专利名称：微生物异步发酵生产长链α，ω-二元酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用微生物发酵正构烷烃生产长链α·ω-二元酸的方法。
长链α·ω-二元酸是一类重要的化工原料。可用来合成高级香料、工程塑料、热熔胶、树脂、高级润滑油添加剂、食品防腐剂等。特别是α·ω-十三碳二元酸和十六碳二元酸，它们分别是合成十三烷二酸乙撑酯和环十五烷酮的重要原料。
七十年代以来，各国相继开展了以正构烷烃为基质利用微生物发酵制取长链二元酸的研究。1982年日本矿业株式会社率先工业放大，于1984年建成年产200吨十三碳二元酸的装置，并已投入生产。中国专利87105445.0提出了生产长链α·ω-二羧酸的方法，特别是生产α·ω-十六碳二羧酸的方法。在16升发酵罐中，正构十六烷烃投入量为20%，发酵液PH控制在6.8～7.3，发酵70小时，产酸量达到77.5克/升，延长发酵时间到117小时，产酸量达到123克/升，转化率为79%。美国专利US4，339，536也提出了生产长链二元酸的方法，它是将菌种浓度为10-15克/升的种子液120升加入含有正构十三烷烃240升和培养基1200升的发酵槽中，无菌空气通入量为400升/分，在温度32℃、PH为5的条件下培养12小时后，调节PH至7.0，并再培养72小时，最后得到含有十三碳二元酸40克/升、正构十三烷烃8克/升以及菌体20克/升的1200升发酵液。
本发明的目的是提出一种利用微生物异步发酵含碳原子数为11-18的正构烷烃生产长链α·ω-二元酸的方法，特别是高产12-16个碳原子的α·ω-二元酸的方法。
本发明所用的微生物为热带假丝酵母(Candldatroplcalls)不完全阻断型多倍体变异菌株。它是经紫外线多次诱变选育和定期复壮筛选而得的高产二元酸生产菌株，特别是对α·ω-十三碳二元酸、十二碳二元酸的生产能力极强。它具有对两末端ω-氧化正构烷烃能力强，同化正构烷烃和β-氧化能力弱的特点。
本发明利用上述菌种，以菌种浓度作为发酵控制指标、采用烷烃和糖质为主要底物，并配以其它营养组份发酵，通过补加正构烷烃和烷基磷酸酯，控制培养阶段和发酵阶段的操作条件，使菌种生长和发酵分两步进行，以获得高产的长链α·ω-二元酸。
将由固体斜面培养的菌种接人种子培养基内培养，培养后作为发酵种子液。按照一定的投入量将发酵种子液接入含有正构烷烃和发酵培养基的混合液中，开始搅拌，控制温度、PH，同时用酸液调节培养液PH值呈酸性，进行菌种的培养和繁殖，在菌种培养阶段，α·ω-二元酸生成极少，而菌种生长和繁殖迅速，待菌种达到一定浓度后，开始补加适量的正构烷烃和烷基磷酸酯，用碱液调节培养液PH呈碱性，开始转入发酵阶段，进行二元酸的积累。生成的二元酸则以金属盐的形式溶解于发酵液中。发酵结束后，经酸化和分离处理，制得精制的长链α·ω-二元酸。
本发明的菌种培养基有(1)6波美度的麦芽汁加2%琼脂制成的固体斜面。(2)烷烃液体培养基。
烷烃液体培养基组成为Na2HPO4·12H2O 4-6克/升，KH2PO42-4克/升，MgSO4·7H2O0.5-3克/升，NaCl 1-3克/升，蔗糖 15-30克/升，酵母膏 0.5-2克/升，玉米浆0.5-2克/升，尿素0.5-3克/升，维生素B1 0.1-0.3克/升，正构烷烃50-80毫升/升和来自水配制。烷烃液体培养基配制后，需将其PH调至4.5左右。
培养菌种过程是(1)取一满接种环热带假丝酵母不完全阻断型多倍体变异菌株，涂布在麦芽汁固体斜面上。麦芽汁固体斜面具体做法是将6波美度的麦芽汁和2%的琼脂加热溶解，然后装入φ25×210mm的玻璃试管内，每支试管装液量为8-10毫升，放成斜面，凝成固体斜面后即可使用。将涂布在麦芽汁固体斜面上的菌种在30～32℃下培养48小时。(2)取一支上述斜面上的菌种接入到经灭菌的600毫升/3000毫升底部带有六个挡板三角瓶的烷烃培养基内，于30-32℃下在180转/分的旋转摇床上培养48小时，作为发酵菌种。
在烷烃发酵过程中，当菌种繁殖到一定浓度时，就要提高发酵液的PH值，使之有利于发酵产酸。过早地调节PH，菌种浓度太低，影响产酸量，过晚地调节PH值，又会相对缩短产酸时间。转发酵时，只有菌种达到一定浓度，才能获得较高的产酸量。转发酵时菌种的适宜浓度为2.0-6.0×108个菌种/毫升或是7-12%(湿菌重)，最好是8-10%。在短时间内获得转发酵所需的上述菌种浓度，最好是在培养阶段将培养液PH值调呈酸性，适宜的PH值为4.0-6.0，最好是控制在4.5±0.1，此时二元酸生成极少，而菌种消耗糖质得以快速生长和繁殖，在12-36小时内，就能达到转发酵所需的菌种浓度。
加入乳化剂对菌种与烷烃的充分接触是十分重要的。加入适量的乳化剂可以提高烷烃的微粒化程度。烷基磷酸酯是较为理想的乳化剂。加入适量的烷基磷酸酯可促进产酸量的增加，特别是对十二碳二元酸和十三碳二元酸的产酸量增加较为明显。它在发酵液中的适宜含量为1-5克/升，最好是1-3克/升。加入烷基磷酸酯最好是在转入发酵时进行，它可以单独加入，也可与烷烃一起补加到发酵液中。
在培养阶段，正构烷烃适宜的投入量为2-15%(v/v，占总发酵液体积)，最好是5-10%(v/v)。正构烷烃的碳原子数为11-18，而含有12-16个碳原子比较好，但最好是含有13个碳原子，其次是含有12个碳原子。发酵阶段，正构烷烃适宜的补加量为15-30%(v/v，占总发酵液体积)，其补加正构烷烃的碳原子数情况同培养阶段，最好的补加量为20-25%。
菌种在酸性条件下经培养阶段的培养，其浓度达到7-12%时，开始补加15-30%(v/v)的正构烷烃和适量的烷基磷酸酯，然后，逐渐地调节发酵液PH值，调节时间为0.5-4.5小时，最好是3.5-4.5小时。最后将PH值调至7.0-8.0，最好是控制在7.8±0.1。
菌种液接入后的培养阶段，用酸液，如6N硫酸，调节培养液PH为4.0-6.0。菌种在生长和繁殖过程中，仍然要代谢生成少量的α·ω-二元酸，PH值下降，用碱液，如12N氢氧化钠或氢氧化钾，进行调节，使PH维持在4-6。在发酵过程中，由于有大量α·ω-二元酸积累，PH下降，用上述碱液调节PH并维持在7.0-8.0，直至发酵结束。
在多元底物中，正构烷烃和蔗糖是主要碳源，蔗糖作为碳源用来维持菌种的生长和繁殖，正构烷烃是目的代谢产物的相应基质。发酵培养基中蔗糖的适宜含量为20-30克/升。镁离子是多种酶的激活剂，适量的镁离子浓度对生产二元酸极为有利，特别是对生产碳数12到15的α·ω-二元酸，添加镁离子尤为重要。适宜的MgSO4·7H2O含量为0.5-2.5克/升，最好是1.0-2.0克/升。加入适量的维生素B1对菌种的生长和发酵有利，最适宜的含量为0.1-0.2克/升。适当的尿素含量可以提高菌种的增殖速度，提前进入菌种生长稳定期，延长有效产酸期。尿素的含量最好是1-2克/升。
所有补加液或流加液和菌种培养基、发酵培养基是在0.1MPa、121℃下灭菌20-30分钟后使用。含11-18个碳原子的正构烷烃纯度大于97%，含有11-18个碳原子的长链α·ω-二元酸用气相色谱法作定性和定量分析。
通过下述步骤可完成本发明(1)取一接种环菌种做斜面培养，培养时间为48小时，温度32℃。
(2)将斜面培养的菌种接入烷烃培养基中，培养48小时，温度32℃，作为种子液。
(3)将种子液接入发酵罐内，或再经1-3级种子培养后接入发酵罐内进行发酵。
将发酵菌种按5-30%(v/v)的投入量接入含有2-15%(v/v)的11-18碳原子的正构烷烃和发酵培养基混合液中，将混合液PH调至4.0-6.0，在适宜条件下培养，待菌种浓度达到7-12%(湿菌重)时，补加15-30%(v/v)的上述烷烃和烷基磷酸酯，烷基磷酸酯的含量为1-5克/升，用碱液逐渐调节发酵液PH值至7.0-8.0，并维持7.0-8.0到发酵结束，经加热、破乳、分油、结晶、重结晶即得α·ω-二元酸产品。
本方法用热带假丝酵母(Candldatroplcalls)不完全阻断型多倍体变异菌株发酵含有11-18个碳原子的正构烷烃得到相应碳数的α·ω-二元酸。用3立方米发酵罐发酵正构十三烷烃生产α·ω-十三碳二元酸。培养阶段，正构十三烷烃投入量为5%(v/v)，PH为4.5±0.1，培养24小时菌种浓度达到8%(湿菌重)，开始补加20%(v/v)的上述烷烃和适量的烷基磷酸酯，调节PH为7.8±0.1，转入发酵，发酵48小时，产酸量达100.1克/升，延长到96小时，产酸量达144.4克/升，转化率为82.9%。在3升发酵罐分别发酵正构十二、十六碳二元酸产量达120克/升，α·ω-十六碳二元酸产量达68.6克/升。
实施例1(1) 取一接种环的热带假丝酵母(Candlda troplcalls)不完全阻断型多倍体变异菌株，涂布在φ25×210mm玻璃试管内的麦芽汁和2%琼脂制成的固体斜面上，共4支。在32℃下培养48小时。(2)将上述培养的4支斜面菌种，分别接入4瓶装有经灭菌的600毫升烷烃培养基的3000毫升底部带有六个挡板的三角摇瓶内，于32℃，180转/分的旋转摇床上培养48小时。(3)将(2)培养的菌种液两瓶一组(约1.2升)，共两组分别接入装有正构十三烷烃0.5升和培养基8.3升的两个装液量10升的培养罐内，作为一级种子培养。培养基组成为Na2HPO4·12H2O6克/升，KH2PO42克/升，NaCl1克/升，蔗糖30克/升，维生素B1 0.1克/升，酵母膏1克/升，玉米浆1克/升，尿素2克/升，MgSO4·7H2O1克/升，该培养基用水配制。正构十三烷烃、尿素、MgSO4·7H2O分别单独灭菌，于接种前加入。上述底物灭菌条件为0.1MPa、121℃水蒸汽，灭菌时间30分钟。(4)接种后，在32.5℃、PH4.5±0.1，搅拌转速550转/分、通气量8升/分、罐压0.02MPa下培养菌种，培养时间为36小时。(5)将(4)培养的20升菌种液，接入装有8升正构十三烷烃和132升培养基的200升气提式内环流培养器内，在32.5℃、PH4.5±0.1、通气量183升/分、罐压0.03MPa下培养36小时。作为二级种子培养。(6)将(5)培养的160升菌种液，接入装有30升正构十三烷烃和410升培养基的800升培养罐内，在搅拌转速200转/分，通气量为550升/分，其它条件同(4)的情况下培养40小时，作为三级种子培养。(7)将(6)培养的600升菌种液接入装有正构十三烷烃125升和培养基1775升的3立方米发酵罐内，在(6)的操作条件下培养24小时，菌种浓度达到9.8%(湿菌重)，开始补加500升正构十三烷烃和2.5千克烷基磷酸酯，用12N氢氧化钠溶液逐步调节发酵液PH值至7.8±0.1，时间为4小时，开始转入发酵。转入发酵(流加少量甘油聚醚消泡剂)后发酵48小时，α·ω-十三碳二元酸产量达100.1克/升。从48小时继续发酵至96小时，产酸量达144.4克/升，转化率为82.9%。
实施例2(1)方法同实施例1(1)，培养一支斜面菌种。(2)方法同实施例1(2)，培养一瓶菌种液(约600毫升)。(3)将(2)培养的菌种液取出300毫升接入装有150毫升正构十二烷烃和2550毫升发酵培养基的装液量为3升自动控制的发酵罐内。培养基组成和灭菌方法及培养条件同实施例1(3)。培养时间40小时，菌种浓度达到8%，开始补加600毫升正构十二烷烃和3克烷基磷酸酯，用12N氢氧化钠溶液逐步调节发酵液PH至7.8±0.1，时间4.5小时，开始转入发酵。转入发酵后发酵70小时，α·ω-十二碳二元酸产量达102克/升，转化率为75%。
实施例3方法同实施例2。发酵正构十六烷烃制取α·ω-十六碳二元酸。转发酵后发酵70小时，α·ω-十六碳二元酸产量达68.6克/升，转化率为56%。
实施例4斜面培养菌种(1)和摇瓶培养菌种(2)同实施例1中的(1)和(2)的方法。(3)将摇瓶培养的种子液接入10升培养罐中培养，MgSO4·7H2O含量为2克/升，其它条件同实施例1中的(3)。(4)接种后，搅拌转速为600转/分，通气量为6.5升/分，其它条件同实施例1中的(4)。(5)将10升培养罐培养的20升种子液，接入200升气提式内环流培养器内，通气量为150升/分，培养33小时，其它条件同实例1中(5)。(6)将(5)培养的160升种子液接入800升培养罐内，搅拌速度为160转/分，通气量为500升/分，其它条件同实施例1中的(6)。(7)将(6)培养的600升种子液接入3立方米发酵罐内，培养20小时，菌种浓度达8.7%，补加的烷基磷酸酯为3.0千克，用12N氢氧化钠溶液将发酵液PH值由4.5逐步调至7.8，调节时间为4.5小时。转入发酵后，发酵48小时，产酸量达到98.2克/升，继续发酵72小时，产酸量高达166.3克/升，转化率为84%。
权利要求
1.一种利用微生物异步发酵正构烷烃生产长链α·ω-二元酸的方法，将发酵菌种接入含有正构烷烃和发酵培养基的混合液中培养，在培养阶段，调节培养液呈酸性，使菌种迅速生长，在较短的生长期内菌种达到一定浓度时，补加正构烷烃和乳化剂，调节培养液呈碱性，转入发酵阶段，直至发酵结束。其特征在于菌种生长和产酸分两步进行。在培养阶段，将含菌种的培养液pH值控制在4.0～6.0之间，培养菌种，α·ω-二元酸积累极少，当菌种浓度达到7-12%(湿菌重)时，补加一定量的正构烷烃和乳化剂，并逐步调节培养液pH值7.0～8.0之间，转入发酵阶段，在适宜条件下开始积累长链α·ω-二元酸。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于转发酵时的菌种浓度最好是8～10%。
3.按照权利要求1的方法，其特征在于补加的乳化剂最好是烷基磷酸酯，其适宜含量为1-5克/升，最好是1-3克/升。
4.按照权利要求1的方法，其特征在于培养阶段正构烷烃投入量为2-15%(v/v)，最适宜投入量为5～10%。补加正构烷烃量为15-30%(v/v)，最好是20-25%。
5.按照权利要求1的方法，其特征在于培养阶段培养液PH值最好是控制在4.5±0.1，发酵阶段发酵液PH值最好控制在7.8±0.1。
6.按照权利要求1的方法其特征在于所说的微生物是热带假丝酵母属的二元酸生产菌，最好是热带假丝酵母不完全阻断型多倍体变异菌株。
7.按照权利要求1的方法，其特征在于所说的发酵培养基中蔗糖含量最好是20-30克/升，尿素含量最好是1-2克/升，维生素B1含量最好是0.1-0.2克/升，MgSO4·7H2O含量最好是1-2克/升。
8.按照权利要求1、4的方法，其特征在于所说的正构烷烃含有11-18个碳原子。
9.按照权利要求1的方法，其特征在于所说的正构烷烃含有12-16个碳原子比较好。
10.按照权利要求1、4的方法，其特征在于所说的正构烷烃最好含有13个碳原子。
全文摘要
本发明为微生物异步发酵生产长链α。ω-二元酸的方法。采用的微生物为热带假丝酵母(Candidatropicalis)不完全阻断型多倍体变异菌株。特点是，在微生物菌种接入发酵液后，控制体系pH在4.0～6.0之间，当培养基中菌浓达到7—12％(湿菌重)时，补加一定量的正构烷烃和乳化剂，并调节体系pH至7.0～8.0，开始发酵。当本方法用于正构十三烷烃发酵生产十三碳二元酸时，发酵72小时，产酸量可达100.1克/升，发酵120小时，产酸量可达144.4克/升。
文档编号C12P7/44GK1071951SQ9110989
公开日1993年5月12日 申请日期1991年10月29日 优先权日1991年10月29日
发明者丁国卿, 佟明友, 李淑兰, 王战宇, 李春光, 王桂珠, 陈善刚 申请人:中国石油化工总公司抚顺石油化工研究院