具有高光热效应的生物纳米零价钯材料在制备加热产品中的应用

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1.本发明属于微生物纳米材料技术领域，具体涉及巨大芽孢杆菌y-4合成具有高光热效应的生物纳米钯，将其用于抗菌和加热食品等方面。


背景技术：

2.众所周知，预防和治疗细菌感染最常见和有效的方法是抗生素治疗。然而，由于长期滥用抗生素，抗生素菌株的持续出现和快速传播已成为世界范围内对人类健康的最严重威胁之一。迫切需要开发一种新的策略来解决抗生素耐药性细菌。加热过程，如巴氏杀菌，已被用作物理抗菌手段，即至青霉素发现之前，由于热休克蛋白的变性，细菌将在55℃以上的温度下进行消毒。因此，开发具有高生物相容性的新型纳米材料受到追捧。光热疗法(ptt)涉及使用光热换能器将近红外(nir)光转换为热量以杀死细菌。与传统抗生素治疗相比，它需要更短的治疗时间，并可以避免耐药性的出现。因此，ptt被视为处理细菌感染的安全有效策略。
3.为此，由于纳米颗粒的特定尺寸、形状、组成、更大的表面积与体积比以及单个成分的纯度，近年来致力于开发具有良好光热效应的新型纳米材料，特别是金纳米材料。不同的金纳米颗粒，包括纳米棒、纳米壳、纳米笼和纳米星，已经被合成，具有在nir区域将光能转换为热能的优异能力。然而，其中一些具有光热稳定性差和合成过程复杂等缺点。
4.钯纳米结构具有显著的化学和光学性质，最近成为光热传感器的新候选材料。与au纳米材料相比，pd纳米结构表现了出色的光热稳定性和高光学消光系数。研究表明，pd-nps的光热转换效率取决于尺寸和形态。为了实现高光热转换效率，已经合成了不同的钯纳米结构，例如多孔钯纳米颗粒和钯纳米片。此外，还利用表面配体对pd-nps进行修饰以提高pd-nps的水稳定性，以改善光热效应。尽管这些策略在某些方面实现了提高pd-nps性能的目标，但存在许多缺点，如使用有毒溶剂、产生有害副产物和/或需要复杂的多个合成步骤。因此，迫切需要找到新的方法来合成具有良好光热功效的环保和生物相容的pd-nps。
5.微生物生物合成纳米颗粒被认为是清洁、无毒和环境可接受的绿色化学过程。据报道，许多微生物能够在不添加有毒还原剂的情况下将pd(ii)还原成pd(0)并进一步促进pd-nps的成核和生长。我们发现，巨大芽孢杆菌y-4，一种在好氧条件下可以快速生长的细菌，可以有效地将pd(ii)生物还原为pd(0)。最近，这些生物合成的pd-nps在催化有机合成和环境污染物降解中被广泛探索。然而，很少探索微生物pd-nps的光热转换特性以及生物应用潜力。
6.在这项研究中，我们成功地利用巨大芽孢杆菌y-4合成了微生物pd-nps，并系统地探索了其独特的理化特性。已经证明，生物还原pd-nps的超声处理赋予材料在nir区域更高的吸收和更好的光热转换效率。所制备的材料在近红外辐射下显示出优异的生物相容性和抗菌活性。在不到10分钟的时间内，低剂量pd-nps(20mg/l)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌效率为99.99％。这些结果表明，合成的pd-nps作为ptt试剂用于快速消毒应用具有
巨大的潜力。


技术实现要素：

7.本发明的第一个目的是提供具有高光热效应的生物纳米零价钯材料在制备加热产品中的应用，生物纳米零价钯材料在在不到10分钟的时间内，低剂量pd-nps(20mg/l)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的消毒效率为99.99％，反应条件温和，需要的成本低，对环境友好。
8.因此，本发明提供了具有高光热效应的生物纳米零价钯材料在制备加热产品中的应用。
9.优选，所述的加热产品是用于加热、加热食品或抗菌产品等。
10.优选，所述的具有高光热效应的生物纳米零价钯材料是用巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)y-4还原pd(ii)获得生物纳米零价钯，再经超声获得具有高光热效应的生物纳米零价钯材料。
11.进一步优选，所述的具有高光热效应的生物纳米零价钯材料是148mg/l b.megaterium y-4在5mm甲酸钠和无氧条件下还原100mg/l pd(ii)，在30℃条件下反应12h获得生物纳米零价钯，再经超声20min，获得具有高光热效应的生物纳米零价钯材料。
12.优选，是具有高光热效应的生物纳米零价钯材料联合近红外辐照在用于加热、加热食品或抗菌产品中的应用。
13.进一步优选，是近红外辐照具有高光热效应的生物纳米零价钯材料用于加热或近红外辐照含有具有高光热效应的生物纳米零价钯材料和菌的混合物如溶液中，以杀菌。
14.优选，是用808nm的近红外光，功率密度为1.35～3.14w/cm2辐照20～40mg/l具有高光热效应的生物纳米零价钯材料和菌的溶液10min以上。
15.优选，所述的抗菌产品是抗大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的产品。
16.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
17.(1)在功率密度分别为1.35、2.56和3.14w/cm2的近红外辐照下，20mg/l超声生物pd-nps的最终温度分别达到55、78和90℃，具有良好的加热性能；
18.(2)在10～80mg/ml浓度范围内的超声生物pd-nps可保持》90％的人胚胎肾(hek 293)细胞活力，表明合成的生物pd-nps具有良好的生物相容性；
19.(3)本发明在1.35w/cm2的近红外辐照功率下，当时间大于10min时，浓度为20mg/l生物pd-nps时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别可达99.99％、99.9998％。
附图说明
20.图1为bacillus megaterium y-4合成生物pd-nps的表征：没有超声处理(a和c)和超声处理(b和d)生物pd-nps的tem图；没有超声处理(e)和超声处理(f)生物pd-nps的xps光谱。
21.图2为生物pd-nps的光热性能，(a)生物pd-nps的uv-vis-nir吸收光谱；(b)在不同nir辐射功率下，超声处理的生物pd-nps悬浮液(20mg/l)温度随时间的变化；(c)在nir照射(1.35w/cm2)下，不同浓度生物pd-nps温度随时间的变化；(d)三个开关周期(1.35w/cm2)中pd-nps(20mg/l)的光热循环曲线。
22.图3为生物pd-nps的生物相容性评估
23.图4为超声处理的生物pd-nps的抗菌活性，(a)大肠杆菌和(b)金黄色葡萄球菌在不同处理下的相对抗菌效率；(c)不同处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的平板计数；第一组：大肠杆菌，无辐照；第二组：大肠杆菌，近红外辐照功率1.35w/cm2；第三组：金黄色葡萄球菌，无辐照；第四组：金黄色葡萄球菌，近红外辐照功率1.35w/cm2。
24.图5为不同处理后用syto 9/pi染色的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的重叠荧光(绿色：所有细胞；红色：死亡细胞)图像。
25.图6为超声处理pd-nps在辐照功率为1.35w/cm2下，不同时间处理后(a)大肠杆菌和(b)金黄色葡萄球菌的抗菌活性；(c)大肠杆菌和(d)金黄色葡萄球菌用超声处理的pd nps(20mg/l)在辐照功率为1.35w/cm2下处理几个周期的相对生存能力。
具体实施方式
26.以下是对本发明的内容结合实施案例进行进一步的阐述，但不是对本发明的限制。
27.实施例1巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)y-4的筛选和鉴定
28.称10.0g电子废弃物厂污泥放入250ml锥形瓶中，再加100ml新鲜的lb培养基，同时加入一定量的四氯钯酸钠，用空气封口膜封好，放置于转速150r/min，30℃的摇床中进行驯化和富集培养。驯化最开始加入10mg/l pd(ii)，然后驯化三天，以后依次以10mg/l递增，每个浓度驯化三天，直到最后pd(ii)浓度为100mg/l，驯化约30天。取驯化的混合菌液1ml按10-1
……
10-7
进行稀释，再取100μl均匀涂布在平板上，放入30℃培养箱中培养12h，挑取单菌落再液体培养，再稀释涂布进一步分离纯化，直至菌落形态一致，再进行甘油保藏。然后考察每种细菌还原pd(ii)的效果，还原pd(ii)效果好的细菌进一步纯化和扩大培养，然后进行菌种鉴定，由此获得菌株y-4。
29.菌株y-4为好氧菌，革兰氏阳性，杆状，末端圆，能运动。将菌株y-4进行纯培养、菌株总dna的提取、16s rdna的pcr扩增及将扩增产物送到北京擎科生物科技有限公司广州分公司进行序列测定，将正反序列拼接获得16s rdna基因序列长度为1493bp，如seq id no.1所示。测定结果在ncbi网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行blast比对，该菌株与bacillus megaterium strain mn509794.1的相似性为99.93％，将菌株命名为巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)y-4。
30.该菌株公开于文献the effect of biotic and abiotic environmental factors on pd(ii)adsorption and reduction by bacillus megaterium y-4，本技术人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
31.实施例2b.megaterium y-4合成生物pd-nps及其表征
32.b.megaterium y-4先进行斜面培养活化1-2天，然后取一环至装有100ml液体lb培养基的250ml锥形瓶中，用空气封口膜封口，置于恒温振荡培养箱中，在30℃、150r/min条件下培养，将培养的菌液以4000r/min离心5min，去除上清培养基，得到菌体，用无菌磷酸盐缓冲液(ph＝7.0)冲洗，再以4000r/min离心清洗两次，获得菌体。随后148mg/l b.megaterium y-4在5mm甲酸钠和无氧条件下还原100mg/l pd(ii)，在30℃条件下反应12h获得生物纳米零价钯(pd-nps)。生物纳米零价钯(pd-nps)再经超声20min处理获得超声处理后的生物纳
米零价钯(pd-nps)。
33.tem图像(图1a、1c)表明获得的生物pd-nps主要分布在细胞的周质空间上，观察到pd-np聚集，b.megaterium y-4还原pd
2+
合成pd-nps随着反应时间的增加不可避免地沉淀而聚集，这可能会对其光学性能产生负面影响。因此，超声处理从微生物宿主中释放pd-nps。超声20min后pd-nps的tem图像如图1b和图1d所示。分离后的pd表现出较好的分散性，这可能有利于其理化性能的提高。采用xps表征方法评价超声处理前后pd-nps的化学状态。如图1e和图1f所示，以339.82ev和334.57ev为中心的结合能归属于pd0的pd
3d/2
和pd
5d/2
，以341.51ev和336.26ev为中心的结合能归属于pd
2+
的pd
3d/2
和pd
5d/2
。根据pd0和pd
2+
的峰面积，超声处理和未超声处理样品的pd0含量分别为76.9％和75.8％，说明超声处理对pd-nps的化学状态没有影响。
34.实施例3生物pd-nps的光热性能
35.用紫外可见分光光度计测定了实施例2制备的相同浓度下超声pd-nps和非超声pd-nps的紫外-可见-近红外吸收光谱。如图2a所示，与未超声样品相比，超声pd-nps表现出更强的吸光度，这可能是由于b.megaterium y-4释放的pd-nps的水分散性得到了改善。为了系统评价超声生物pd-nps的光热性能，用808nm不同功率密度的激光照射1ml不同浓度的pd-nps，并用数字温度计记录温度变化。结果表明，在功率密度分别为0.015、1.35、2.56和3.14w/cm2的近红外辐照下，20mg/l超声pd-nps(图2b)的最终温度分别达到41、55、78和90℃。在功率密度为1.35w/cm2的近红外辐射下(图2c)，浓度为5.5、11、20和40mg/l的超声pd-nps的最终温度分别达到41、45、56和62℃。对照组pbs溶液温度(图2c)无明显变化。正如预期的那样，超声生物pd-nps具有良好的光热转换能力，光热效应与材料浓度和光密度有关。进一步研究了超声pd-nps在加热和冷却周期为20min时的光稳定性，结果如图2d所示。经过5个循环后，与处理前相比，超声pd-nps的光热性能几乎没有变化，而未超声pd-nps的光热性能略有下降。这可能是由于未经超声处理的pd-nps在光热效应下进一步聚集所致。这些结果表明，生物pd-nps具有良好的光热稳定性，是一种很有前途的光热试剂。
36.实施例4超声pd-nps的抗菌活性
37.在超声生物pd-nps用于杀灭细菌之前，首先研究了其细胞毒性。将人胚胎肾(hek 293)细胞与不同浓度实施例2制备的生物pd-nps孵育24小时，然后使用cck-8法评估细胞活力(图3)。在10～80mg/ml浓度范围内的pd-nps可保持》90％的细胞活力，表明合成的生物pd-nps具有良好的生物相容性。
38.我们进一步通过平板计数法研究了超声处理后的生物pd-nps对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外杀菌活性(图4)。采用不同浓度(0、5.5、11和20mg/l)的超声生物pd-nps在近红外光照(808nm，1.35w/cm2)和无光照条件下对细菌进行处理。随着pd-nps浓度的增加，ii组(e.coli，近红外辐照组)和ⅳ组(s.aureus，近红外辐照组)的活菌落数量急剧下降，而i组(e.coli，无辐照组)和iii组(s.aureus，无辐照组)的活菌落数量没有明显变化。20mg/l pd-nps悬浮液处理组ii和ⅳ组琼脂上几乎没有菌落生长。而对照组(pd-nps:0mg/l)，无论近红外光照射或未照射，在琼脂板上均有大量菌落存活。
39.用syto 9/碘化丙啶(pi)双染试剂盒进一步测定超声生物pd-nps在近红外照射下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的失活作用(死菌：红色荧光；所有细：绿色荧光)。如图5所示，在没有照射的情况下，用超声生物pd-nps孵育的细菌大部分染成绿色，表明它们细菌活
性很好。但在近红外辐照下，10分钟后，染成红色的细菌数量与染成绿色的细菌数量几乎相等，表明大肠杆菌和金黄色葡萄球菌几乎完全被灭活。为了揭示细菌被超声生物pd-nps的光热特性所破坏，进一步通过仅用近红外处理的细胞染色进行对照分析。几乎所有的细菌都只被绿色荧光染色，这表明近红外光对细胞活力的影响可以忽略不计。这些结果有力地支持了超声生物pd-nps可以通过其良好的光热转换性能杀灭细菌。这些结果表明，灭活细菌的主要因素不是近红外或pd-nps，而是生物pd-nps优异的光热效应。
40.在1.35w/cm2的近红外辐照功率下，研究了不同浓度超声生物pd-nps对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性随时间的变化(图6a，图6b)。随着808nm激光照射时间的延长，抗菌效率逐渐提高。当时间大于10min时，浓度为20mg/l生物pd-nps时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别可达99.99％、99.9998％。结果表明，超声生物pd-nps对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均可在10min内达到快速杀菌效果(》99.99％)。由于该材料具有良好的光热稳定性，研究了该材料的可重复利用性。如图6c和图6d所示，即使经过四个循环，仍有超过94.1％的大肠杆菌和99.5％的金黄色葡萄球菌被杀死，这表明超声pd-nps可以反复用于抗菌应用。