0g，柠檬酸铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g。本申请以下实施例的实验均重复进行5次取平均值，且各次实验结果之间差异不显著，p>0.05。商品化的风味蛋白酶(货号ff-104)购自安琪酵母股份有限公司，最适ph范围5.0-7.0。商品化的酸性蛋白酶(货号ap-10)购自安琪酵母股份有限公司，ph范围2.5-6.0，最适ph范围2.5-4.0。商品化的复合蛋白酶(货号mf-103)购自安琪酵母股份有限公司，作用ph为5.0-9.0，最适ph范围6.0-7.0。商品化的中性蛋白酶(货号z8030)购自北京索莱宝科技有限公司，最适ph范围7.0左右。实施例1菌酶协同发酵菌株的选择以清酒乳杆菌l1、植物乳杆菌l2、戊糖乳杆菌l3和乳酸片球菌l4作为候选菌株。其中，清酒乳杆菌l1(cgmccno.9742)于申请号201410822500.3的专利申请中公开；植物乳杆菌l2(cgmccno.9741)已于申请号为201410835061.x的专利申请中公开；戊糖乳杆菌l3(cgmccno.2313)公开于cn101531973a中；乳酸片球菌l4(cgmccno.2312)公开于cn101289647a中；植物乳杆菌l5购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，原始保藏编号cicc22217；植物乳杆菌l6购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，原始保藏编号cicc6240。中国工业微生物菌种保藏管理中心地址为：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼。1、菌粉的制备：将不同乳酸菌按照1％的接种量接种到mrs肉汤培养基，37℃活化24h，按照同样的方式活化2-3代，继续于mrs培养基中培养，得到乳酸菌菌液；新鲜菌液经4℃、5000rpm、离心15min后，与等质量的冻干保护剂(每100ml质量浓度为10％的脱脂乳中添加有2g甘油，3g蔗糖。)混合，-20℃预冻2h后，置于真空冷冻干燥机中，进行真空干燥(冷阱温度-45℃，真空度10～20pa)22～24h，菌粉含水量降至2.5～3％时停止干燥，即得到干粉形式的菌剂，菌剂中活菌含量为1011cfu/g。2、发酵菌株的筛选：将猪五花肉切块后，将食盐、葡萄糖、菌粉按(食盐的加入量占原料肉总质量的4％、葡萄糖的加入量占原料肉总质量的1％、米粉的加入量占原料肉总质量的8％，菌粉用无菌水溶解后加入，接种量为106cfu/g原料肉)配比混合均匀后置于经无菌处理的发酵瓶中，封口置于25℃发酵15天。结束后测定样品中乳酸菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌的活菌数量，并测定ph值。3、最优菌种的筛选：不同菌株发酵后，如表1所示，戊糖乳杆菌l3发酵的样品ph值稍高，其它样品ph值差别不大；各样品的乳酸菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌数量差别不大；在抑制大肠埃希氏菌生长方面，植物乳杆菌l2和乳酸片球菌l4优于清酒乳杆菌等其他4株菌；在抑制金黄色葡萄球菌生长方面，植物乳杆菌l2优于乳酸片球菌l4，因此选择植物乳杆菌l2(cgmccno.9741)作为发酵菌株。表1不同菌株对ph和微生物的影响发明人在实验中发现，保藏编号cgmccno.9741的植物乳杆菌l2虽然发酵能力强，能够保证安全改善风味，但由于抑制了其它微生物生长代谢(包括自然发酵过程中有益微生物，例如产蛋白酶微生物)，因此利用该菌作为单一发酵剂的酸肉产品在蛋白源风味物质形成、游离氨基酸产生方面，反而不如自然发酵酸肉。因此进行以下实验，以期寻找与植物乳杆菌l2组配后发酵酸肉效果最好的蛋白酶。实施例2菌酶协同发酵蛋白酶的选择将猪五花肉、食盐、葡萄糖、米粉、蛋白酶按(食盐的加入量占原料肉总质量的4％，葡萄糖的加入量占原料肉总质量的1％，米粉的加入量占原料肉总质量的8％，蛋白酶加入量为300u/g原料肉)的配比混合均匀后置于经无菌处理的发酵瓶中，封口置于25℃培养箱中发酵15天。如表2所示，比较不同蛋白酶酶解后游离氨基酸总含量，发现由酸性蛋白酶降解后，必需氨基酸和游离氨基酸总含量最高(p＜0.05)，显示其在添加乳酸菌发酵剂条件下优异的酶解能力，所以选择酸性蛋白酶。表2不同蛋白酶对游离氨基酸含量的影响单位：mg/100g试验项目风味蛋白酶酸性蛋白酶复合蛋白酶中性蛋白酶必需氨基酸699.5818.2580.5595.2非必需氨基酸440.8502420.8420.4游离氨基酸总和1140.31320.21001.31015.6实施例3不同接种量下的菌酶协同发酵工艺控制食盐、葡萄糖、米粉、蛋白酶添加量(食盐的加入量占原料肉总质量的4％、葡萄糖的加入量占原料肉总质量的1％、米粉的加入量占原料肉总质量的8％、酸性蛋白酶加入量为300u/g原料肉)、植物乳杆菌l2(cgmccno.9741)菌粉用无菌水溶解后加入，接种量分别为106、107、108、109cfu/g原料肉。混合均匀后置于经无菌处理的发酵瓶中，封口置于25℃发酵15天。如表3所示，比较不同接种量酸肉的必需氨基酸和游离氨基酸总含量，发现接种量超过106cfu/g的情况下，总游离氨基酸含量均超过1200mg/100g酸肉，ph值达4.5-5.0。表3不同接种量对游离氨基酸含量的影响单位：mg/100g试验项目106cfu/g107cfu/g108cfu/g109cfu/g必需氨基酸805.5800.2780.5755.2非必需氨基酸519.6500.5509.8500.4游离氨基酸总和1325.11300.71290.31255.6实施例4不同蛋白酶添加量下的菌酶协同发酵工艺控制食盐、葡萄糖、米粉、菌粉添加量(食盐的加入量占原料肉总质量的4％、葡萄糖的加入量占原料肉总质量的1％、米粉的加入量占原料肉总质量的8％、植物乳杆菌l2(cgmccno.9741)菌粉用无菌水溶解后加入，接种量为106cfu/g原料肉)，分别添加酸性蛋白酶0、300、500、1000u/g原料肉。混合均匀后置于经无菌处理的发酵瓶中，封口置于25℃发酵15天。结果如表4所示。表4不同蛋白酶添加量对游离氨基酸含量的影响单位：mg/100g试验项目0300u/g500u/g1000u/g必需氨基酸155.6805.5855.6872.5非必需氨基酸139.0519.6477.2534.5游离氨基酸总和294.61325.11332.81407实施例5不同发酵温度下的菌酶协同发酵工艺控制食盐、葡萄糖、米粉、菌粉、蛋白酶的添加量(食盐的加入量占原料肉总质量的4％、葡萄糖的加入量占原料肉总质量的1％、米粉的加入量占原料肉总质量的8％、植物乳杆菌l2(cgmccno.9741)菌粉用无菌水溶解后加入，接种量为106cfu/g原料肉，酸性蛋白酶添加量为300u/g原料肉)，混合均匀后置于经无菌处理的发酵瓶中，封口后分别置于15、20、25、30℃发酵15天。结果如表5所示，25℃发酵时总游离氨基酸含量可达1325.1mg/100g酸肉，ph值达4.5-5.0。表5不同发酵温度对游离氨基酸含量的影响单位：mg/100g试验项目15℃20℃25℃30℃必需氨基酸550.6660.8805.5780.6非必需氨基酸447.9466.0519.6459.6游离氨基酸总和998.51126.81325.11240.2实施例6不同发酵时间下的菌酶协同发酵工艺控制食盐、葡萄糖、米粉、菌粉、蛋白酶的添加量(食盐的加入量占原料肉总质量的4％、葡萄糖的加入量占原料肉总质量的1％、米粉的加入量占原料肉总质量的8％、植物乳杆菌l2(cgmccno.9741)菌粉用无菌水溶解后加入，接种量为106cfu/g原料肉，酸性蛋白酶添加量为300u/g原料肉)，混合均匀后置于经无菌处理的发酵瓶中，封口后置于25℃发酵0、10、15、20天。结果如表6所示，15天后总游离氨基酸含量即可超过1000mg/100g酸肉，ph值达4.5-5.0。表6不同发酵时间对游离氨基酸含量的影响单位：mg/100g试验项目0天10天15天20天必需氨基酸75.9352.6805.5801.5非必需氨基酸72.8528.9519.6501.1游离氨基酸总和148.7881.51325.11302.6实施例7不同菌株与酸性蛋白酶复合发酵工艺以清酒乳杆菌l1、植物乳杆菌l2、戊糖乳杆菌l3和乳酸片球菌l4作为候选菌株。其中，清酒乳杆菌l1(cgmccno.9742)于申请号201410822500.3的专利申请中公开；植物乳杆菌l2(cgmccno.9741)已于申请号为201410835061.x的专利申请中公开；戊糖乳杆菌l3(cgmccno.2313)公开于cn101531973a中；乳酸片球菌l4(cgmccno.2312)公开于cn101289647a中；植物乳杆菌l5购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，原始保藏编号cicc22217；植物乳杆菌l6购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，原始保藏编号cicc6240。中国工业微生物菌种保藏管理中心地址为：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼。将猪五花肉、食盐、葡萄糖、米粉、酸性蛋白酶、菌粉按(食盐的加入量占原料肉总质量的4％，葡萄糖的加入量占原料肉总质量的1％，米粉的加入量占原料肉总质量的8％，蛋白酶加入量为300u/g原料肉，菌粉用无菌水溶解后加入，接种量为106cfu/g原料肉)的配比混合均匀后置于经无菌处理的发酵瓶中，封口置于25℃培养箱中发酵15天。如表7所示，比较不同菌株与酸性蛋白酶复合发酵后游离氨基酸总含量，发现添加植物乳杆菌l2发酵样品的必需氨基酸和游离氨基酸总含量最高(p＜0.05)，显示其在添加植物乳杆菌l2和酸性蛋白酶条件下优异的酶解能力。表7不同菌株与酸性蛋白酶复合发酵对游离氨基酸含量的影响单位：mg/100g虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12