一种利用乳酸乳球菌的发酵牛奶方法与流程

本发明属于后生元，具体涉及一种利用乳酸乳球菌产生色氨酸及其代谢物质的发酵牛奶方法。

背景技术：

1、乳酸乳球菌(lactococcus lactis，lla)是一类革兰氏阳性菌，存在于许多发酵食品中，被认为对人体健康有益处。发酵的乳主要含有活的乳酸乳球菌和至少18种色氨酸代谢物，如附图所示。益生菌乳酸菌具有抗过敏[1]、抗炎和免疫调节等生物活性作用[2]。此外，有文献表明，乳酸乳球菌的使用增强了先天免疫和适应性免疫，从而提高了感染清除率[3]。发酵乳的色氨酸代谢物是有益分子，即后生元，主要代谢物为血清素、犬尿氨酸及吲哚类衍生物。与普通牛奶相比，乳酸菌发酵乳中含有较高含量的吲哚-3-乳酸(ila)、吲哚-3-乙酸(iaa)和犬尿氨酸，它们是芳烃受体(ahr)的强配体。ahr的激活参与多种生物和医学过程，包括免疫反应、发育和病理调节[4]。据报道，ahr的激活积极调节心脏功能、血管发育和血压的健康[5]。此外，ahr信号的抗炎作用也得到了很好的阐释[6]。总的来说，本发明的乳杆菌发酵乳可能具有积极提高免疫力和心血管功能的生物活性。发酵乳还可能具有抗过敏和抗炎作用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供一种利用乳酸乳球菌的发酵牛奶方法，通过从酸奶块中提取的lla发酵牛奶，获得的酸奶进行色氨酸代谢分析。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种利用乳酸乳球菌的发酵牛奶方法，包括以下步骤：

3、1.lla发酵牛奶；

4、2.发酵产物进行色氨酸代谢分析；

5、3.对步骤2中的色氨酸代谢产物进行数据分析。

6、进一步的，所述步骤1具体为：从酸奶块中提取的lla在tsb(solarbio,北京)37℃培养过夜，经5000rpm离心10min后，用磷酸盐缓冲盐(pbs)混匀以用于牛奶发酵。通过酶标仪，将光密度为600nm(od600)转化为菌落形成单位(cfu)以计算细菌数量。发酵牛奶时，添加108cfu/ml的纯牛乳与108cfu/ml的lla，并每6h观察一次容器中致密固体的形成。

7、进一步的，所述步骤2进行色氨酸代谢物分析具体为：将步骤1中牛奶发酵形成的致密固体在-20c下冷冻30min制备冻干发酵粉，并使用eyela fdu-2110实验室冷冻干燥机在100微米汞柱的真空压力下干燥12小时将冻干的发酵粉(100mg)溶解在500ul乙腈/水(1：1，v/v)溶剂中，使用质谱仪进行液相色谱和质谱分析(lc-ms)。流动相a和b分别采用甲酸铵(25mm)和0.1％的乙腈甲酸溶液。并采用多反应监测模式(mrm)选择性地定量监测发酵牛奶中的色氨酸代谢物。色谱峰面积和保留时间采用multiquant 3.0.2软件提取，并建立不同浓度的18种色氨酸代谢物的标准曲线进行定量。

8、进一步的，所述步骤3具体为：对所有代谢物的表达量进行距离矩阵计算，并用层次聚类图，以及根据分散程度绘制表达量趋势图进行分析。

9、进一步的，所述步骤2中使用的质谱仪为配备了电喷雾电离装置源(esi)的sciex5500q-trap质谱仪(ab sciex llc,弗雷明汉,马萨诸塞州,美国)，该质谱仪连接到安捷伦1290无限超高性能液相色谱(uhplc)系统(安捷伦技术公司，圣克拉拉市，加利福尼亚州，美国)。

10、进一步的，所述步骤1中使用的磷酸盐缓冲盐添加量为每50ml菌液/20ml pbs。

11、本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明益生菌乳酸菌具有抗过敏、抗炎和免疫调节等生物活性作用；乳酸乳球菌的使用增强了先天免疫和适应性免疫，从而提高了感染清除率。此外，乳酸菌乳发酵中的色氨酸代谢物可能具有积极提高免疫力和心血管功能的生物活性。发酵乳还可能具有抗过敏和抗炎作用。

技术特征：

1.一种利用乳酸乳球菌的发酵牛奶方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用乳酸乳球菌的发酵牛奶方法，其特征在于，所述步骤1具体为：从酸奶块中提取的lla在tsb中37℃培养过夜，经5000rpm离心10min后，用磷酸盐缓冲盐混匀以用于牛奶发酵；通过酶标仪，将od600转化为cfu以计算细菌数量。发酵牛奶时，添加108cfu/ml的纯牛乳与108cfu/ml的lla，并每6h观察一次容器中致密固体的形成。

3.根据权利要求2所述的利用乳酸乳球菌的发酵牛奶方法，其特征在于，步骤2进行色氨酸代谢物分析具体为：将步骤1中牛奶发酵形成的致密固体在-20c下冷冻30min制备冻干发酵粉，并使用eyelafdu-2110实验室冷冻干燥机在100微米汞柱的真空压力下干燥12小时将100mg冻干的发酵粉溶解在500ul乙腈/水体积比为1：1的溶剂中，使用质谱仪进行液相色谱和质谱分析(lc-ms)；流动相a和b分别采用25mm的甲酸铵和0.1％的乙腈甲酸溶液；并采用多反应监测模式选择性地定量监测发酵牛奶中的色氨酸代谢物；色谱峰面积和保留时间采用multiquant 3.0.2软件提取，并建立不同浓度的18种色氨酸代谢物的标准曲线进行定量。

4.根据权利要求1所述的利用乳酸乳球菌的发酵牛奶方法，其特征在于，所述步骤3具体为：对所有代谢物的表达量进行距离矩阵计算，并用层次聚类图，以及根据分散程度绘制表达量趋势图进行分析。

5.根据权利要求3所述的利用乳酸乳球菌的发酵牛奶方法，其特征在于，所述步骤2中使用的质谱仪为配备了电喷雾电离装置源的sciex 5500q-trap质谱仪，该质谱仪连接到安捷伦1290无限超高性能液相色谱系统。

6.根据权利要求2所述的利用乳酸乳球菌的发酵牛奶方法，其特征在于，所述步骤1中使用的磷酸盐缓冲盐添加量为每50ml菌液/20ml pbs。

技术总结
本发明属于后生元技术领域，公开了一种利用乳酸乳球菌产生色氨酸及其代谢物质的发酵牛奶方法。步骤包括LLA发酵牛奶、发酵产物进行色氨酸代谢分析、对色氨酸代谢产物进行数据分析。本发明益生菌乳酸菌具有抗过敏、抗炎和免疫调节等生物活性作用；乳酸乳球菌的使用增强了先天免疫和适应性免疫，从而提高了感染清除率。此外，乳酸菌乳发酵中的色氨酸代谢物可能具有积极提高免疫力和心血管功能的生物活性。发酵乳还可能具有抗过敏和抗炎作用。

技术研发人员：黄俊铭,迟庆,汤洁,张庆镐
受保护的技术使用者：蕴能（大连）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25