专利名称：被囊细菌的制作方法
苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensisisraelensis，BTI)在形成孢子的期间产生一种胞内的称为伴孢晶体的杀虫毒素。此毒素由昆虫(如蚊子)吸收后，被昆虫肠道内的碱性物质分解，它就在昆虫的肠道内导致肠道解体并杀死昆虫。该昆虫毒素的一般生产方法如下使BTI发酵形成大量细胞，诱导细胞形成孢子，使产生毒素和形成孢子，然后溶解母体细胞，将孢子和伴孢晶体释放至培养基中。然后收集晶体和与其相连的孢子，配制杀虫剂并进行包装。将此杀虫剂分散于所需位点之上。关于这些可参见例如Aizawa的“昆虫害的微生物控制”(《农业微生物学进展》第15章397页，Subba编，OxfordIBH，1982)，Lacey等人的摘要(J.Am.Mosq.Control.Ass，1493-497，1985);Novak等人的摘要(J.Am.ControlAss.1449～453，1985)。
在第一个方面，本发明的特征是一种含有杀虫毒素的细菌，所述细菌包有一层由非生命的、树脂的、保护物质构成的被囊，该被囊在高碱性PH(例如PH高于9)条件下可渗透目标昆虫的消化酶。被囊化是指由聚合物完全包裹，从而在环境中遇到的PH水平下(例如PH低于8.5)免受环境因素的影响，这些因素包括热、湿度和溶液，例如，由雨水形成的碳酸溶液。“保护”是指该物质在农业应用中遇到的环境条件下，能显著地阻止被囊细菌的降解。
在优选的具体方案中，该毒素是伴孢晶体毒素，细菌是苏云金芽孢杆菌;聚合物在农业环境中是稳定的，例如，在土壤中或植物叶片上;具体地说，聚合物具有热稳定性(至少在高达大约120°F)，并且不会被水(PH低于8.5)、紫外辐射及农业环境中的其他条件迅速降解。另外，聚合物还保护孢子囊免受其他的环境降解，例如，微生物降解或酶降解。聚合物无须在昆虫肠道中迅速降解，只要它能容易透过溶解孢子囊的昆虫肠道液(例如PH高于10)就行。聚合物应在此条件下能透过毒素，从而将它释放至昆虫肠道中。毒素是通过将细菌培养到孢子形成的第Ⅲ期而生产的。聚合物可以是非离子型的、多阴离子型的或多阳离子型的。一种合适的非离子型聚合物是葡聚糖，淀粉或明胶;一种合适的多阴离子型聚合物是海藻酸盐或角叉胶，一种合适的多阳离子型聚合物是脱乙酰壳多糖或聚氧乙烯二胺。其它优选的聚合物的特征是(a)聚合物是交联的，最好是与甲醛、戊二醛、二甲基己二酰亚胺2HCl(DMA，参见Waterman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.63580-587，1975)、二甲基辛二酰亚胺2HCl(DMS，参见Packman等，Biochemistry，215171～5175，1982)、二〔2-(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基〕砜(BSOCOES，参见Zarling等，J.Immunol.124913～920，1980)、二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST，参见Bragg等，Eur.J.Biochem.106495～503，1980)、硫-BSOCOES(Zarling等)、硫-DST(Bragg等)、多磷酸盐离子或金属离子(例如Ca2+)的交联物;以及(b)聚合物中还含有一种添加剂，例如，防晒生色团、调味剂或引诱剂如外激素。
在第二方面，本发明涉及一种含有上述细菌的细菌细胞团。团聚体的直径优选为10～100微米，最好为20～50微米。
在第三个方面，本发明涉及一种生产被囊杀虫剂的方法。该方法包括培养含有昆虫毒素编码基因的细菌，以形成杀虫剂，然后将细菌包囊在聚合物中。
在优选的具体方案中，细菌是能够产生孢子的，细菌培养至形成孢子的第Ⅲ期，被囊化包括包裹细菌的外膜。
本发明利用微生物细胞壁这一特征，以吸引细胞聚合物，并因此被包囊。通过化学交联这些被囊制剂的稳定化产生一种适用于控制昆虫的高度稳定的产物，对于公共卫生和农业都很重要。在优选的方面，毒素是胃毒素，微被囊化提高了目标昆虫的吞食，并使毒素释放和通过目标昆虫肠道碱性基质中的消化酶活化。在一个特别优选的具体方案中，使用例如苏云金芽孢杆菌，该方法使细胞维持为完整的孢子囊。
被囊化的毒素在大田条件下高度稳定，因此不必象以前的杀虫剂那样频繁使用，从而降低使用费用。此外，生产这些杀虫剂的方法也相对便宜一些。由于优选的是使毒素保留在细菌内，因此可缩短发酵时间。例如，形成孢子的细菌只需培养至生产完成时，也就是形成孢子的第Ⅲ期。细菌可在此时用被囊聚合物直接包裹并出售、运输并以此状态施用于农产品。在天然和模拟的大田条件下，被囊毒素比非被囊毒素的半衰期长得多。此外，由于细胞能够通过聚合物的交联而团聚，因此可选择最佳的团聚物直径，使它最适于目标昆虫的饲喂要求。例如，对于蚊子来说(其中有些是滤食性动物)，当颗粒直径为25～100微米时毒性增强，而对于较小的幼虫，10～20微米的大小更好。
本发明的另一个特征是提供了在聚合物中掺入防晒生色团、食物添加剂、染料和外激素的机会和可能性。生色团保护被囊毒素不受紫外辐射，因此提高其稳定性。食品添加剂和外激素提高昆虫吞食毒素的机会。
本发明的其它特征和优点，从下述优选的具体方案和权利要求中是显而易见的。
毒素适于本发明的毒素包括杀虫毒素。合适的毒素包括常用的那些，在某些情况下它们在通常的农业应用环境中是不稳定的。这些毒素包括BTI或苏云金芽孢杆菌昆虫亚种(B.thuringlensisentomotsides)的伴孢晶体毒素及其有关的毒素。参见上述引用的Aizawa，第400页。毒素可通过常规使用的方法或修改过的方法生产，这些方法如下所述。毒素也可以通过标准技术(Mclean和Whitely，J.Bacteriol、169(3)1017～1023(1987);Ward等，J.Mol.Biol、19113～22(1986))在其它细菌(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)中通过表达编码毒素的基因而进行生产。在被囊化的过程中，毒素最好保留在这些细菌内。
被囊聚合物适于包囊上述毒素的聚合物包括许多非离子型、多阴离子型和多阳离子型聚合物。这种聚合物的实例有葡聚糖如淀粉，蛋白质如明胶，海藻酸盐或角叉胶和脱乙酰壳多糖和聚氧乙烯二胺。这些聚合物通常都是生物聚合物，具有广泛的可生物降解性，但它们最好是对多种通常的农业型条件具有足够的抗性，以保护毒素一个时间，使其被吞食，并显著缩短应用之间的时间。聚合物保护孢子囊不受到细菌或酶降解。聚合物是高度多孔的，并接近碱性条件和消化酶，例如在昆虫的肠道中。
实施例在此实例中，应用从多种包囊聚合物之一种来包裹含有BTI伴孢晶体毒素的孢子囊。
本实施例并不限制本发明，本领域的专业人员将认识到，上述毒素和包囊聚合物可在本实例中进行取代。
BTI细胞在浸没培养中于32℃培养大约12～18小时，培养利用隔板式震荡玻瓶于100rpm下进行。另外，使细胞在发酵罐中培养，每体积培养基具有0.8体积的空气，直至达到孢子形成的第Ⅲ期。此期通过标准方法测定，例如通过显微观察或监测细菌的代谢热输出。在发酵的这一阶段，温度由32℃降至22℃，或通过加入硫酸使PH由7降到6。这些环境变化有助于延迟细菌溶解达24小时以上。此延迟使得细菌被囊化得以进行，而不至使毒素晶体从形成孢子的母体细胞或孢子囊中释放出来。
利用下述三种聚合物中的一种包裹孢子囊。(在此步骤之前可使细胞浓缩，即简单地使它们沉淀，并倾出沉淀物上的大约80%的液体。另外，细胞可保留在悬浮液中。)a)在培养基中加入一种非离子型聚合物，如可溶性淀粉，然后加入50%体积的一种有机溶剂，例如乙醇或丙酮。这些溶剂起凝聚剂作用，使被囊细胞由培养基中沉淀出来。一般来说，淀粉加入量大约等于培养基中的细胞量，其浓度约为0.5～5%重量。通过迅速的温度改变也能使聚合物从溶剂中沉淀出来。
b)在培养基中加入一种多阳离子型聚合物，如脱乙酰壳多糖(大约0.4～4%重量)。脱乙酰壳多糖已予先用乙酸(0.2～0.5M)酸化至PH小于大约5。载负电荷的孢子囊壁吸引可溶性聚合物。然后用多磷酸离子(0.1～0.2M)使聚合物稳定化。
c)在培养基中加入一种阴离子型聚合物，如海藻酸盐(约0.4～4%重量)。这些聚合物被吸引在细胞上。然后加入钙盐(0.1～0.2M)使聚合物交联，从而产生具有多层聚合物的细胞。
在这一阶段，加入色彩引诱剂，如染料或紫外光屏蔽化合物，如对氨基苯甲酸。
包裹步骤只需要几分钟，但混合物可放置1～2小时。此刻，包裹的孢子囊与添加剂一起进行化学交联，以使最终产品稳定。合适的交联物质(约0.1～0.01%重量)有醛类，如甲醛或戊二醛、双功能氨基酯，如DMA或DMS，双功能N-羟基琥珀酰亚胺酯，如BSOCOES或DST、及其他列于PierceHandbookandCatalog(1986～7，PP311～340)中的物质。最合适的这种交联剂是具有碱回复性的那种，它因此在目标昆虫的肠道中被切断。参见Zarling(见上)。这些交联物质因此提高了肠道中的毒素释放，以及毒素的最终活化。
最终产品是由交联聚合物包囊的孢子囊，能使之喷雾干燥或作为乳化剂出售，并直接施用于目标植物。喷雾干燥是用雾化器通过标准方法进行，将混合物喷雾于钙或多磷酸盐溶液中(根据需要)。另外，混合物可通过加入苯甲酸或山梨酸进行保存，它们通常以0.1%的浓度用作食品防腐剂。这种溶液或干燥产品可在数月甚至数年内保持稳定。它们通过标准技术被施用于植物或大田，但杀虫剂的用量少于现有的制剂，因为其必要的应用次数较少。
其他的具体方案也落入下述权利要求的范围内。
权利要求
1.一种被囊细菌，所说细菌包括一种杀虫毒素，其中所述细菌由一种非生命的、树脂状的、保护性聚合物所包裹，该聚合物在高碱性PH下能透过昆虫的消化酶。
2.权利要求1的细菌，其中的毒素是伴孢晶体毒素。
3.权利要求2的细菌，其中的细菌是苏云金芽孢杆菌的孢子囊。
4.权利要求1的细菌，其中的聚合物在农业环境中具有稳定性。
5.权利要求1的细菌，其中的聚合物能透过昆虫肠道的消化液。
6.权利要求1的细菌，其中的聚合物基本上不能透过能够降解所述细菌的生物剂。
7.权利要求1的细菌，其中的细菌是通过收集孢子形成第Ⅲ期的集落而生产的。
8.权利要求1的细菌，其中的聚合物是非离子型，多阴离子型或多阳离子型的。
9.权利要求1的细菌，其中的聚合物是选自以下物质葡聚糖、淀粉、明胶、海藻酸盐、角叉胶、脱乙酰壳多糖和聚氧乙烯二胺。
10.权利要求1的细菌，其中的聚合物是交联的。
11.权利要求8的细菌，其中的聚合物是与甲醛、戊二醛、DMA、DMS、BSOCOES、DST、多磷酸盐离子或金属交联的。
12.权利要求1的细菌，其中的聚合物包括选自以下的添加剂防晒生色团、吞噬促进剂和昆虫引诱剂。
13.一种含有权利要求1的细菌的细菌细胞团聚体。
14.权利要求13的团聚体，其直径为10～100微米。
15.权利要求13的团聚体，其直径为20～50微米。
16.一种生产杀虫剂的方法，包括的步骤如下培养具有昆虫毒素编码基因的细菌，以产生所述毒素，并用一种聚合物包裹所述细菌。
17.权利要求16的方法，其中所述的细菌是能够形成孢子的，所述的培养步骤包括使所述细菌进入孢子形成第Ⅲ期。
18.权利要求16的方法，其中所述包裹包括用所述聚合物包裹所述细菌的外膜。
19.权利要求16的方法，其中用来包裹细菌的聚合物能透过昆虫肠道消化液，并基本上不透过能降解所述细菌的生物剂。
全文摘要
一种被囊细菌，该细菌含有一种杀虫毒素，所述细菌被包囊在聚合物中。
文档编号C12N11/08GK1036226SQ89101839
公开日1989年10月11日 申请日期1989年2月11日 优先权日1988年2月12日
发明者埃利沙·佐马, 安德鲁·斯皮尔曼, 约瑟夫·B·佩龙 申请人:哈佛大学校长及研究员协会