一种酸性大豆多肽饮料及益生菌制剂的联合制备方法与流程

1.本发明涉及酸性大豆多肽饮料及益生菌制剂的联合制备工艺技术领域，具体是指一种色泽透亮、口感层次丰富、无苦味、抗氧化活性显著的酸性大豆多肽饮料及一种高活菌数的益生菌冻干制剂的联合制备工艺。


背景技术：

2.豆粕是大豆提取油脂后得到的副产品，根据其加工方式不同，通常可分为高温豆粕和低温豆粕。高温豆粕又称为高变性豆粕，主要用于饲料行业。低温豆粕又称为低变性豆粕，它最大限度地降低了豆粕蛋白质的变性程度，可用于食品加工或作为大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白等的主要原料。豆粕中含有40～50％的蛋白质、10～15％的低聚糖、20～25％的多糖和纤维素，且其蛋白质中80％以上都是水溶性蛋白，是一种优质的植物蛋白质资源。近年来，我国豆粕产量呈逐年上升的趋势，但绝大部分应用于畜禽饲料，附加值较低，资源浪费严重。因此，实现豆粕的高附加值综合利用具有重要的经济价值和社会效益。
3.大豆多肽是大豆蛋白的水解产物，其平均肽链长度为2～10个氨基酸残基，分子量范围通常在3000da以下。与大豆蛋白相比，大豆多肽的溶解性、乳化性、起泡性和稳定性等理化特性均有所改善，同时还具有多种生理功能活性，包括抗氧化、抗衰老、抗疲劳、降血压、抗肿瘤、免疫调节等，极具开发和研究价值。但大分子蛋白质被水解成分子量较低的多肽时，被包裹在蛋白质结构内部的疏水性氨基酸残基随之暴露出来，使得多肽往往带有一定的苦味，限制了其在食品工业中的应用和发展，如何实现大豆多肽的高效脱苦及风味改善是工业生产中亟待解决的技术难点之一。目前针对这一难题主要采取包埋法掩盖苦味，以及应用自制专用蛋白酶制剂或微生物发酵法通过改变酶切位点来脱去苦味。不过，这些方法虽然能够比较好地解决产品的风味问题，但同时也带来了多肽生产成本的提升和资源的浪费，影响了产品的经济效益。
4.近年来，益生菌因其对肠道微生态以及对人和动物免疫、神经等多种生理功能的影响而备受关注。益生菌是指能够耐受胃肠道消化液、活着到达并粘附定殖在肠道上皮细胞的微生物，如干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等乳酸菌，以及凝结芽孢杆菌等。它们在肠道内生长繁殖，产生乳酸、细菌素、短链脂肪酸等代谢产物，抑制有害菌，促进宿主健康。因此，越来越多的消费者开始选择益生菌及其发酵食品。而在研究方面，不断有新的益生菌或新的益生菌功能被发现或发掘。不过，无论是益生菌制剂还是发酵食品，首先都必需要获得活菌制剂，这些活菌制剂一方面需要高密度培养，另一方面需要在干燥过程中保持活性，以提高生产效率。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术中存在的缺点和不足，本发明提供一种既实现了豆粕的高附加值和高效化利用，又获得了高活性益生菌制剂，极大地提高了生产效率的酸性大豆多肽饮料及益生菌制剂的联合制备方法。
3％～8％，于30～42℃恒温培养箱中培养12～24h，重复活化2～3次，待用。
21.优选地，步骤3)中，所述的发酵剂的接种量为豆粕酶解液体积的3％～8％；所述的离心条件为：温度4～8℃、转速5000～10000rpm、时间5～20min。
22.优选地，步骤4)中，所述的鲜榨葡萄汁的制备方法为：将新鲜葡萄洗净后，于搅拌机中带皮破碎15～30s，用50～200目纱布过滤，所得滤液为鲜榨葡萄汁。
23.优选地，步骤4)中，所述nahco3溶液和/或鲜榨葡萄汁的添加量为酸性大豆多肽饮料体积的10～100％。
24.优选地，步骤5)中，所述的灭菌的温度为100～121℃，时间为10～20min；所述的益生菌沉淀和脱脂奶粉溶液的体积比为1:1～1:2。
25.本发明与现有的技术和方法相比，具有如下优点：
26.1)本发明采用碱性蛋白酶酶解法和乳酸菌发酵法相结合，所得的酸性大豆多肽饮料无苦味且抗氧化活性显著，具有良好的市场应用价值。
27.2)本发明生产得到的益生菌冻干制剂具有较高的活菌数，活菌数达到109cfu/g以上，可作为口服益生菌制剂用于肠道菌群的调节或作为酸豆奶、酸牛奶等发酵产品的发酵剂。
28.3)本发明以低温豆粕为原料，提供了一种酸性大豆多肽饮料和益生菌冻干制剂的联合制备方法，工艺简便、设计巧妙，实现了豆粕的高附加值和高效化利用。
附图说明
29.图1为豆粕溶液和实施例1～4中酸性大豆多肽饮料的sds
‑
page图谱。
具体实施方式
30.为了能够清楚直观地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
31.本发明中，发酵剂干酪乳杆菌1号(lactobacillus casei)的菌种保藏号为gdmccno.60137，保存单位：广东省微生物菌种保藏中心，地点：广州市先烈中路100号大院59 号楼5楼，邮编510075；保存时间为2016年12月27日。
32.植物乳杆菌2号(lactobacillus plantarum)的菌种保藏号为gdmcc no.60360，保存单位：广东省微生物菌种保藏中心，地点：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编 510075；保存时间为2018年5月4日。
33.下面实施例中，酸性大豆多肽饮料的ph值采用雷磁phs
‑
3e型ph计直接测定。
34.下面实施例中，酸性大豆多肽饮料的酸度参照gb 5009.239
‑
2016所述方法进行测定。具体操作为：精确称取样品10g，置于100ml烧杯中，加入20ml无二氧化碳的蒸馏水，混匀后，加入1.0ml酚酞指示液，用0.05mol/l的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色，且30s内不消退为滴定终点，样品的酸度值按照以下公式计算：
35.x＝(c
×
v
×
100)/(m
×
0.1)
36.x—样品的酸度，单位为
°
t；
37.c—氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为mol/l；
38.v—消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为ml；
39.m—样品的质量，单位为g。
40.下面实施例中，酸性大豆多肽饮料的蛋白质浓度用双缩脲法进行测定。具体操作为： (1)标准曲线的绘制：用酪蛋白配制成10mg/ml的标准蛋白质溶液，分别取0、0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0ml的标准蛋白质溶液，用水补足至1ml，加入4ml双缩脲试剂，充分混匀后，室温下放置30min，于540nm测定其吸光度值。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得到酪蛋白标准曲线方程为y＝0.0476x+0.0067，r2＝0.9993(y为吸光度值，x为酪蛋白浓度)。(2)样品蛋白质浓度的测定：样品经适当稀释后，取1ml稀释液，加入4ml 双缩脲试剂，室温静置30min，于540nm处测定其吸光度值，根据标准曲线计算样品的蛋白质浓度。
41.下面实施例中，酸性大豆多肽饮料抗氧化活性的测定参照文献changes in bioactivecompounds and their relationship to antioxidant activity in white sufu during manufacturing中所述方法并进行适当修改。具体方法如下。(1)dpph自由基清除能力的测定：2ml样液与2ml 0.2mmol/l dpph
‑
乙醇溶液充分混匀后，黑暗条件下反应30min，于波长517nm处测定其吸光度值。以生育酚(trolox)作为标准物质，酸性大豆多肽饮料的dpph自由基清除能力表示为μmol trolox/ml样品，其中，trolox标准曲线方程为y＝1.0622x
‑
1.2159，r2＝0.9991 (y为吸光度值，x为trolox浓度)。(2)abts自由基清除能力的测定：配制含有7mmol/l abts 溶液和2.45mmol/l过硫酸钾溶液的abts
·
+
溶液，使用前在黑暗环境中放置12～16h，使用时用无水乙醇稀释abts
·
+
溶液，使其在734nm处的吸光度值为0.70
±
0.02。取30μl 样液，加入3ml上述稀释后的abts
·
+
溶液，室温反应6min，于734nm处测定其吸光度值。以trolox作为标准物质，酸性大豆多肽饮料的abts自由基清除能力表示为mmoltrolox/ml样品，其中，trolox标准曲线方程为y＝
‑
0.2752x+0.663，r2＝0.9993(y为吸光度值，x为trolox浓度)。(3)铁离子还原能力(ferric ion reducing antioxidant power,frap)的测定：用40mmol/l hcl溶液配制10mmol/l tptz溶液，再以1:1:10(v/v)的比例依次加入上述tptz溶液、20mmol/l fecl3溶液和0.3mol/l ph 3.6的乙酸盐缓冲液，充分混匀后即为frap工作液。取100μl样液，加入3ml frap工作液，37℃反应10min后，于592nm 处测定其吸光度值。以trolox作为标准物质，酸性大豆多肽饮料的铁离子还原能力表示为 mmol trolox/ml样品，其中，trolox标准曲线方程为y＝1.47x
‑
0.0012，r2＝0.9994(y为吸光度值，x为trolox浓度)。
42.下面实施例中，发酵剂的制备按照下述方法进行：取100ml三角瓶2只，各加入50ml 豆粕酶解液，于121℃灭菌10min，冷却至室温后，按5％(v/v)的比例分别接种植物乳杆菌和干酪乳杆菌，37℃恒温培养箱中发酵12～24h，连续活化2～3次后，作为种子液备用。
43.下面实施例中，样品中乳酸菌总数的测定参照gb 4789.2
‑
2016中所述方法进行测定。具体操作为：样品经10倍递增稀释后，选取2～3个适宜稀释度的样品匀液，吸取1ml样品匀液置于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，将15～20ml冷却至46℃的mrs 琼脂培养基倾注入平皿内，转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，于37℃厌氧培养48h。选取菌落数在30～300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
44.下面实施例中，酸性大豆多肽饮料的感官评价参照gb 7171
‑
2015中所述方法并进行适当修改。按9分制进行打分，1分最差，9分最好。按照气味、外观、滋味和总体可接受性 4项，邀请8位品评员进行打分，并对产品的气味、色泽、滋味进行描述分析。
45.表1为酸性大豆多肽饮料的感官评价表。
[0046][0047]
实施例1(对比实施例)
[0048]
(1)取低温脱溶豆粕(山东新嘉华集团有限公司)20g，加入200ml蒸馏水，沸水浴加热15min后，自然冷却至室温。调节溶液ph值至8.0，用100目的纱布过滤并收集滤液，向滤液中加入1500u/g蛋白质的碱性蛋白酶(诺维信生物技术有限公司，食品级alcalase 2.4 l碱性蛋白酶)，磁力搅拌下于55℃水浴中酶解5h。酶解结束后，加入3wt％的蔗糖，于 100℃灭菌灭酶15min。
[0049]
(2)理化分析及感官评价结果表明：豆粕酶解液的ph为6.86，酸度值为23.58
°
，蛋白质浓度为22.38mg/ml，感官评价的总体可接受性评分为5.83分，其中气味评分为6.38分，外观评分为8.03分，滋味评分为5.40分。
②
其dpph自由基清除能力为263.02μmoltrolox/ml，abts自由基清除能力为0.93mmol trolox/ml，铁离子还原能力为0.79mmoltrolox/ml。
[0050]
实施例2
[0051]
一种酸性大豆多肽饮料及益生菌制剂的联合制备方法，包括如下步骤：
[0052]
(1)取低温脱溶豆粕(山东新嘉华集团有限公司)20g，加入200ml蒸馏水，沸水浴加热15min后，自然冷却至室温。调节溶液ph值至8.0，用100目的纱布过滤并收集滤液，向滤液中加入1500u/g蛋白质的碱性蛋白酶(诺维信生物技术有限公司，食品级alcalase 2.4 l碱性蛋白酶)，磁力搅拌下于55℃水浴中酶解5h。酶解结束后，加入3wt％的蔗糖，于 100℃灭菌灭酶15min，得豆粕酶解液。
[0053]
(2)按5％(v/v)的比例向上述豆粕酶解液中接种植物乳杆菌2号种子液(lactobacillusplantarum no2，菌种保藏号为gdmcc no.60360)，充分混匀后，置于37℃恒温培养箱中发酵10h。发酵结束后，于8000r/min的条件下离心10min，所得上清液即为酸性大豆多肽饮料，所得沉淀保存于4℃冰箱中。
[0054]
(3)进一步理化分析及感官评价结果表明：
①
酸性大豆多肽饮料的ph值为4.01，酸
度值为125.73
°
，蛋白质浓度为21.22mg/ml，感官评价的总体可接受性评分为5.93分，其中气味评分为7.25分，外观评分为8.63分，滋味评分为5.53分。
②
大豆多肽的分子量分布主要集中在1000da以下，占73.3％，其次是1000
‑
2000da，占14.5％，2000
‑
5000da占9.4％，5000
‑
10 000da仅占2.8％(见表2)。
③
酸性大豆多肽饮料的dpph自由基清除能力为344.24 μmol trolox/ml，abts自由基清除能力为1.14mmol trolox/ml，铁离子还原能力为0.72 mmol trolox/ml。
[0055]
(4)以千克和升作为质量和体积单位计，配制质量体积比为12％的脱脂乳粉溶液，于 100℃灭菌20min，冷却至室温；向步骤(2)所得沉淀中添加冷却后的脱脂乳粉溶液，混合均匀后，真空冷冻干燥即为干酪乳杆菌冻干制剂(益生菌冻干制剂)，经测试，该制剂的活菌数为1.38
×
109cfu/g。
[0056]
表2为本实施例所得酸性大豆多肽饮料的分子量分布情况表。
[0057][0058]
实施例3
[0059]
一种酸性大豆多肽饮料及益生菌制剂的联合制备方法，包括如下步骤：
[0060]
(1)取低温脱溶豆粕(山东新嘉华集团有限公司)24g，加入200ml蒸馏水，沸水浴加热15min后，自然冷却至室温。调节溶液ph值至8.0，用100目的纱布过滤并收集滤液，向滤液中加入2000u/g蛋白质的碱性蛋白酶(诺维信生物技术有限公司，食品级alcalase 2.4 l碱性蛋白酶)，磁力搅拌下于50℃水浴中酶解5.5h。酶解结束后，加入3wt％的蔗糖，于 105℃灭菌灭酶10min。
[0061]
(2)按5％(v/v)的比例向上述豆粕酶解液中接种植物乳杆菌2号种子液(lactobacillusplantarum no2，菌种保藏号为gdmcc no.60360)，充分混匀后，置于42℃恒温培养箱中发酵6h。发酵结束后，于8000r/min的条件下离心10min，所得上清液即为酸性大豆多肽饮料。
[0062]
(3)进一步理化分析及感官评价结果表明：
①
酸性大豆多肽饮料的ph值为4.75，酸度值为87.22
°
，蛋白质浓度为29.31mg/ml，感官评价的总体可接受性评分为7.28分，其中气味评分为7.58分，外观评分为8.55分，滋味评分为7.48分。
②
其dpph自由基清除能力为415.13μmol trolox/ml，abts自由基清除能力为1.17mmol trolox/ml，铁离子还原能力为0.79mmol trolox/ml。
[0063]
(4)以千克和升作为质量和体积单位计，配制质量体积比为11％的脱脂乳粉溶液，于 100℃灭菌15min，冷却至室温；向步骤(2)所得沉淀中添加冷却后的脱脂乳粉溶液，混合均匀后，真空冷冻干燥即为干酪乳杆菌冻干制剂(益生菌冻干制剂)，经测试，该制剂的活菌数为1.58
×
109cfu/g。
[0064]
实施例4
[0065]
一种酸性大豆多肽饮料及益生菌制剂的联合制备方法，包括如下步骤：
[0066]
(1)取低温脱溶豆粕(山东新嘉华集团有限公司)20g，加入200ml蒸馏水，沸水浴加热15min后，自然冷却至室温。调节溶液ph值至8.0，用100目的纱布过滤并收集滤液，向滤液
中加入1500u/g蛋白质的碱性蛋白酶，磁力搅拌下于55℃水浴中酶解5h。酶解结束后，加入3％的蔗糖，于100℃灭菌灭酶15min。
[0067]
(2)按5％(v/v)的比例向上述豆粕酶解液中接种干酪乳杆菌1号种子液(lactobacilluscasei
‑
1，菌种保藏号为gdmcc no.60137)，充分混匀后，置于37℃恒温培养箱中发酵10 h。发酵结束后，于8000r/min的条件下离心10min，所得上清液即为酸性大豆多肽饮料，所得沉淀保存于4℃冰箱中。
[0068]
(3)进一步理化分析及感官评价结果表明：
①
酸性大豆多肽饮料的ph值为4.05，酸度值为125.70
°
，蛋白质浓度为21.43mg/ml，感官评价的总体可接受性评分为5.90分，其中气味评分为7.43分，外观评分为8.70分，滋味评分为5.60分。
②
其dpph自由基清除能力为351.16μmol trolox/ml，abts自由基清除能力为1.22mmol trolox/ml，铁离子还原能力为0.73mmol trolox/ml。
[0069]
(4)以千克和升作为质量和体积单位计，配制质量体积比为12％的脱脂乳粉溶液，于 121℃灭菌15min，冷却至室温；向步骤(2)所得沉淀中添加冷却后的脱脂乳粉溶液，混合均匀后，真空冷冻干燥即为干酪乳杆菌冻干制剂(益生菌冻干制剂)，经测试，该制剂的活菌数为1.81
×
109cfu/g。
[0070]
实施例5
[0071]
一种酸性大豆多肽饮料及益生菌制剂的联合制备方法，包括如下步骤：
[0072]
(1)取低温脱溶豆粕(山东新嘉华集团有限公司)20g，按1:10的比例(v/v)加入200 ml蒸馏水，调节溶液ph值至8.0，室温下搅拌提取2小时，用100目的纱布过滤并收集滤液。向滤液中加入1500u/g蛋白质的碱性蛋白酶，磁力搅拌下于55℃水浴中酶解5h。酶解结束后，于90℃灭菌灭酶25min。
[0073]
(2)按5％(v/v)的比例向上述豆粕酶解液中接种干酪乳杆菌1号种子液(lactobacilluscasei
‑
1，菌种保藏号为gdmcc no.60137)，充分混匀后，置于37℃恒温培养箱中发酵15 h。发酵结束后，于8000r/min的条件下离心10min，所得上清液即为酸性大豆多肽原浆。
[0074]
(3)在干酪乳杆菌发酵后得到的酸性大豆多肽原浆中加入2％的蔗糖后，再与0.5％ nahco3溶液按照5:3(v:v)的比例复配，复配后溶液的理化分析及感官评价结果表明：
①
复配饮料的ph值为4.53，酸度值为59.35
°
，蛋白质浓度为13.55mg/ml，感官评价的总体可接受性评分为7.33分，其中气味评分为7.53分，外观评分为8.53分，滋味评分为7.33分。
②
其dpph自由基清除能力为283.16μmol trolox/ml，abts自由基清除能力为0.83mmoltrolox/ml，铁离子还原能力为0.51mmol trolox/ml。
[0075]
(4)以千克和升作为质量和体积单位计，配制质量体积比为10％的脱脂乳粉溶液，于 100℃灭菌20min，冷却至室温；向步骤(2)所得沉淀中添加冷却后的脱脂乳粉溶液，混合均匀后，真空冷冻干燥即为干酪乳杆菌冻干制剂(益生菌冻干制剂)，经测试，该制剂的活菌数为1.69
×
109cfu/g。
[0076]
实施例6
[0077]
一种酸性大豆多肽饮料及益生菌制剂的联合制备方法，包括如下步骤：
[0078]
(1)取低温脱溶豆粕(山东新嘉华集团有限公司)20g，按1:10的比例(v/v)加入200 ml蒸馏水，调节溶液ph值至8.0，室温下搅拌提取2小时，用100目的纱布过滤并收集滤液。向
滤液中加入1500u/g蛋白质的碱性蛋白酶，磁力搅拌下于55℃水浴中酶解5h。酶解结束后，于90℃灭菌灭酶25min。
[0079]
(2)按5％(v/v)的比例向上述豆粕酶解液中接种干酪乳杆菌1号种子液(lactobacilluscasei
‑
1，菌种保藏号为gdmcc no.60137)，充分混匀后，置于37℃恒温培养箱中发酵15 h。发酵结束后，于8000r/min的条件下离心15min，所得上清液即为酸性大豆多肽原浆。
[0080]
(3)在干酪乳杆菌发酵后得到的酸性大豆多肽原浆、0.5％nahco3溶液和鲜榨葡萄汁按照2:1:1的比例复配，复配后溶液的理化分析及感官评价结果表明：
①
复配饮料的ph值为 4.21，酸度值为62.67
°
，蛋白质浓度为11.03mg/ml，感官评价的总体可接受性评分为8.13 分，其中气味评分为8.43分，外观评分为8.18分，滋味评分为8.25分。
②
其dpph自由基清除能力为346.28μmol trolox/ml，abts自由基清除能力为0.72mmol trolox/ml，铁离子还原能力为0.97mmol trolox/ml。
[0081]
(4)以千克和升作为质量和体积单位计，配制质量体积比为15％的脱脂乳粉溶液，于 110℃灭菌10min，冷却至室温；向步骤(2)所得沉淀中添加冷却后的脱脂乳粉溶液，混合均匀后，真空冷冻干燥即为干酪乳杆菌冻干制剂(益生菌冻干制剂)，经测试，该制剂的活菌数为1.92
×
109cfu/g。
[0082]
从以上实施例可知，
①
与未经乳酸菌发酵处理的豆粕酶解液相比(实施例1)，经植物乳杆菌和干酪乳杆菌发酵后得到的酸性大豆多肽饮料不仅在苦味、腥臭味等不良风味上有显著改善，且乳酸菌发酵过程产生的乳酸及其它风味物质也能在一定程度上掩盖多肽的不良风味，赋予产品宜人的滋味，使产品的气味、外观、滋味和总体可接受性均有所提升。
②
乳酸菌在发酵过程中能够将大分子蛋白质和多肽进一步降解为小分子肽和氨基酸，并生成多种功能性代谢产物，使发酵产品的dpph自由基和abts自由基清除能力较未发酵前相比，均有显著提升(实施例2～6)。
③
经碱性蛋白酶酶解法和发酵法联合制备得到的酸性大豆多肽饮料主要为小分子肽，其分子量均＜10000da，其中，分子量＜1000da的组分可达73.3％(见表2和图1)，更易被人体消化吸收，极具开发和应用价值。
④
酶解后的大豆提取物，可不添加蔗糖，直接接种发酵，发酵结束并离心后所得的酸性大豆多肽原浆，可通过添加nahco3溶液或果蔬汁等调整产品的感官风味，使得产品的气味、外观、滋味和整体可接受性均有所提升，进而提高消费者的接受度。
⑤
在制备富含大豆多肽的饮料的同时，通过对离心沉淀物的收集和冷冻干燥，也获得了植物源益生菌制剂，活菌数达到109cfu/g 以上，避免了资源的浪费，极大地提高了生产效率。
[0083]
本发明的实施方式并不受上述实施案例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。