一种植物发酵组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于功能食品技术领域，具体涉及一种植物发酵组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.衰老指机体对环境的生理和心理适应能力进行性降低、逐渐趋向死亡的现象。衰老是一个持续的变化过程，国际主流认为自由基损伤人体细胞，从而引起众多疾病，加速人体衰老。自由基从生成到淬灭，深刻影响着脂褐素的形成、线粒体dna的突变、诱导细胞凋亡和蛋白质的合成，自由基与衰老间的关系，自由基可引起的疾病。因而，防止自由基增多以及清除多余的自由基能够达到抗衰老的效果。现有技术公开了多种抗衰老的食物，其中以植物原料居多，例如胡萝卜、黄瓜、石榴等。
3.但是，目前，还没有将植物发酵物用于抗衰老的报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物发酵组合物及其制备方法和应用。
5.本发明提供了一种植物发酵组合物，包括以下原料：番石榴、火龙果、柠檬和乳酸杆菌。
6.优选的，所述番石榴、火龙果和柠檬的质量比为(1～2)：(3～4)：(2～3)。
7.优选的，所述番石榴、火龙果和柠檬的质量比为1：3：2。
8.优选的，所述乳酸杆菌包括植物乳杆菌。
9.本发明还提供了上述方案所述的植物发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
10.1)在氮气保护下，对番石榴、火龙果和柠檬的可食用部位打浆后，得到浆料；
11.2)将所述浆料和乳酸杆菌混合，进行发酵，得到植物发酵组合物。
12.优选的，所述发酵的温度为32～45℃。
13.优选的，所述发酵的ph值为5.5～5.8。
14.优选的，所述浆料和乳酸杆菌的质量比为100：(2～5)。
15.优选的，在所述发酵后，还包括对所述发酵后的产物进行固液分离，收集液体组分。
16.本发明还提供了上述方案所述的植物发酵组合物或者所述制备方法制备得到的植物发酵组合物在制备抗衰老的产品中的应用。
17.本发明提供了一种植物发酵组合物，命名为5靶点，所述植物发酵组合物包括以下原料：番石榴、火龙果、柠檬和乳酸杆菌。本发明的植物发酵组合物具有一定的抗衰老效果。通过使用秀丽隐杆线虫这种被广泛应用于抗衰老研究的模式生物，其寿命延长、脂褐素减少、移动速度增强、抗逆性增强等实验结果，均说明5靶点可以有效延长秀丽隐杆线虫寿命，改善其生活状态与活动能力，进一步证实5靶点具有抗衰老的效果。
附图说明
18.图1为线虫寿命试验结果；
19.图2为显微镜明场和荧光下的线虫脂褐素照片；
20.图3为使用imagej分析相对荧光强度后，对照组和5靶点组脂褐素的相荧光强度对比；
21.图4为线虫活动能力实验结果图；
22.图5为线虫摆动能力实验结果图；
23.图6为线虫抗氧化能力实验结果图；
24.图7为线虫抗热激能力实验结果图；
25.图8为添加原料各种水果的线虫脂褐素对照实验结果图；
26.图9为线虫不同时期给予5靶点的寿命对照实验，其中a为从一开始就给予5靶点，b为正常培养10天后再给予5靶点。
具体实施方式
27.本发明提供了一种植物发酵组合物，包括以下原料：番石榴、火龙果、柠檬和乳酸杆菌。
28.在本发明中，所述番石榴、火龙果和柠檬的质量比优选为(1～2)：(3～4)：(2～3)，更优选为1：3：2。
29.在本发明中，所述乳酸杆菌优选的括植物乳杆菌。在本发明中，所述植物乳杆菌优选的购自于美国atcc公司，菌种号为jylp-326。在本发明中，植物乳杆菌jylp-326可通过影响肠道微环境，调节肠道内部分细菌的数量比例，直接或间接影响黏膜免疫，降低肠道疾病的发生率，从而间接缓解精神性疾病。
30.本发明还提供了上述方案所述的植物发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
31.1)在氮气保护下，对番石榴、火龙果和柠檬的可食用部位打浆后，得到浆料；
32.2)将所述浆料和乳酸杆菌混合，进行发酵，得到植物发酵组合物。
33.本发明首先在氮气保护下，对番石榴、火龙果和柠檬的可食用部位打浆后，得到浆料。在对番石榴、火龙果和柠檬的可食用部位打浆后，本发明优选的还包括对番石榴、火龙果和柠檬的可食用部位进行灭菌。本发明对所述灭菌的方式没有特殊限制，采用本领域的常规灭菌方式即可。
34.得到浆料后，本发明将所述浆料和乳酸杆菌混合，进行发酵，得到植物发酵组合物。
35.本发明对所述乳酸杆菌的初始发酵的有效活菌数没有特殊限制。
36.在本发明中，所述发酵的温度优选为32～45℃，更优选为35～40℃。在本发明中，所述发酵的ph值优选为5.5～5.8，更优选为5.6～5.7。在本发明中，所述发酵的时间优选为72～120h，更优选为96～120h。
37.在本发明中，所述浆料和乳酸杆菌的质量比优选为100：(2～5)。
38.在本发明中，在所述发酵后，还包括对所述发酵后的产物进行固液分离，收集液体组分。在本发明中，所述固液分离的方式优选为板框过滤。
39.本发明在所述收集液体组分后，优选的还包括对所述液体组分进行灭菌；所述灭
菌的方式优选为巴氏灭菌。
40.本发明在所述巴氏灭菌后，优选的还包括灌装。
41.本发明还提供了上述方案所述的植物发酵组合物或者所述制备方法制备得到的植物发酵组合物在制备抗衰老的产品中的应用。在本发明中，所述产品包括食品、保健品或药品。
42.如无特殊说明，本发明对所用原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
43.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
44.实施例1
45.使用秀丽隐杆线虫这种模式生物进行实验，在线虫培养基上涂布5靶点来进行喂食。通过寿命实验，脂褐素实验，移动速度与摆动能力实验以及抗逆性实验，从不同角度证明5靶点对线虫具有显著的抗衰老作用。
46.5靶点制备：市场购买番石榴：火龙果：柠檬＝1：3：2。
47.清洗、打浆为防止空气使之氧化，加氮气保护。
48.发酵罐发酵(美国atcc公司植物乳杆菌，2～5％，发酵温度：32～45℃，ph:5.5～5.8)
49.发酵时间72～120h，板框过滤机固液分离，巴氏灭菌法将其灭菌，罐装。
50.菌种制备：秀丽隐杆线虫以大肠杆菌op50为食。按照无菌操作的方法，利用接种环挑取菌种，在lb固体培养基上平板划线，将平板倒置于37℃培养箱。挑取e.coli op50至2mllb液体培养基，37℃、180rpm振荡培养12～16h，od值＝0.4～0.6。
51.ngm培养基制备：nacl 3g、agar20g、tryptone 2.5g加水定容至975ml。1m cacl21ml、1m maso41ml、5mg/ml胆固醇1ml、1m磷酸钾缓冲液(ph＝6.0)25ml，定容至1l。
52.在无菌环境下，分装于培养皿中，冷却备用。
53.线虫培养与传代：取适量e.coli op50接种于ngm固体平板中，37℃恒温过夜培养。次日将线虫转移其中，20℃下恒温培养，产卵期，每隔一天转移至含有e.coli op50ngm固体平板，相同条件下继续培养，直至死亡。
54.线虫同期化：用m9缓冲液冲洗含有线虫卵的平板，收集到ep管中，2000rpm离心2min，弃去上清，m9缓冲液清洗3遍。在ep管中加入600μlm9缓冲液，300μl线虫裂解液(2:1＝naoh:naclo)
55.寿命实验:将同期化的线虫分别传代于实验组和空白对照组，实验组涂布5靶点与op50大肠杆菌，空白组涂布同体积的大肠杆菌与m9缓冲液，此时记为0天。每隔两天传于新的ngm培养基中，直至线虫全部死亡。判断死亡的方法:重复轻触线虫头部，线虫不再活动则说明死亡。实验结果如表1和图1所示，通过在食物中加入5靶点，可以有效延长线虫的平均寿命并提高其最大寿命，并且呈剂量依赖的趋势。
56.表1
57.58.脂褐素实验：脂褐素是线虫个体衰老的重要指标。随着衰老程度加深，脂褐素的积累会越来越多。在紫外线(430nm～490nm)照射下，脂褐素会激发荧光，通过image j分析荧光的平均灰度值，可以判定线虫体内脂褐素积累多少。如图2、图3所示，在5靶点处理下，脂褐素积累显著减少，平均降低了76.6％，说明喂食5靶点有效延缓了线虫的衰老进程。
59.活动能力实验：在同期化培养8d后，每隔两天观察线虫移动能力，统计活动能力。将移动能力划分为三个等级，自发活跃状态为正常；轻触后不协调移动或只有触碰时才可移动为迟钝；触碰时只有头部运动为几乎不变。如图4所示，喂食5靶点的线虫在各个生命阶段中活动能力均显著强于空白组线虫，且这种提高呈剂量依赖性，5靶点原液效果最好。
60.摆动能力实验：将同期化的线虫分别于5靶点和空白培养基上培养4天，之后每隔两天于显微镜下观察。以线虫完成一次完整的正弦运动算作一次摆动，统计线虫30s内摆动次数，摆动次数越多说明生存状态越好。如图5所示，喂食5靶点的线虫摆动次数显著高于于空白组线虫，且呈剂量依赖性，5靶点原液效果最好。
61.抗氧化实验：将同期化后的线虫，分别在空白和5靶点培养基中培养4天，再将线虫置于于涂布了3％的过氧化氢溶液的平板上，记录线虫死亡时间。如图6所示，5靶点处理组延缓了线虫死亡的时间，说明5靶点具有一定的抗氧化作用，增强了线虫的抗逆性，也侧面反映了其抗衰老效果。
62.抗热激实验：将同期化后的线虫，分别在空白和5靶点培养基中培养4天，之后将线虫转移到35℃高温环境下进行培养，记录线虫在高温条件下的死亡时间。如图7所示，5靶点处理组线虫在高温条件下生存时间显著长于空白对照组，说明5靶点增强了线虫抵御高温的能力，这种抗逆性也是抗衰老的一种体现。
63.对比例1
64.与原料中单个水果对比：将作为5靶点发酵液原料的火龙果、柠檬、番石榴分别榨汁，通过离心过滤等步骤获得上清液，涂布于线虫培养基上。将同期化后度线虫分别置于这些涂布有水果榨取液的平板上培养7天，于荧光显微镜下观察脂褐素积累情况。实验结果如图8所示，柠檬和番石榴提取液组与空白组相比并未产生明显变化，火龙果组脂褐素积累有轻微下降，但与5靶点处理组差距明显。这些实验结果说明5靶点的抗衰老作用并不是因为其中水果原料产生的。
65.5靶点喂食时间对比：分别给刚孵化的线虫(青年组)以及正常培养10天后的线虫(老年组)喂食5靶点，统计其寿命长短。如表2和图9所示，青年与老年线虫的空白组寿命相差不大，而10天后才喂食5靶点的老年组线虫平均寿命以及最大寿命都显著低于一直喂食5靶点的青年组线虫。这说明更长时间的喂食5靶点可以更进一步延缓衰老。
66.表2
[0067] 平均寿命最大寿命青年control组15.5620青年5靶点组18.0423老年control组15.8520老年5靶点组16.4822
[0068]
本发明的植物发酵组合物可以食用，能够改善身体抗氧化能力，延缓了衰老，为延缓衰老提供一种新的方法。
[0069]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。