专利名称：通过采用低温沉淀物制备的改善的生物胶的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有A和B两种组分的组织胶、制备该组织胶的方法、使用高含量抑肽酶和蛇毒蛋白水解酶制备组织胶的应用。
通过使用血浆蛋白改善外科创伤部位的局部止血是众所周知的。因此，目前已经将纤维蛋白裹伤胶布用于脑外科止血。用血浆和凝血酶制备外科创伤用的纤维蛋白膜。在过去20年中，有大量出版物描述了将“纤维蛋白胶”或“纤维蛋白胶粘剂”或“纤维蛋白密封剂”用于多数外科。在过去10年中在欧洲广泛使用了市售“胶”制剂。这种“胶”由两种成分组成，而这些成分的混合物产生凝块。第一种成分是纤维蛋白原浓缩物。该浓缩物还含有粘连蛋白和ⅩⅢ因子，后者对于凝块的稳定和强度是重要的。第二种成分是凝血酶，即将纤维蛋白原(正常凝结系统的最后一种成分)转变成纤维蛋白凝块的活性酶。该方法绕过正常凝结的多数步骤而模仿其最后阶段。一些厂商加入血浆酶原(这是一种在一些时间后使凝块溶解的酶)，而另一些厂商加入抑肽酶(这是一种防止凝块溶解的蛋白酶抑制剂)。
这些产品尽管对于那些有轻度出血疾病的患者取得了令人满意的结果，但是患有严重的出血疾病例如血友病A或B的患者仍然有很高的手术后出血的危险。有时在外科手术平均数天之后发生延迟的出血并发症。那些用抗凝结因子治疗过的患者还不能用现有技术的组织胶治疗。市售浓缩物另一种严重的不利条件是造价高。
WO86/01814公开了一种制备含有纤维蛋白原和Ⅷ因子的低温沉淀悬浮液的方法，该冷沉淀悬浮液用作纤维蛋白胶制剂的前体，该方法包括(a)将单一供体(例如经过血液传染病检诊的一个人或其他动物)的新鲜冷冻血浆在-80℃冷冻至少满6小时，(b)使冷冻血浆的温度升至例如0℃到室温之间，以形成上清液和含有纤维蛋白原及Ⅷ因子的低温沉淀的悬浮液;和(c)回收该低温沉淀悬浮液。该专利还公开了一种用于外科术过程中的纤维蛋白胶的制备方法，该方法包括(a)如上所述制备低温沉淀悬浮液;(b)对所需部位施用一定体积的悬浮液;和(c)向该部位施用含有足够量凝血酶的组合物以使悬浮液中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白胶，然后固化。
EP-A-0341007公开了外科胶粘剂，它以含水组合物的形式含有患者自身血浆、胶原、凝血酶，以及非必须地可以含有抗纤维蛋白溶解剂。该胶粘剂是从患者血浆形成的，不需要使用浓缩或分离纤维蛋白原的任何添加剂。该胶粘剂方便地配制成两部分组合物，在使用前将其混合。
EP-A-0253198公开了一组份的组织胶，它具有纤维蛋白原、Ⅷ因子、凝血酶抑制剂、凝血酶原因子、钙离子和随意可含有血浆酶抑制剂的水溶液。该组织胶可以通过加入水从冻干样品恢复。该组织胶可以含有巴氏消毒形式的所有活性物质，以避免肝炎和HTLV Ⅲ转移。
本发明的目的是提供一种组织胶，该组织胶也适用于患有严重血液凝结疾病如血友病A或B的患者。本发明另一个目的是提供一种组织胶，该组织胶也可用于那些容易产生 抗牛凝血酶抗体的患者，该抗体是组分B的活性因子。本发明还有另一个目的是为接受抗凝结因子如肝素治疗的患者提供组织胶。由于组织胶成分具有转移病毒疾病的危险，必需确保组织胶成分是病毒灭活的。
本发明的组织胶含有组分A，它含有全血的低温沉淀物和高含量蛋白酶抑制剂(相当于3，000至5，000KIU/ml单位的抑肽酶)，优选抑肽酶;该组织胶还含有组分B，它含有蛋白水解酶，该酶能够专一地使组分A中存在的纤维蛋白原裂解并使纤维蛋白聚合物形成。
市售低温沉淀物可以用来制备本发明的组织胶。但因子2-5，优选因子3可能有利于浓缩该低温沉淀物。
向该低温沉淀物中加入相当于3，000-5，000KIU/ml单位抑肽酶量的足够浓度的蛋白酶抑制剂，来制备适用于严重出血病患者的本发明的组织胶。优选的蛋白酶抑制剂是抑肽酶，它可以以商标Trasylol 或Antagosan 购买到。
该低温沉淀物可以在手术前由病人自己提供自源血液单位而得到。这种方法防止了通过血衍生物传染病毒的危险。可是，为了获得合适的市售产品，必需将该低温沉淀物病毒灭活。在PCT/EP 91/00503中描述了病毒灭活方法。其基本原理是用特定的清洁剂处理低温沉淀物，然后从低温沉淀物中除去清洁剂。
本发明组织胶的第二种组分即组分B是由能够专一地断裂纤维蛋白原的蛋白水解酶的溶液制备的。通常使用凝血酶，它是从人或哺乳动物例如牛的血浆中分离的。用40mmol氯化钙溶液可以使凝血酶恢复水份。优选的凝血酶浓度是50-200u/ml。
对于制备快速组织胶，需要制备大约100u/ml凝血酶的氯化钙溶液。对于制备慢速胶例如用于填充空洞(即拔牙)或封闭transphenoided hypophisectomy洞的胶，需要将凝血酶用合适的氯化钙溶液进一步溶解至25u/ml的浓度。
本发明改进的组织胶另一个具体方案是含有从蛇毒分离的蛋白水解酶作为组成B。该具体方案是有利的，因为产生抗凝血酶抗体的患者也可以接受治疗。此外，用肝素预先治疗过的患者也可以用本发明的组织胶治疗，因为肝素不影响蛇毒酶的反应。本发明特别优选的具体方案中使用了蛇毒酶batroxobin，它可以从南美深洼蝰蛇Bothrpos moujeni中分离。优选的是，组成B含有0.5-10μ/ml蛇毒的各种蛋白水解酶。
化学方法得到的batroxobin是分子量约为36，000的单链糖肽。Defibrase 引起纤维蛋白原中α16Arg/17Glg键断裂，纤维蛋白原则引起纤维蛋白肽A释放并形成单体纤维蛋白Ⅰ。
当抑肽酶以本发明的量使用时，含有纯化的纤维蛋白原，粘连蛋白和ⅩⅢ因子的组织胶也可以用作组分A。那么后出血的危险就显著降低了。
当来源于蛇毒的蛋白水解蛋白酶用于组分B的制剂时，也可以使用含有纤维蛋白原，粘连蛋白和ⅩⅢ因子的“常规”组分A。本发明优选使用高含量的抑肽酶。最佳的具体方案是从低温沉淀物获得的本发明的组分A(含有或者不含大量的抑肽酶)与具有从蛇毒分离的蛋白水解酶的本发明的组分B结合。
本发明纤维蛋白胶的制备方法包括制造组分A的步骤，包括从低温沉淀物制备低温物溶液的步骤，-病毒灭活，-除去杀病毒剂，-加入蛋白酶抑制剂和-制备合适的蛋白酶溶液。
优选的是将低温膏状物在4-10℃预先解冻过夜。将低温膏状物溶于PH7.0-7.2的含有氯化钠、柠檬酸三钠和甘氨酸的缓冲液中，然后加热至30-35℃。低温膏状物应该易于溶解，否则它不适用于该制剂。解冻后将低温膏状物切成小片可以加快其溶解。将溶液冷却至接近室温并调节PH值至7.0-7.2后边搅拌边加入氢氧化铝。离心并倾析沉淀物。可以进行非必须的过滤步骤。然后加入氯化钙至所需的最终氯化钙浓度。
将溶液加热至30℃使病毒灭活。然后加入清洁剂。再搅拌一段时间，将溶液转入无病毒的容器中，并在不搅拌的条件下使其渐渐升温几小时。
通过加入一定量的蓖麻油并轻轻搅拌几分钟除去杀病毒剂。当油/水相分离时将溶液冷却至室温。将水层移入病毒安全的容器中并倾析出油层。过滤使水层澄清。必需将PH控制在7.0-7.2。然后在室温抽吸蛋白质溶液使其通过反相柱。在测量蛋白质含量(10-60mg/ml的范围)之后，透滤浓缩洗脱液至蛋白质含量为60-100mg/ml并在缓冲液中透析，该缓冲液与上述缓冲液相同，只是含有附加的较高浓度的氯化钙。然后加入蛋白酶抑制剂。进行无菌过滤并将样品装入合适的容器中低温冻干。
优选的组分B是冻干蛋白酶。特别优选的是冻干凝血酶或南美深洼蝰蛇Bothrpos moujeni的冻干馏分。已知该蛋白水解酶的商品名为蛇毒凝血酶(Reptilase)并且是酶batroxobin。
将蛋白水解酶溶于氯化钙缓冲液中。
采用双注射技术例如通过塑料连接器施用A和B两种组分。两种组分一混合就形成凝块。可以通过插管或喷到三腔管上施用。将两种组分的每一种注入分隔的腔中，并将若干大气并以6rpm的速率转动，而功率为700瓦的13.56MHz的恒定射频，相当于0.24Wcm-2功率密度被施加在台面上20分钟，使台面建立在一个对地电位约为200V的负偏压下(“过热处理S1”)。
利用光栅将衬底台面遮住避开装有8″×4″Pt靶的一个平面型磁控管源，将124W的直流功率提供给该溅射源数分钟，以便清洁溅射靶及建立工作的稳定状态(“靶的预整备步骤”)。
然后在六次连续的通过中利用Pt溅射源沉积Pt中间层，建立的全部厚度约为50
。提供给溅射电极的功率为124W，电极的偏压相对地电位为-414V。衬底处于相对地电位约15V的负电位上。衬底与靶隔开11cm，并且台面以6rpm速度转动(“中间层沉积”)。
随后将射频功率(13.56MHz)提供给衬底台面对Pt中间层的表面作过热处理。200W的射频功率被施加了5分钟的时间，建立的台面对地的偏压为-100V，衬底台面以6rpm速度转动(“过热处理S2”)。
用于产生所需多层结构的Co通量源由位于Pt源直接对面的且面对着它的一个射频平面型磁控管来提供。来自每个源的通量被放置在它们中间的衬底台面挡住。使用一个薄的钴靶(8″×4″×1mm)来增强磁控管的溅射效果。利用将衬底遮住避开两个溅射源，将功率提供给每个源，其功率值是用于制造多层结构的Pt<p>纤维蛋白胶实质上是通过双注射法产生的，一个注射器中含有纯的或低温沉淀的纤维蛋白原物质，另一个注射器中含有带有氯化钙(20mM)的蛇毒凝血酶(20u/ml)或凝血酶。
用Research Model 300-R ACL凝结分析仪(IL，Milan)测定凝块时间(CT)。在37℃在3通Heiliger凝血弹性描记仪上测定粘弹性(TEG)。通过在两片粗织的人造纤维片(0.5×1cm)之间混合胶组分，使得在两片粗网织物之间形成完全相互交织的凝胶，并且在24℃2小时后用Accuforce Cadet Tensionometer(AMATEK，Mansfield & Greene，USA)将网-胶-网的整体拉开，测定胶(以克计)的断裂强度(BS)。
从冷冻(-30℃)的人血浆制备无菌低温沉淀物(cryo)，该血浆在4℃解冻并除去上清液血浆。将五份这样的单位注入到测定的蛋白质中，并通过Buiret方法在低温沉淀物(15稀释)凝结之前或之后用2U/ml凝血酶测定纤维蛋白原的浓度。在用4U/ml牛凝血酶于22℃使样品活化10分钟之后，通过测量与二甲基化酪蛋白结合的[3H]一腐胺测定ⅩⅢ因子。
CT-纤维蛋白原曲线的显著特征是对于固定含量的凝血酶或蛇毒凝血酶是双相的(即1U/ml，
图1A)，并且在1-8mM纤维蛋白原范围达到最小值。这与最大浊度(10分钟后)略有不同，最大浊度在20-40mM纤维蛋白原范围达到峰值。相反的试验表明CT依赖于凝血酶或蛇毒凝血酶的含量。该曲线表明在低酶浓度(低于2U/ml)是接近线性的胶凝速率反依赖性的，而在较高含量之上达到稳定状态。
纯纤维蛋白粘弹度的发展比其浊度稍慢。在通过ⅩⅢa因子诱导的蛋白质链共价联锁加强凝胶中，Ca(Ⅱ)是主要的辅助因子。这种凝胶交联是凝胶机械强度的主要来源，在20分钟后达到稳定状态。
对蛇毒凝血酶诱导ⅩⅢa因子活性的能力的注意似乎是适合的。
混合的低温沉淀物的蛋白质含量从5单位制备的混合低温沉淀物得到下列平均值蛋白质75mg/ml纤维蛋白原36mg/mlⅩⅢ因子4.10U/ml凝结速度低温沉淀物的凝块时间(CT)对凝血酶或蛇毒凝血酶含量呈线性依赖性。但是，高于3U/ml，增加酶的含量几乎对CT不产生影响。对于固定含量的酶，以一系列低温沉淀物的稀释液得到相当于纯纤维蛋白系统所示的纤维蛋白原依赖性的双相CT曲线。
低温沉淀物胶的粘弹性(TEG)和断裂强度(BS)。
用凝血酶或蛇毒凝血酶对低温沉淀物胶的粘弹性形成进行研究。该参数的发展比浊度更缓慢。但是，用过量CaCl2和凝血酶或蛇毒凝血酶制备的低温沉淀物胶在大致相同的时间范围内取得了相等的TEG值。似乎在最初的胶凝开始后，ⅩⅢa因子诱导的交联支撑着凝胶橡胶结构，所以两种胶的TEG值在一小时内相遇。用过量CaCl2形成的两种低温沉淀物胶的最终BS值也是同样。两种低温沉淀物胶均在50-60g断裂。这些试验表明在此胶范围内的凝胶纤维被ⅩⅢa因子诱导的共价交联加强。
低温沉淀物溶液的制备。将市售低温膏状物在4℃-10℃预先解冻过夜。将1公斤该低温物溶于2升缓冲液A(120mM/L NaCl、10mM/L柠檬酸三钠、120mM/L甘氨酸，PH7.0-7.2)中并预热至30-35℃。该低温膏状物应该容易溶解，否则将不适用于该制备。为了加快溶解速度，在解冻后将低温糊状物切成小片。然后将溶液冷却到20℃-22℃并调节PH。必需通过可选择地加入稀氢氧化钠或酸调节PH至7.0-7.2。加入100ml氢氧化铝并再搅拌30分钟。离心并倾析沉淀。用1μm滤器过滤上清液。加入0.1M/L CaCl2使Ca2+最终浓度为1mM/L。再次调节PH。
病毒灭活。
将溶液加热至30℃。加入1%w/vTNBP和1%w/v聚乙二醇辛基苯基醚。将混合物轻轻搅拌 1/2 小时。然后将溶液转入无病毒的容器中，并在不搅拌条件下在30℃放置3 1/2 小时。
除去杀病毒剂。
将150ml蓖麻油加到如上所述制备的混合物中并轻轻搅拌30分钟。在等待油/水分离(30-45分钟)的同时使溶液冷却到20℃。将水层移至病毒安全的容器中。而将油层弃去。在1μm/0.45μm滤器上阶式过滤使水层澄清。然后在室温抽吸蛋白质溶液使其以3升/小时的速度通过反相柱(C-18柱)。用uv监测通过量并收集组分直到吸光度回复到50%。正如蛋白质分析方法测量的，该馏分含有大约40mg/ml。
将洗脱液透滤浓缩至蛋白质含量为70-80mg/ml，并且在足够量的缓冲液B(与缓冲液A的成分相同，只是另加了1mM/L CaCl2)中透析。然后在每升溶液中加入4mio KIU抑肽酶。用0.45μm+0.2μm滤器进行阶式无菌过滤。然后将溶液装入塑料袋中以极低的温度快速冷藏，也可以冻干。凝血酶溶液的制备。
将冻干凝血酶溶于40mM/L氯化钙溶液中。在胶中凝血酶的量是100u/ml。对于快速起作用的胶，例如喷到创伤表面的胶，在CaCl2中的100u/ml的凝血酶溶液就足够了。对于慢速胶，例如填充拔牙的洞或封闭transphenoided hypophisectomy洞的胶，需要加入大量CaCl2将凝血酶进一步溶解至25u/ml的最终浓度。
蛇毒凝血酶的制备与凝血酶类似。但是，蛇毒凝血酶的量约为2u/ml。
临床病例报告21岁MY患者(一个21岁男性)因需要抗凝血酶抑制剂患有严重出血病。没有背景疾病(即肿瘤或自免疫疾病)可以解释这种问题。两个实验外证实的实验室试验表明MY具有高含量抗凝血酶IgG抗体。前一年该患者因其在肾盂中的大结石引起肾绞痛再次发作。计划进行超声选择碎石术。根据IgG与蛋白质A亲合柱结合的技术，对患者进行与体外免疫吸收法结合的免疫抑制法治疗。将60L患者血浆通过蛋白质A柱，8次治疗后，抑制剂效价下降98%。这是通过采用亲合前与亲合后纯化的MJ血浆测量凝血酶的正常郁积血导的时间(TT)测定的。然而，TT、PT和APTT值均被延长。此时，肾结石移至尿道，引起肾完全阻塞并伴有肾盂积水。该患者接受了10多次免疫吸收治疗(约80升血浆)然后集中取出血浆(约50升)并输注高剂量免疫球蛋白(2g/kg)。此时间点，凝血酶抑制剂的含量降至0.5%。PTT降至47秒(相对于85-90秒的预处理)，TT为35秒(相对于90秒的预处理和27秒的正常对照)。决定使用由低温沉淀物和高含量(200u/ml)凝血酶制备的生物胶凝剂低温胶外科除去结石。随着混合该低温沉淀物一旦经喷雾立即胶凝。但是在该患者中未发生胶凝，并且通过缝合局部止血。外科手术结束后创伤看上去是“干的”。但是6小时后，该患者从外科引流管中出血。进行10升血浆的免疫吸收法治疗，但是对出血没有作用，出血急剧增加。
对患者再次手术以找出出血源。但是没有发现外科出血。发现整个创伤表面在渗血。这时，将低温沉淀物与蛇毒凝血酶(2U/ml;Defibrase)混合喷到创伤面上。喷雾立即凝快，创伤表面呈现浑浊并停止出血。对患者继续进行另外5天的日免疫吸收治疗，没有出血。这就证明了使用蛇蛋白酶作为本发明组织胶的组分B是有益的。
权利要求
1.组织胶，该组织胶含有组分A和组分B，组分A含有全血的低温沉淀物和高含量的相当于3，000-5，000KIU/ml单位抑肽酶的蛋白酶抑制剂，组分B含有蛋白水解酶，该酶能够专一地使组分A中存在的纤维蛋白原裂解并使纤维蛋白聚合物形成。
2.权利要求1的组织胶，其中组分A的低温沉淀物是浓缩的。
3.权利要求1的组织胶，其中蛋白酶抑制剂是3，000-5，000KIU/ml单位的抑肽酶。
4.权利要求1-3中任一项的组织胶，其中蛋白水解酶是从哺乳动物或人得到的凝血酶。
5.组织胶，该组织胶含有组分A和组分B，组分A含有全血的低温沉淀物，组分B含有可从蛇毒得到的蛋白水解酶，该酶能够专一地使组分A中存在的纤维蛋白原裂解并使纤维蛋白聚合物形成。
6.权利要求5的组织胶，其中蛇毒酶是从南美深洼蝰蛇Bothrpos moujeni分离的batroxobin。
7.权利要求5或6的组织胶，含有高含量的相当于3，000-5，000KIU/ml单位抑肽酶的蛋白酶抑制剂，优选抑肽酶。
8.权利要求1-7的任一项的组织胶，其中低温沉淀物是病毒灭活的。
9.权利要求1-8的纤维蛋白胶的制造方法，该方法包括下列步骤-制造组分A，包括从低温沉淀物制备低温物溶液的步骤，-病毒灭活，-除去杀病毒剂，-加入蛋白酶抑制剂并制备用作组分B的合适蛋白酶的适合溶液。
10.组织胶，该组织胶含有纤维蛋白原，粘连蛋白和ⅩⅢ因子以及相当于3，000-5，000KIU/ml抑肽酶的蛋白酶抑制剂作为组分A。
11.权利要求10的组织胶，其组分B是权利要求5和/或6的蛋白水解酶或凝血酶。
12.组织胶，该组织胶含有纤维蛋白原，粘连蛋白和ⅩⅢ因子作为组分A，并且组分B是权利要求5和/或6的蛋白水解酶。
13.将3，000-5，000KIU/ml高含量抑肽酶与低温沉淀物或者纤维蛋白原，粘连蛋白和ⅩⅢ因子的结合物结合用于制备组织胶的应用。
14.将蛇毒蛋白酶用于制备组织胶的应用。
15.将从Bothrpos moujeni分离的batroxobin用于制备组织胶的应用。
全文摘要
本发明描述了一种组织胶，该组织胶含有组分A和组分B。组分A含有全血的低温沉淀物和相当于3,000—5,000KIU/ml单位抑肽酶的高含量蛋白酶抑制剂；组分B含有蛋白水解酶，该酶能够专一地使组分A中存在的纤维蛋白原裂解并使纤维蛋白聚合物形成。在另一种具体方案中描述了改善的组织胶，它含有含全血的低温沉淀物的组分A和组分B。组分B含有可从蛇毒获得的蛋白水解酶，该酶能够专一地使组分A中存在的纤维蛋白原裂解并使纤维蛋白聚合物形成。
文档编号C12N9/74GK1073605SQ92112470
公开日1993年6月30日 申请日期1992年9月26日 优先权日1991年9月27日
发明者U·马丁诺维兹, F·巴尔 申请人:奥克塔法马有限公司