一种蜡样芽孢杆菌及其生产组胺的方法
【专利摘要】本发明涉及一种保藏号为CGMCC?No.7782的蜡样芽孢杆菌及其生产组胺的方法，将菌株活化后于培养基中静止培养，再用离心机分离，所得上清液即为组胺液。本发明菌株产组胺能力强，所得组胺液浓度高，可以极大降低生产成本和节约能源。
【专利说明】一种蜡样芽孢杆菌及其生产组胺的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，特别是一种蜡样芽孢杆菌及其生产组胺的方法。
【背景技术】
[0002]组胺是一种活性胺化合物，化学式是仏H9M3，分子量是111.15。中文同名词为IH-咪唑-4-乙胺、2-咪唑基乙胺、组织胺、B-氨基乙基咪唑、B-氨乙基甘噁啉、组氨、麥角胺，是合成药物的重要中间体，也可以作为生化试剂，目前，我国组胺需求量大，多数从国外进口，价格昂贵。
[0003]传统的组胺生产是采用人工合成，这种方法生产的组胺纯度低，生产效率低，并且难以提纯。通过微生物代谢产生组胺，获得高浓度组胺液，然后提取组胺，确实能降低组胺的生产成本和能源消耗，也成为研究的主要方向。
[0004]蜡样芽孢杆菌是芽孢杆菌属(Bacillus)中的一种。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0~1.2X3.0~5.0微米。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0~1.5微米，孢囊无明显膨大。革兰氏阳性，无荚膜，运动。菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。兼性好氧。生长温度范围20~45°C，10°C以下生长缓慢或不生长。存在于土壤、水、空3以及动物肠道等处。与人类关系密切是引起食物中毒，中毒者症状为腹痛、呕吐腹泻。蜡状芽孢杆菌可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境。可产生细菌蛋白酶;可用于麻脱胶，是各种抗生素抗菌活性的测定菌。可用于明胶液化，牛奶胨化，还原硝酸盐，水解淀粉。
[0005]蜡样芽胞杆菌与少数食物中毒有关，会引起一些严重的恶心、呕吐以及腹痛。但已被证实的蜡样芽孢杆菌中，未曾`经高产组胺的菌株报道。
【发明内容】
[0006]针对目前人工合成组胺纯度低的问题，提供一种蜡样芽孢杆菌并通过该菌代谢产生高浓度组胺液。
[0007]本发明是这样实现的:一种腊样芽孢杆菌(ferraiia ot/ori/era),其特征在于:保藏号为 CGMCC N0.7781。
[0008]一种利用所述蜡样芽孢杆菌生产组胺的方法，其特征在于:
1)将菌落接种于装有A培养基的试管中活化，接种量为105cfu/ml，37°C静置培养24小时，重复上述步骤五次；
2)将步骤I)的菌液接种到B培养基中，接种量为106cfu/ml，37°C静止培养4天；
3)将步骤2)培养的菌液放入离心机中，10000转离心10分钟，取上清液，即为组胺
液；
所述的A培养基为:改良MSA液体培养基中添加质量比为0.1%组氨酸；
所述的B培养基为:改良MSA液体培养基中添加质量比为0.005%的磷酸吡哆醛和质量比为0.1%的组氨酸。[0009]所述改良MSA液体培养基为:蛋白胨10g，牛肉膏lg，D_甘露醇10g，NaCl 40g，酚红 0.025g，蒸馏水 1000mL，pH 值 7.2~7.6，115°C灭菌 15 分钟。
[0010]本发明的优点在于，由于保藏号为CGMCC N0.7781的蜡样芽孢杆菌odoridera )产组胺能力强,所得组胺液浓度高,可以极大降低生产成本和节约能源。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为蜡样芽孢杆菌电子显微镜照片。
[0012]图2为高效液相色谱检测组胺标准曲线。
[0013]图3检测蜡样芽孢杆菌产组胺高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
实施例1腊样芽孢杆菌ifeciBiAs cereus的筛选和保藏 培养基配方:
改良MSA液体培养基:蛋白胨10g，牛肉膏lg，D-甘露醇10g，NaCl 40g，酚红0.025g，蒸馏水lOOOmL，pH值7.2~?.6，115°C灭菌15分钟。
[0015]下层培养基:胰蛋白胨10g，牛肉膏lg，D-甘露醇10g，NaCl 40g，磷酸吡哆醛
0.05g,组氨酸5g,琼脂18g, 1000ml蒸懼水，pH值5.5,115°C高压灭菌15分钟。
[0016]上层培养基:溴甲酚紫0.06g，琼脂15g，1000ml蒸馏水，pH值5.5，121°C灭菌10分钟。
[0017]改良MSA固体培养基:在改良MSA液体培养基中加入质量比为1.8%的琼脂。
[0018]筛选方法:
在无菌条件下取20g新疆熏马肠，剪碎后置于装有180ml已灭菌生理盐水的三角瓶中，室温下230转摇床摇10分钟，取Iml接种于改良MSA液体培养基中，37°C培养24小时，取Iml培养液用9ml生理盐水逐级稀释到10-100 cfu/ml，涂布于下层培养基上，37°C培养72小时。缓慢倾入一薄层上层培养基，10分钟开始记录结果，显紫色的菌落为阳性，显黄色为阴性，其中，阳性为产生组胺菌株，阴性为不产胺菌株。
[0019]挑取阳性菌株，在改良的MSA固体培养基上37°C培养24小时，可以看到，菌落在改良的MSA液体培养基中富集，菌落呈白色，菌体杆状，末端方，中端有芽孢，成短链，或长链生长，革兰氏阳性，在普通显微镜下呈长杆形的菌株。挑取单菌落在改良MSA固体培养基上划线纯化，重复纯化至少三次后接种于改良的MSA液体培养基37°C培养24小时至活菌量达到105cfu/ml，8000rmp离心lOmin，将所得菌株，加入无菌甘油，_80°C冰箱保存。
[0020]将所得菌株送华大基因测序为SEQ ID I。
[0021]登陆NCBI (http//:www.ncb1.nlm.nih.gov),将所得序列与数据库中的已知序列进今亍相"(以?生 t匕对。得至":比寸源为cereusstrain SigaKolBc4 16S ribosomalRNA gene，partial sequence, Max ident:99%，Max score:734，
将该菌株命名为蜡样芽孢杆菌002，于2013年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center, CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC N0.7782，该菌保藏时， 申请人:自定义为002号菌株。其 16S rDNA 的 Genbank 登陆号为 KC887973。
[0022]实施例2制备组胺
改良的MSA液体培养基为:蛋白胨10g，牛肉膏lg，D-甘露醇10g，NaCl 40g，酚红
0.025g，蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2~7.6，115°C灭菌 15 分钟。[0023]A培养基为:改良MSA液体培养基中添加质量比为0.1%组氨酸。
[0024]B培养基为:改良MSA液体培养基中添加质量比为0.005%的磷酸吡哆醛和质量比为0.1%的组氨酸。
[0025]取002号菌株接种于装有A培养基的试管中，接种量为105cfu/ml，37°C静置培养24小时；重复上述步骤五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37°C静止培养4天，接种量为106cfu/ml ;将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液。
[0026]实施例3组胺含量测定
1、组胺标准溶液的配制
准确称取组胺50 mg,用0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50mL,制成I mg/ml标准品储备液。分别取以上标准品储备液，用0.4 mol/L HClO4配制成终浓度分别为5.0、10、20、30、40、50 μ g/ml的标准溶液，避光4 V冰箱保存。
[0027]2、样品溶液的衍生化
取实施例2的上清液ImL加入ImL 0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)混均后，取ImL于5ml容量瓶中，加入200μΙ^^2πιΟ1/1 NaOH，然后加入300 μ L的饱和碳酸氢钠溶液，再加入2 ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40°C水浴黑暗中反应处理40分钟。反应结束后加入100 μ L的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5 mL，再后用0.22 μ m的有机滤膜过滤，获得样品溶液的衍生物。
[0028]3、标准溶液标样的衍生化
分别取5.0、10、20、30、40、50μ g/ml标准溶液样品ImL于5ml容量瓶中，加入200 μ L的2mol/L NaOH,然后加入300 μ L的饱和碳酸氢钠溶液，再加入2 ml的丹磺酰氯(dansylchloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40°C水浴黑暗中反应处理40分钟。反应结束后加入100 μ L的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。再用0.22 μ m的有机滤膜过滤后，获得六组样品溶液的衍生物。
[0029]4、色谱检测
液相色谱系统:SHIMADZU LC-2010A HT ；
色谱柱为 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6X 250mm,.5 μ m);
流速为I mL/min,紫外检测波长为254nm,突光检测激发波长(Ex) 340nm,发射波长(Em) 515nm,进样量20 μ L，柱温30°C，流动相A为水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。
[0030]表1梯度洗脱程序
【权利要求】
1.一种蜡样芽孢杆菌(也^77心cerem)，其特征在于:保藏号为CGMCC N0.7782。
2.一种利用权利要求1所述蜡样芽孢杆菌生产组胺的方法，其特征在于: O将菌落接种于装有A培养基的试管活化，接种量为105cfu/ml，37°C静置培养24小时，重复上述步骤五次；2)将步骤I)的菌液接种到B培养基中，接种量为106cfu/ml，37°C静止培养4天； 3)将步骤2)培养的菌液放入离心机中，10000转离心10分钟，取上清液，即为组胺液； 所述的A培养基为:改良MSA液体培养基中添加质量比为0.1%组氨酸； 所述的B培养基为:改良MSA液体培养基中添加质量比为0.005%的磷酸吡哆醛和质量比为0.1%的组氨酸； 所述改良MSA液体培养基为:蛋白胨10g，牛肉膏lg，D-甘露醇10g，NaCl 40g，酚红`0.025g,蒸馏水 1000mL, p`H 值 7.2~7.6，115°C灭菌 15 分钟。
【文档编号】C12R1/085GK103555632SQ201310543383
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】卢士玲, 李蕊婷, 李开雄, 姬华, 蒋彩虹, 王庆玲 申请人:石河子大学