用木聚糖酶处理植物材料的制作方法

专利名称：用木聚糖酶处理植物材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及木聚糖酶制剂用于减低植物材料的粘度和用于将植物材料(例如小麦)分成单个有用的成分，以及进行所述粘度降低或分离的方法。
背景技术：
小麦含有谷蛋白和淀粉这些可在用湿磨法加工过程中回收的有价值成分。重要的谷蛋白是主要产物，而高质A-淀粉和低质B-淀粉是有价值的副产品。残余的纤维和可溶性固体物质是更进一步的副产品。
通过商售途径可得的Trichoderma reesei纤维素酶酶制剂SpezymeRCP(Genencor，USA)已被证明可以降低粘度和改善小麦和谷物淀粉的加工。
Weegels等人(1992)描述了酶类(纤维素酶、半纤维素酶、脂酶和蛋白酶/淀粉酶)在小麦的分离处理中的应用。该文还得出结论纤维素酶和半纤维素酶能改善小麦的加工特性和提高谷蛋白和淀粉的产率。所用的半纤维素酶是一种木聚糖酶制剂，该制剂含有包括淀粉酶和蛋白酶活性的显著附带活性。
已知木聚糖酶能够将小麦粉和来源于其它植物的材料降解成大量不同的降解产物。已有大量参考文献描述了从真菌泡盛曲霉中纯化的木聚糖酶，例如，可以参考公开了三株泡盛曲霉菌之内木聚糖酶理化和动力学特征的Kormelink等人的文章(1993)。通过将这类泡盛曲霉木聚糖酶应用于酶降解各种植物材料包括谷麸、燕麦裂壳、小麦粉、落叶松木和桦木所得的降解产物已在特别是下列文献中描述Kormelink et al.，(1991)、kormelink et al.，(1992)、J.M.Kormelinkand A.G.J.Voragen(1993)、Gruppen at al.，(1992)和Grmppen etal.，Rymposium 1993，10。
Voragen等人(1992)和Gmippen等人(1993a和1993b)公开了用泡盛曲霉内木聚糖酶降解从小麦粉分离的水可提取和水不可提取的阿拉伯糖基木聚糖部分。后一参考文献描述了两种泡盛曲霉木聚糖酶在小麦面包焙烤中的应用。
Shei等人(1985)和Fournier等人(1985)描述了从黑曲霉中分离的内木聚糖酶之纯化和鉴定特征。
上述的参考文献无一介绍过木聚糖酶可用于小麦的分离，也没有说明如何选择专门用于所述目的的木聚糖酶。
Dusterhoft等人(1993.10，研讨会)描述了内木聚糖酶在降解动物饲料中非淀粉多糖中的应用；Vietor等人(1993)描述了内木聚糖酶在啤酒酿造过程中用于降低麦芽汁的粘度。
本发明的目的在于提供改变植物材料粘度和将植物材料分成所需成分的改良方法。
附图的简要说明

图1表示木聚糖酶II和其它酶一起的比粘度。
图2表示湿磨小麦分离法的原理。
图3表示小麦在Broiler中的AMEn。
BF+＝Bio-FeedRPlusXylII＝木聚糖酶II本发明的简明公开本发明人意外地发现，木聚糖酶分别对水溶性和水不溶性戊聚糖的活性似乎对木聚糖酶降低植物材料粘度和/或分离植物材料成分很重要。本发明正是基于这一发现。
据此，本发明的第一方面涉及木聚糖酶制剂用于改变植物材料的粘度，其中，木聚糖酶制剂表现为a.所加入的每毫克蛋白质WSPS至少为0.06和/或b.所加入的每毫克蛋白质WSPU至少为15和/或c.比活性至少0.053FVRU/mg蛋白质。
本发明的第二重要方面涉及表现出上述特征a)-c)的木聚糖酶制剂。更进一步，本发明涉及这类毒制剂的多种用途。
在本说明书中，WSPU(水溶性戊聚糖单位)定义为木聚糖酶制剂每毫克蛋白质对水溶性戊聚糖的活性，而WIPU(水不溶性单位)定义为木聚糖酶制剂每毫克蛋白对水不溶性戊聚糖的活性，其中所述活性以还原糖检测。有关水溶性和水不溶性戊聚糖各自的产生之描述见于下文的材料与方法部分。在实施例4中描述了确定WSPU和WIPU的测定方法。WSPS是每毫克所加入蛋白质WSPU和WIPU间的比，其中的蛋白质是根据Kjeldahl的描述(参见本文的材料与方法部分)确定。
在本发明说明书中，术语“所加入的蛋白质”意指含有木聚糖裂解活性的一定量蛋白质，该蛋白质是从已产生了所述酶的发酵肉汤中回收的，并且随后用于本发明目的。因此，在评定如本文所定义的指定酶的WSPS、WSPU和FVRU值时，术语“毫克蛋白质”是指在从发酵肉汤中回收时与所述酶相关的毫克蛋白质，而并不是任何无活性的或非木聚糖裂解性的所加入蛋白质。
可以理解到，用于本发明目的的木聚糖酶制剂与现有技术的木聚糖酶和纤维素酶相比而言，每毫克蛋白质含有极高的木聚糖裂解活性。这就意味着利用出人预料低剂量(毫克量蛋白质)的本发明木聚糖酶制剂，即可分别获得极大的粘度降低(表示为比粘度)和小麦的分离能力。欲用于本发明的酶最好基本上为单一成分的酶，典型情况下，可以借助重组DNA技术以高纯度形式高效地产生(即，含有相对小量的、与木聚糖裂解活性相比所不需要的附带活性)。
FVRU被定义为酶的比粘度，它是相对于如WO92/03540所述由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)DSM 6124所产生的木聚糖酶标准酶制剂的比粘度。所述酶在下文的描述中被称为短小芽孢杆菌木聚糖酶。该短小芽孢杆菌制剂之比粘度的检测与所加入的毫克短小芽孢杆菌木聚糖酶蛋白相关。实施例1描述了比粘度的测定方法。
上文所定义的一类木聚糖酶被认为在小麦的分离中具有特别的用途。因此，本发明人已观察到，在小麦分离中具有良好作用的木聚糖酶能够迅速地降解水溶性小麦戊聚糖，而只以非常低的速度降解水溶性小麦戊聚糖。无需局限于任何理论，现在就可以相信，这种在小麦分离中表现出来的良好作用是由于粘性水溶性戊聚糖的降解所致。对于不溶性戊聚糖的低降解作用对于用本文所定义的木聚糖酶获得的粘度降低也是很重要的，因为增溶的不溶性戊聚糖可以增加粘度。
本发明更进一步涉及将植物材料分成所需成分的方法和改变植物材料粘度的方法，其中应用了上文所定义的木聚糖酶制剂。本发明的详细描述木聚糖酶制剂正如通过上文的描述可以理解的，用于本发明目的的木聚糖酶制剂的活性(用术语WSPS或WSPU定义)被认是最关键的。最好是用于本发明目的的木聚糖酶制剂所具有的每毫克所加蛋白质的WSPS大于0.06。优选的是，所增加的WSPS为0.06-10.0/毫克蛋白质，更优选地为0.7-8.0/毫克蛋白质，再优选的是0.9-6.0/毫克蛋白质，特别是至少1.5-4.0/毫克蛋白质，和/或每毫克所加蛋白质的WSPU大于15，如25或大于25。优选的是每毫克所加蛋白质的WSPU为至少100至至多150.000，更优选的是130-120.000，如至少160-100.000，更优选的是300-90.000，再优选的是20.000-85.000，和/或比活性至少为0.053FVRU/mg蛋白质。优选的比活性范围是0.053-3.0FVRU/mg蛋白质，如0.4、0.5或0.6至3.0FVRU/mg蛋白质，更优选的是0.1-2.0FVRU/mg蛋白质，再优选的是0.4-1.0FVRU/mg蛋白质。
用于本发明目的的木聚糖酶制剂可以是有包括哺乳动物、植物或动物在内的任何来源，而目前优选的还是木聚糖酶来源于微生物。特别是所述木聚糖酶制剂可以来源于丝状真菌或酵母。
木聚糖酶已在许多种真菌中发现，所述真菌种特别是指曲霉，如黑曲霉、泡盛曲霉、A.acnleatus曲霉和米曲霉；木霉，如T.reesei或T.harzianum毒霉，如沙门柏干酪青霉；镰孢菌，如尖镰孢霉以及Hu-micola如H.lannginosa和H.insolens。也曾在细菌中发现过木聚糖酶，例如，在芽胞杆菌属，如短小芽孢杆菌中有木聚糖酶。
用于本发明目的的木聚糖酶制剂可以通过包括下列步骤的方法提供a.利用现有技术中已知方法从任何产木聚糖酶的微生物中分离木聚糖酶制剂，b.如本文所述测试该木聚糖酶制剂的WSPS、WSPU和/或FRVU活性，以评价该酶是否适合用于本发明目的。
步骤A中所指的产木聚糖酶微生物可以是天然产木聚糖酶的微生物，或者是已被编码所述木聚糖酶DNA转化的微生物。
已经发现真菌A.aculeatus曲霉，特别是菌株CBS101.43可以产生特别适用于本发明目的的木聚糖酶。所述木聚糖酶在本发明的描述中被称为木聚糖酶II(或XylII)。并且在WO94/21785中被进一步描述，该文献也包括在本申请中。
在实施例4中，分别列出了大量现有技术中已知的木聚糖酶和本发明木聚糖酶II的WSPS及WSPU值。而且，还显示了这些酶用于小麦分离的效果(表示为FVRU)。很显然，所述现有技术木聚酶中设有一种表现出能与本文所公开的木聚糖酶II相比的小麦分离效果。
编码木聚糖酶II的DNA序列在WO94/21785的SEQ ID NO.2中示出，而且其相应的氨基酸序列为SEQ ID NO.5。可以这样认为，与木聚糖酶II显示出同源性的木聚糖酶可以与木聚糖酶II一样有类似的活性，因此而可用于本发明目的。据此，在特别优选的实施方案中，用于本发明的木聚糖酶可以是i.由WO94/21785的SEQ ID NO.2所示DNA序列或其编码木聚糖酶II同系物的类似物编码；ii.含有WO94/21785的SEQ ID NO.5所示氨基酸序列或其同源序列；和/或iii.与抗纯化的木聚糖酶之抗体有免疫反应性，所述纯化的木聚糖酶来源于A.aiuleatm曲霉CBS101.43。
本说明书中，术语“同系物”意指显示木聚糖酶活性(根据本文所定义的WSPS、WSPU和/或FVRU)的多肽，由能与根据编码木聚糖酶II的DNA序列制备的寡核苷酸探针在某特定条件下杂交的DNA序列编码，所述杂交条件例如，在5XSSC中预浸泡，并于含5XSSC、5xDenhandt溶液、50mM磷酸钠pH6.8和5Dug变性的超声处理的小牛胸腺DNA的溶液中于-40℃预杂交1小时，随后在补充了50μci32P-dCTP标记探针的相同溶液中于-40℃杂交18小时，然后在2xSSC、0.2％SDS中于40℃漂洗3次，共30分钟。更确切地说，术语“同系物”是指与WO94/21785的SEQ ID NO.2所示DNA序列或其实质部分至少有70％同源性的DNA序列，例如，与WO94/21785的SEQ ID NO.2的DNA序列或其编码具有木聚糖酶活性多肽之实质部分有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或者甚至至少95％的同源性。该术语欲包括对WO94/21785的SEQ ID NO.2之DNA序列所进行的各种修饰，例如核苷酸替换，它并不形成木聚糖酶的另一种氨基酸序列，但对应于被导入DNA构建体的宿主微生物中的密码子用法，或者所述核苷酸替换确实产生不同的氨基酸序列，因而可能产生可以形成与天然酶具不同特性之木聚糖酶实变体的不同蛋白质结构。其它可能的修饰作用实例为在序列中插入一个或多个密码子，在序列的任一端增加一个或多个密码子，或者在序列的任一端或在序列的内部缺失一个或多个密码子。可以理解，本文所定义的木聚糖酶II同系物包括许多不同的氨基酸残基，只要木聚糖酶的活性如本文所定义。
有关木聚糖酶II的生产及其进一步的特征鉴定可从已经包括在本申请中的WO94/21785的公开中很容易得知。
用于本发明的木聚糖酶制剂可以借助任何适当的技术从所涉及的微生物中获得。例如，木聚糖酶制剂可以借助现有技术已知的方法发酵微生物，继而分离所述酶来获取，但更优选的是利用现有技术已知的重组DNA技术。这类方法通常包括在允许所述酶表达的条件下，在培养基中培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，该重组载体能够表达并携带编码所述木聚糖酶的DNA序列，然后从培养物中回收所述酶。
包括在本发明范围内的可以是从微生物来源的单一成分酶(即基本不含任何其它活性)制备的、具有上述木聚糖酶特征a)-c)的任何酶制剂。本发明的木聚糖酶可以在分离所术成分酶后测定其WSPS、WSPU和FVRU值来鉴定。
所用编码木聚糖酶的DNA序列可以具有任何来源，例如可以是cDNA序列、基因组序列、合成序列或其任何组合，适用于本发明目的的木聚糖酶的制备方法已在WO94/21785中有详细的描述。
当所述木聚糖酶用于本发明分离小麦的方法(或将产生淀粉的其它方法)时，最好是所述木聚糖酶制剂基本不含淀粉酶，因为任何淀粉酶活性的存在会降解将产生的淀粉。相应地，当木聚糖酶将用于蛋白质的产生时，例如用于产生谷蛋白的本发明小麦分离方法中时，最好所述木聚糖酶基本不含蛋白酶，因为蛋白酶对所产生的谷蛋白不利。可以用现有技术中已知的方法除去淀粉酶和蛋白酶活性。有关的一个例子是热灭活法，该方法相对于米曲霉所产生的木聚糖酶II具有特别的优点，因为木聚糖酶II通常比由所述宿主细胞产生的淀粉酶和蛋白酶具有更好的热稳定性。
已经发现，当所述木聚糖酶与纤维素酶一起使用时，木聚糖酶在本发明的植物材料分离方法中产生的作用可以得到极大地改善。
据此，用于本发明的木聚糖酶制剂可以含有纤维素酶。该纤维素酶最好具有微生物来源，例如可以来源于丝状真菌(如曲霉、木霉、腐质霉、镰孢菌)。适用于本发明目的之纤维素酶的具体例子包括可来自H.insolens并可由WO91/17244之图14中的氨基酸序列进一步定义的内葡聚糖酶(内葡聚糖酶I)和由WO91/17243描述的43KDH.indolens内葡聚糖酶。
可与本文所描述的木聚糖酶结合使用的经商售可得的纤维素酶制剂包括CelluclastR(可得自Novo Norelisk A/S)，SpezymeRCP(可得自Genencor，USA)和RohamentR7069W(可得自Rohm，德国)。植物材料的分离方法在含木聚糖的任何植物材料(如软材和硬材)可用本发明进行处理的同时，最好是植物材料来源于Poaceae科，并且特别是由谷类植物如小麦、黑麦、大麦或燕麦制备的植物材料。该植物材料另外还可以来源于蔬菜或水果，例如从玉米、大米、高梁豆或水果壳制得的植物材料。所述植物材料可以由上述植物之任何组合制得，并且可以另外含有非植物材料。
欲按照本发明进行处理的植物材料可以为任何适宜的形式。如下文将进一步解释的那样，所述植物材料可以方便地成为使得可以进行连续加工的可抽吸分散液或溶液形式。该分散液通常可以通过将干磨材料，尤其是颗粒平均大小为50-100μm的小麦和水混合制得。
根据本发明进行加工的优选植物材料是小麦。借助本发明的方法，小麦将被分成谷蛋白、淀粉和纤维部分。如此产生的谷蛋白例如可以被加到面粉中，以改善其焙烤特性，或者可用于改善诸如肉类、早餐谷类和宠物食品等产品的营养值。所述淀粉例如可用于造纸工业中的制浆(如纸张涂层)和纺织工业中的制浆。所述纤维部分例如可用于动物饲料。
下面将参照小麦的分离来描述本方法分离植物材料的方法。然而，可以理解，借助相似类型的方法可以分离上述任何其它类型的植物材料，并且，本领域的技术人员知道应该选择哪类方法用于分离所给定的植物材料，例如可以参考题为“淀粉生产技术”(J.A.Radley著)的书籍，其中的图2显示了说明小麦分离过程的流程图。
本发明的方法可以通过现有技术已知的任何工业小麦分离方法来完成，然而，本发明优先使用所谓的粉碎法(或湿磨法)，其中的起始材料是待分离小麦的稀释的可抽吸分散液。通常，该分散液由小麦粉和水构成。分散液的干物质含量范围一般为35-50％。已知两种主要类型的粉碎方法为水力旋流器法和滗析器法。这些方法的优点在于水耗较低。
在水力旋流器法中，面粉首先与水混合制成生面，然后进一步稀释，并通过一个其中已附聚了谷蛋白的搅拌附聚罐，含小谷蛋白附聚物和淀粉的分散液被抽吸至一套水为旋流器中，在此进行离心分离，作为最轻部分的谷蛋白和“B”—淀粉一起留在水力旋流器的顶部，再经过滤将谷蛋白从“B”—淀粉中分开。来自水力旋流器的底流主要含有“A”—淀粉，而戊聚糖(或纤维)见于上下两部分。所述部分将经一系列的清洗/浓缩步骤得以进一步的净化。
滗析器法与水力旋流器法之区别至少在于一个主要问题，即当谷蛋白被附聚时。在滗析器方法中，为了避免在两级或三级滗析器中进行分离前谷蛋白形成更大的团块，保持很低粉碎物浓度是非常重要的。在分离之前，将被混合的面粉/水分散液抽吸通过一个均质器，这是一个具有高剪切力的特殊针状碾机(pin miu)，可以启动谷蛋白的附聚，就在分离开始之前，再次对分散液进行稀释。在两级滗析器的情况下，底流含有相当清洁的“A”淀粉，而溢流含谷蛋白、“B”淀粉和戊聚糖。对于三级笔析器而言，有两级除了“A”淀粉外含谷蛋白和一些“B”淀粉，而还有一级含谷蛋白、“B”淀粉和戊聚糖。当如本文所定义的木聚糖被用于小麦的分离时，有可能获得改善的揉面和均化能力、改善的分离能力、戊聚糖部分降低的粘度(当蒸发和干燥时降低能耗)和滗析器上降低的电流消耗。而且，可获得高纯度的终产物，由于降低粘度而增加了可流动性，所以加工时间也可缩短。
植物材料的分离法通常在pH3-8的范围内进行，如PH4-7，特别是PH5.5-6.5。典型情况下，温度范围是15-50℃，如35-45℃。在小麦分离法中，根据本发明所进行的分离一般于40℃进行1-5分钟完成。
对于有些目的而言，与木聚糖酶一起使用其它的酶是有利的。例如，已发现将本文所定义的木聚糖酶与纤维素酶结合使用具有协同作用。适宜类型的纤维素酶已在上文“木聚糖酶制剂”部分介绍过。所用纤维素酶的量相当于0-30,000 EGU/kg面粉，优选200-5000 EGU/kg面粉。粘度降低如上所述，本文所定义的木聚糖酶制剂可用于降低植物材料的粘度。粘度的降低对于例如本文所述的连续小麦分离法之重要在于可以得到增加的小麦粉流动性。而且，所述粘度降低的重要性还体现在食品或饲料的制备和酿造方面，参考Visser et al.，Xylans andXylanases，1991。酿造本文所述木聚糖酶被认为特别适用于在酿造过程中降低麦芽汁的粘度。所述木聚糖酶可以由大麦和高梁制得的麦芽汁一起使用，并可以如戊聚糖酶用于酿造的相同方式使用，参考例如Vietor etal.，1993和EP227159。饲料要制备的饲料通常是基于上文所确定的植物材料，如谷类植物，尤其是小麦和/或大麦。所述木聚糖酶通过降解植物材料所含的阿拉伯基木聚糖来发挥其作用，籍此获得动物饲料含能量成分及其它营养成分全面利用的改善。而且，特别是对于适合烤焙的小鸡，可以降低食糜的粘度。可以认为，降低的粘度对于饲料的可消化性是重要的，这可能是由于内源性酶可以更好地与底物接触，或是由于消化产物猕散性增加的缘故。这些原因导致了吸引量的增加。另外，降解作用通过使营养物更容易被获取，从而有助于稳定小肠微生物菌群。所制备的饲料例如可用于饲喂适于烤焙的小鸡、蛋鸡和小猪。木聚糖酶可以任何适当的剂量，如5-2000FXU/kg饲料的量掺入饲料中，优选量的20-1000FXU/kg饲料。制备β-葡聚糖和其它谷类植物成分本文所公开的木聚糖酶制剂被认为特别适用于通过降解存在于例如非淀粉多糖废品中的阿拉伯糖基木聚糖来制备β-葡聚糖。所述β-葡聚糖可以用作树胶或填充剂(以降解形式)。而且，由上文公开的内容可以证明，所述木聚糖酶制剂可用于制备淀粉，尤其是小麦淀粉和谷蛋白。材料与方法由小麦粉生产可溶性戊聚糖(WSP)将100kg普通小麦粉悬浮于300kg冷水中。搅拌1小时后，用滗析器除去泥状物。然后用酶处理所得的上清液以除去淀粉和蛋白质。在将pH调至6.5和温度调至90℃后，首先加入2％(干物质，d.m.)TermamylR120L，同时搅拌90分钟；随后用3％(干物质)AMGR300L于pH4.6和60℃条件下进行类似的处理共120分钟，以水解淀粉部分。最后，在连续搅拌、pH8.0和55℃条件下用1％(干物质)AlcalaseR2.4L处理上清液120分钟，水解淀粉和蛋白质之后，用蔡氏滤器K250在压滤机上过滤所得产物，以除去残余的不溶性物质。用10,000mw截留膜对上清液进行超滤处理，以将产物从淀粉和蛋白质水解物中分出。将截留物进一步透滤直至达到0OBRIX。所述产物通过在Luwa蒸发器上蒸发而浓缩，并且最终被冻干。由小麦粉生产不溶性戊聚糖(WIP)将150kg普通小麦粉悬浮于450kg冷水中。该悬液被加热至60℃，再加入600g TermamylR120L。当加热至95℃导致淀粉部分胶凝之后，将悬液冷却至60℃继续水解180分钟。用NaOH调pH至8.0后加入300g AlcalaseR2.4L。在连续搅拌下水解蛋白质的过程中，用NaOH滴定，使PH维持在7.5-8.0。水解反应进行120分钟，离心后回收沉淀物，用水洗涤一次，然后用冷水在35μm筛上进一步冲洗，以除去全部残留的可溶性物质。向所得的不溶性物质中加入达20L的水，并加热至60℃。在用NaOH调pH至8.0后，加入100g AlcalaseR2.4L。继续进行水解反应和NaOH滴定，直至pH不再下降。然后将所述材料再次置于35μm筛洗涤，直至除去全部可溶性物质，最好冻干。
用于本发明之木聚糖酶的活性检测是借助还原糖从可溶性戊聚糖(保温后稀释25倍)和不溶性戊聚糖(保温后稀释5倍)中的释放。
将如上所述生产的0.5％水溶性或水不溶性戊聚糖溶解或悬浮于0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH6.0)中。每个样品的0.9ml底物与0.1ml酶溶液混合。在酶与底物混合之前和混合过程中，底物被置于冰上。当所述酶于100℃变性处理5分钟后，于40℃保温15分钟。当所述样品被冷却时，可溶性戊聚糖溶液被稀释25倍，而不溶性戊聚糖溶液被稀释5倍。然后，通过在微量滴定板上与PH-BAH试剂反应测定还原糖，所述PHBAH试剂含有0.15g对羟基苯甲酸酰肼(Sigma H-9882)，0.50g酒石酸钾一钠(Merch 8087)和2％NaOH溶液，达10.0ml。空白的结果被减去。木糖用作标准物。还原糖可用于测定WSPU和WSPS。蛋白质测定法-Kjeldahl利用Tecator浸煮器和1003型蒸馏装置进行所述测定。破坏作用(Tecator浸煮器)待分析样品被转置于Kjeldahl管中，对于液体样品大约1.5g；冻干样品为约0.1g。向样品中加入a)3.0ml硫酸(浓H2SO4)b)1.5ml过氧化氢(32％H2O2)c)1Kjeltab(Se+K2SO4)如果样品在加入化学物质后起泡，则其将在第二天才被破坏。在正常情况下，样品在10分钟后被置于破坏部件中。该部件的温度设置为370℃。当样品呈清亮或微黄时，将其取出。根据样品的组成不同，破坏作用通常需要进行0.5-1小时。将样品冷却至室温约20分钟。然后准备进行蒸馏。蒸馏(1003型蒸馏装置)样品在含Kjeldahl指示剂(A0.12g亚甲基兰溶于100ml96％乙醇，B0.125g亚甲基红溶于100ml96％乙醇，将A和B以1A∶2B的比例混合)的25ml2％硼酸中蒸馏。被破坏的样品与32.5％NaOH混合。氨被蒸馏到2％硼酸中，然后用0.1 NHCl滴定，直到pH达4.85。测定内葡聚糖酶活性(EGU)分析方法利用振动粘度测定法于CMC(pH6.0)分析发酵肉汤。更确切地说，制备含有溶于0.1M磷酸盐(pH6.0)的34.0g/L CMC(Blanose Aqualon)的底物溶液。待分析的酶样品也溶于相同的缓冲液中。将14ml底物溶液与0.5ml酶溶液混合，并转置于振动粘度检测计(例如MIVI 3000，可得自Sofraser，法国)于40℃恒温。内葡聚糖单位(EGU)测定为样品粘度与标准酶溶液粘度之比。测定木聚糖酶活性(FXU)用一种测定法检测内木聚糖酶活性，在所述测定方法中，木聚糖酶样品与remazol-木聚糖底物pH6.0(用Remazol亮兰R染色的4-O-甲基-D-葡糖醛酸基(glucurono)-D-木聚糖，Fluka)一起保温。保温过程于50℃进行30分钟。未被降解的染色底物之背景用乙醇沉淀。用分光光度计于585nm检测上清液中所保留的兰色，其与内木聚糖酸活性成比例。
相对于酶标准测定样品的内木聚糖酶活性。
该测定法在出版物AF293.6/1-GB中有进一步的描述。该出版一经有需求即可从Novo Nordirk A/S，Denmark得到。测定内葡聚糖酶单位(ECU)相对于一酶标准物测定ECU(内纤维素单位)。
内纤维素酶分解羟甲基纤维素(CMC)。用CMC-振动粘度测定计(例如MIVI3000，可得自Sofraser，法国)检测所得到的降低的粘度。
所制备的底物溶液含有溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)的35g/L CMC(Blanose Aqualon)。待分析的酶样品溶解于相同缓冲液中。
将0.15ml标准酶液或末知酶样品置于10ml试管中。加入预热至40℃的5ml CMC-底物液。充分混合该溶液，保温30分钟，置于粘度计中。
该方法在AF302/1-GB中有进一步的描述，在提出请求时即可从Novo Nordirk获取AF302/1-GB。面粉在下面实施例中的所用面粉含有下列成分表1所用面粉的组分
Fakt粉非指定型商售面粉(“Lnksus Hvedemel”，prepared by Daglig-varegruppen，Dk-7100 Vejle)。
实施例实施例1降低小麦粉粘度测试不同的木聚糖酶在如上所定义的Fakta粉中降低粘度的能力。
所测试的木聚糖酶为—SpezymeRCP，可得自Genencor，USA—H.insolens木聚糖酶(其生产如WO92/17573之实施例2所述)—木聚糖酶I粉末(用WO94/21785所述木聚糖酶I作为起始材料，根据标准方法通过固相分离、浓缩和冻干等步骤生产)—木聚糖酶II(如WO94/21785所述生产)—木聚糖酶，如WO92/03540所述用B.pumilus菌株DSM6124生产(在下文称为B.pumilus木聚糖酶)。
利用下述方法检测粘度的降低精确称量100g面粉。向置于35℃的120ml去离子水中加入上述酶。酶的剂量如下SpezymeRCP 8.5FXU(相当于3.4mg蛋白质)木聚糖酶I粉末28.3FXU(相当于0.19mg酶蛋白和0.24mg蛋白质)。
木聚糖酶II7.5FXU(相当于0.19mg酶蛋白和0.25mg蛋白质)。
H.insolens木聚糖酶82.2FXU(相当于2.2mg酶蛋白和22.3mg蛋白质)。
短小芽孢杆菌木聚糖酶21FXU(相当于0.2mg蛋白质)空白样品作为对照(未加酶)。用于搅拌面粉和水30秒，然后在混合器(Warring，Commercial Laboratoig blender，Struers，Adjust-ments OFF 1-7 rotor in bottom(4 blades))以7档速度(最大速度)精确混合30秒。花30秒将该液体倒入粘度计的测定管(Pro-grammable rheometer，model DV-111，Brookfield，Spindel 25，测定管于38℃恒温)。每个第15秒测40rpm时的粘度，共测4分钟。比粘度表示为样品粘度的均数与空白粘度均数的百分比，其用作粘度降低的检测。平均粘度为60秒后和直到检测结束时所达水平的均数。
最低的比粘度见于在使用木聚糖酶II的情况下。其它的木聚糖酶也被发现可以降低比粘度(木聚糖酶I，SpezymeRCP)，尽管其降低的程度较小。还发现所述量的H.insolens木聚糖酶可以升高粘度。作为实例，上述量对于木聚糖酶II、木聚糖酶I、SpezymeRCP和H.insolens木聚糖酶而言，产生的比粘度分别为69％、78％、87％和128％(相当于0.63FVRU/gm蛋白质、0.044FVRU/mg蛋白质、0.053FVRU/mg蛋白质和0.012FVRU/mg蛋白质)。实施例2小麦的分离通过离心试验评估实施例1中所述酶的小麦分离能力。该试验用实施例1所述面粉进行。
根据实施例1所述方法将面粉与水混合。在此之后将糊状物以4332g离心(Megafuge 1.0 Heraeus Sepatech)5分钟。在底层有淀粉，继而是上部的谷蛋白、泥状物和流出物层。该分离作用表示为流出物百分比。百分比越高，分离效果越好。
已经证实，木聚糖酶II有最好的作用，作为实例，对于空白样品、SpezymeRCP、木聚糖酶I和木聚糖酶II而言，面粉流出物的百分比分别为14％、21％、22％和23％。实施例3木聚糖酶II与其它酶相结合降低粘度测试不同的木聚糖酶在与木聚糖酶II相结合使用时降低粘度的能力。所用Fakta粉如上文所述。
测试的木聚糖酶有—CelluelastRCCN3035，可得自Novo Nordisk A/S—内葡聚糖酶I，一种含有如WO91/17244图14所示氨基酸序列的H.insolens纤维素酶，其生产方法如所述文献所述。
—43KD内葡聚糖酶，一种如WO91/17243所述的H.insolens纤维素酶，该文献还描述了其生产方法。
—H.insolens木聚糖酶(如92/17573之实施例2所述生产)。
—木聚糖酶I粉末(如上所鉴定)。
—B.pumulis木聚糖酶(如上所鉴定)。
每一种酶都与木聚糖酶II联用，并与SpezymeRCP相比较。如实施例1所述检测粘度的降低。
所用酶量如下CelluclastR16EGU(相当于0.024ml)内葡聚糖酶I26.5ECU(相当于0.053ml)43KD内葡聚糖酶101ECU(相当于0.017ml)H.insolens木聚糖酶82.2FXU(相当于2.2mg酶蛋白和22.3mg蛋白质)
木聚糖酶I粉末28.3FXU(相当于0.19mg酶蛋白和0.24mg蛋白质)短小芽孢杆菌木聚糖酶21FXU(相当于0.024ml和0.2mg蛋白质)木聚糖酶II7.5FXU(相当于0.19mg酶蛋白和0.25mg蛋白质)SpezymeRCP8.5FXU(相当于0.024ml和3.4mg蛋白质)由图1可证明，没有其它的酶可以将粘度降至和木聚糖酶II一样能达到的水平。而且，当木聚糖酶II尤其是与内葡聚糖酶I和43KD纤维素酶联用时可以显著降低粘度。木聚糖酶II还可以与显示出多成分酶的CelluclastR联用。在图1中，暗柱图表示酶的单独作用。亮柱图表示所述酶与木聚糖酶II联用所观察到的效果1＝木聚糖酶II 2＝木聚糖酶II3＝SpezymeRCP 4＝43KD内葡聚糖酶5＝H.insolens木聚糖酶 6＝内葡聚糖酶I7＝木聚糖酶I粉末 8＝CelluclastR9＝短小芽孢杆菌实施例4测定WSPS和WSPU在测定WSPS和WSPU中，必须检测据Kjeldahl所述确定的所加酶的蛋白含量，以及所述酶对如前所述生产的水不溶性(WIP)和水溶性戊聚糖(WSP)的，以还原糖来检测的酶活性。所确定的许多制剂之WSPS和WSPU值如下
WSPU为优选的每公斤面粉中的每毫克蛋白质对WSP的活性，且WSPS为优选的每公斤面粉中的每毫克蛋白质的WSP/WIP比值。
由此可见，木聚糖酶II表现出极高的WSPU和WSPS，这反映出与蛋白质的加入相比，以高速度降解水溶性戊聚糖都以低速度降解水不溶性戊聚糖实施例5木聚糖酶用于动物饲料以含和不含酶的实验性饮食喂养适于烤焙的小鸡六周。该饮食在实验的头三周含81％小麦，在后三周含84.5％小麦。将其分成3种处理。对于头六周，每种处理包括以8小肉鸡重复12次，后三周每种处理以5只小鸡重复6次。
所述处理包括不含酶的对照和下列酶处理400FXU/Kg饲料Bio-FecdTMPlus(BF+)(可得自Noro Nordisk A/S)和400FXU/kg饲料木聚糖酶II。两种酶都根据WO92/12645所述方法配成CT颗粒。测定体重增加和饲料消耗量，并计算0-3周和3-6周的饲料转化率(FCR)。而且，利用Brookfield LVTDV-II粘度计确定肠内容物之上清液的Jejunal和ileal粘度。
所述结果从下表中可显而易见。表1 0-3周生产的有关参数
表2 3-6周生产的有关参数
表3第3周和第6周的Jejunal粘度
表4第3周和第6周的Ileal粘度
从表1和2所见，在3周和6周后，接受酶的处理组之FCR均较低。在两种情况下，木聚糖酶II好于BF+。这主要是因为该组动物生长得更好。
关于Jejunal粘度，木聚糖酶与BF+和对照相比产生了较低的粘度。这也是ileal粘度的情况。对照和木聚糖酶两者在6周之后比3周之后所产生的粘度要低，而对于BF+而言却非如此。因此，似乎应该是木聚糖酶II在后三周期间比BF+有更好的作用，这也由木聚糖酶II在第6周时相比于BF+有相对较低的FCR来证明。
因此，该实验表明，在同样的基础上，木聚糖酶比BF+能产生更好的饲料转化率，即用木聚糖酶II可以得到更多的营养物，这部分原因是木聚糖酶II组中的ileal粘度较低。实施6木聚糖酶II在动物饲料中的可代谢能量利用欧洲的参考方法(Bourdillon et al.，1990)测定木聚糖酶II(100FXU/kg和200FXU/kg)对AME(表观可代谢能)的影响，并与商售产品Bio-FeedTMPlus(400FXU/kg)(BF+，得自NoVo NordiskA/S)相比较。AMEn值表示饲料中考虑到N-残留进行校正了的可代谢能。
使用了来自商业孵化场的一天龄雄性RoSS适于烤焙的小鸡。
从1-16天，给小鸡喂商售的起始(Starter)饮食。第16天分别给小鸡称重。去掉高或低体重的鸡，其余的分配至孵蛋箱中。从16-23天小鸡适应孵箱。根据Bourdillon等人(1990 supra)的方法在24-28天于体内进行平衡试验。该实验包括以每次重复均含4只小鸡的总数为5次重复的9种处理。
基础饮食含56％高梁、32.5％大豆粉、6％动物脂肪、1％豆油和5％矿物质、维生素、微量元素和氨基酸。在实验饮食中，一半的基础饮食被小麦替换。山鸡饲喂的糊状饲料占其随意摄取量的90％。测定AMEn每天定量收案小鸡的排泄物。分析饮食和冻干排泄物样品中的脂肪、总能量(GE)和氮。
由各自的排泄物/饲料比以及相应的总能量(GE)计算饮食的AME量。考虑到N残留的校正至零是用34.36KJ/g残留N的能量等式进行的。
通过饮食和冻干排泄物的脂肪提取物确定脂肪消化率。
所测定的AMEn如图3所示。
由图3可见，补充了木聚糖酶II的基础饮食与Bio-FeedTM(BF+)相比导致可代谢能的明显改善。
参考文献Weegels et al.，Starch/Strke，44 No.2，pp.44-48，1992.H·Gruppen et al.，Journal of Cereal Science，Vol.18，pp.111-128，1993a.Kormelink，F.J.M.and Voragen，A.G.J.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，38，pp.688-695，1993.Kormelink，F.J.M.et al.Journal of Biotechnology.，27，pp.249-265，1993.Kormelink et al.，Xylans and Xylanases，Elsevier SciencePublishers，1993，pp.141-147.H.Gruppen et al.，Carbohydr.Res.233(1992)，45-64.H.Gruppen et al.，Journal of Cereal Science，Vol.18，pp.129-143，1993b.Düsterhft et al.，SymposiumEnzymes in Animal Nutrition，13-15 October，1993，Kantause Ittingen.H.Gruppen et al.，SymposiumEnzymes in Animal Nutrition，13-15 October，1993，Kantause Ittingen.A.G.J.Voragen et al.，in＂Xylans and Xylanases＂，ElsevierScience Publishers B.V.，1992，51-68.F.J.M.Kormelink and A.G.J.Voragen，in＂Xylans and Xylanases＂，Elsevier Science Publishers，1993，p.415-418.Viёtor et al.，1993，J.Inst.Brew.，May-June，99，pp.243-248.Shei，J.C.，et al.，Biotech.and Bioeng.Vol.XXVII，pp.533-538，1985.Fournier，R.et al.，Biotech.and Bioeng.Vol.XXVII，pp.539-546，1985.Bourdillon et al.(1990)，Br.Poultry Sci.，31，557-565)
权利要求
1.降低植物材料粘度的方法，该方法包括用木聚糖酶处理所述植物材料，所述木聚糖酶具有I.所加入的每毫克蛋白质的WSPS大于0.06，和/或II.所加入的每毫克蛋白质的WSPU大于15，和/或III.比活性大于0.053FVRU/mg蛋白质。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的木聚糖酶处理是在pH3-8和/或温度15-50℃的条件下进行。
3.将植物材料分成单个成分的方法，该方法包括用木聚糖酶处理所述植物材料，所述木聚糖酶具有I.所加入的每毫克蛋白质的WSPS大于0.06，和/或II.所加入的每毫克蛋白质的WSPU大于15，和/或III.比活性大于0.053FVRU/mg蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任何一个的方法，其中的植物是谷类植物，如小麦、大麦、黑麦、燕麦、大米和高梁。
5.根据权利要求4的方法，其中的谷类植物是小麦。
6.根据权利要求3-5中的任意一种方法，其中的谷类植物被分成含淀粉的和含蛋白质的成分。
7.根据权利要求6的方法，其中的谷类植物是被分成“A”型淀粉、“B”型淀粉和/或谷蛋白的小麦。
8.根据任何一个在前权利要求的方法，其中的木聚糖酶来源于微生物。
9.根据权利要求7的方法，其中的木聚糖酶来源于丝状真菌或酵母。
10.根据权利要求9的方法，其中的木聚糖酶来源于曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢菌属或腐质霉属的菌株。
11.根据权利要求10的方法，其中的木聚糖酶来源于曲霉属菌株，特别是棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉。
12.根据权利要求11的方法，其中的木聚糖酶由从棘孢曲霉CBS101.43的DNA文库中分离的DNA序列编码。
13.根据权利要求12的方法，其中的木聚糖酶I.由WO94/21785的SEQ ID NO.2所示DNA序列或其编码木聚糖酶II之同系物的类似物编码，和/或II.含有WO94/21785的SEQ ID NO.5所示氨基酸序列或其同源序列，和/或III.与抗来自棘孢曲霉CBS 101.43之纯化木聚酶的抗体有免疫反应性。
14.根据任何一个在前权利要求的方法，其中将比活性至少为10.000 EGU/FVRU的含纤维素酶制剂与木聚糖酶结合使用。
15.根据权利要求14的方法，其中含纤维素酶制剂来源于微生物。
16.根据权利要求15的方法，其中含纤维素酶的制剂来源于丝状真菌或酵母菌。
17.根据权利要求16的方法，其中含纤维素酶的制剂来源于木霉属、曲霉属或腐质霉属。
18.含木聚糖酶的制剂，所述木聚糖酶具有I.所加入的每毫克蛋白质的WSPS大于0.06，和/或II.所加入的每毫克蛋白质的WSPU大于15，和/或III.比活性大于0.053FVRU/mg蛋白质。
19.根据权利要求18的制剂，其中的木聚糖酶来源于微生物。
20.根据权利要求19的制剂，其中的木聚糖酶来源于丝状真菌或酵母菌。
21.根据权利要求20的制剂，其中的木聚糖酶来自曲霉属、土霉属、青霉属、镰孢菌属或腐质霉属的菌株。
22.根据权利要求21的制剂，其中的木聚糖酶来源于曲霉属菌属，特别是棘孢曲霉、黑曲霉或米曲霉。
23.根据权利要求22的制剂，其中的木聚糖酶由自棘孢曲霉CBS101.43之DNA文库分离的DNA序列编码。
24.根据权利要求23的制剂，其中的木聚糖酶I.由SEQ ID NO.2所示序列或其编码木聚糖酶II之同系物的类似物编码，II.含有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列或其同源序列，和/或III.与抗来自棘孢曲霉CBS 101.43之纯化木聚糖酶抗体有免疫反应性。
25.根据权利要求18-24中任意的一种制剂，其中的木聚糖酶由分离的单一成分酶制得。
26.根据权利要求18-25中任意的一种制剂，其中的木聚糖酶为WO94/21785中的木聚糖酶II。
27.根据权利要求18-25中任意的一种制剂，其中的木聚糖酶为WO94/21785中的木聚糖酶I。
28.根据权利要求27的制剂，其中的木聚糖酶是木聚糖酶I粉。
29.根据权利要求18-28中任意的一种制剂，含有比活性至少10.000EGU/FVRU的纤维素酶制剂。
30.权利要求18-29中任意一种制剂用于降低植物材料的粘度。
31.权利要求18-29中任意一种制剂用于分离谷类植物成分。
32.根据权利要求31的用途，其中的谷类植物包括小麦、大麦、黑麦、燕麦、大米和高梁。
33.根据权利要求32的用途，其中的谷类植物是小麦。
34.根据权利要求31或33的用途，其中的谷类植物被分成含淀粉的和含蛋白质的成分。
35.根据权利要求34的用途，其中的谷类植物是被分成“A”淀粉、“B”淀粉和谷蛋白的小麦。
36.根据权利要求18-29中的任意一种制剂用于制备β-葡聚糖。
37.权利要求18-29中的任意一种制剂用于酿酒。
38.权利要求18-29中的任意一种制剂用于制备动物饲料。
39.根据权利要求38的用途，是用于降低动物饲料的粘度。
40.根据权利要求38和39的用途，用于改善动物饲料的消化率。
41.根据权利要求38或39的用途，用于改善动物饲料的代谢能。
42.根据权利要求38-41的任一用途，其中的动物饲料是鸡饲料。
43.根据权利要求38-41的任一用途，其中的动物饲料是猪饲料。
全文摘要
本发明涉及减低植物材料粘度的方法，该方法包括用木聚糖酶处理植物材料，所述木聚糖酶具有I.所加入的每毫克蛋白质WSPS大于0.06，和/或II.所加入的每毫克蛋白质WSPU大于15和/或III.比活性大于0.053FVRU/mg蛋白质。而且，本发明还涉及木聚糖酶制剂用于将植物材料(如小麦)分成有用的成分以及所述粘度降低或分离的方法。
文档编号A21D6/00GK1144457SQ9519229
公开日1997年3月5日 申请日期1995年2月24日 优先权日1994年3月2日
发明者T·S·加克森, H·P·海德-哈森, L·V·考夫德, C·巴格尔, A·穆勒兹 申请人:诺沃挪第克公司