发酵法制造l-异亮氨酸的方法

专利名称：发酵法制造l-异亮氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及用发酵法制造L-异亮氨酸的方法和在该方法中所使用的大肠杆菌属细菌。L-异亮氨酸对于人类和动物来说是必需的氨基酸，主要以营养剂为主用于医药方面。
由于异亮氨酸具有2个不对称碳原子，所以用化学合成方法在工业上廉价地单生产L型是比较困难的。此外，已知将α-氨基丁酸和α-氧代丁酸等L-异亮氨酸生物合成的前体作为原料，通过生物转化制造L-异亮氨酸的方法。但是这些方法的原料昂贵，不能说是在工业上能廉价地制造L-异亮氨酸的有效方法。
使用廉价的碳源及氮源，用直接发酵法制造L-异亮氨酸的方法有以下几种1)以对于L-异亮氨酸的拮抗剂具有抗药性的棒状杆菌属、沙雷式菌属或埃希氏杆菌属的变异株作为L-异亮氨酸生产株的方法(特公昭51-21077号公报、特公昭52-4629号公报、特公昭56-29998号公报、特公昭56-3035号公报等)，2)以L-异亮氨酸生物合成的关键酶——苏氨酸脱氨酶或其乙酰羟基酸合酶通过重组DNA技术而增强的埃希氏杆菌属或棒状杆菌属的微生物作为L-异亮氨酸生产株的方法(特开平2-458号公报、特开平2-42988号公报等)。
本发明的目的在于提供一种利用发酵法以更高收率廉价地制造L-异亮氨酸的方法。
本发明者们使用具有L-异亮氨酸生产性的埃希氏杆菌属细菌以更高收率廉价地制造了L-异亮氨酸，该菌类的特征是保留含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因的thrABC操纵子和含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子。
本发明所提供的具有L-异亮氨酸生产性的埃希氏杆菌属细菌的特征是保留含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因的thrABC操纵子和含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需区域的ilvGMEDA操纵子。
本发明的埃希氏杆菌属细菌可以将上述thrABC操纵子和上述ilvGMEDA操纵子保留在质粒上。
本发明的埃希氏杆菌属细菌可以保留携带上述thrABC操纵子的质粒(A)和携带上述ilvGMEDA操纵子的质粒(B)两种质粒。
上述ilvGMEDA操纵子的具体例是具有记载在序列表中序列号1上的DNA序列的953位至1160位缺损的DNA序列的ilvGMEDA操纵子。
质粒(A)的具体例可以举出pVIC40，质粒(B)的具体例可以举出pMWD5。
上述的埃希氏杆菌属细菌优选大肠杆菌。
本发明中更优选的埃希氏杆菌属细菌是具有下述特征的大肠杆菌宿主株缺损thrC基因，在5mg/ml的L-苏氨酸存在下可以增殖，缺失苏氨酸脱氢酶活性，ilvA基因具有渗漏变异，并且保留含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操纵子和编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子。其具体例可举出大肠杆菌AJ12919株。
本发明还提供了具有L-异亮氨酸生产性的埃希氏杆菌属细菌，其特征是保留含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因的thrABC操纵子和编码实质上解除了L-赖氨酸的抑制的天冬氨酸激酶III的lysC基因以及含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子。
本发明的埃希氏杆菌属细菌可以将上述的thrABC操纵子和上述lysC基因以及上述ilvGMEDA操纵子保留在质粒上。
本发明的埃希氏杆菌属细菌可以保留携带上述thrABC操纵子和上述lysC基因的质粒(C)和携带上述ilvGMEDA操纵子的质粒(B)两种质粒。
上述ilvGMEDA操纵子的具体例可以举出具有记载在序列表中序列号1上的DNA序列的953位至1160位缺损的DNA序列的ilvGMEDA操纵子。
质粒(C)的具体例可以举出pVICLC*80A，质粒(B)的具体例可以举出pMWD5。
上述埃希氏杆菌属细菌优选大肠杆菌。
本发明的更优选的埃希氏杆菌属细菌是具有下述特征的大肠杆菌宿主株缺损thrC基因，在5mg/ml的L-苏氨酸存在下可以增殖，缺失苏氨酸脱氢酶活性，ilvA基因具有渗漏变异，并且保留含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操纵子和编码实质上解除了L-赖氨酸的抑制的AKIII的lysC基因以及含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子。其具体例是大肠杆菌AJ13100株。
本发明还提供了用发酵法制造L-异亮氨酸的方法，其特征是在培养基中培养上述埃希氏杆菌属细菌，使L-异亮氨酸在该培养基中生成积累，而后从该培养基中采出L-异亮氨酸。
以下，在本申请说明书中，往往将编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因称为“解除型thrA基因”，将含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶的thrA基因的thrABC操纵子称为“解除型thrABC操纵子”。
在本申请说明书中，往往将编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因称为“解除型ilvA基因”，将含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因(解除型ilvA基因)的ilvGMEDA操纵子称为“解除型ilvGMEDA操纵子”。含有解除型ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子称为“完全解除型ilvGMEDA操纵子”。
在本申请说明书中，往往将天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I简称为“AKI-HDI”，将苏氨酸脱氨酶简称为“TD”。
在本申请说明书中，往往将实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I简称为“解除型AKI-HDI”，将实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶简称为“解除型TD”。
下面详细说明本发明。
1.含有实质上解除了L-苏氨酸的抑制的thrA基因的thrABC操纵子含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因的thrABC操纵子(即解除型thrABC操纵子)在所含的thrA基因具有变异方面与野生型thrABC操纵子不同。该变异是指解除了L-苏氨酸对thrA基因编码的AKI-HDI的反馈抑制的变异。
按以下方法得到这种解除型thrABC操纵子。首先将含有野生型thrABC操纵子的DNA进行体外变异处理，变异处理后的DNA与适合宿主的载体DNA连接，得到重组DNA。将重组DNA导入宿主微生物后，得到转化体，如果在所述转化体中选择可以表达解除型AKI-HDI的转化体，则该转化体可保留解除型thrABC操纵子。另外将含有野生型thrABC操纵子的DNA与适合宿主的载体DNA连接后，得到重组DNA，将重组DNA进行体外变异处理，将变异处理后的重组DNA导入宿主微生物，得到转化体，在所述转化体中选择可以表达解除型AKI-HDI的转化体，该转化体也可以保留解除型thrABC操纵子。
也可以将生产野生型AKI-HDI的微生物变异处理，建立生产解除型AKI-HDI的变异株后，再从该变异株得到解除型thrABC操纵子。或者将重组DNA(该重组DNA连接着野生型thrABC操纵子)导入所形成的转化体进行变异处理，建立生产变异型AKI-HDI的变异株后，从该变异株中回收重组DNA，也可以在该DNA上建立解除型thrABC操纵子。
将DNA体外变异处理的药剂有羟胺等。羟胺是通过将胞嘧啶变成N4-羟基胞嘧啶而使得胞嘧啶变异成胸腺嘧啶的化学变异处理剂。另外，在将微生物本身进行变异处理时，可以用紫外线照射或用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)等通常人工突变中所用的诱变剂进行处理。
作为thrABC操纵子，可以举出来自埃希氏杆菌属细菌、特别是来自大肠杆菌(Escherichia coli；下称“E.coli”)的thrABC操纵子。
利用来自埃希氏杆菌属细菌的thrABC操纵子时，作为含有野生型thrABC操纵子的DNA供给菌，任何属于埃希氏杆菌属的微生物都可以使用。具体地说，可以使用Neidhardt等所著书(Neidhardt，F.C.等，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)中列举的微生物。例如E.coli JM109株和MC1061株等。用野生株作为含有thrABC操纵子的DNA供给菌时，可以得到含有野生型thrABC操纵子的DNA。
(1)野生型thrABC操纵子的获得下面对于含有thrABC操纵子的DNA的制备例进行说明。首先培养具有野生型AKI-HDI的E.coli，例如MC1061株，得到培养物。培养上述微生物时，可以用通常的固体培养法，但是考虑到集菌时的效率，最好采用液体培养法。另外，作为培养基，可使用在酵母提取物、胨、胰酶解胨、或肉提取物中加入氯化钠(NaCl)得到的培养基。具体地说是L-肉汁(bact·胰酶解胨1％、bact·酵母提取物0.5％、NaCl 0.5％、葡萄糖0.1％，pH＝7.2)。培养基的初始pH最好调节到6～8。另外，培养在30～42℃、优选37℃左右采用通气搅拌内部培养、振荡培养或静置培养等方法进行4～24小时。
将这样得到的培养物在例如3000r.p.m.下离心分离5分钟，得到E.coli MC1061株菌体。通过使用例如斋藤、三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))、K.S.Kirby的方法(Biochem.J.，64，405(1956))等方法可从此菌体得到染色体DNA。
为了从这样得到的染色体DNA中分离thrABC操纵子，制备染色体DNA库。首先用适当的限制性内切酶将染色体DNA部分分解，得到各种片段的混合物。例如，使Sau3AI在30℃以上的温度、优选37℃和1～10单位/ml的酶浓度下与染色体DNA作用不同时间(1分～2小时)，将其消化。
接着，将断裂的染色体DNA片段连接至可在埃希氏杆菌属细菌细胞内自体复制的载体DNA上，制备重组DNA。具体地说，将产生与用于切断染色体DNA的限制性内切酶Sau3AI相同的末端碱基顺序的限制性内切酶(例如BamHI)在30℃以上温度、1～100单位/ml酶浓度的条件下与载体DNA作用1小时以上、优选1～3小时后，将其完全消化、切断。再将上述得到的染色体DNA片段混合物与断裂的载体DNA混合，将其与DNA连接酶、优选T4DNA连接酶在4～16℃、1～100单位/ml酶浓度的条件下作用1小时以上、优选6～24小时，得到重组DNA。
使用得到的重组DNA转化埃希氏杆菌属微生物，例如大肠菌K-12株或E.coli Gif106M1株(thrA1101，metM1000，lysC1001，ilvA，argH)那类天冬氨酸激酶缺损变异株，制备染色体DNA库。这种转化可以按照D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology 68，326，1979)或用氯化钙处理受容菌细胞的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))进行。另外，E.coliGif106M1株可从E.coli Genetic Stock Center(美国康涅狄格州)得到。
从得到的染色体DNA库中选择天冬氨酸激酶活性增大的株或者可以互补由于天冬氨酸激酶基因缺损引起的营养缺陷的株，得到具有含有thrA基因的重组DNA的菌株。
确认具有含有thrA基因的重组DNA的候补株是否保留thrA基因纯株培养成的重组DNA时，可以通过由候补株制备细胞提取液，由其制备粗酶液后，检查天冬氨酸激酶活性增大的方法来完成。天冬氨酸激酶活性的测定方法可以按照Stadtman等的方法进行(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.和Robichon Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，236,2033(1961))。
另外，由于天冬氨酸激酶缺损变异株需要L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-蛋氨酸及二氨基庚二酸，所以当将天冬氨酸激酶缺损变异株用于宿主时，可在不含有L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-蛋氨酸及二氨基庚二酸的最少培养基上，或者在不含有高丝氨酸及二氨基庚二酸的培养基上分离出可生长的菌株，通过从该菌株中回收重组DNA，可以得到含有thrA基因的DNA片段。
但是，在E.coli中存在三种天冬氨酸激酶，所以也存在编码天冬氨酸激酶的三种基因。因此，为了确认目的thrA基因是否被分离出来，最好通过分析其碱基顺序或限制性内切酶切断模式加以判定。已经有关于E.coli的thrA基因的碱基顺序的报导(Katinka，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77,5730(1980))。
然后，通过使用P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.，116,1064(1973))、D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.，110,667(1972))等，可以从上述菌株中分离出含有thrA基因的DNA被插入载体DNA得到的重组DNA。
分离thrABC操纵子全长时，必须从染色体DNA库中再次选择保留含有thrABC操纵子全长的重组DNA的转化体，即，将得到的thrA基因作为探针(プロ-ブ)通过菌落杂交法进行选择。菌落杂交法按常规方法进行(Molecular Cloning，第二版，Cold Spring HarborPress(1989))。
确认thrABC操纵子全长是否被分离出来时，可以将分离出的候补DNA导入到缺损thrB基因的株中，确认thrB基因的缺损得到恢复，进而将分离出的候补DNA导入到缺损thrC基因的株中，如果能确认出thrC基因的缺损得到恢复即可。缺损thrB基因的株有E.coli YA73株(thrB1000，thi-1，relA1，λ-，spoT1)。缺损thrC基因的株有E.coli Gif41株(thrC1001，thi-1，relA1，λ-，spoT1)。E.coli YA73株和E.coli Gif41株可以从E.coli GeneticStock Center(美国康涅狄格州)得到。
除此之外，在确认thrABC操纵子全长是否被分离时，可以通过分析分离出的候补DNA的碱基顺序或者限制性内切酶切断模式加以确认。已经有E.coli的thrB基因的碱基顺序的报导(Cossart，P.等，Nucleic Acids Res.，9,339(1981))，E.coli的thrC基因的碱基顺序也有报导(Parsot，C.等，Nucleic Acids Res.，11,7331(1983))。
野生型thrABC操纵子的获得方法如下首先从染色体上有野生型thrABC操纵子的株按斋藤、三浦的方法等制备染色体DNA，然后按聚合酶连锁反应法(参照PCRPolymerase chain reaction；White，T.J.等；Trends Genet.5,185(1989))扩增thrABC操纵子。用于扩增反应的DNA引物使用含有thrABC操纵子的全区域或一部分区域的DNA双链的两个3′末端的互补物。当仅扩增thrABC操纵子的一部分区域时，必须以该DNA片段作探针从染色体DNA库筛选含有全区域的DNA片段。扩增thrABC操纵子的全区域时，将含有DNA片段(该片段含有扩增了的thrABC操纵子)的PCR反应液提供给琼脂糖凝胶电泳后，通过提取目的DNA片段可以回收含有thrABC操纵子的DNA片段。
DNA引物可以E.coli中已知的序列为基础适当地制成。例如，Katinka，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77,5730(1980)中报导了E.coli的thrA基因的碱基顺序，Cossart，P.等，Nucleic Acids Res.，9,339(1981)中报导了E.coli的thrB基因的碱基顺序，Parsot，C.等，Nucleic Acids Res.，11,7331(1983)中报导了E.coli的thrC基因的碱基顺序。
引物DNA可以通过ホスホァミダイド法(参照TetrahedronLetters，22,1859(1981))，使用市售的DNA合成装置(例如Applied Biosystems公司制的DNA合成机380B型等)进行合成。另外，PCR反应使用市售的PCR反应装置(パ-キンエルマ-公司制的DNA热循环机PJ2000型等)，用Taq DNA聚合酶(宝酒造(株)供给)按照供给者指定的方法进行。
用PCR法扩增了的thrABC操纵子连接在埃希氏杆菌属细菌细胞内可以自体复制的载体DNA上，通过导入到埃希氏杆菌属细菌细胞内，使得向thrA基因中导入变异等操作变得简单。所使用的载体DNA和转化方法以及thrABC操纵子存在的确认方法与上述方法相同。
(2)向thrABC操纵子中导入变异在上述得到的thrABC操纵子中进行氨基酸残基的置换、插入及缺失等变异的方法有重组体PCR法(Higuchi，R.，61，PCR Technology(Erlich，H.A.Eds.，Stockton press(1989)))、部位特异的变异方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.in Enzymol.，154,350(1987)；Kunkel，T.A.等，Meth.in Enzymol.，154,367(1987))等。使用这些方法，可以在目的部位引起所需的变异。
另外，若按照目的基因的化学合成方法可以向目的部位导入变异或者随机的变异。
还有直接用羟胺处理染色体或质粒上的thrABC操纵子的方法(Hashimoto，T.和Sekiguchi，M.，J.Bacteriol.，159,1039(1984))。也可以使用用紫外线照射保留thrABC操纵子的埃希氏杆菌属细菌的方法或者用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸等化学药剂处理的方法。按照这些方法可以随机地导入变异。
解除型thrABC操纵子的选择方法如下首先直接用羟胺等将由含有thrABC操纵子的DNA片段和载体DNA构成的重组DNA变异处理，用此方法(例如)转化E.coli Gif106M1株。接着在含有L-苏氨酸拮抗剂(例如α-氨基-β-羟基戊酸(AHV))的最少量培养基(例如M9)中培养转化株。由于保留含有野生型thrABC操纵子的重组DNA的株用其重组DNA表达的AKI-HDI受到AHV的抑制，所以L-高丝氨酸及二氨基庚二酸(DAP)的合成不能进行，生长受到抑制。与此相反，保留含有thrABC操纵子(该操纵子含有编码解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因)的重组DNA的株由于该重组DNA中thrA基因所编码的解除型AKI-HDI不受AHV的抑制，所以可以在添加了AHV的最少培养基中生长。利用这种现象，生长可以选择对AHV具有抗药性的株，也就是保留含有thrABC操纵子(该操纵子含有解除了抑制的解除型thrA基因)的重组DNA的株。
将得到的该解除型thrABC操纵子作为重组DNA导入适当的宿主微生物中，通过使其表达，可以得到保留解除了反馈抑制的AKI-HDI、thrABC操纵子所编码的L-苏氨酸生物合成系的酶群的表达增强的微生物。宿主优选属于埃希氏杆菌属的微生物，例如大肠杆菌(E.coli)。
另外，也可以使用从重组DNA中取出解除型thrABC操纵子并插入其他载体DNA所得到的微生物。在本发明中可以使用的载体DNA优选质粒载体DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。此外，也可以利用噬菌体DNA的载体。
为了有效地进行解除型thrABC操纵子的表达，也可以除去位于解除型thrABC操纵子上游位置的转录控制区域(操纵基因或减弱子(attenuator))。或者也可以连接lac、trp、PL等在微生物内起作用的其他启动子，还可以扩增thrABC操纵子固有的启动子后使用。
另外，如上所述，可以将解除型thrABC操纵子插入到能自体复制的载体DNA后，再导入宿主内，作为质粒类染色体外DNA保留在宿主内，也可以通过利用转导作用、易位子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1,417(1983))、Mu噬菌体(特开平2-109985)或同源性重组(Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Habor Lab.(1972))的方法将thrABC操纵子编入宿主微生物的染色体内。
2.含有实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因的ilvGMEDA操纵子，即解除型ilvGMEDA操纵子，在所含的ilvA基因具有变异方面与野生型ilvGMEDA操纵子不同。此种变异是指解除了L-异亮氨酸对ilvA基因所编码的TD的反馈抑制的变异。
含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子，即完全解除型ilvGMEDA操纵子，除解除型ilvGMEDA操纵子外，在导入不发生减弱的变异方面与野生型ilvGMEDA操纵子或解除型ilvGMEDA操纵子不同。此种变异是除去存在于ilvGMEDA操纵子的5′上游区域的减弱子全部、一部分或附近部分的变异，此外还包括在减弱子内部插入新的DNA片段的变异。
取得解除型ilvGMEDA操纵子的方法如下。首先将含有野生型ilvGMEDA操纵子的DNA进行体外变异处理，将变异处理后的DNA与适合宿主的载体DNA连接，得到重组DNA。将重组DNA导入宿主微生物后得到转化体，若在所述转化体中选择可以表达解除型TD的转化体，则该形质转化体可保留解除型ilvGMEDA操纵子。另外，将含有野生型ilvGMEDA操纵子的DNA与适合宿主的载体DNA连接，得到重组DNA，然后将重组DNA体外变异处理，将变异处理后的重组DNA导入宿主微生物，得到转化体，在所述转化体中选择可以表达解除型TD的转化体，该转化体也可保留解除型ilvGMEDA操纵子。
将生产野生型TD的微生物变异处理，建立生产解除型TD的变异株后，也可由变异株取得解除型ilvGMEDA操纵子。或者，对将连接有野生型ilvGMEDA操纵子的重组DNA导入后得到的转化体进行变异处理，建立生产变异型TD的变异株后，由该变异株回收重组DNA时，可在该DNA上建立解除型ilvGMEDA操纵子。
用于体外变异处理DNA的药剂有羟胺等。羟胺是通过将胞嘧啶变成N 4-羟基胞嘧啶而使胞嘧啶变异成胸腺嘧啶的化学变异处理剂。此外，在将微生物本身进行变异处理时，可以使用用紫外线照射或用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)等通常人工突变中所使用的诱变剂进行处理。
作为ilvGMEDA操纵子，可举出来自埃希氏杆菌属细菌、特别是来自大肠杆菌(E.coli)的ilvGMEDA操纵子。
利用来自埃希氏杆菌属细菌的ilvGMEDA操纵子时，作为含有野生型ilvGMEDA操纵子的DNA供给菌，任何属于埃希氏杆菌属的微生物都可以使用。具体地说，可以使用Neidhart等的著作(Neidhardt，F.C.等，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)中所列举的微生物。用野生株作为含有ilvGMEDA操纵子的DNA供给菌时，可以得到含有野生型ilvGMEDA操纵子的DNA。
但是，E.coli作为野生型ilvGMEDA操纵子的DNA供给菌时，由于K12野生株的ilvG基因具有移码变异，所以具有活性的乙酰羟基酸合酶的同功酶II(AHASII)不能表达(Proc.Natl.Acad.Sci.USA78，922，1981)。因此，以K12株作为DNA供给菌时，为了使ilvG基因所编码的乙酰羟基酸合酶II的活性恢复，必须在制备框架(frame)恢复变异株后，将该变异株作为供给菌使用。或者也可以将来自K12株以外的E.coli作为DNA供给菌，只分离ilvG基因，再将其导入来自K12株的ilvGMEDA操纵子中。也就是以K12株作为DNA供给菌分离出ilvMEDA部分，以来自K12株以外的E.coli作为DNA供给菌，只分离出ilvG基因，连接两者得到全长的ilvGMEDA操纵子。另外，乙酰羟基酸合酶的同功酶II(AHASII)由大小两个亚单元构成，大亚单元被ilvG基因编码，小亚单元被ilvM基因编码。
获得完全解除型ilvGMEDA操纵子的方法如下。
R.P.Lawther等报道了存在于ilvGMEDA操纵子的5′上游区域的减弱子的位置及碱基顺序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))。以解除型ilvGMEDA操纵子作为起始原料，通过制备完全除去减弱子的ilvGMEDA操纵子，可得到完全解除型ilvGMEDA操纵子。
在序列表的序列号1中记载的碱基顺序揭示了减弱作用所必需的区域。从999位至1007位的DNA序列编码存在于领头肽内的缬氨酸残基的连续部分，从1008位至1016位的DNA序列编码存在于领头肽内的异亮氨酸残基的连续部分。从1081位至1104位的DNA序列编码形成存在于减弱子内的低非依赖型终止区样干/环(シュテム/ル-プ)的部分。
当细胞内存在足量的L-异亮氨酸时，由于从1081位至1104位的DNA序列转录的RNA形成了低非依赖型终止区样干/环，所以RNA聚合酶的转录终止，ilvGMEDA操纵子不能表达。
细胞内的L-异亮氨酸不足时，细胞内异亮氨酸结合的tRNA不足，在编码领头肽的区域内所存在的异亮氨酸残基的连续部分通过核糖体的翻译停止。为此，mRNA形成了新的立体结构，其结果由1081位至1104位的DNA序列转录的RNA形成的低非依赖型终止区样干/环不能形成。因此，可以进行由RNA聚合酶的转录，ilvGMEDA操纵子得到表达。
因此，为了除去了减弱作用所必需的区域，只要除去序列表的序列号1公开的序列的1008位至1016位的DNA序列或者1081位至1104位的DNA序列即可。
可是，所谓除去了减弱作用所必需的区域是指导入不发生减弱的变异。因此，该变异并不只限于除去存在于ilvGMEDA操纵子的5′上游区域的减弱子全部。总之，也可以是减弱子不能形成低非依赖型终止区样干/环的变异。在领头肽内也可以存在不含有异亮氨酸残基的连续部分的变异。无论哪种情况，减弱作用均消失。
即，此种变异是，除去存在子ilvGMEDA操纵子的5′上游区域的减弱子全部、一部分或附近部分的变异，此外还包括在减弱子内部插入新的DNA片段的变异。
另外，含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子，即完全解除型ilvGMEDA操纵子也可用以下方法得到，即将变异导入野生型ilvGMEDA操纵子中，使之不发生减弱，然后将变异导入含在该ilvGMEDA操纵子中的ilvA基因中，成为对该ilvA基因所编码的苏氨酸脱氨酶而言实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的操纵子。
(1)野生型ilvGMEDA操纵子的获得在取得含有ilvGMEDA操纵子的DNA时，可以考虑分别取得ilvGM基因、ilvE基因、ilvD基因及ilvA基因，而后把它们连接起来的方法。
首先，培养具有野生型TD的E.coli，例如E.coli K12株、E.coli W3110株、E.coli MC1061株(以上的三个株的ilvG会引起移码)、E.coli MI162株(thr-10，car-94，λ-，relA1，ilvG603，thi-1)、E.coliB株(以上的二株具有正常的ilvG)，得到培养物。培养上述微生物时，可以用通常的固体培养法培养，但是考虑到集菌时的效率，最好采用液体培养法进行培养。培养基可使用在酵母提取物、胨、胰酶解胨、或者肉提取物中加入氯化钠(NaCl)得到的培养基。具体地说是L-肉汁(bact·胰酶解胨1％、bact·酵母提取物0.5％、NaCl 0.5％、葡萄糖0.1％，pH＝7.2)。培养基的初始pH调节到6～8较为适宜。培养在30～42℃、优选在37℃左右通过通气搅拌内部培养、振荡培养或静置培养等方法进行24小时。此外，E.coli MI162株可以从E.coli Genetic StockCenter(美国康涅狄格州)得到。该株的索引号是CGSC5919。该株的详细性质记载在Mol.Gen.Genet.143，243(1976)，J.Bacteriol.，149，294(1982)上。
将这样得到的培养物在例如3000r.p.m.下离心分离5分钟，可以得到E.coli的菌体。通过例如斋藤、三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))、K.S.Kirby的方法(Biochem.J.，64，405(1956))等方法可以由此菌体得到染色体DNA。
为了从这样得到的染色体DNA中分离出ilvGMEDA操纵子，制备染色体DNA库。首先用适当的限制性内切酶将染色体DNA部分分解，得到各种片段的混合物。例如，在30℃以上、优选37℃和1～10单位/ml的酶浓度下使Sau3AI与染色体DNA作用不同时间(1分～2小时)，将其消化。
接着，将断裂了的染色体DNA片段连接在可在埃希氏杆菌属细菌细胞内自体复制的载体DNA上，制备重组DNA。具体地说，将产生与用于切断染色体DNA的限制性内切酶Sau3AI相同的末端碱基顺序的限制性内切酶(例如BamHI)在30℃以上温度、1～100单位/ml酶浓度的条件下与载体DNA作用1小时以上、优选1～3小时，将其完全消化、切断。再将上述得到的染色体DNA片段混合物与断裂的载体DNA混合，在4～16℃、1～100单位/ml酶浓度的条件下使其与DNA连接酶、优选T4 DNA连接酶作用1小时以上、优选6～24小时，得到重组DNA。
使用得到的重组DNA，将埃希氏杆菌属的微生物，例如E.coliMI262株(leuB6，ilvI614，ilvH612，λ-，relA1，spoT1，ilvB619，ilvG603，ilvG605(am)，thi-1)类的乙酰羟基酸合酶缺损变异株、E.coli AB2070株(proA2，trp-3，hisG4，ilvE12，metE46，thi-1，ara-9，lacY1或lacZ4，galK2，malA1，mtl-1，rpsL8或rpsL9，ton-1，tsx-3，λR，λ-，supE44)类的转氨基酶B缺损变异株、或者E.coli AB1280株(hisG1，ilvD16，metB1，argH1，thi-1，ara-13，lacY1或lacZ4，gal-6，xyl-7，mtl-2，malA1，rpsL8，9或17，tonA2，λR，λ-，supE44)类的二羟酸脱水酶缺损变异株、E.coli AB1255株(thi-1，ilvA201，argH1，metB1，hi sG1，lacY1或lacZ4，malA1，mtl-2，xyl-7，ara-13，gal-6，rpsL8，9或17，tonA2，tsx-5，λR，λ-，supE44)类的苏氨酸脱氨酶缺损变异株进行转化，制备染色体DNA库。此转化可通过D.M.Morrison的方法(Methods inEnzymology 68，326，1979)或用氯化钙处理受体菌细胞以增加DNA的透过性的方法(Mandel，M.和Hi ga A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970)等来进行。此外，E.coli MI262株可以从E.coli GeneticStock Center(美国康涅狄格州)得到。该株的索引号是CGSC5769。该株的详细性质记载在Mol.Gen.Genet.，156，1(1977)。E.coliAB2070株可以从E.coli Genetic Stock Center(美国康涅狄格州)得到。该株的索引号是CGSC2070。该株的详细性质记载在J.Bacteriol.，109，730(1972)。E.coli AB1280株可从E.coliGenetic Stock Center(美国康涅狄格州)得到。该株的索引号是CGSC1280。E.coli AB1255株可从E.coli Genetic StockCenter(美国康涅狄格州)得到。该株的索引号是CGSC1255。该株的详细性质记载在J.Bacteriol.，109，730(1972)。
可是，由于ilvGMEDA操纵子的全碱基顺序是明确的(NucleicAcids Res.15，2137(1987))，所以通过选择特定的限制性内切酶消化染色体DNA，可以将含有目的基因的DNA片段切成特定的长度。只将具有此特定长度的DNA片段与载体DNA连接，制成重组DNA，用此重组DNA制成染色体DNA库，可更有效地取得含有目的基因的DNA片段。
从得到的染色体DNA库中选择乙酰羟基酸合酶活性增大的株或者选择可互补因乙酰羟基酸合酶基因缺损引起的营养缺陷的株，得到具有含ilvGM基因的重组DNA的菌株。
从得到的染色体DNA库中选择转氨基酶B活性增大的株或者选择可互补因转氨基酶B基因缺损引起的营养缺陷的株，得到具有含ilvE基因的重组DNA的菌株。
从得到的染色体DNA库中选择二羟酸脱水酶活性增大的株或者选择可互补因二羟酸脱水酶基因缺损引起的营养缺陷的株，得到具有含ilvD基因的重组DNA的菌株。
从得到的染色体DNA库中选择苏氨酸脱氨酶活性增大的株或者选择可互补因苏氨酸脱氨酶基因缺损引起的营养缺陷的株，得到具有含ilvA基因的重组DNA的菌株。
确认具有含ilvGM基因的重组DNA的候补株是否保留ilvGM基团纯株培养得到的重组DNA的方法如下由候补株制备细胞提取液，由此制备粗酶液后，确认乙酰羟基酸合酶活性的增大。乙酰羟基酸合酶的酶活性的测定可以按照M.D.Felice等的方法进行(Methods inEnzymology 166，241)。
另外，由于乙酰羟基酸合酶缺损变异株需要异亮氨酸、亮氨酸及缬氨酸，所以将乙酰羟基酸合酶缺损变异株用于宿主时，可以在不含有缬氨酸的最少培养基上分离出可以生长的菌株，通过由该菌株回收重组DNA，可得到含有ilvGM基因的DNA片段。
R.P.Lawther等报导了含有ilvGM基因的DNA的碱基顺序(NucleicAcids Res.15，2137(1987))。因此可从候补株分离出重组DNA，解码其碱基顺序，通过与该报告中的碱基顺序比较加以确认。
如上所述，E.coli K12株的ilvG基因的解读框架内部产生变异。结果引起移码，进而由于中途出现终止密码子而翻译终止。即，从ilvG基因的开始密码子的ATG(第1～3位)数到第982～984位，出现终止密码子。因此，使用从该株取得的ilvGM基因时，有时必须通过サイト·ダイレクテイツド·ミュ-タジエネシス法使变异部分恢复正常。例如，对于大肠杆菌MI162株的ilvG基因(ilvG603)，在第982～984位的终止密码子TGA前插入TG两个碱基对后，框架恢复正常。J.Bacteriol.149，294(1982)的图2详细记载了其他基因。
具有含ilvE基因的重组DNA的候补株是否保留ilvE基因纯株培养得到的重组DNA可按以方法确定。由于转氨基酶B缺损变异株需要异亮氨酸，所以将转氨基酶B缺损变异株用于宿主时，在不含有异亮氨酸的最少培养基上分离出可生长的菌株，通过从该菌株回收重组DNA可以得到含有ilvE基因的DNA片段。
R.P.Lawther等报导了含有ilvE基因的DNA的碱基顺序(NucleicAcids Res.15，2137(1987))。因此，从候补株分离出重组DNA，解码其碱基顺序，通过与该报告中的碱基顺序比较也可以确认。
具有含ilvD基因的重组DNA的候补株是否保留ilvD基因纯株培养得到的重组DNA可按以下方法加以确定。由于二羟酸脱水酶缺损变异株需要异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸，所以将二羟酸脱水酶缺损变异株用于宿主时，在不含有缬氨酸的培养基上分离出可生长的菌株，通过从该菌株回收重组DNA，可以得到含有ilvD基因的DNA片段。
R.P.Lawther等报导了含有ilvD基因的DNA的碱基顺序(NucleicAcids Res.15，2137(1987))。因此，从候补株分离出重组DNA，解码其碱基顺序，通过与该报告中的碱基顺序比较也可以确认。
具有含ilvA基因的重组DNA的候补株是否保留ilvA基因纯株培养得到的重组DNA可按以下方法确定。由候补株制备细胞提取液，由此制备粗酶液后，确认苏氨酸脱氨酶活性的增大。苏氨酸脱氨酶的酶活性的测定方法记载在Methods in Enzymology 17B，555(1971)中。
另外，由于苏氨酸脱氨酶缺损变异株需要异亮氨酸，所以将苏氨酸脱氨酶缺损变异株用于宿主时，在不含有异亮氨酸的最少培养基上分离出能生长的菌株，通过从该菌株回收重组DNA，可以得到含有il vA基因的DNA片段。
R.P.Lawther等报导了含有ilvA基因的DNA的碱基顺序(NucleicAcids Res.15，2137(1987))。因此，从候补株分离出重组DNA，解码其碱基顺序，通过与该报告中的碱基顺序比较也可以确认。
通过P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.，116，1064(1973))、D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.，110，667(1972))等可以从上述各菌株中分离重组DNA。
分离ilvGMEDA操纵子全长时，将具有ilvGM基因的DNA片段、具有ilvE基因的DNA片段、具有ilvD基因的DNA片段及具有ilvA基因的DNA片段连接。连接时，可以参考R.P.Lawther等报导的ilvGMEDA操纵子全碱基顺序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))。
野生型ilvGMEDA操纵子的获得也可按斋藤、三浦的方法等由染色体上具有野生型ilvGMEDA操纵子的株制备染色体DNA，按聚合酶连锁反应法(参照PCRPolymerase Chain reaction；White，T.J.等；Trends Genet.5，185(1989))通过ilvGMEDA操纵子的扩增来完成。用于扩增反应的DNA引物使用含有ilvGMEDA操纵子的全区域或者一部分区域的DNA双链的两个3′末端互补的引物。只是扩增ilvGMEDA操纵子的一部分区域时，必须以该DNA片段作为探针从染色体DNA库中筛选含有全区域的DNA片段。扩增ilvGMEDA操纵子的全区域时，可将含有DNA片段(该片段含有扩增了的ilvGMEDA操纵子)的PCR反应液提供给琼脂糖凝胶电泳，然后通过提取目的的DNA片段回收含有ilvGMEDA操纵子的DNA片段。
制备DNA引物时，可以参考R.P.Lawther等报导的E.Coli的ilvGMEDA操纵子全碱基顺序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))。
引物DNA的合成可以按ホスホァミダイド法(参照TetrahedronLetters，22，1859(1981))等常规方法，使用市售的DNA合成装置(例如Applied Biosystems公司制的DNA合成机380B型等)进行。另外，PCR反应可使用市售的PCR反应装置(パ-キンエルマ-公司制的DNA热循环机PJ2000型等)，用Taq DNA聚合酶(宝酒造(株)提供)按提供者指定的方法进行。
用PCR法扩增了的ilvGMEDA操纵子连接在埃希氏杆菌属细菌细胞内可自体复制的载体DNA上，通过导入埃希氏杆菌属细菌细胞，使得向ilvA基因导入变异的操作及除去 减弱作用所必需的区域的操作变得简单。所用的载体DNA和转化方法以及ilvGMEDA操纵子存在的确认方法与上述相同。
(2)向ilvGMEDA操纵子导入变异在上述得到的ilvGMEDA操纵子中进行氨基酸残基的置换、插入及缺失等变异的方法有重组体PCR法(Higuchi，R.，61，PCRTechnology(Erlich H.A.Eds.，Stockton press(1989)))、部位特异的变异方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.inEnzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.等，Meth.in Enzymol.，154，367(1987))等。使用这些方法，可以在目的部位引起所需的变异。
另外，如果用化学方法合成目的基因，可以向目的部位导入变异或者随机的变异。
还有直接用羟胺处理染色体或质粒上的ilvGMEDA操纵子的方法(Hashimoto，T.和Sekiguchi，M.，J.Bacteriol.，159，1039(1984))。或者也可以使用用紫外线照射保留ilvGMEDA操纵子的埃希氏杆菌属细菌的方法或者用N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍或亚硝酸等化学药剂处理的方法。用这些方法可随机地导入变异。
按以下的方法选择具有解除型ilvA基因的DNA片段。首先直接用羟胺等变异处理由含有ilvA基因的DNA片段和载体DNA构成的重组DNA，用此方法转化例如E.coli W3110株。接着在含有L-异亮氨酸的拮抗剂(例如适量的甘氨酰-L-亮氨酸)的最少培养基(例如M9)中培养转化株时，保留具有野生型ilvA基因的重组DNA的株有时不能合成L-异亮氨酸，生长受到抑制(载体上使用少量复制物，可以减少由基因剂量效果带来的影响，所以较为合适)。与此相反，保留具有编码解除了L-异亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因的重组DNA的株，即使甘氨酰-L-亮氨酸存在时，由于过剩合成L-异亮氨酸，所以在添加了甘氨酰-L-亮氨酸的最少培养基上的生长应该是可能的。利用此现象，生长可以选择对甘氨酰-L-亮氨酸有抗药性的株，即保留含有解除了抑制的解除型ilvA基因的重组DNA的株。
将含有这样得到的解除型ilvA基因的解除型ilvGMEDA操纵子作为重组DNA导入适当的宿主微生物中，通过使其表达，可以得到保留解除了反馈抑制的TD、ilvGMEDA操纵子所编码的L-异亮氨酸生物合成系的酶群的表达增强的微生物。宿主优选属于埃希氏杆菌属的微生物，例如大肠杆菌(E.coli)。
另外，也可使用从重组DNA中取出解除型ilvGMEDA操纵子并插入其他载体DNA所得的微生物。可用于本发明的载体DNA优选质粒载体DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。此外，也可以利用噬菌体DNA的载体。
进而，为了有效地进行解除型ilvGMEDA操纵子的表达，也可以除去位于解除型ilvGMEDA操纵子的上游位置的转录控制区域(操纵基因或减弱子)。或者也可以连接lac、trp、PL等在微生物内起作用的其他启动子，还可以扩增ilvGMEDA操纵子固有的启动子后使用。
另外，如上所述，可将插入了解除型ilvGMEDA操纵子的可自体复制的载体DNA导入宿主中，作为质粒类染色体外DNA保留在宿主中，但也可以通过利用转导作用、易位子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌体(特开平2-109985)或同源性重组(Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Habor Lab.(1972))的方法将ilvGMEDA操纵子编入宿主微生物的染色体中。
(3)ilvGMEDA操纵子的减弱作用所必需区域的除去从ilvGMEDA操纵子中除去减弱作用所必需的区域，即在ilvGMEDA操纵子上导入不发生减弱的变异时，除了除去存在于ilvGMEDA操纵子的5′上游区域的减弱子全部、一部分或附近部分之外，也包括在减弱子内部插入新的DNA片段。此处所称“减弱子”是指形成低非依赖型终止区样干/环的碱基序列，例如记载在序列表序列号1中的碱基序列的1081位至1104位的部分。
为了除去减弱子，制备处于ilvGMEDA操纵子的减弱子部分的上游的DNA片段，另外，制备处于ilvGMEDA操纵子的减弱子部分的下游的DNA片段，将两者连接起来即可。例如，ilvGMEDA操纵子中处于减弱子部分的上游的DNA片段可以通过用适当的限制性内切酶切断含有完全长的ilvGMEDA操纵子的DNA片段来制备。或者也可用PCR法扩增处于ilvGMEDA操纵子中减弱子部分的上游的DNA片段。用于PCR法的引物DNA可以R.P.Lawther等报导的碱基顺序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))、G.Coppola等报导的碱基顺序(Gene 97，21(1991)为基础进行化学合成。进而，也可以用化学方法合成处于ilvGMEDA操纵子的减弱子部分的上游的DNA片段。
ilvGMEDA操纵子中处于减弱子部分的下游的DNA片段的制备方法与上述相同。
以解除型ilvGMEDA操纵子为起始原料，通过制备除去减弱子的一部分或附近部分的ilvGMEDA操纵子，有时可以得到完全解除型ilvGMEDA操纵子。R.P.Lawther等报导了减弱子的位置及碱基顺序(Nucleic Acids Res，15.2137(1987))，以此碱基顺序为基础可决定除去的DNA。
除去的DNA部分是减弱子形成低非依赖型终止区样干/环所必需的DNA部分或含有编码位于该干/环的上游的连续异亮氨酸残基的适当的DNA部分，或者优选两者。为了除去减弱子的一部分或附近部分，制备处于ilvGMEDA操纵子中被除去的DNA部分的上游的DNA片段以及处于ilvGMEDA操纵子中被除去的DNA部分的下游的DNA片段，将两者连接起来即可。例如，处于ilvGMEDA操纵子中被除去的DNA部分的上游的DNA片段可以通过用适当的限制性内切酶切断含有完全长的ilvGMEDA操纵子的DNA片段来制备。或者也可用PCR法扩增处于ilvGMEDA操纵子中被除去的DNA部分的上游的DNA片段。PCR法中所使用的引物DNA可以R.P.Lawther等报导的碱基顺序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))、G.Coppola等报导的碱基顺序(Gene 97，21(1991))为基础进行化学合成。进而也可以用化学合成法合成处于ilvGMEDA操纵子中被除去的DNA部分的上游的DNA片段。
处于ilvGMEDA操纵子中被除去的DNA部分的下游的DNA片段的制备方法与上述相同。
以解除型ilvGMEDA操纵子作为起始原料，通过制备在减弱子内部插入了新DNA片段的ilvGMEDA操纵子，有时也能得到完全解除型ilvGMEDA操纵子。R.P.Lawther等或G.Coppola等报导了减弱子的位置及碱基顺序，可以以此顺序为基础决定新的DNA片段的插入位置及插入的DNA片段的碱基顺序。
插入的新DNA片段最好插入减弱子形成低非依赖型终止区样干/环所必需的DNA部分或编码位于该干/环的上游的连续异亮氨酸残基的DNA部分。插入的结果，减弱子往往不能形成低非依赖型终止区样干/环，因此可以预期减弱子机能消失。
插入的新DNA片段的碱基顺序最好设计成在插入时减弱子不形成低非依赖型终止区样干/环，以及在插入时该干/环的上游不存在连续异亮氨酸残基。
为了在减弱子内部插入新的DNA片段，制备处于ilvGMEDA操纵子中插入了新的DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段。另外，制备处于ilvGMEDA操纵子中插入了新的DNA片段的DNA部分的下游的DNA片段，进而制备插入的新的DNA片段，将三者连接起来即可。例如，处于ilvGMEDA操纵子中插入了新DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段可以通过用适当的限制性内切酶切断含有完全长的ilvGMEDA操纵子的DNA片段进行制备。或者也可用PCR法扩增处于ilvGMEDA操纵子中插入了新DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段。用于PCR法的引物DNA可以R.P.Lawther等报导的碱基顺序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))、G.Coppolo等报导的碱基顺序(Gene 97，21(1991))为基础进行化学合成。进而，也可以用化学合成法合成处于ilvGMEDA操纵子中插了新的DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段。
处于ilvGMEDA操纵子中插入了新DNA片段的DNA部分的下游的DNA片段的制备方法与上述方法相同。
插入的新DNA片段可用化学合成方法制备。
另外，当用PCR法扩增处于ilvGMEDA操纵子中插入了新DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段、或者处于ilvGMEDA操纵子中插入了新DNA片段的DNA部分的下游的DNA片段时，可以连接插入引物DNA的新DNA片段。例如，在为了扩增处于ilvGMEDA操纵子中插入了新的DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段而使用的3′侧DNA引物上，连接插入的新DNA片段的一个链。同样，在为了扩增处于ilvGMEDA操纵子中插入了新的DNA片段的DNA部分的下游的DNA片段而使用的5′侧DNA引物上，连接插入的新DNA片段的互补链。将用这些引物扩增了的两种DNA片段连接。
将这样得到的完全解除型ilvGMEDA操纵子作为重组DNA导入到适当的宿主微生物中，通过使其表达，可以得到保留解除了反馈抑制的TD、且由于不产生减弱而使得ilvGMEDA操纵子所编码的L-异亮氨酸生物合成系的酶群的表达更强的微生物。宿主例如属于埃希氏杆菌属的微生物，优选大肠杆菌(E.coli)。
另外，也可以使用从重组DNA中取出完全解除型ilvGMEDA操纵子并将其插入到其他载体DNA得到的微生物。本发明中可以使用的载体DNA优选质粒载体DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。此外，也可以利用噬菌体DNA的载体。
进而，为了有效地进行完全解除型ilvGMEDA操纵子的表达，也可以在完全解除型ilvGMEDA操纵子的上游连接lac、trp、PL等在微生物内起作用的其他启动子，也可以扩增ilvGMEDA操纵子固有的启动子后使用。
如上所述，可以将完全解除型ilvGMEDA操纵子插入到可自体复制的载体DNA并导入到宿主中，作为质粒类染色体外DNA保留在宿主中，但也可以通过利用转导作用、易位子(Berg.D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌体(特开平2-109985)或者同源性重组(Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Habor Lab.(1972))的方法，将ilvGMEDA操纵子编入宿主微生物的染色体中。
可使用任何属于埃希氏杆菌属的微生物作为含有编码AKIII的基因(lysC)的DNA的供给菌。具体地说，可使用Neidhardt等所著书(Neidhardt，F.C.等，Escherichia coli and SalmonellaTyphimurium，American Society for Microbiology，WashingtonD.C.，1208，表1)中列举的微生物。例如，E.coli JM109株、MG1061株等。
用野生株作为含有编码AKIII的基因(lysC)的DNA的供给菌时，可得到含有野生型AKIII基因的DNA。欲向该基因中导入变异而得到解除了L-赖氨酸的反馈抑制的AKIII基因(lysC*)，可采取直接用羟胺处理DNA的体外变异处理法。羟胺是通过将胞嘧啶转变成N4-羟基胞嘧啶而使胞嘧啶变异成胸腺嘧啶的化学变异处理剂。
另外，通过用解除了L-赖氨酸对AKIII活性的反馈抑制的变异株作为DNA供给菌，可以得到含有解除了L-赖氨酸的反馈抑制的AKIII基因的DNA。例如可从用常规的变异处理法、即用紫外线照射或用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)等诱变剂处理所得的变异株细胞群中得到该变异株。
下面说明含有编码AKIII的基因(lysC)的DNA的制备。
首先，培养具有野生型lysC的E.coli(例如MC1061株)，得到培养物。培养上述微生物时，可用常规的固体培养法培养，但从集菌效率的观点考虑，优选采用液体培养法。作为培养基，例如可以使用在酵母提取物、胨、肉提取物、玉米浆或者大豆或小麦的浸出液等一种以上的氮源中，加入磷酸钾、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钠、氯化镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰等无机盐中的一种以上，以及根据需要适当地加入糖类原料、维生素等得到的培养基。培养基的初始pH值调节到7～8较为适宜。培养在30-42℃、优选37℃左右用常规的搅拌内部培养、振荡培养、静置培养等进行4-24小时。将这样得到的培养物在例如3000r.p.m.下离心分离5分钟，得到E.coliMC1061株的菌体。
可通过例如斋藤等的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72,619(1963))、K.S.Kirby的方法(Biochem.J.，64，405(1956))等方法由该菌体得到染色体DNA。
lysC基因的分离方法如下。用适当的限制性内切酶切断用上述方法得到的染色体DNA。然后连接在埃希氏杆菌属细菌细胞内可增殖的载体DNA，用得到的重组DNA使埃希氏杆菌属微生物的天冬氨酸激酶I、II、III全缺损变异株(例如GT3)转化(基因库)，分离可在不含有赖氨酸的最少培养基上生长的菌株，由此可分离lysC基因的重组DNA。
具体地说，用限制性内切酶(例如Sau3AI)在30℃以上温度、优选37℃和1-10单位/ml的酶浓度下与染色体DNA作用不同时间(1分钟至2小时)，将其消化、部分分解，得到各种染色体DNA片段混合物。使一种限制性内切酶(例如BamHI)与可于埃希氏杆菌属细菌细胞内增殖的载体DNA在30℃以上温度和1-100单位/ml的酶浓度下作用1小时以上、优选1-3小时，将其完全消化，得到断裂的DNA，其中所述限制性内切酶可产生与切断染色体DNA所用的限制性内切酶Sau3AI相同的末端碱基顺序。然后，将上述得到的含有来自E.coli MC1061株的含有lysC基因的DNA片段的混合物与断裂的载体DNA混合，使DNA连接酶、优选T4 DNA连接酶在4-16℃、1-100单位/ml的酶浓度下与之作用1小时以上、优选6-24小时，得到重组DNA。
可在本发明中使用的载体DNA优选质粒载体DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等。也可使用噬菌体DNA的载体。为了有效地进行目的基因的表达，也可使用lac、trp、PL等在微生物内起作用的启动子。这里所说的重组DNA还包括通过利用易位子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌体(特开平2-109985号公报)或同源性重组(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HaborLab.(1972))的方法将所述目的基因编入染色体所得的重组DNA。
用该重组DNA转换例如大肠杆菌K12株、优选GT3株，由AK活性增大的株或互补营养缺陷的株得到具有lysC基因的重组DNA的菌株。该转化可按D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology 88，326，1979)或用氯化钙处理受容菌细胞以增加DNA的透过性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))进行。然后可通过例如P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.，116，1064(1973))、D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.，110，667(1972))等由上述菌株中分离含有lysC基因的DNA被插入载体DNA所得的重组DNA。
确认候补株是否保留lysC纯株培养得到的重组DNA的方法如下制备细胞提取液，再由此制备粗酶液，然后确认天冬氨酸激酶活性。天冬氨酸激酶的酶活性可按Stadtman等的方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.和Robichon-Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，236，2033(1961))进行测定。
或者，lysC基因也可用下述方法得到由上述按斋藤等的方法等得到的染色体DNA按PCR法(参照Polymerase chain reaction；White，T.J.等；Trends Genet.，5，185(1989))扩增lysC基因。扩增所用的DNA引物使用含有lysC基因的全部区域或一部分区域的DNA双链的两个3′末端互补的引物。仅扩增lysC基因的一部分区域时，必须以该DNA片段作引物由基因库中筛选含有全区域的DNA片段。扩增全部区域时，将该DNA片段供入琼脂糖凝胶电泳后，通过取出目的带，可回收含有lysC基因的DNA片段。
作为DNA引物，例如可以E.coli中已知的序列(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))为基础适当制成，但可扩增编码lysC基因的1347base的区域的5′-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3′(后面所示序列表的序列号6)和5′-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3′(后面所示序列表的序列号7)两种引物也适用。DNA的合成可使用Applied Biosystems公司制的“DNA合成机380B型”，用ホスホァミダイド法(参照Tetrahedron Letters，22，1859(1981))按常规方法进行。PCR反应用宝酒造公司制的“DNA热循环机PJ2000型”，用Taq DNA聚合酶按提供者指定的方法进行。
将用PCR法扩增的lysC基因与可在埃希氏杆菌属细菌细胞内增殖的载体DNA连接，导入埃希氏杆菌属细菌细胞内。所用的载体DNA和转化法以及lysC的确认方法与上述方法相同。
对得到的lysC进行氨基酸置换、插入和缺失等变异的方法有重组体PCR法(Higuchi，R.，61，PCR Technology(Erlich，H.A.Eds.，Stockton Press(1989))、部位特异的变异法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.in Enzymol.，154，350(1987)和Kunkel，T.A.等，Meth.in Enzymol.，154，367(1987))等。用这些方法可在目的部位产生目的变异。另外，利用直接用羟胺处理染色体或质粒上的目的基因DNA的方法(Hashimoto，T.和Sekiguchi，M.，J.Bacteriol.159，1039(1984))或者用紫外线照射保留该DNA的菌体或用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸等化学药剂处理的常规方法、化学合成目的基因的方法等，都可以随机地导入变异。
抑制解除型变异基因lysC*的获得方法如下。首先，将变异处理得到的重组DNA转化或AK完全缺损株，例如E.coli GT3株。然后在含有大量赖氨酸的最少培养基(例如M9)中培养转化株。由于保留具有野生型lysC的质粒的株的唯一的AK受赖氨酸的抑制，故而不能合成苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，生长受到抑制。与此相反，具有解除了赖氨酸的抑制的lysC*的质粒的保留株在加入了大量赖氨酸的最少培养基中应该是可能生长的。利用这种现象，生长可以选择对赖氨酸或赖氨酸的类似物S-2-氨乙基半胱氨酸(ABC)有抗药性的株，即具有解除了抑制的lysC*的质粒的保留株。
将这样得到的变异型基因作为重组DNA导入适当的微生物(宿主)中，通过使其表达，可得到保留解除了反馈抑制的AK的微生物。
生产苏氨酸时，得到的lysC基因或变异型lysC基因(lysC*)被导入并扩增的宿主的例子是上述埃希氏杆菌属细菌的野生株，除此之外，满足下述条件的菌均可作为宿主使用这样得到的重组载体DNA的复制起点和lysC基因或变异型lysC基因(lysC*)发挥作用，重组载体DNA可以复制，且lysC基因或变异型lysC基因(lysC*)可以增强。最好的宿主是E.coli B-3996株。
3.用本发明方法制造L-异亮氨酸通过导入上述得到的解除型thrABC操纵子使之转化，进而在合适的培养基中，培养保留解除型ilvGMEDA操纵子的埃希氏杆菌属细菌，使L-异亮氨酸在该培养物中生产积累，从该培养物中采出L-异亮氨酸，可以高效地制造L-异亮氨酸。即，通过将解除型thrABC操纵子和解除型ilvGMEDA操纵子同时保留在埃希氏杆菌属细菌中，可以高效地制造L-异亮氨酸。
进而，通过导入上述得到的解除型thrABC操纵子使之转化，进而在合适的培养基中，培养保留完全解除型ilvGMEDA操纵子的埃希氏杆菌属细菌，使L-异亮氨酸在该培养物中生产积累，从该培养物中采出L-异亮氨酸，可以更高效地制造L-异亮氨酸。即，将解除型thrABC操纵子和完全解除型ilvGMEDA操纵子同时保留在埃希氏杆菌属细菌中，可以更高效地制造L-异亮氨酸。
作为保留解除型thrABC操纵子的埃希氏杆菌属细菌，可举出含有解除型thrABC操纵子的DNA被编入染色体DNA并转化的埃希氏杆菌属细菌，或者将连接该DNA和在埃希氏杆菌属细菌细胞内可自体复制的载体DNA构成的重组DNA导入细胞内并使之转化的埃希氏杆菌属细菌等。
另一方面，通过将含有解除型ilvGMEDA操纵子的DNA导入埃希氏杆菌属细菌中进行转化时，可将含有解除型ilvGMEDA操纵子的DNA编入染色体DNA进行转化，也可通过将连接含有解除型ilvGMEDA操纵子的DNA和在埃希氏杆菌属细菌细胞内可自体复制的载体DNA构成的重组DNA导入细胞内进行转化。
进而，通过将含有完全解除型ilvGMEDA操纵子的DNA导入埃希氏杆菌属细菌中进行转化时，可将含有完全解除型ilvGMEDA操纵子的DNA编入染色体DNA中进行转化，也可通过将连接含有完全解除型ilvGMEDA操纵子的DNA和在埃希氏杆菌属细菌细胞内可自体复制的载体DNA构成的重组DNA导入细胞内进行转化。
将解除型thrABC操纵子和解除型ilvGMEDA操纵子两者或解除型thrABC操纵子和完全解除型ilvGMEDA操纵子两者同时导入埃希氏杆菌属细菌中时，即使两个操纵子均可被编在埃希氏杆菌属细菌的染色体DNA上而被保留，也可在细胞内作为染色体外DNA被保留在单一或分开的质粒上。进而，一个操纵子可被编在染色体DNA上而被保留，另一个操纵子可作为染色体外DNA被保留在细胞内的质粒上。解除型thrABC操纵子和解除型ilvGMEDA操纵子或完全解除型ilvGMEDA操纵子以各自的质粒形式保留在大肠杆菌属细菌中时，优选两种质粒不显示不相容性且具有不同种类的复制起点。
将含有解除型thrABC操纵子的DNA及含有解除型ilvGMEDA操纵子的DNA导入埃希氏杆菌属细菌时，两个DNA的导入顺序无关紧要。
将含有解除型thrABC操纵子的DNA及含有完全解除型ilvGMEDA操纵子的DNA导入埃希氏杆菌属细菌时，两个DNA的导入顺序无关紧要。
作为宿主使用的埃希氏杆菌属细菌只要满足下述条件即可为了使其细胞内的解除型thrABC操纵子、解除型ilvGMEDA操纵子及完全解除型ilvGMEDA操纵子的启动子或它们的基因表达的其他启动子发挥作用，进而所述操纵子中的任何一个作为染色体外DNA导入到质粒上时，用于导入的载体DNA的复制起点在细胞内发挥作用而能够复制。将解除型thrABC操纵子解除型ilvGMEDA操纵子或完全解除型ilvGMEDA操纵子以各自的质粒的形式保留在埃希氏杆菌属细菌中时，两种质粒的复制起点必须同时发挥作用。
用本发明的微生物生产L-异亮氨酸可用通常的微生物培养方法进行。
所用的培养基只要含有碳源、氮源、无机物，必要时含有适当量的所用菌株生长需要的营养源，无论合成培养基还是天然培养基都可以。
作为碳源，可举出以葡萄糖为主的各种糖类、以丙酮酸为主的各种有机酸。另外，根据所使用的微生物的可利用性，可使用乙醇、甘油等醇类物质。
氮源可使用氨、硫酸铵等各种酸的铵盐及胺类以外的氮化合物以及胨、大豆水解产物、发酵菌体分解物等天然氨源。
无机物可使用磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙等。
培养在振荡培养、通气搅拌培养等有氧条件下进行，培养温度为20～40℃，优选30～38℃。培养基的pH为5～9，优选6.5～7.2。培养基的pH可通过氨、碳酸钙、各种酸、各种碱、缓冲液等进行调节。
通常培养1～3日，L-异亮氨酸积累在培养液中。
培养结束后，可用离心分离、膜分离法除去培养液中的菌体等固形物，通过离子交换法、浓缩法、结晶法等回收L-异亮氨酸。
下面说明本发明的实施例。
实施例1 pMWD5的构建从大肠杆菌MI162株提取染色体DNA。用限制性内切酶HindIII切断该染色体DNA。判明含有ilvGM基因的HindIII-HindIII DNA片段的长度为4.8kb。因此，将长度为4.8kb左右的HindIII-HindIII DNA片段和用HindIII切断由宝酒造公司购入的质粒载体pBR322得到的DNA片段连接。将得到的DNA混合物导入乙酰羟基酸合酶缺损株——大肠杆菌MI262株。转化后，选择乙酰羟基酸合酶缺损的性状的互补株，分离该株保留的质粒。分析该质粒的结构，发现在pBR322的HindIII部位插入了含有ilvGM基因的4.8kb的DNA片段。将该质粒命名为pBRGM7。
以Gene 97，21(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，922(1981)和J.Bacteriol.149，294(1982)报导的碱基顺序作为参数，合成了序列表中序列号2及序列号3记载的合成低聚核苷酸DNA。以两个DNA作为引物，以MI162株的染色体DNA作为模板，用PCR法进行DNA的扩增。扩增的DNA片段是具有序列表中序列号1记载的碱基顺序中第25位到952位的序列的DNA片段。将该片段作为片段(A)。
同样，以Gene 97，21(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，922(1981)和J.Bacteriol.149，294(1982)报导的碱基顺序作为参考，合成了序列表中序列号4及序列号5记载的合成低聚核苷酸DNA。以两个DNA作为引物，以MI162株的染色体DNA作为模板，用PCR法扩增DNA。扩增的DNA片段是具有序列表中序列号1记载的碱基顺序中第1161位至2421位的序列的DNA片段。将该片段作为片段(B)。
将用SmaI消化片段(A)得到的大片段和用SmaI消化pUC18(宝酒造)得到的DNA片段连接，得到质粒pUCA。将用KpnI消化片段(B)得到的大片段和用HincII及KpnI消化pHSG399(宝酒造)得到的大片段连接，得到质粒pHSGB。
用KpnI消化质粒pUCA，用DNA聚合酶I的大片段(クレノ-片段)将断裂端平滑末端化，进而用PstI消化，最终分离含有片段(A)的DNA片段。用HindIII消化质粒pHSGB，用DNA聚合酶I的大片段(クレノ-片段)将断裂端平滑末端化，进而用PstI消化，最终分离含有片段(B)的NA片段。连接两个DNA片段，作成质粒pHSGSK。
将携带在pHSGSK上的来自片段(A)及片段(B)的SmaI-KpnI片段命名为片段(C)。片段(C)相当于用SmaI和KpnI切断含有ilvGM基因的4.8kb的HindIII-HindIII片段所得到的片段，含有启动子、SD序列及ilvG基因的上游区域，但缺少由领头序列到减弱子区域的序列约0.2kb。将以上构建pHSGSK的步骤表示在

图1中。
将用SmaI和KpnI消化质粒pHSGSK得到的片段(C)与用SmaI和KpnI消化质粒pBRGM7得到的大DNA片段连接。将得到的质粒命名为pdGM1。携带在pdGM1上的含有ilvGM基因的4.6kb的HindIII-HindIII片段缺少减弱作用所必需的区域。将缺少减弱作用所必需的区域的ilvGM基因在本实施例及图中表示为“ΔattGM”。将构建pdGN1的步骤表示在图2中。
特开平2-458号公报记载的质粒pDRIA4是通过将可用埃希氏杆菌属细菌自体复制且可用短杆细菌属细菌自体复制的シヤトル载体pDR1120和含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因的BamHI-BamHI片段结合来制备的。另外，该BamHI-BamHI片段在特开平2-458号公报中为2.3kb，但现在表明为2.75kb。质粒pDRIA4存在于黄色短杆菌J12358(FERM BP-5087)或者黄色短杆菌J12359(FERM BP-5088)的染色体DNA外。可用通常方法由这些株制备质粒pDRIA4。
在质粒pDRIA4上的BamHI-BamHI 2.3kb的DNA片段中，制备含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因的HindIII-BamHI片段，并与用HindIII及BamHI切断载体pMW119(日本基因社制)得到的DNA片段连接，将这样制得的质粒命名为pMWA1。在本实施例及图中将编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因表示为“A*”。
将用HindIII切断质粒pMWA1后得到的DNA片段与用HindIII切断质粒pdGM1得到的含有ilvGM基因的DNA片段连接。通过分析存在于质粒上的限制性内切酶识别部位的位置，选择ilvGM基因的转录方向和ilvA基因的转录方向相同者，将其命名为质粒pMWGMA2。将构建pMWGMA2的步骤表示在图3中。
制备大肠杆菌MI162株的染色体DNA，用SalI及PstI将其切断，制备DNA片段混合物。另一方面，用SalI及PstI切断载体pUC19(宝酒造社)，制备DNA片段。连接DNA片段混合物及切断pUC19得到的DNA片段，得到DNA混合物。将该DNA混合物导入到转氨基酶B缺损的AB2070株中，进行转化，选择支链氨基酸需要性恢复的株。在由该株制备质粒时，将用SalI及PstI切断质粒pUC19得到的DNA片段和含有ilvE基因的SalI-PstI DNA片段连接。将该质粒命名为pUCE1。
用HindIII部分消化pMWGA2，制备DNA片段混合物。另一方面，用HindIII切断pUCE1，制备含有一部分ilvE基因和一部分ilvD基因的1.7kb的HindIII-HindIII DNA片段。使用连接两者得到的DNA混合物转化二羟酸脱水酶(ilvD基因产物)缺损的AB1280株，选择被转化株中支链氨基酸需要性消失的株。由该转化株制备质粒时，将仅用存在于ΔattGN和A*之间的HindIII部位切断pMWGMA2得到的DNA片段与含有来自pUCE1的ilvE基因的一部分与一部分ilvD基因的1.7kb的HindIII-HindIIIDNA片段连接，再生ilvGMEDA质粒。将这样得到的质粒命名为pMWD5。构建pMWD5的步骤表示在图4中。
如上述得到的质粒pMWD5是以pMW119作为载体携带含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子的质粒。
实施例2 L-异亮氨酸生产菌株的制造将由实施例1得到的质粒pMWD5用常规氯化铷法导入到特表平3-501682号公报及USP 5，175，107记载的L-苏酸氨生产菌大肠杆菌B-3996株中。在由pMWD5转化得到的株中，选择对100μg/ml链霉素和100μg/ml氨苄青霉素同时具有抗药性的转化株。将得到的转化株命名为AJ12919株。
L-苏氨酸生产菌大肠杆菌B-3996株以登记号1867保存在原苏联抗生素研究院(the USSR Antibiotics Research Institute)中。B-3996株的宿主菌是大肠杆菌TDH-6株，缺损thrC基因，在5mgml的L-苏氨酸存在下可以增殖，缺失苏氨酸脱氢酶活性，ilvA基因具有渗漏变异。而且B-3996株保留着质粒pVIC40，该质粒是thrABC操纵子被来自广宿主域载体RSF1010的载体携带而得到的，其中thrABC操纵子含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因。因此，保留质粒pVIC40和质粒pMWD5的大肠杆菌AJ12919株是通过质粒载体保留thrABC操纵子和ilvGMEDA操纵子的株，其中thrABC操纵子含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因，ilvGMEDA操纵子含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域。
实施例3 用AJ12919株生产L-异亮氨酸的试验(1)用由实施例2得到的AJ12919株进行L-异亮氨酸的发酵生产试验。在由1％bact·胰酶解胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂、100μg/ml链霉素、100μg/ml氨苄青霉素组成的培养基上涂布AJ12919株，在37℃下培养18～24小时后，将其中一部分用白金环接种在20ml发酵培养基(4％葡萄糖、1.6％硫酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁七水合盐、0.001％硫酸亚铁七水合盐、0.001％硫酸锰五水合盐、0.2％酵母提取物、3％碳酸钙，pH7.0)中，在37℃下振荡培养24小时。用高速液相色谱法测定除去菌体的培养上清液中的L-异亮氨酸及L-苏氨酸的浓度。结果表示在表1中。
(表1)菌株 L-异亮氨酸浓度(g/l)L-苏氨酸浓度(g/l)AJ 1291910 0实施例4 用AJ12919株生产L-异亮氨酸的试验(2)将AJ12919株在与实施例3相同的琼脂培养基中在37℃下培养24小时后，接种在含有300ml与实施例3相同组成的发酵培养基的1升发酵槽中，在400rpm搅拌速度、300ml/分通气量、37℃下培养16小时，得到种培养液。将30ml得到的种培养液接种在含有250ml由6％葡萄糖、1.6％硫酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁七水合盐、0.001％硫酸亚铁七水合盐、0.001％硫酸锰五水合盐、0.2％酵母提取物组成的发酵培养基(pH7.0)的1升发酵槽中，在37℃、300ml/分通气量下，一边控制搅拌数，使培养基中的溶存氧浓度达5％以上，一边适当地供给葡萄糖，用氨气维持pH值在7.0左右，培养进行23小时。用高速液相色谱法测定除去菌体的培养上清液中的L-异亮氨酸浓度。结果表明，培养上清液中L-异亮氨酸的积累量为39g/升。
实施例5 L-异亮氨酸生产菌种的制备(2)在国际公开专利WO94/11517号公报中，公开了从保藏在原苏联抗菌素研究院(登记号1867)的L-苏氨酸生产菌B-3996株保留的质粒pVIC40和保藏在日本工业技术院生命工学工业技术研究所(登记号FERMP-13136，国际保藏号FERM BP-4462)的编码实质上解除了L-赖氨酸的抑制的AKIII的lysC基因携带质粒(PLLC*80)，构建含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操纵子和编码实质上解除了L-赖氨酸的抑制的AKIII的lysC基因被来自广宿主域载体RSF1010的载体携带得到的质粒pVICLC*80A的方法，以及将该质粒pVICLC*80A导入B-3996株的宿主B-399株(TDH-6株)得到的L-苏氨酸生产菌。
在将质粒pVICLC*80A导入B-3996株的宿主B-399株(TDH-6株)所得的L-苏氨酸生产菌中，用常规氯化铷法导入由实施例1得到的质粒pMWD5。在由pMWD5转化而成的株中，选择对100μg/ml链霉素和100μg/ml氨苄青霉素同时具有抗药性的转化株。将得到的转化株命名为AJ13100株。
AJ13100株的宿主菌是大肠杆菌TDH-6株(B-399株)，缺损thrC基因，在5mg/ml的L-苏氨酸存在下可以增殖，缺失苏氨酸脱氢酶活性，ilvA基因具有渗漏变异。而且AJ13100株保留着质粒pVICLC*80A和实施例1得到的质粒pMWD5，质粒pVICLC*80A是thrABC操纵子和lysC基因被来自广宿主域载体RSF1010的载体携带而得到的，其中thrABC操纵子含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因，lysC基因编码实质上解除了L-赖氨酸的抑制的AKIII。因此，大肠杆菌AJ13100株是通过质粒载体保留thrABC操纵子、lysC基因和ilvGMEDA操纵子的株，其中thrABC操纵子含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因，lysC基因编码实质上解除了L-赖氨酸的抑制的AKIII，ilvGMEDA操纵子含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域。
实施例5中所用的TDH-6株(B-399株)已保藏在原苏联商业微生物保藏中心(位于USSR Research Institute of Geneticsand Selection of Commercial Microorganism，保藏号BKIIMB-3420)。
实施例6 由AJ13100株生产L-异亮氨酸的试验用实施例5得到的AJ13100株进行L-异亮氨酸的发酵生产试验。在由1％bact·胰酶解胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂、100μg/ml链霉素、100μg/ml氨苄青霉素组成的培养基上涂布AJ13100株，在37℃下培养18～24小时后，将其中一部分用白金环接种在20ml发酵培养基(4％葡萄糖、1.6％硫酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁七水合盐、0.001％硫酸亚铁七水合盐、0.001％硫酸锰五水合盐、0.2％酵母提取物、3％的碳酸钙，pH7.0)中，在37℃下振荡培养24小时。按同样方法培养由实施例2得到的AJ12919株。用高速液相色谱法测定除去菌体的培养上清液中的L-异亮氨酸及L-苏氨酸的浓度。结果表示在表2中。
(表2)菌株 L-异亮氨酸浓度(g/l)L-苏氨酸浓度(g/l)AJ 12919 100AJ 13100 120由于含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因的thrABC操纵子被携带在多复制的质粒上进行扩增，所以本发明的具有L-异亮氨酸生产性的埃希氏杆菌属细菌 可生物合成足量的L-异亮氨酸的前体物质——L-苏氨酸。进而，由于含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子被携带在复数复制的质粒上进行扩增，故可高效地将L-苏氨酸变换成L-异亮氨酸。
若使用含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子，可以使来自ilvGM基因、ilvE基因、ilvD基因及ilvA基因的L-异亮氨酸生物合成系的酶群平衡地产生。由于转录用原来的启动子进行，所以能高效率地进行。
一般认为，使用多复制的质粒，只增加含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因的ilvGMEDA操纵子的基因量，可解除ilvGMEDA操纵子的转录水平的负控制，充分改善L-异亮氨酸的生产性。可是在本申请的发明中，通过进一步除去 减弱作用所必需的区域，意外成功地进一步改善了L-异亮氨酸的生产性。
序列表序列号(SEQ ID NO)1序列长度2841序列类型核酸(nucleic acid)链数双链(double)拓扑结构直链形(linear)序列种类染色体DNA起源生物名大肠杆菌(Escherichia coli)株名MI162序列的特征表示特征的符号CDS存在位置957..1055决定特征的方法S表示特征的符号减弱子存在位置1081..1104决定特征的方法S表示特征的符号CDS存在位置1195..2841决定特征的方法S表示特征的符号断裂部位(SmaI)存在位置52..57决定特征的方法S表示特征的符号断裂部位(KpnI)
存在位置2395..2400决定特征的方法S序列CTCGCTTTCC TTGTTCCTGA CCGATAACAT CACTGAGATC ATGTTGTAGC GCCCGGGATA 60CTGCATCAGT TGGTTTCGGG CGTTCGAGAG CGTGCTTACC TTCCAGAAAC GCACAGACAG120CTTGCAGATG ATCGGCTATC AGGCATCCTT CACCGTTAAT TAGCCCCACT TCATCTTCGT180TATCTTTCGC GACGATAATT TTTCTGCCCG ACTTAATAGC TTCAGTTGCA CTGGAGATTG240CGCCGGGAAC GCCACGCAGA GCGCCTGTAA GCGCCAGTTC TCCGACTAAT TCATATTCAT300CTAACTTATT GGCTGTAAGC TGTTCTGAGG CCGCCAGCAA CGCAATGGCG ATAGGTAAAT360CATATCGTCC CCCTTCTTTT GGCAGATCAG CTGGAGCCAG GTTGATGGTG ATTTTTTTCG420CCGGATATTC ATATCCGCTA TTGATAATGG CGCTGCGCAC GCGATCGCGA GCTTCTTTTA480CCGTTGTTTC TGGTAAGCCC ACCATCGTTA AGCCGGGTAG ACCTTTACTG ATATGTACCT540CAACAGTGAT CGGGGGCGCA TTTACTCCCA GGGCTGCGCG GGTATGAACA ATTGACAGTG600ACATAAGCCC TCCTTGAGTC ACCATTATGT GCATAAGATA TCGCTGCTGT AGCCCGCTAA660TTCGTGAATT TTAGTGGCTG ATTCCTGTTT ATTTGTGCAA GTGAAGTTGA GTTGTTCTGG720CGGTGGAATG ATGCTCGCAA AAATGCAGCG GACAAAGGAT GAACTACGAG GAAGGGAACA780ACATTCATAC TGAAATTGAA TTTTTTTCAC TCACTATTTT ATTTTTAAAA AACAACAATT840TATATTGAAA TTATTAAACG CATCATAAAA ATCGGCCAAA AAATATCTTG TACTATTTAC900AAAACCTATG GTAACTCTTT AGGCATTCCT TCGAACAAGA TGCAAGAAAA GACAAA956ATG ACA GCC CTT CTA CGA GTG ATT AGC CTG GTC GTG ATT AGC GTG GTG 1004Met Thr Ala Leu Leu Arg Val Ile Ser Leu Val Val Ile Ser Val Val1 5 10 15GTG ATT ATT ATC CCA CCG TGC GGG GCT GCA CTT GGA CGA GGA AAG GCT 1052Val Ile Ile Ile Pro Pro Cys Gly Ala Ala Leu Gly Arg Gly Lys Ala20 25 30TAGAGATCAA GCCTTAACGA ACTAAGACCC CCGCACCGAA AGGTCCGGGG GTTTTTTTTG1112ACCTTAAAAA CATAACCGAG GAGCAGACAA TGAATAACAG CACAAAATTC TGTTTCTCAA1172GATTCAGGAC GGGGAACTAA CT ATG AAT GGC GCA CAG TGG GTG GTA CAT GCG 1224Met Asn Gly Ala Gln Trp Val Val His Ala1 5 10TTG CGG GCA CAG GGT GTG AAC ACC GTT TTC GGT TAT CCG GGT GGC GCA 1272Leu Arg Ala Gln Gly Val Asn Thr Val Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala15 20 25ATT ATG CCG GTT TAC GAT GCA TTG TAT GAC GGC GGC GTG GAG CAC TTG 1320Ile Met Pro Val Tyr Asp Ala Leu Tyr Asp Gly Gly Val Glu His Leu30 35 40CTA TGC CGA CAT GAG CAG GGT GCG GCA ATG GCG GCT ATC GGT TAT GCT 1368Leu Cys Arg His Glu Gln Gly Ala Ala Met Ala Ala Ile Gly Tyr Ala45 50 55CGT GCT ACC GGC AAA ACT GGC GTA TGT ATC GCC ACG TCT GGT CCG GGC 1416Arg Ala Thr Gly Lys Thr Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly60 65 70GCA ACC AAC CTG ATA ACC GGG CTT GCG GAC GCA CTG TTA GAT TCC ATC 1464Ala Thr Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Ile75 80 85 90CCT GTT GTT GCC ATC ACC GGT CAA GTG TCC GCA CCG TTT ATC GGC ACT 1512Pro Val Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Ser Ala Pro Phe Ile Gly Thr95 100 105GAC GCA TTT CAG GAA GTG GAT GTC CTG GGA TTG TCG TTA GCC TGT ACC 1560Asp Ala Phe Gln Glu Val Asp Val Leu Gly Leu Ser Leu Ala Cys Thr110 115 120AAG CAT AGC TTT CTG GTG CAG TCG CTG GAA GAG TTG CCG CGC ATC ATG 1608Lys His Ser Phe Leu Val Gln Ser Leu Glu Glu Leu Pro Arg Ile Met125 130 135GCT GAA GCA TTC GAC GTT GCC TGC TCA GGT CGT CCT GGT CCG GTT CTG 1656Ala Glu Ala Phe Asp Val Ala Cys Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu140 145 150GTC GAT ATC CCA AAA GAT ATC CAG TTA GCC AGC GGT GAC CTG GAA CCG 1704Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Ser Gly Asp Leu Glu Pro155 160 165 170TGG TTC ACC ACC GTT GAA AAC GAA GTG ACT TTC CCA CAT GCC GAA GTT 1752Trp Phe Thr Thr Val Glu Asn Glu Val Thr Phe Pro His Ala Glu Val175 180 185GAG CAA GCG CGC CAG ATG CTG GCA AAA GCG CAA AAA CCG ATG CTG TAC 1800Glu Gln Ala Arg Gln Met Leu Ala Lys Ala Gln Lys Pro Met Leu Tyr190 195 200GTT GGC GGT GGC GTG GGT ATG GCG CAG GCA GTT CCG GCT TTG CGT GAA 1848Val Gly Gly Gly Val Gly Met Ala Gln Ala Val Pro Ala Leu Arg Glu205 210 215TTT CTC GCT GCC ACA AAA ATG CCT GCC ACC TGT ACG CTG AAA GGG CTG 1896Phe Leu Ala Ala Thr Lys Met Pro Ala Thr Cys Thr Leu Lys Gly Leu220 225 230GGC GCA GTA GAA GCA GAT TAT CCG TAC TAT CTG GGC ATG CTG GGG ATG 1944Gly Ala Val Glu Ala Asp Tyr Pro Tyr Tyr Leu Gly Met Leu Gly Met235 240 245 250CAC GGC ACC AAA GCG GCA AAC TTC GCG GTG CAG GAG TGT GAC CTG CTG 1992His Gly Thr Lys Ala Ala Asn Phe Ala Val Gln Glu Cys Asp Leu Leu255 260 265ATC GCC GTG GGC GCA CGT TTT GAT GAC CGG GTG ACC GGC AAA CTG AAC 2040Ile Ala Val Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Asn270 275 280ACC TTC GCG CCA CAC GCC AGT GTT ATC CAT ATG GAT ATC GAC CCG GCA 2088Thr Phe Ala Pro His Ala Ser Val Ile His Met Asp Ile Asp Pro Ala285 290 295GAA ATG AAC AAG CTG CGT CAG GCA CAT GTG GCA TTA CAA GGT GAT TTA 2136Glu Met Asn Lys Leu Arg Gln Ala His Val Ala Leu Gln Gly Asp Leu300 305 310AAT GCT CTG TTA CCA GCA TTA CAG CAG CCG TTA AAT CAA TGT GAC TGG 2184Asn Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Asn Gln Cys Asp Trp315 320 325 330CAG CAA CAC TGC GCC CAG CTG CGT GAT GAA CAT TCC TGG CGT TAC GAC 2232Gln Gln His Cys Ala Gln Leu Arg Asp Glu His Ser Trp Arg Tyr Asp335 340 345CAT CCC GGT GAC GCT ATC TAC GCG CCG TTG TTG TTA AAA CAA CTG TCG 2280His Pro Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Pro Leu Leu Leu Lys Gln Leu Ser350 355 360GAT CGT AAA CCT GCG GAT TGC GTC GTG ACC ACA GAT GTG GGG CAG CAC 2328Asp Arg Lys Pro Ala Asp Cys Val Val Thr Thr Asp Val Gly Gln His365 370 375CAG ATG TGG GCT GCG CAG CAC ATC GCC CAC ACT CGC CCG GAA AAT TTC 2376Gln Met Trp Ala Ala Gln His Ile Ala His Thr Arg Pro Glu Asn Phe380 385 390ATC ACC TCC AGC GGT TTA GGT ACC ATG GGT TTT GGT TTA CCG GCG GCG 2424Ile Thr Ser Ser Gly Leu Gly Thr Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala395 400 405 410GTT GGC GCA CAA GTC GCG CGA CCG AAC GAT ACC GTT GTC TGT ATC TCC 2472Val Gly Ala Gln Val Ala Arg Pro Asn Asp Thr Val Val Cys Ile Ser415 420 425GGT GAC GGC TCT TTCATG ATG AAT GTG CAA GAG CTG GGC ACC GTA AAA 2520Gly Asp Gly Ser Phe Met Met Asn Val Gln Glu Leu Gly Thr Val Lys430 435 440CGC AAG CAG TTA CCG TTG AAA ATC GTC TTA CTC GAT AAC CAA CGG TTA 2568Arg Lys Gln Leu Pro Leu Lys Ile Val Leu Leu Asp Asn Gln Arg Leu445 450 455GGG ATG GTT CGA CAA TGG CAG CAA CTG TTT TTT CAG GAA CGA TAC AGC 2616Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Gln Leu Phe Phe Gln Glu Arg Tyr Ser460 465 470GAA ACC ACC CTT ACT GAT AAC CCC GAT TTC CTC ATG TTA GCC AGC GCC 2664Glu Thr Thr Leu Thr Asp Asn Pro Asp Phe Leu Met Leu Ala Ser Ala475 480 485 490TTC GGC ATC CAT GGC CAA CAC ATC ACC CGG AAA GAC CAG GTT GAA GCG 2712Phe Gly Ile His Gly Gln His Ile Thr Arg Lys Asp Gln Val Glu Ala495 500 505GCA CTC GAC ACC ATG CTG AAC AGT GAT GGG CCA TAC CTG CTT CAT GTC 2760Ala Leu Asp Thr Met Leu Asn Ser Asp Gly Pro Tyr Leu Leu His Val510 515 520TCA ATC GAC GAA CTT GAG AAC GTC TGG CCG CTG GTG CCG CCT GGC GCC 2808Ser Ile Asp Glu Leu Glu Asn Val Trp Pro Leu Val Pro Pro Gly Ala525 530 535AGT AAT TCA GAA ATG TTG GAG AAA TTA TCA TGA 2841Ser Asn Ser Glu Met Leu Glu Lys Leu Ser540 545序列号(SEQ ID NO)2序列长度22序列类型核酸(nucleic acid)链数单链(single)拓扑结构直链形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列TAACATCACT GAGATCATGT TG序列号(SEQ ID NO)3序列长度21序列类型核酸(nucleic acid)链数单链(single)拓扑结构直链形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列TCTTTTCTTG CATCTTGTTC G序列号(SEQ ID NO)4序列长度22序列类型核酸(nucleic acid)链数单链(single)拓扑结构直链形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列TCTGTTTCTC AAGATTCAGG AC序列号(SEQ ID NO)5序列长度19序列类型核酸(nucleic acid)链数单链(single)拓扑结构直链形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列CGCCGGTAAA CCAAAACCC序列号(SEQ ID NO)6序列长度20序列类型核酸(nucleic acid)链数单链(single)拓扑结构直链形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG序列号(SEQ ID NO)7序列长度18序列类型核酸(nucleic acid)链数单链(single)拓扑结构直链形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列GAATTCCTTT GCGAGCAG附图的简要说明图1表示质粒pHSGSK的构建步骤。
图1中所用的省略符号中，H表示存在于DNA上的HindIII切断部位。同样，P表示PstI切断部位，K表示KpnI切断部位，B表示BamHI切断部位，X表示XbaI切断部位，Sm表示SmaI切断部位。&表示不能由限制性内切酶再切断。
P→表示启动子。SD表示シヤイン·ダルガノ序列。ATG表示翻译开始密码子。TGA表示翻译终止密码子。
Ap是赋予转化株对氨苄青霉素的抗药性的标记基因。Cm是赋予转化株对氯霉素的抗药性的标记基因。
图2表示除去了ilvGMEDA操纵子的减弱作用所必需的区域的ilvGM基因及质粒pdGM1的构建步骤。
图2中所用的省略符号与图1中所用的省略符号的意义相同。
图3表示质粒pMWGMA2的构建步骤。
图3中所用的省略符号与图1中所用的省略符号的意义相同。
图4表示质粒pMWD5的构建步骤。
图4中所用的省略符号与图1中所用的省略符号的意义相同。此外，S表示SaII切断部位，par表示质粒的稳定化区域。
权利要求
1.具有L-异亮氨酸生产性的埃希氏杆菌属细菌，其特征是保留含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因的thrABC操纵子和含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子。
2.权利要求1所述的埃希氏杆菌属细菌，其特征是将上述thrABC操纵子和上述ilvGMEDA操纵子保留在质粒上。
3.权利要求2所述的埃希氏杆菌属细菌，其特征是保留携带上述thrABC操纵子的质粒(A)和携带上述ilvGMEDA操纵子的质粒(B)两种质粒。
4.权利要求1-3中任何一项所述的埃希氏杆菌属细菌，其中上述的ilvGMEDA操纵子具有记载在序列表中序列号1上的DNA序列的953位至1160位缺损的DNA序列。
5.权利要求4所述的埃希氏杆菌属细菌，其中上述两种质粒中，质粒(A)是pVIC40，质粒(B)是pMWD5。
6.权利要求1-5中任何一项所述的埃希氏杆菌属细菌，其中上述的埃希氏杆菌属细菌是大肠杆菌。
7.权利要求6所述的大肠杆菌，其特征是宿主株缺损thrC基因，在5mg/ml的L-苏氨酸存在下可以增殖，缺失苏氨酸脱氢酶活性，ilvA基因具有渗漏变异，并且保留含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操纵子和含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子。
8.权利要求7所述的大肠杆菌，它是大肠杆菌AJ12919株。
9.用发酵法制造L-异亮氨酸的方法，其特征是在培养基中培养权利要求1-8的任何一项所述的埃希氏杆菌属细菌，使L-异亮氨酸在该培养基中生成积累，而后从该培养基中采出L-异亮氨酸。
10.具有L-异亮氨酸生产性的埃希氏杆菌属细菌，其特征是保留含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因的thrABC操纵子和编码实质上解除了L-赖氨酸的抑制的天冬氨酸激酶III的lysC基因以及含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子。
11.权利要求10所述的埃希氏杆菌属细菌，其特征是将上述thrABC操纵子和上述lysC基因以及上述ilvGNEDA操纵子保留在质粒上。
12.权利要求11所述的埃希氏杆菌属细菌，其特征是保留携带上述thrABC操纵子和上述lysC基因的质粒(C)和携带上述ilvGMEDA操纵子的质粒(B)两种质粒。
13.权利要求10-12中任何一项所述的埃希氏杆菌属细菌，其中上述的ilvGMEDA操纵子具有记载在序列表中序列号1上的DNA序列的953位至1160位缺损的DNA序列。
14.权利要求13所述的埃希氏杆菌属细菌，其中上述两种质粒中，质粒(C)是pVICLC*80A，质粒(B)是pMWD5。
15.权利要求10-14中任何一项所述的埃希氏杆菌属细菌，其中上述的埃希氏杆菌属细菌是大肠杆菌。
16.权利要求15所述的大肠杆菌，其特征是宿主株缺损thrC基因，在5mg/ml的L-苏氨酸存在下可以增殖，缺失苏氨酸脱氢酶活性，ilvA基因具有渗漏变异，并且保留含有编码实质上解除了L-苏氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操纵子和编码实质上解除了L-赖氨酸的抑制的AKIII的lysC基因以及含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子。
17.权利要求16所述的大肠杆菌，它是大肠杆菌AJ13100株。
18.用发酵法制造L-异亮氨酸的方法，其特征是在培养基中培养权利要求10-17中任何一项所述的埃希氏杆菌属细菌，使L-异亮氨酸在该培养基中生成积累，而后从培养基中采出L-异亮氨酸。
全文摘要
本发明提供了用发酵法以更高收率廉价制造L-异亮氨酸的方法，亦提供了以更高收率廉价制造用于输液用氨基酸等用途的L-异亮氨酸的制造方法。本发明包括属于埃希氏杆菌属、保留解除型thrABC操纵子和完全解除型ilvGMEDA操纵子的L-异亮氨酸生产性微生物；属于埃希氏杆菌属、保留上述thrABC操纵子、上述ilvGMEDA操纵子和编码实质上解除了L-赖氨酸的抑制的天冬氨酸激酶III的lysC基因的L-异亮氨酸生产性微生物；以及用上述微生物通过发酵法制造L-异亮氨酸的方法。
文档编号C12N15/52GK1117524SQ9510662
公开日1996年2月28日 申请日期1995年5月30日 优先权日1994年5月30日
发明者桥口贤一, 岸野浩子, 辻本信晴, 松本裕 申请人:味之素株式会社