用于预防和治疗炎性疾病的食物和/或饲料组合物的制作方法

本发明一般涉及对抗炎性疾病的组合物和方法，特别涉及食物和/或饲料组合物用于预防、减轻和/或治疗炎性病症、疾病或不适的用途。

背景技术：

1、人的炎性疾病(或炎症相关病症)为例如以下疾病，诸如阿尔茨海默病、强直性脊柱炎、关节炎(骨关节炎、类风湿性关节炎(ra)、银屑病关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、克罗恩氏病(crohn′s disease)、结肠炎、皮炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠易激综合征(ibs)、系统性红斑狼疮(sle)、肾炎(nephritism)、帕金森症、溃疡性结肠炎、自身免疫疾病、哮喘、遗传性过敏症(atopy)、心血管疾病、糖尿病、免疫衰老、心脏或肾局部缺血/再灌注损伤、猫科传染性腹膜炎、乳腺炎、牛皮癣、败血症、系统性红斑狼疮、肿瘤转移和内脏或皮肤利什曼病(leishmaniasis)。其还可以用于预防或治愈促炎症事件，例如在使用细胞抑制剂进行癌症治疗期间发生的促炎症事件，或在使用引起内脏损伤的药物期间的其它不适。

2、这些疾病大部分是广泛传播的。

3、例如，在美国，关节炎是最常见的致残原因。超过2000万患关节炎的个体每天受到严重的功能限制。它可以影响人以及动物。在本发明的语境中，我们使用术语“患者”来描述目标个体。这些患者易患或患有炎性疾病。

4、风湿病或风湿性病症是影响关节和/或结缔组织的医学问题的非专用术语。术语“风湿病”仍然用于口语和历史语境中，但不再频繁用于医学文献或技术文献中；不再有简单称为“风湿病”的任何公认的病症。该传统术语涵盖了多种不同的问题，以至于将症状归于“风湿病”说明不了什么。“非关节风湿病”(又称“局部疼痛综合征”或“软组织风湿病”)可引起明显的不适和困难。此外，关节炎和风湿病之间包括至少200种不同的病症。

5、风湿病和关节炎是以炎症和疼痛为特征的急性病症和慢性病症的通用术语。风湿病是以肌肉和关节炎症和疼痛为特征的通用病症类别，包括关节炎。关节炎的特征是引起肿胀和疼痛的关节炎症。关节炎的类型包括骨关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎(as)和系统性红斑狼疮(sle)。风湿病病症包括传染性关节炎、类风湿性关节炎、由风湿热引起的关节炎、由外伤或退行性关节病引起的关节炎、肌炎、神经性关节病、滑囊炎、纤维肌炎和关节积水。这种疾病的原因并不总是完全清楚，但可以是其它退行性疾病、创伤或自身免疫疾病例如sle的结果。炎症还发生为对外来物质入侵宿主和导致免疫反应的机械创伤(例如微生物物质，诸如细菌和病毒、毒素、警报分子和瘤形成)的防御性反应。

技术实现思路

1、作为炎性疾病例子的这些疾病和病症的共同之处在于炎症和由此引起的疼痛。现有的预防和治疗炎性疾病的方法通常集中于止痛和抗炎药物。典型的方法集中于口服药物例如甾体可的松衍生物和许多非甾体抗炎药(nsaids)。不幸的是，这些药物几乎总是展示出不期望的副作用。其它努力集中于关节植入物，例如膝关节或髋关节植入物。这些方法是漫长且复杂的手术程序，其迫使患者经受昂贵的侵入性手术以及需要严格且昂贵的物理疗法方案的重要恢复期。因此，需要新的用于预防和治疗炎性疾病的方法，其避免以前用于预防和治疗炎性疾病的方法所特有的不期望的副作用和昂贵的手术程序。

2、本发明适用的另一个例子是控制或预防不健康饮食或使用药物所引起的疾病和/或不适和/或不想要的副作用。例如，粘膜炎是由化学疗法(例如常用的阿霉素)引起的小肠炎症。这种药物引起粘膜损伤和释放细胞内分子，例如dna、rna和热休克蛋白(也称为警报分子或危险相关分子模式)，从而导致严重的粘膜炎炎性反应。这可以通过本发明来预防或减轻。这被视为(但不限于)由于不健康饮食、使用药品或使用药物的炎性反应的例子。

3、在动物中，涉及炎性反应的胃肠道紊乱普遍存在。在农场动物(猪、家禽和反刍动物)中，这种现象造成了巨大的经济损失。例如，在猪群中，在欧盟出生的所有小猪的总损失合计约为17％，且这些损失的大部分可与经由粘膜表面的感染有关(lallès等人,2007,proc nutr soc.66(2):260-268)。新断奶小猪的短暂性厌食被认为是导致肠功能障碍、对肠道感染的敏感性增加和腹泻这些问题的主要原因。伴随的病理生理变化包括与绒毛萎缩相关的粘膜重量减少20-30％(lallès等人,2004,animal research 53,301–316)，肠屏障功能受损(wijtten等人,2011,br j nutr.105(7):967-981)，肠道微生物群稳态紊乱(bauer等人，,2006,nutr res rev.19(1):63-78)以及免疫系统的解剖学和功能发育紊乱(lallès等人,2007,proc nutr soc.66(2):260-268)。此外，在家禽中，肠疾病是经济损失的重要原因，这归因于动物性能受损、死亡率增加和鸟类安宁(welfare)降低(timbermont等人,2011,avian pathol.40(4):341-347)。非特异性肠炎、球虫病、病毒感染、菌群失调和细菌感染已被确定为引起家禽垫料潮湿的主要肠道疾病(hermans等人,2006,vet rec.158(18):615-622)。虽然存在一些物种相关的差异，但潜在的病理生理变化与猪中的那些相当类似。例如，新孵化肉鸡的小肠发育在低采食水平下恶化(wijtten等人,2012,actaagriculturae scandinavica section a-animal science,62(1),1-12)。

4、过去，预防性地使用饲料中的抗生素生长促进剂来防止这类问题。目前，由于担心食物中的抗生素残留和病原体的抗生素耐药性增加，在农场动物中预防性使用几种抗生素在欧盟被禁止，或者在其它国家(例如美国)的舆论压力加大。因此，对于动物，也需要新的用于预防和治疗涉及炎性反应的胃肠道紊乱的方法。

5、出乎意料地发现：特定种类的果胶(就其酯化度而言)能够用于预防、减轻和/或治疗炎性病症、疾病或不适。

6、“预防、减轻和/或治疗炎性病症、疾病或不适”主要是指：

7、·使沾染任何上述疾病的风险降至最低，和/或

8、·改善相关症状，和/或

9、·减轻与任何上述疾病相关的疼痛或不适，和/或

10、·延长可发生任何上述疾病的发病之间的时间，和/或

11、·改善人和动物的整体健康和安宁。

12、果胶是陆生植物的初生细胞壁中所含的结构性杂多糖。其在商业上生产为白色至浅棕色粉末，主要从柑橘类水果中提取，并用于食品中作为胶凝剂，特别是果酱和果冻中。它还用于馅料、药品、甜食中，作为果汁和牛奶饮料中的稳定剂，以及作为膳食纤维的来源。

13、梨、苹果、番石榴、榅桲、李子、鹅莓、橙子和其他柑橘类水果含有大量果胶，而樱桃、葡萄和草莓等浆果类含有少量的果胶。但除了水果之外的其他植物来源也可以包含果胶。例如，果胶可以来源于马铃薯、大豆、甜菜、菊苣、胡萝卜、番茄、豌豆、欧防风(parsnip)和(绿色)豆类。

14、所有这些清单都根本不是穷尽的。只列出了主要来源。

15、下面显示了果胶以及(部分)酯化果胶的部分结构。

16、果胶(聚半乳糖醛酸)的结构

17、

18、(部分)甲基化果胶的结构

19、

20、在上面所示的式中，酯化是甲基化，但也可以使用其他基团(例如乙酰基)。可以用一种基团(例如ch3或coch3)或者在同一低聚物结构中用多于一种基团酯化果胶。乙酰化通常发生在2号位和/或3号位的羟基中的氧上，而甲基化通常发生在5号位的羧基上。

21、在本发明的范围内，酯化度被用于描述骨架中酯化的果胶单体单元的百分比。

22、果胶是由α-1,4-连接的d-半乳糖醛酸(gala)骨架(所谓的同聚半乳糖醛酸或平滑区域)和以下区段构成的复合多糖，所述区段由α-(1,2)-连接的l-鼠李糖基和α-1,4-连接的d-半乳糖醛酸残基的交替序列组成，有阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和半乳聚糖的侧链为分支(支化的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖或毛状区域)。果胶装饰有中性糖(ns)，主要是与骨架中的鼠李糖部分连接的半乳糖和阿拉伯糖。

23、由于酸提取，商业果胶通常含有少量中性糖(中性糖含量为5％左右)。果胶的其他结构要素是木糖半乳糖醛酸聚糖和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖ii。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖ii携带独特的糖残基例如api(d-芹菜糖)、acea(3-c-羧基-5-脱氧-l-木糖)、dha(2-酮基-3-脱氧-d-来苏-庚酮糖酸(2-keto-3-deoxy-d-lyxo-heptulosaric acid))和kdo(2-酮基-3-脱氧-d-甘露-辛酮糖酸)。这些不同结构要素的相对比例对于不同的植物来源和各种衍生的商业产品而言可显著不同。

24、可以酯化果胶的各种结构要素。酯化的主要类型有：o-甲基、o-乙酰基和o-阿魏酰基。不排除任何其他类型的酯化。大部分酯化位于gala残基上的同聚半乳糖醛酸聚糖区域。因此，gala残基可存在有游离羧基或在一个或多个羧基上被酯化。酯化可以作为单酯化发生，也可以作为单个gala残基的双酯化发生。不排除任何其他数量的酯化。单个残基上的酯化可以通过单一类型的烷基(即甲基)或单一类型的酰基(即乙酰基)。不排除任何混合型酯化。因此，gala可以被甲基化(导致每个gala残基上0或1个甲基)或者可以被乙酰化(导致在c-2和/或c-3上的羟基的氧上分别0、1或2个乙酰基)。后者本身就发生在甜菜和马铃薯果胶中。

25、本发明的果胶通常具有5kda到800kda的mw尺寸分布。mw尺寸分布优选介于5kda和400kda之间。优选地，给定果胶组合物中的大多数果胶分子具有低于200kda的mw。优选地，给定果胶组合物中的大多数果胶分子具有低于100kda的mw。

26、酯化度(de)根据定义为每100摩尔总半乳糖醛酸(游离的gala和经取代的gala合在一起)中存在的酯的量(以摩尔计)。由于大多数商品果胶基本上具有甲基-酯类型的酯化，因此de通常以甲基化度(即dm)表示。在这种情况下，酯化度根据定义为每100摩尔总半乳糖醛酸(游离的gala和经取代的gala合在一起)中存在的甲基-酯的量(以摩尔计)。在酯化是乙酰基型的情况下，de通常以乙酰化度(即da)表示。在这种情况下，酯化度根据定义为每100摩尔总半乳糖醛酸(游离的gala和经取代的gala合在一起)中存在的乙酰基-酯的量(以摩尔计)。在一种果胶样品中有多种酯化类型的情况下，de通常分开表示为甲基化度(即dm)和乙酰化度(即da)。这些如上所述进行计算。或者，de可以表示为酯化度，通过每100摩尔总半乳糖醛酸(游离的gala和经取代的gala合在一起)中存在的经一种或多种酯化(甲基型或乙酰基型)修饰的半乳糖醛酸残基的量(以摩尔计)来定义。

27、在本发明的上下文中，使用术语酯化度(de)，所述百分比总是基于通过酯化(即甲基化)取代的gala残基的量。de为50意味着所有可能的gala残基的50％被酯化(即甲基化)。

28、以下专利申请涉及酯化果胶的用途，更具体地涉及具有特定酯化度的酯化果胶的用途。

29、对酯化果胶进行以下区分：

30、(i)低酯化果胶

31、(ii)高酯化果胶。

32、低酯化果胶的酯化度(de)小于50％。这意味着少于50％的可能位置被酯化。

33、高酯化果胶的de超过50％。这意味着超过50％的可能位置被酯化。

34、市售hm-果胶的de值通常为60-75％，而lm-果胶的de值为20-40％(sriamornsak,2003,silpakorn university international journal 3(1-2),206-228)。

35、如上所述，果胶存在于几乎所有高等植物中。食品行业的一些副产品被用于果胶提取，所述副产品例如柑橘类果皮(柑橘汁生产的副产品)、苹果果渣(苹果汁生产的副产品)、甜菜(甜菜糖产业的副产品)、略微延伸到土豆纤维、向日葵头部(sunflower heads)(油生产的副产品)和洋葱(1990年5月,carbohydr.polymers,12:79-99)。从果渣或果皮中提取hm果胶的典型方法是在ph1-3、50-90℃下，在热的稀释无机酸中持续3-12小时(rolin,2002,在pectins and their manipulation；seymour g.b.,knox j.p.,blackwellpublishing ltd,222-239中)。干柑橘果皮含有20-30％的果胶(基于干物质)，干燥苹果果渣中果胶的存在量较低(10-15％)(christensen,1986,pectins.food hydrocolloids,3,205-230)。通过加入醇(通常是异丙醇，但也使用甲醇或乙醇)，果胶被沉淀。最后，将凝胶状物质加压、洗涤、干燥并研磨(1990年5月,carbohydr.polymers,12:79-99)。取决于工艺条件，获得dm为55-80％的果胶(rolin,2002,在pectins and their manipulation；seymourg.b.,knox j.p.,blackwell publishing ltd,222-239中)。

36、可通过使高甲基化(hm)果胶脱酯化来获得低甲基化(lm)果胶，这主要通过控制提取过程中的酸度、温度和时间来进行。为了生产其他类型的果胶，可以在提取之前或提取期间，通过酸或碱的作用将酯类作为浓缩液体或在醇性浆液中水解，然后分离并干燥。当使用碱时，反应必须在低温和水溶液中进行以避免聚合物的β-消除性降解(kravtchenko等,1992,carbohydrate polymers,19,115-124)。还可以用水性螯合剂例如六偏磷酸盐提取lm果胶(例如马铃薯果胶)(voragen等,1995,在food polysaccharides and theirapplications；stephen a.m.,new york:marcel dekker inc,287-339中)。使用果胶甲基酯酶(pme)来生产lm果胶可以作为化学提取的替代方案(christensen,1986,pectins.foodhydrocolloids,3,205-230)。不同反应的条件和时间是不同的，从而导致de不同(甚至de低至为零)的果胶。

37、虽然商业lm果胶几乎全部来源于hm果胶，但存在lm果胶的天然来源，例如成熟向日葵头部(thakur等,1997,critical reviews in food science and nutrition,37(l):47-73)。

38、可以通过公知的方法来测定de。

39、例如，可以使用几种方法来测定酯化度，例如滴定法(food chemical codex,1981)、ir光谱测定法(gnanasambandam&proctor,2000,food chemistry,68,327-332；haas&jager,1986,journal of food science,51(4),1087-1088；reintjes等,1962,journal of food sciences,27,441-445)和nmr光谱测定法(grasdalen等,1988,carbohydrate research,184,183-191)。已经开发了使用hplc(chatjigakis等,1998,carbohydrate polymers,37,395-408；levigne等,2002,food hydrocolloids,16(6),547–550；voragen等,1986,food hydrocolloids,1(1),65-70)和gc-顶部空间(huisman等,2004,food hydrocolloids,18(4),665-668；walter等,1983,journal of food science,48(3),1006–1007)分析果胶皂化后的甲醇含量的其它方法。已经开发了毛细管电泳(ce)方法来确定聚合物本身的dm(jiang等,2005,food chemistry,91,551-555；jiang等,2001,agricultural and food chemistry,49,5584-5588；zhong等,1998,carbohydrateresearch,308,1-8；zhong等,1997,carbohydrate polymers,32(1),27-32)。ce方法的一个优点是：计算dm不需要样品的gala含量，而根据gc顶部空间和hplc方法，在dm计算之前必须知道gala值。

40、出乎意料地发现，使用至少一种de小于65％的果胶能够预防、减轻和/或治疗炎性病症、疾病或不适。

41、根据本发明的果胶优选未酰胺化(果胶中不存在酰胺基团)。

42、此外，出乎意料的是，与使用现有技术中已知的果胶相比，使用较低浓度的果胶获得了这种效果。这导致配制方面的优点，因为较低浓度的本发明果胶更容易配制到食品和/或饲料产品中。

43、因此，本发明涉及用于治疗患者的免疫介导的疾病和炎性疾病的酯化果胶或酯化果胶的混合物，其特征在于：所述酯化果胶(或酯化果胶的混合物)的酯化度(de)小于65％。

44、在本发明的上下文中，优选通过a.g.j.voragen、h.a.schols和w.pilnik在题为“determination of the degree of methylation and acetylation of pectins byh.p.l.c”的出版物(公开于food hydrocolloids，第1卷，第1期，第65-70页，1986)中所述hplc方法测定酯化度。

45、此外，本发明涉及通过向患者施用酯化果胶(或酯化果胶的混合物)来预防、减轻和/或治疗炎性病症、疾病或不适(减轻炎性疾病)的方法(m)，其中所述果胶的酯化度小于65％。

46、如实施例所示，酯化度较高的果胶(超过本发明的果胶；即de为75)效果差得多，并且仅在较高果胶剂量下有效。

47、在本发明的上下文中，可以从任何已知的来源获得果胶。上文给出了合适来源的清单。通过使用上述方法之一，获得具有恰当de的果胶。

48、优选地，果胶(作为单一化合物或当在混合物中使用时)的de小于60％，更优选小于55％，特别优选小于50％。

49、因此，本发明还涉及用于治疗免疫介导的疾病和炎性疾病的酯化果胶或酯化果胶的混合物，其为这样的酯化果胶或酯化果胶的混合物，其中所述果胶的de小于60％。

50、因此，本发明还涉及用于治疗免疫介导的疾病和炎性疾病的酯化果胶或酯化果胶的混合物，其为这样的酯化果胶或酯化果胶的混合物，其中所述酯化果胶或酯化果胶的de小于55％。

51、因此，本发明还涉及用于治疗免疫介导的疾病和炎性疾病的酯化果胶或酯化果胶的混合物，其为这样的酯化果胶或酯化果胶的混合物，其中所述酯化果胶或其混合物酯化果胶的de小于50％。

52、因此，本发明还涉及方法(m1)，其是方法(m)，其中所述果胶的de小于60％。

53、因此，本发明还涉及方法(m1’)，其是方法(m)，其中所述果胶的de小于55％。

54、因此，本发明还涉及方法(m1”)，其是方法(m)，其中所述果胶的de小于50％。

55、通常，果胶的de为至少1％、优选至少2、更优选至少3％。因此，存在1-65％、2-65％、3-65％、1-60％、2-60％、3-60％、1-55％、2-55％和3-55％的范围。

56、商业果胶可以是几个群体的混合物：取代基分布在分子内水平上(在单个果胶聚合物链内)或在分子间水平上(在单个果胶样品内)可以不同。这适用于所有取代基，因此适用于糖类以及酯化，所以这两个类别在下文中都用“取代基”一词来表示。取代基可以完全随机分布。当取代基有规律地分布在单个果胶聚合物链上时，这种随机分布可遵循均匀分布模式，从而导致更均质的果胶聚合物链。如果一种果胶样品中的所有果胶聚合物链具有相同的均质类型，则样品也可被称为均质的。

57、然而，一种均质果胶聚合物链可以存在于具有其他均质果胶聚合物链但具有不同的分子内(但仍然是均质的)取代基分布的组合物中。在这种情况下，果胶样品应被视为异质的。

58、此外，还可以对根据本发明的酯化果胶进行修饰。一种可行的修饰是酰胺化。酰胺化果胶是果胶的一种修饰形式。在这种情况下，一些半乳糖醛酸被氨转化为羧酸酰胺。这是根据众所周知的方法进行的。酰胺基通常存在于酰胺化gala残基的c-6位。如果果胶被酰胺化，则de通常以酰胺化度(即dam)来表示。在这种情况下，酯化度根据定义为每100摩尔总半乳糖醛酸(游离的gala和经取代的gala合在一起)中存在的酰胺的量(以摩尔计)。

59、其他可行的果胶修饰是乙基或丙基。

60、优选地，果胶的酯化类型是甲基化和/或乙酰化，更优选甲基化。

61、因此，本发明还涉及如上所述的用于治疗免疫介导的疾病和炎性疾病的酯化果胶或酯化果胶的混合物，其中所述果胶的酯化类型是甲基化和/或乙酰化。

62、因此，本发明还涉及如上所述的用于治疗免疫介导的疾病和炎性疾病的酯化果胶或酯化果胶的混合物，其中所述果胶的酯化类型是甲基化。

63、因此，本发明还涉及方法(m1)，其是方法(m)，其中所述果胶的酯化类型是甲基化和/或乙酰化。

64、因此，本发明还涉及方法(m1’)，其是方法(m)，其中所述果胶的酯化类型是甲基化。

65、stéphanie guillotin的博士论文(studies on the intra-and intermoleculardistributions of substituted in commercial pectins.wageningen university，thenetherlands，2005，isbn 90-8504-265-8)中详细描述了表征天然果胶、经修饰果胶以及商业果胶的不同组分(即gala含量、中性糖含量、甲基酯化度、乙酰化度、酰胺化度、非甲基酯化的gala的分布、分子量)的方法。

66、如上所述，特定果胶被用于对抗人或动物的炎性疾病。

67、术语“患者”是指可能发生或已患有炎性疾病的人或其它动物，包括禽鸟、牛科动物、犬科动物、马、鸡(galline)、猫科动物、山羊、兔、鼠科动物、鼬鼠科动物、绵羊、鱼、猪和狐狸动物，优选地，所述患者是人、牛科动物、犬科动物、猫科动物、鸡、绵羊、猪或禽鸟。

68、如上所述，使用本发明的特定果胶来预防、减轻和/或治疗炎性病症、疾病或不适。通过以下事实获得了该结果：本发明的特定果胶出乎意料地能够结合tlr2(其参与许多疾病)来调节肠屏障功能和调节免疫反应。

69、toll样受体(tlr)是在先天免疫系统中起关键作用的一类蛋白质。它们是通常在岗哨细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)中表达的单一、跨膜的非催化性受体，识别来自微生物的结构保守分子。一旦这些微生物突破了物理屏障(例如皮肤或肠道黏膜)，便被tlr识别，其激活免疫细胞反应。tlr包括tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、tlr11、tlr12和tlr13。

70、出乎意料地发现，只有具有低酯化度(即低de)的果胶能够以足够的方式结合tlr2。特别地，具有低甲基化度(即低dm)的果胶能够以足够的方式结合tlr2。

71、利用基于细胞的试验来检测根据本发明的特定果胶与tlr的相互作用。在本发明的语境中，使用hek-bluetm检测(来自invivogen)。hek-bluetm系统由多种特定的细胞系和细胞培养基构成，其被开发用于通过所谓的seap表达提供一种快速便捷的方法来监测分子间相互作用(详见实施例1)。这种细胞试验能够商业获得。下面的实施例中详细公开了这些试验的结果。结果表明：低酯化的(特别是甲基化的)果胶显示出出乎意料的积极效果！

72、所用果胶的量可因患者而异。其必须是显示出足够效果的量。

73、患者所摄入的果胶可以是任何形式的。可以将果胶原样使用或在与其它成分的混合物中使用。当在混合物中使用时，在该混合物中的量取决于其它成分以及混合物的形式。

74、通常根据混合物的用途来选择所使用的成分。成分可用来改善混合物的性质，或当混合物用于配制成最终组合物时，用来改善最终组合物。

75、成分可以用于一个或多个目的。很明显，这些成分必须是食品或饲料级的(取决于其用途)。

76、果胶也可以是食品或饲料产品的一部分，而食品或饲料产品可以是任何公知和常用的形式。

77、所用的果胶量可以变化(取决于患者和/或靶向的炎性疾病)。这取决于体重。通常，每千克体重每天0.01-5g de小于65％的果胶的量是期望的。

78、特定食品或饲料产品中果胶的量通常因食品或饲料产品而异。还取决于消费者/动物食用多少这种食品或饲料产品。食品或饲料产品中的量应该是这样的量：通过惯常消耗所述食品或饲料产品，能够消耗必需剂量的果胶。

79、以下实施例用于阐释本发明。

80、实施例

81、实施例1果胶抑制tlr2介导的nfkb激活

82、细胞系和培养

83、在含有10％去补体胎牛血清、50u/ml青霉素(sigma,st.louis,mo,usa)、50μg/ml链霉素(sigma,st.louis,mo,usa)和100μg/ml normocin(invivogen,toulouse,法国)的dmem培养基(lonza,basel,瑞士)中培养细胞系。

84、使用表达人tlr2和seap(可溶性胚胎碱性磷酸酶)的hek-bluetm tlr2-cd14细胞(invivogen,toulouse,法国)。当tlr2被激动剂激活时，nfκb和ap1被刺激移动到这些细胞系中的细胞核。在本文中，seap基因受nfκb/ap-1应答启动子的控制。表达后，seap基因产物被分泌到培养基中，并且可以使用quantiblue(invivogen,toulouse,法国)溶液进行定量。取决于活性，酶将粉色转化为蓝色，这可以利用分光光度计来测量。

85、向培养基中加入1x hek-bluetm selection(invivogen,toulouse,法国)以仅控制hek-bluetm tlr2-cd14细胞的生长。

86、果胶来源

87、所有果胶都是从柑橘中分离出来的。de为0的果胶得自mp biomedicals,llc。de为7、22、45、60和75的果胶得自cp kelko。

88、果胶抑制tlr2-1

89、用tlr2-1特异性激动剂pam3csk4激活hek-bluetm tlr2-cd14细胞。以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml加入不同de值(0、7、22、45、60和75)的果胶。作为对照，仅用果胶孵育hek-bluetm tlr2-cd14细胞。

90、将hek-bluetm tlr2-cd14细胞以500000个细胞/ml接种在每孔100μl体积的96孔板中。使细胞生长过夜。第二天，用不同浓度的不同果胶处理细胞以研究对tlr2的效果。用果胶孵育1小时后，以100ng/ml的浓度加入pam3csk4。在37℃下用果胶和pam3csk4孵育24小时后，测定seap基因的表达。将孵育细胞的上清液与quanti-blue溶液以1:10的比例混合。seap的存在使得quanti-blue变蓝。通过使用elisa板阅读器versa max(moleculardevices,sunnyvale,ca,usa)测量650nm处的颜色强度来量化nfκb激活。该试验在96孔板中进行，具有8个技术重复。每个实验重复三次。

91、

92、

93、出乎意料地，通过nfκb激活seap基因表达之后seap活性的水平，根据650nm处quanti-blue的颜色变化确定了果胶抑制tlr2。de低的果胶的抑制作用最强，但所有de值的抑制作用都取决于各自果胶的浓度。de值较高(45、60和75)的果胶的抑制作用明显是浓度依赖性的，这表明：在较高浓度下，局部de<65％(由于整个果胶分子和/或样品中的酯化gala残基的可能不规则或不均匀的分布)的分子内区域或分子间区域的绝对数变得较高，因此tlr2抑制(通过de低于65的那些区域)增强。

94、hek-bluetm tlr2-cd14的生存力不受添加果胶的影响(使用wst-1试剂检测)。

95、实施例2果胶与tlr2结合

96、构建tlr2胞外域-ha表达质粒

97、使用plusmini试剂盒(qiagen,venlo,荷兰)从hek-bluetm tlr2-cd14细胞中提取rna。使用oligodt引物(life technologies,carlsbad,ca,usa)、dntp混合物(life technologies,carlsbad,ca,usa)和superscripttm iii逆转录酶(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)并根据供应商的手册来合成cdna。使用来自hek-blue tmhtlr2-cd14的cdna，并使用正向引物5’-gcgcaccggtatgccacatactttgtggatgg-3’、反向引物5’-gcgcggatccgtgacattccgacaccgagag-3’和pfu dna聚合酶(thermo scientific,waltham,ma usa)，合成从密码子1到密码子566的tlr2。引物的5′端侧翼是gc双联体用于限制性酶识别。agei和bamhi限制性位点分别包含在正向引物和反向引物中。用agei和bamhi限制酶(thermo scientific,waltham,ma usa)和质粒pselect-cha-blasti(invivogen,toulouse,法国)消化pcr产物以产生粘性末端。使用t4dna连接酶(thermo scientific,waltham,ma usa)连接pcr扩增的tlr2胞外域片段和线性质粒。连接的质粒被用于转化oneshot top10化学感受态e.coli(life technologies,carlsbad,ca,usa)。使用杀稻瘟菌素琼脂培养基(invivogen,toulouse,法国)选择经转化的e.coli细胞。筛选获得的菌落以得到在质粒中正确定位基因。使所选的正确菌落在杀稻瘟菌素液体培养基(invivogen,toulouse,法国)中生长，并使用qiagen midi制备试剂盒分离质粒。然后对质粒进行测序以选择未突变的克隆(baseclear,leiden,荷兰)。

98、用tlr2胞外域-ha表达片段转染hek293t

99、将hek293t细胞以500000个细胞/ml接种在12孔培养板中并孵育过夜。第二天，通过使用lipofectamine(life technologies,carlsbad,ca,usa)进行转染。用限制性内切酶noti(fast digest,thermo scientific,waltham,ma usa)线性化序列经验证的质粒。将经纯化的1μg线性质粒在低血清培养基opti-(life technologies,carlsbad,ca,usa)中稀释并与3.5μl lipofectamine(life technologies,carlsbad,ca,usa)混合。将这种转染混合物在室温下孵育30分钟，然后加入到培养基中先前接种的细胞中。将细胞与转染培养基混合物一起孵育24小时，并使用杀稻瘟菌素在含有10％去补体胎牛血清、50u/ml青霉素(sigma,st.louis,mo,usa)、50μg/ml链霉素(sigma,st.louis,mo,usa)和100μg/ml normocin(invivogen,toulouse,法国)的dmem培养基(lonza,basel,瑞士)中选择转染细胞。分离单细胞克隆以形成hek293t tlr2胞外域-ha细胞系。

100、细胞培养

101、在含有10％去补体胎牛血清、50u/ml青霉素(sigma,st.louis,mo,usa)、50μg/ml链霉素(sigma,st.louis,mo,usa)、100μg/ml normocin(invivogen,toulouse,法国)和50μg/ml杀稻瘟菌素(invivogen,toulouse,法国)的dmem培养基(lonza,basel,瑞士)中培养细胞系。

102、蛋白质免疫沉淀

103、使用1x ripa裂解缓冲液(merck millipore,billerica,ma,usa)，在由aebsf(4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐)、抑酶肽、苯丁抑制素、e-64、edta和亮抑酶肽组成的蛋白酶抑制剂混合物(sigma,st.louis,mo,usa)的存在下，在4℃下裂解过夜生长的hek293t tlr2胞外域-ha细胞持续10分钟，然后以0％功率进行两次持续5秒的超声。以14000g离心10分钟后，分离上清液。使anti-ha agarose(thermo scientific,waltham,ma usa)在微量离心管中免疫沉淀tlr2胞外域-ha标记的蛋白质。使用ha合成肽(thermo scientific,waltham,ma usa)，通过在30℃下用单倍床体积的ha合成肽进行两次持续15分钟的孵育来竞争性洗脱蛋白质。将分离的蛋白质脱盐并使用zeba旋转脱盐柱和装置,40k mwco(thermoscientific,waltham,ma usa)除去ha肽。使用thermo scientific bca蛋白质测定试剂盒定量分离并脱盐的蛋白质。

104、用于tlr2和果胶结合的elisa

105、elisa缓冲液由ph 8.2的0.05m tris缓冲液中的1mm cacl2和150mm nacl组成。缓冲液用于洗涤以及用于抗体和果胶的稀释剂。通过将3％乳粉(frieslandcampina,amersfoort,荷兰)溶解在elisa缓冲液中来制备封闭缓冲液。对于抗体溶液，使用用elisa缓冲液1:2稀释的封闭缓冲液来溶解抗体。在37℃下，用50μl 50μg/ml的聚-l赖氨酸处理elisa板(corning,tewksbury,ma,usa)1小时。用400μl elisa缓冲液洗涤孔一次。将果胶(de为0、7、22、45、60和75)以1mg/ml的浓度溶解在elisa缓冲液中，并向每个孔中加入50μl。在37℃下孵育板4小时以允许果胶结合。然后用400μl elisa缓冲液洗涤每个孔，并在4℃下用100μl封闭缓冲液封闭过夜。封闭步骤后，用elisa缓冲液洗涤elisa板一次。将tlr2胞外域-ha融合蛋白以每孔0.33μg、1μg、3μg和9μg的浓度施加到果胶包被的孔中。然后在37℃下孵育elisa板3小时。使用ha合成肽作为负对照，每孔的浓度为0.33μg、1μg、3μg和9μg，与tlr2胞外域-ha融合蛋白相同。1:100稀释的来自plantprobes(leeds，uk)的果胶结合抗体lm19(对de 0和de 7特异)和lm20(对de 22、de 45、de 60和de 75特异)被用作果胶结合的正对照。之后，用400μl elisa缓冲液洗涤孔5次，并用50μl 1:200稀释的ha标记物的初级检测抗体(cell signaling,danvers,ma,usa)孵育。在37℃下孵育第一抗体2小时。第一抗体孵育后，再用elisa缓冲液洗涤板5次。洗涤后，将50μl 1:500稀释的生物素标记的第二抗体(southern biotech,birmingham,al,usa)施加到每个孔中。在37℃下孵育生物素标记的抗体1小时。该步骤之后，用400μl elisa缓冲液洗涤5次。将1:1000稀释的链霉亲和素-hrp(dako,heverlee,比利时)(100μl)加入每个孔中。在37℃下孵育1小时后，用400μl elisa缓冲液洗涤板7次。最后，为了检测，将100μl tmb底物(cell signaling,danvers,ma,usa)施加到每个孔中，并在37℃下孵育30分钟。通过添加100μl终止液(cell signaling,danvers,ma,usa)来终止反应。在读板器versa max(molecular devices,sunnyvale,ca,usa)中，在420nm处读取elisa板。为了清楚起见，从利用tlr2胞外域-ha获得的值中减去负对照的值。

106、

107、出乎意料地，如elisa试验中获得的剂量依赖性值所示，de低的果胶与tlr2胞外域直接结合。

108、实施例3果胶仅抑制tlr2的促炎途径而不抑制其调控途径

109、细胞系

110、将hek-bluetm null1(invivogen,toulouse,法国)以500000个细胞/ml接种在12孔培养板中并孵育过夜。第二天，通过使用lipofectamine(life technologies,carlsbad,ca,usa)进行转染。用noti(thermo scientific,waltham,ma usa)线性化质粒puno3-htlr2(invivogen,toulouse,法国)。将1μg纯化的dna在低血清培养基opti-(life technologies,carlsbad,ca,usa)中稀释并与3.5μl lipofectamine(life technologies,carlsbad,ca,usa)混合。将这种转染混合物在室温下孵育30分钟，然后加入到培养基中先前接种的细胞中。将细胞与转染培养基混合物一起孵育24小时，并使用zeocin(100μg/ml)和潮霉素b(150μg/ml)/ml在含有10％去补体胎牛血清、50u/ml青霉素(sigma,st.louis,mo,usa)、50μg/ml链霉素(sigma,st.louis,mo,usa)和100μg/ml normocin(invivogen,toulouse,法国)的dmem培养基(lonza,basel,瑞士)中选择转染细胞。分离单细胞克隆。如此获得的hek-bluetm null1 tlr2细胞系仅表达tlr2而不表达cd14。

111、tlr2激活和抑制试验

112、将hek-bluetm null1 tlr2细胞以500000个细胞/ml接种在每孔100μl体积的96孔板中。使细胞生长过夜。第二天，用不同的果胶处理细胞以研究对tlr2的效果。用果胶孵育1小时后，以100ng/ml的浓度加入tlr2-6特异性激动剂fsl-1。在37℃下用果胶和fsl-1孵育24小时后，测定seap基因的表达。将孵育细胞的上清液与quanti-blue溶液以1:10的比例混合。seap的存在使得quanti-blue变蓝。通过使用elisa读板器versa max(moleculardevices,sunnyvale,ca,usa)测量650nm处的比色读数来量化nfκb激活。该试验在96孔板中进行，具有10个技术重复。

113、每个实验重复三次。

114、

115、数据显示：果胶不抑制tlr2-6信号传导途径，因为通过fsl-1的hek-bluetm null1tlr2细胞中的刺激不因果胶的存在而改变，而通过pam3csk4的刺激清楚地显示：果胶抑制tlr2 -1信号传导应答(实施例1)。

116、实施例4仔猪饮食中的果胶导致紧密连接的肠渗透性降低

117、仔猪喂食试验设置

118、年幼仔猪的实验农场位于法兰德斯(比利时)，其由8组(battery)组成，每组包含4栏。所研究的仔猪是topigs piétrains的杂种，其在21天时断奶。在断奶时以及断奶后2周和4周分别称重仔猪。在称重时，记录每栏4只仔猪的饲料摄入。到达时，用新的sanitel号码标记仔猪。在试验期间，兽医和felasa d认证的人员根据法律ec/86/609中所述的国际准则监督所进行的仔猪实验。

119、在试验开始时，每栏(1.5m x 1.5m)包含4只仔猪。对于每栏，针对粉或颗粒安装一个喂食器(随意)。每栏安装一个饮用奶嘴。起始温度为28±2℃，直至断奶后10天。之后，将温度降至25±2℃。

120、给予商业未掺药饮食。未掺药意味着仔猪在试验前和试验期间没有接受任何治疗性抗生素。以粗粉的形式给予饮食。分析所有饲料的营养成分含量。

121、应用四种处理(饮食a、b、c、d)，7个重复，每组4只仔猪。在试验开始时，将仔猪(体重约7公斤)按重量分配到不同的栏中。这种分配是为了使每个处理和栏具有相等的平均重量和相等的围绕平均重量的标准偏差。对于微生物计数和采活检，仔猪接受过量的巴比妥类(nembutal)，然后杀死。之后，对仔猪进行切割。立即处理用于微生物计数的样品，同时将用于组织化学实验的样品固定用于以后的分析。

122、在整个试验期间，除了微生物计数期之外，随意喂食仔猪。在进行微生物计数前三天，仔猪的喂食受到限制。仔猪每天接受三次一定量的饲料，所述饲料被仔细称重并记录。在8:00、13:00和18:00给予饲料。必要时，(通过注射)单独处理病仔猪。以下参数被考虑在内。(i)个体生长数据，(ii)每栏的饲料摄入数据(针对最终损失进行校正)，(iii)断奶、开始和整个试验期期间的饲料转化率，(iv)排泄物评分和临床评分，(v)紧密连接(tightjunctions)，(vi)微生物分析，(vii)组织化学分析。

123、饮食

124、饲料组成(以g/kg计)：

125、

126、*木聚糖酶/β-葡聚糖酶和植酸酶混合物(basf)

127、**预混物包含香料、额外的微量矿物质、维生素(vitamex n.v.)

128、果胶来源

129、de为33和55的果胶分离自柑橘属，其是从herbstreith&fox(neuenbürg/württingen,德国)获得的。大豆粕(sbm)来自南美洲来源(来自阿根廷、巴西和/或巴拉圭的混合物)，通过将33％干物质的sbm与自来水混合并在120℃下高压灭菌30分钟对其进行加工以提取残留的果胶。冷却后，将所得物质冷冻干燥并研磨，并在饮食中原样使用。

130、甘露醇-乳果糖试验

131、通过在动物中进行甘露醇-乳果糖试验来量化回肠的渗透性。乳果糖不能通过完整小肠，这被认为是积极的，因为全身感染和免疫问题的可能性较低。

132、甘露醇是一种代谢惰性的单糖，通过肠粘膜被被动吸收。任何吸收的甘露醇都在几小时内完全排泄到尿中。以0.3g甘露醇/kg体重，通过胃抽器向小猪施用甘露醇(解剖前4小时)。乳果糖是一种代谢惰性的二糖，除非粘膜屏障受损，否则通常不被吸收。任何吸收的乳果糖在6小时内完全排泄到尿中。以0.75g乳果糖/kg体重，通过胃抽器向仔猪施用乳果糖(解剖前4小时)。

133、在解剖期间，收集仔猪的尿。在具有健康肠的仔猪中，乳果糖的平均吸收率低于施用剂量的1％。尿中>1％乳果糖的回收率指示二糖渗透性过高。

134、在具有健康肠的仔猪中，甘露醇的平均吸收率是施用剂量的>14％。

135、尿中<14％甘露醇的回收率指示碳水化合物吸收不良。

136、较低的乳果糖/甘露醇比(l/m比)指示饮食的积极作用。

137、

138、如上所示：所有果胶(特别是de为33和55的果胶)均导致l/m比降低，因此在幼猪的小肠中具有积极的效果。

139、实施例5饮食中的果胶导致绒毛与隐窝之比增加

140、仔猪喂养试验设置如实施例4所述。

141、用于组织学的样品制备

142、取样：取十二指肠和/或回肠的样品，并用生理水(0.9％ nacl)冲洗。储存在20ml福尔马林缓冲液(1ml甲醛(37％)/升)中。4.5g nah2po4+10.4g na2hpo4)

143、包埋(bedding)：将石蜡溶液倒入接受器中(未完全充满)，并将肠样品垂直放置在接受器中。在4℃下凝固，并使接受器完全充满。在-3℃下凝固。

144、活检：用10％二甲苯清洁解剖刀，然后干燥。用刷子和针状物将切片转移到50％醇中。然后切成块，并用刷子和显微镜玻片转移到蒸馏水(65℃)中。将样品置于显微镜玻片上并在60℃下孵育一晚。

145、在环境温度下的苏木精-伊红(h&e)染色步骤：

146、1).去除石蜡

147、·用10％二甲苯洗涤3次(持续5分钟)

148、·用100％乙醇洗涤2次(持续3分钟)

149、·用90％乙醇洗涤1次(持续3分钟)

150、·用70％乙醇洗涤1次(持续3分钟)

151、·用水洗涤1次(持续3分钟)

152、·用水洗涤1次(持续3分钟)

153、2).染色

154、·在mayers苏木精中孵育(持续6分钟)

155、·用水洗涤1次(持续5分钟)

156、3).反染色

157、·在10％伊红中孵育(持续5分钟)

158、·用水洗涤10次(每次持续30秒)

159、4).脱水

160、·用90％乙醇洗涤10次(每次持续30秒)

161、·用70％乙醇(每次持续30秒)

162、·用100％乙醇洗涤2次(持续5分钟)

163、·用10％二甲苯洗涤3次(持续5分钟)

164、量化绒毛长度和隐窝深度

165、通过olympus显微镜分析上述嵌入的组织学样品，并测量绒毛长度(mm)和隐窝(深度)。

166、

167、较长的绒毛意味着较高的吸收能力，而较长的隐窝意味着较低的吸收能力。因此，较高的绒毛与隐窝之比被视为饮食的积极效果，而较低的绒毛与隐窝之比被视为使用各饮食的消极缺点。如所示，尤其是含有de为33和55的果胶的饮食在十二指肠和回肠中均具有提高的绒毛-隐窝比，这证明了两种果胶改善胃肠健康的能力。

168、实施例6果胶在阿霉素诱导的粘膜炎中充当抗炎剂

169、粘膜炎也被称为粘膜屏障损伤，是放疗和化疗处理最严重的副作用之一。粘膜屏障的细胞凋亡和炎症都会导致其不连续，从而促进细菌易位。在粘膜炎的病理生理学中，五个阶段是重要的：(1)在起始阶段期间，形成活性氧物质，从而导致核因子κb(nfκb)被激活，(2)在上调/信使生成阶段期间，诱导信使分子例如肿瘤坏死因子α(tnfα)，从而导致治疗相关的组织炎症和细胞凋亡，(3)在扩增/信号转导阶段期间，扩增信使分子，从而导致更多的炎症和细胞凋亡，(4)在溃疡性阶段期间，由细胞凋亡引起上皮屏障不连续，从而促进细菌易位，和(5)自发性愈合阶段，其特征在于细胞增殖(sonis,2004,semin oncol nurs.20(1):11-5)；van vliet等人,2010,plos pathog.6(5):e1000879)。

170、小鼠

171、c57bll/6雌性小鼠(7-10周龄)购自法国的janvier实验室。格罗宁根大学动物伦理委员会(animal ethical committee of the university of groningen)批准了动物的实验用途。在实验开始之前，使所有小鼠适应2.5周。通过施用阿霉素(sigma,st.louis,mo,usa)来诱导粘膜炎。饮食向小鼠供应随意rmh-b饮食(ab饮食,woerden,荷兰)。供应商列举的饮食成分是小麦、肉粉(80％，已消毒)、黄色马齿种玉米、全燕麦、小麦麸、苜蓿、豆油、干酵母、磷酸二钙、碳酸钙、nacl、dl-蛋氨酸、维生素和微量元素。从自来水向小鼠提供饮用水，水瓶每周更换一次。

172、果胶来源

173、de为7的果胶得自cp kelko。

174、诱导粘膜炎和读数

175、将阿霉素溶解在无菌的0.9％氯化钠中并在4℃下等份储存。将果胶(dm为7)溶解在无菌水中并通过灌胃施用给小鼠持续10天或11天，每天两次，3mg/天。在第8天，以10mg/kg的浓度腹膜内注射阿霉素。在第10天(48小时阿霉素)或第11天(72小时阿霉素)处死小鼠。通过灌胃接受水的动物充当对照。收集组织样品后，通过颈椎脱臼处死小鼠。

176、在小鼠中阻断tlr2

177、在阿霉素处理前1小时，以10mg/kg腹膜内施用tlr2阻断抗体克隆t2.5(invivogen,toulouse,法国)。

178、中性粒细胞计数

179、用2ml pbs收集腹膜灌洗液以收集腹膜中性粒细胞流入。使用ztmseries coulter(beckman coulter,brea,ca,usa)计数腹膜灌洗液中活细胞的总数。将灌洗液以500000个细胞/ml稀释，并应用100μl细胞溶液来制备细胞离心涂片(cytospin)。在室温下，用giemsa染色剂(merck millipore,billerica,ma,usa)对细胞离心涂片玻片染色1小时。在hamamatsu玻片扫描仪(hamamatsu photonics,日本)中扫描染色的玻片，并使用250个细胞中的形态特征对中性粒细胞进行计数。利用来自细胞离心涂片制品的中性粒细胞计数和腹膜中的总细胞计数来计算中性粒细胞的总数。

180、

181、从数据可以看出：阿霉素诱导的粘膜炎使中性粒细胞计数增加为56倍。通过tlr2阻断抗体克隆t2.5或果胶de7阻断tlr2显著降低了中性粒细胞计数，从而表明果胶充当抗炎剂。

182、实施例7果胶对健康有益的微生物有积极作用

183、消化物收集

184、在实验饮食喂食期间(实施例4)，在第14天和第28天收集猪排泄物样品。排泄物收集期之后，麻醉动物并进行安乐死。从末端回肠、近端结肠、中段结肠和远端结肠收集消化物样品。将每种消化物的一部分储存在1.5ml eppendorf管中以分析微生物群组成和scfa。将这些管立即冷冻在液氮中并储存在-80℃。将剩余量的消化物立即储存在-20℃直至进一步分析。

185、dna提取和微生物群分析

186、通过使用排泄物dna提取流程(salonen a,j,jalanka-tuovinen j,immonen o,m,kekkonen ra,palva a&de vos wm.2010.comparativeanalysis of fecal dna extraction methods with phylogenetic microarray:effective recovery of bacterial and archaeal dna using mechanical celllysis.journal of microbiological methods,81:127–134)从250mg消化物中提取微生物dna。通过连续沉淀来分离dna，最后通过使用qiaamp dna粪便迷你试剂盒柱(qiagen,hilden,德国)并根据制造商的建议进行纯化。通过使用miseq平台(illumina)以双末端模式扩增并测序16srrna基因。

187、序列分析

188、使用qiime 1.9.0对原始illumina fastq文件解复用，进行质量过滤并分析。

189、

190、

191、*相对丰度是通过illumina测序获得的总数据集中普雷沃氏菌的16s rrna数据的百分比**相对增加是总数据集中普雷沃氏菌16s rrna的倍数增加％，即针对喂养特定果胶的样品测定的相对丰度除以对照样品。

192、出乎意料地，向饮食中添加果胶会导致肠中的普雷沃氏菌物种的普遍性增加(其是一个健康指标，参见wu gd,chen j,hoffmann c,bittinger k,chen yy,keilbaugh sa,bewtra m,knights d,walters wa,knight r,sinha r,gilroy e,gupta k,baldassano r,nessel l,li h,bushman fd&lewis jd.2011.linking long-term dietary patternswith gut microbial enterotypes.science334:105–108)。

193、所有这些实施例都清楚且出乎意料地表明：特定果胶显示出显著的改善。