专利名称：一种霍乱弧菌新菌株及其活菌苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种霍乱弧菌新菌株，以及由此菌株制备的口服活菌苗。
霍乱是世界卫生组织规定的国际检疫烈性传染病之一，为我国法定的甲类传染病。霍乱弧菌由两种生物型(古典型和埃尔托生物型)和两种血清型(小川和稻叶)组成。从1883年人们分离到霍乱弧菌时，人们就开始了霍乱免疫预防研究，至今百余年。尚无理想的霍乱疫苗问世。瑞典人1982年推出高效的霍乱肠毒素加霍乱全菌死菌苗，经过志愿者与现场8年之久的观察，结果免疫效果仅50%，而且持续时间3个月，且要经多次口服，生产价值很高，至今未被世界卫生组织所认可。
另外，人们从自然存在的菌株选育或用物理化学诱变的方法或抗生素的方法诱变的减毒活菌苗或因免疫效力不好，或因盲目突变，潜伏回复突变的可能性，未被接受。
近年来，由于基因工程的使用，人们用新技术研制霍乱菌苗，以美国菌苗发展中心研制的用基因工程手段将霍乱致毒因子逐一减去的方法，自1982年至今，都因有残余毒力，至今尚不为世界卫生组织认可。
我们在总结以上研制菌苗的基础上，从我所保藏的霍乱弧菌埃尔托生物型流行株和非流行株中，用DNA重组手段，以霍乱肠毒素的基因探针，挑选出14株自然霍乱肠毒素结构基因缺失株。又用免疫学方法选出一株无毒，具有良好免疫效果的菌株IEM101，该菌株缺失了至今已有报导的毒力因子的结构基因，又保持其表面抗原结构，如脂多糖，外膜蛋白和主要定居因子一菌毛等结构。经过动物测毒，证明无毒，免疫效果检测证明，有很好的免疫反应，进而在人体一次口服达109cfu无付反应，且可在人肠道定居，并刺激人体产生相应的免疫抗体，是理想的菌苗制备株。
本发明提供一种可制备理想菌苗的新的霍乱弧菌菌株。本发明人在研究霍乱肠毒素原性中用CT基因探针检验402株EVC流行株，发现14株自然CT基因缺失株。从这些菌株中应用基因探针和免疫学方法选出了1株自然缺失主要毒力因子CT，zot和ace结构基因，但有TcpA及B菌毛的菌株，它对实验动物及人体都有较好保护力。经鉴定，该菌株为霍乱弧菌种内的一个新株，我们将该菌株命名为霍乱弧菌(Vibrio cholerae)IEM101，我们已于1994年元月29日将该菌株保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0207。
本发明还提供了一种安全无残毒的口服活菌苗，将IEM101菌株在一定的培养液中培养后得到的菌液，给人体志愿者一次口服免疫，在人体能定居2-9天以上，并能刺激血清与肠道产生特异性保护性抗体。因而得到了一种理想的口服用霍乱弧菌活菌苗。
下文中详细描述本发明的特征一、IEM菌体的生物学性状1、血清型霍乱弧菌EVC小川血清型。噬菌体生物型1a2、生化反应发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖、左旋糖、糊精和可溶性淀粉产酸不产气;迟发酵乳糖。不发酵阿拉伯糖、卫茅醇、水杨素、木胶糖、侧金盏花和肌醇。靛基质和亚硝酸靛基质反应阴性，VP试验阳性，溶血试验阳性。
3、TcpA及B型菌毛电镜检测见
图1。
4、抗生药物敏感实验IEM101菌株对四环素、氯霉素、庆大霉素、氨卞青霉素、卡那霉素、先锋霉素、新霉素、羧卞青霉素、红霉素、磺胺、利福平、奈定酮酸、丁胺卡那等14种药物敏感，对多粘菌素B及痢特灵表现抗药。
5、生长特性见图2。
二、遗传性状检测1、染色体DNA核酸内切酶图谱见图3。其染色体DNA限制性内切酶图谱与ELTor型流行株相同。
2、DNA-DNA分子杂交结果见图4。
基因探针ct tcpA RSI hly zot st ace slt- ++ +- - - -三、毒力测定
1、Vero细胞测毒按于永茂等人(《中华流行病学杂志》，1992年13(特刊7号)232)的方法进行。将IEM101产毒培养过夜，取培养物上清液试验，未见病理改变。
2、GM1-ELISA检测CT的产生按于永茂等人(同上)的方法进行，IEM101株P/N为1.67(P/N>2为阳性)。
3、乳鼠LD50测定按于永茂等人(同上)的方法进行，IEM101的LD50为1.58×107cfu，比毒株低4个数量级。
4、家兔小肠结扎实验按Bleck RZ等人(Infect Immun.1987551116)描述的方法进行，将IEM101产毒培养48小时后，取1ml静止培养物肠内注射，结果IEM101菌株的积液量为0ml/cm。(大于1.0ml/cm为阳性)。
四、免疫保护力测定家兔被动和主动保护力试验按于永茂等人(同上)的方法进行，家兔主动保护试验分三种方法进行(1)IEM101自然缺失CT菌株，经口服1011菌量，于免疫后28天用EVC79005(小川)，805(稻叶)和CVC小川型395攻击。结果见表1。
表1 家兔主动免疫保护力试验结果 注表中数值为肠段积液量(ml/cm)
(2)IME101 106-8经口免疫家兔，口服后14天用EVC滨43(小川)、吴江-2(稻叶)及CVC395(小川)川9(稻叶)菌株攻击，结果见表2。
表2 家兔主动保护力测定结果 注表中数值为肠段积液量(ml/cm)由表中看出IEM101经口免疫106-8均可对攻毒菌株两种生物型及两种血清型有保护作用。
(3)IEM101 106-7菌悬液直接注入家兔小肠上段，免疫14天后用攻毒菌(ELTor生物型的小川和稻叶血清型及古典生物型小川和稻叶血清型)105-7细菌进行攻击实验，观察8-16小时内肠肿胀，充血，坏死及积液量(ml/cm)，结果见表3。
表3 IEM101家兔主动保护试验结果
注表中数值为肠段积液量(ml/cm)家兔被动保护力测定结果见表4。
免疫血清IEM101免疫家兔后第10天分离免疫血清攻毒菌株吴江-2，滨43 106菌量表4 家兔被动保护实验 注表中数值为积液量ml/cm上表结果显示IEM101免疫血清12稀释可保护毒株攻击，140稀释尚有保护力。
五、人体安全性与免疫原性检测1、免疫志愿者无霍乱发病史的健康人共31人，其中女性13，男性18人，年龄25-60。将31人按免疫剂量不同分为7组，第Ⅰ-第Ⅴ组，每组4人，第Ⅵ组为5人，第Ⅶ组6人。第Ⅰ组每人口服100℃加热杀死的IEM101 109cfu，第Ⅱ-Ⅶ组依次每人口服活IEM101 102、104、106、108、109及1010cuf.这些菌数均悬于2%NaHCO3 50ml。服菌前20-30分钟，先服2%NaHCO3 50ml以中和胃酸。
2、观察结果(1)安全性试验结果在31名志愿者中，IEM101死菌109，活菌102-1010cfu口服者均无副反应。在10名志愿者中有一名于40小时开始无痛性腹泻，稀便两天内共4次，大便量不超过100ml/次，未服药自愈。
表5 志愿者口服菌后症状 (2)排菌时间的检测收集志愿者每次大便及呕吐物，直接接种选择性培养基-庆大霉素琼脂(购自我所腹泻病室)。同时用碱性蛋白胨水做增菌培养，37℃培养24-72小时观察庆大霉素培养菌落形态与颜色，用玻片凝集反应检定，抗霍乱多价与小川血清购自卫生部兰州生物制品研究所。按天计算排菌时间。结果，口服不同剂量IEM101的志愿者，排菌时间长短明显不同，随口服剂量的增加排菌时间延长，结果见表6。
表6 志愿者排菌时间 (3)于免疫前零天及免疫后7、14、28、90、180、270及360天分别采血分离血清及外周血液淋巴细胞(PBL)，血清中特异性抗体的检测ELISA法检测(王世霞等《中华流行病学杂志》1990;11(特刊7号)222，杀弧菌抗体与菌体凝集反应参考Svennerbolm AM，等人(Infect Immun 1976;13735)进行，指示菌为01群霍乱弧菌ELTor型流行株79005，特异性抗体分泌PBL-ELISA的检测按文献[64]进行。同时检测PBL分泌抗CT、LPS及全菌抗体，结果用酶联免疫测定仪测每孔的OD值，计算出P/N值，辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA，IgG及IgM均购自中国医学科学院基础研究所。
通过ELISA，杀弧菌抗体试验和凝集试验，检测免疫前后不同时间血清中各种抗体水平，抗CT抗体免疫前后均为阴性，抗LPS抗体、凝集反应及杀弧菌抗体于免疫前各种抗体水平很低或接近零，免疫后第七天明显上升，杀弧菌抗体和凝集反应抗体水平第14天达高峰，抗LPS抗体IgA、IgG及IgM于28天达高峰，以后逐渐下降，维持到270天，见表7、8、9表7 免疫前后不同时间血清杀弧菌抗体滴度 表中数值为各组抗体滴度的几何平均数表8 免疫前后不同时期血清凝集素抗体滴度 表中数值为各组抗体滴度的几何平均数表9 免疫前后不同时间血清抗LPS抗体滴度 注表中数值为各组抗体滴度的几何平均数实施例1霍乱弧菌IEM101菌株的培养将霍乱弧菌IEM101菌株(CGMCC，0207)接种于添加了0.5%Nacl的普通肉汤(PH7.4)中，于37℃培养2小时。
实施例2霍乱弧菌IEM101菌株口服活菌苗的制备如实施例1所述方法培养得到的菌悬液可直接使用，活菌免疫的剂量为102-1010cfu含菌量，优选为109cfu菌量。
实施例3霍乱弧菌IEM101菌株口服活菌苗的制备将实施例1所述方法制备的菌悬液，按常规方法冷冻干燥，再悬浮于0.85%Nacl溶液中，即制成含菌量为109cfu的口服菌苗。
权利要求
1.一种霍乱弧菌(Vibrio cholerae)新菌株IEM101(CGMCC∶0207)。
2.如权利要求1所述菌株的培养方法，其特征在于将IEM101接种于添加了0.5%Nacl的普通肉汤(PH7.4)中，于37℃，培养2小时。
3.由权利要求1所述菌株制备的口服活菌苗，其特征在于将权利要求2所述方法制备的菌悬液直接口服，或按常规方法将该菌液冻干后，悬浮于0.85% Nacl溶液中即可。
全文摘要
本发明提供了一种可制备理想菌苗的新的霍乱弧菌菌株，该菌株缺失了毒力因子的结构基团，又保持其表面抗原结构，对人体和动物无毒，有良好的免疫能力。本发明还提供了由该菌株制备的口服活菌苗。
文档编号C12N1/20GK1109503SQ9410338
公开日1995年10月4日 申请日期1994年4月1日 优先权日1994年4月1日
发明者刘延清, 祁国明, 王世霞, 于永茂, 段广才, 章丽娟, 高守一 申请人:中国预防医学科学院流行病学微生物研究所