专利名称：微生物生长过程的调控方法
其它相关专利申请本申请是于1993年2月25日申请的No.08/023,172的部分继续申请；该案本身是于1991年7月15日申请的No.07/729,707(已撤销)的继续申请；而该案又是于1991年3月1日申请的07/663,669(已撤销)的分案申请；该案本身又是1989年10月10日申请的07/419,522(已撤销)的部分继续申请。
背景技术：
发明领域本发明涉及从微生物，尤其是藻类中提取天然产物。具体涉及对大型水性光合生物反应器系统的调控，以便从多种至今只在实验室环境中小罐培养过的微生物菌株中获得这些产物。
现有技术由于环保限制，经济原因以及各种其它因素，许多现在从石油或煤衍生的原料化学合成的产品开始受到排斥，受到限制，或被禁止公开销售。例如，许多苯胺基染料在欧洲正在或将被政府规定淘汰，而且很可能在世界其它地方，包括美国也将出台同样的限制或禁令。所以，正在世界范围内展开的一项重要研究与开发努力就是寻找这些合成产品的天然来源。
对于某些类型的染料，已知可从某些种类的微生物，尤其是某些单细胞藻类和浮游植物中获得颜色及其它物理性能基本相当的染料。光照下，藻类通过光合作用产生染料或染料前体(后文统称为“染料”)。如果能够以大型生产规模培养这类微生物，就能够获得一种有价值的经济的染料的天然来源。
光合微生物的大规模生产其明显的实用性在于其光合作用过程本身。给以适量的光、水和二氧化碳(CO2)，光合微生物能够利用必需营养原料，例如氮(N)和磷(P)将光能转化为化学能。因而，光合微生物的生长或培养过程包括在限定体积的培养物中加入完全营养培养基，维持该培养量中的最佳生长条件，以及随后从废培养基中收获或取出微生物细胞。所有的培养过程设计都必须设法高效率地完成上述生产过程的每个阶段。
通常，在上述要求中最难的是维持最佳生长情况。许多可产生染料的微生物对其生长环境的细微变化非常敏感，可相差一个数量级。经常，研究者在实验室中开发了一种在试验罐小体积中维持微生物生长的方法，但无法使该系统按要求大规模运行以进行工业生产，此时，系统参数的控制可能更困难更复杂。
有一种被称为“闪光效应”的光合生长机制，即有些微生物细胞利用间歇光源能量的能力(参见，Emerson等，J.Gen.Physiol.，15(4)391-420)，此能力在大型培养系统中没有得到有效的利用，因为它依赖于生长培养基中的湍流状态使得细胞间歇地与光源接触。接触过多或过少都会降低微生物的产出。迄今，还没有开发出一种方法或设备，利用受控湍流状态来扩大闪光效应，从而将该效应用于大规模培养系统，由此提高其效率和生产能力。本发明即针对了这一需要。
对微藻系统中的流体流动已有所研究，有报道的研究工作指出，为了防止破坏微生物体，必须避免流体中在微生物表面的过度剪切力。例如，Thomas等，J.App.Phycology，271-77(1990)报道，在雷诺数高于116(直至3500)的小间隙旋转罐中，细胞的生长率变为负数，即微生物发生死亡而不是生长。所以，为了减轻湍流对细胞完整性的破坏作用，还必须控制设备的大小和机械形状。
现在，在开放或闭合系统中培养微生物，然后从微生物中收获产物已不是新概念了。世界上已使用有许多系统，在其中为了直接用途(作为动物饲料)或间接用途(作为胡萝卜素之类化学物质的来源)培养和收获藻类或浮游植物。但是，几乎所有这些系统都只能用于很少种类的微生物；即能够耐受最大范围生长条件并且产物相对简单的那些。这使得与已经以实验室规模从试验培养物中提取的产物相比，工业上只能限于生产很少的几种。由于未能使实验室培养物经济地存活或生长于大容量中，培养微生物以生产较复杂产物的努力都失败了。此外，能够耐受过去较粗糙的过程(开放或闭合系统)调控的简单微生物不能直接或间接地以经济的产量生产这些所需的化学物质。更多的能够生产这些化学物质的“外来的”微生物还没有被证明能够培养于现有的系统中，因为不能对这些系统进行足够精确的调控以维持这些能够在实验室中小规模生长的外来的微生物的健康和生长。实验室规模的设备中通常没有湍流，但工业生产规模系统中有湍流。迄今，人们还没有认识到对湍流的控制是大规模培养设备中的关键因素。
在有用但是对条件敏感微生物的水性培养中有许多关键因素。所以，能够精确调控这些操作条件的系统将不仅能够大规模培养许多现在利用现有技术无法培养的微生物，而且可以大规模生产许多市场上现在还无法较为经济地获得的物质。
发明概述本发明是一种进行水性微生物生长过程调控的方法，从而维持对大量微生物而言最佳因而是经济上可行的生长条件，这些微生物迄今还未曾以具有经济价值的量繁殖过。我们发现，能够对这些过程进行精确而连续的调控，由此维持经济上可行的微生物生长情况，其种类与利用现有技术过程和调控方法能够做到的相比多得多。本发明中的主要控制参数是水性生长培养基中的湍流度和设备相对于湍流旋涡的大小。对湍流程度和容器(与大气隔绝的，或者与大气的流通受到限制或控制的，以及以水性培养基部分充满的)大小/形状的调控直接影响到对最佳因而经济的生长所要求的全部条件的调控与光的接触，营养的供给，沉降速度，整体温度，气体交换率和细胞完整性。这样，利用水性培养基湍流和相对湍流的设备形状作为获取最佳生长的主要调控参数，我们能够成功地持续生产大量对条件敏感的光合微生物。不能调控湍流程度或设备形状会使系统无法运行或达不到最佳生长和工业可行性(如Thomas，同上，所证明的)。
所以，最广义地说，本发明是一种调控水溶液微生物生长过程的方法，包括将光合微生物体分散在反应室内的水溶液培养基中，该反应室可透过可见光，水性培养基中的微生物悬浮液少于反应室总体积；将微生物在反应室中保持一段时间，期间微生物繁殖而数量增加；在保持时段向微生物供给营养并排除释放出的气体，从而支持其繁殖；在此整个时段内使水性培养基在反应室中流动；在至少该时段的部分时间内令反应室接受到可见光，可见光透射入反应室从而引发光合作用；在一段时间内在整个反应室内保持带旋涡的湍流状态；期间将反应室大小与旋涡大小之比维持在设定范围；由此，在湍流状态中，适于微生物繁殖的有效的反应条件得以维持直至足以使微生物的数量增加达到要求的时候。
在此调控方法中，湍流本身有两个特征参数时间尺度(t)和其主旋涡的大小尺度L(该尺度中，粘滞流变得很重要)。湍流的时间尺度控制着某个微生物处于设备的光集中区的时间，因此其控制是十分重要的。L与t的组合(L/t)，定义了湍流的速度q，q控制着微生物垂直运输速度。要保持微生物处于悬浮状态，q必须大于微生物的沉降速度。通过选择最佳设备长度(LK)来控制营养素向细胞的传递，从而不至使其细胞壁受的应力过大。通过使湍流与部分充满的容器中重要的自由表面接触来去除对微生物有害的氧。
首先，可以根据雷诺数(NRe)来考虑这些调控因素。其次，受控的设备尺寸(LK)必须相对于湍流旋涡尺寸指定，表示为λK＝LK/L。或者，可将第二项标准定为流体中机械能消散速度ε的指定，由此对于给定的雷诺数可得出向细胞传递营养素所需的L值。在本方法中，湍流控制维持于一定的雷诺数(NRe)范围内，同时控制无流体表面度以对微生物可能接触到的光强度、营养素的传递、沉降速度和气体交换进行调控，以获取最佳产率。本发明所用的最大范围通常为NRe＝2000至106，较好的是4000至106，更好的是4000至250,000，5000至50,000还要好，流动液体反应室中液体量与旋涡长度之比λK的范围在0.1-1个反应室体积单位之间，较好的是0.1-0.8。
本发明在微生物是单细胞藻类、浮游植物、维管植物组织、大型藻类组织等的生长过程调控中尤其有用。其工业可行的生长可通过湍流控制来调控的特定属和种的典型实例有甲藻纲，硅藻纲，Lyngbya lagerheimii(甲藻纲)，Spirulina platensis(甲藻纲)，Haematococcus pluvialis(甲藻纲)，Chlorellasorokiniensis(甲藻纲)，和植物组织细胞培养物。尤其适于利用本发明来生长的是Haematococcus pluvialis，Spirulina platensis，Lyngbya lagerheimii，和Chlorella sorokiniensis。
唯一的附图是说明利用本发明调控方法的示范性藻类生产流程图。调控方法被用于该方法的“生长单元”段中。
优选实施例的详细说明现有两种用于微生物，例如藻类和浮游植物生长的水溶液系统。第一种中，操作者培养并收获用作动物和人类的食物以及提取β胡萝卜素之类的化学物质的普通微生物。这些系统可以是闭合的，但通常是开放的，而且其作为原料的微生物具有较低的对反应条件敏感性。这些系统的特征在于简单地用阳光照射，可用粗分散于水性培养基中的普通营养素，最少的调控例如控制温度、混合、气体交换等。过程的调控通常仅仅是决定何时终止和启动培养基环流设备以及在培养基中注入营养素的次数。这类系统只能较好地生产几种微生物，而且在世界各地都有，特别是在温热和阳光充足的气候中。
但是，这类常规系统不能高效地生产大量对其生长环境条件敏感得多的微生物。迄今，还未曾有过培养于常用发酵设备中的藻类获得工业生产的成功。例如，曾经尝试在工业规模的发酵罐中从Neospongiococcum中生产叶黄素(美国专利3,257,210)，但这过于昂贵。也曾尝试过从Chlorella中生产叶黄素，但在经济上不可行(美国专利3,280,502)。对比之下，本系统具有标准发酵设备中没有的光和湍流调控。人们迫切需要经济地大规模生产这类微生物，因为许多这类微生物可直接或在后处理后生产出重要的化学物质。不幸的是，迄今，只能在实验室或与之相当的小规模过程中对生长环境参数进行足够严格和精确的调控。当开发者想要扩大这种过程的规模时，结果通常是无法保持与实验室中相同的生长速率或是微生物群在短期生长后大量死亡。
我们发现有许多操作条件对“条件敏感”微生物大量、经济而且持续的生长来说是重要的参数。这些是所接受的光，可利用营养素的类型和数量，微生物的沉降速度，培养基流体温度的一致性，培养基提供充分的气体交换的能力，CO2的传递或酸度(pH)，以及微生物生长过程中水性培养基的湍度。此方法中的一个重要因素是认识到，在扩大的，经济可行的生长单元，这些参数在很大程度上是通过控制湍度来调控的，从而使对部分充满的物理生长室/反应器内的湍度控制可提供对上述参数的调控。在现有技术的小规模实验室系统中没有，也不可能期待它有这种单一调控。
人们早已知道，微生物生长率与光强的关系是一个复杂函数，而且每一种微生物都有一个点，在此继续提高光强将对生长产生不利而不是有利的影响；参见Ryther，Limnology and Oceanography，161-70(1956)和Parsons等，Biological and Oceanographic Processes(第3版1984)。所以，为了获得满意的藻类产率，生长系统的操作者必须将光强度维持在或接近于该系统中特定藻类的曲线峰值。现有技术中还没有说明过任何以一种经济、大规模连续的方式来完成对条件敏感微生物的这一调控的方法。
产生“闪光效应”要求环境中的光无光之比约为10∶1；Laws等，Biotech.Bioeng.，152319-2335(1983)。这被认为是因为光合系统在被光相当短暂的暴照后既被光子饱和，不再能利用更多的光子。
本发明的重要特征之一是，微生物的光照过程主要是通过精确调控水性培养基的湍度和设备相对于湍流旋涡的大小来调控的。含有经济上可行的多种细胞的水性培养基由于细胞密度而相对不透明，光的穿透通常仅限于几厘米。在这情况下，必须维持湍流水平使得微生物接近设备光照表面的时间多于其在不透明的培养基内部的时间。本发明中这一调控的完成是通过将微生物循环至部分充满的生长设备内流动培养基的自由表面，而湍度又控制着循环。对培养基中湍度的调控还直接影响着气体交换率。必须保持总体温度和细胞可利用营养素水平的均匀性。必须不断地排除氧气；这是通过循环湍流旋涡使之与部分充满的生长单元的自由表面接触来进行的。生长过程中的沉降速度也很重要。如果任细胞沉降在生长单元的底部或壁上，将会抑制光的透过，而且固定后的细胞会成为碎屑提供有害细菌以生长场所因而产生不良后果。所以，正如所指出的，在设计合理的设备中，我们利用水性培养基的湍度为操作参数就能够成功地连续生产大量条件敏感微生物。本调控方法必须有一个自由流体表面，光线由此透过，氧气通过它与流体交换。
雷诺数的控制已知在流动的流体中有两种主要状态层流状态，其特征为在一定长度的流体中流线保持各不相混；和湍流状态，其特征为整个流体区域内的不稳定性，其中产生的旋涡破坏了流线的流动方式。在存在着整体平移流动的系统中，例如整段流体从管道的一端流向另一端，湍流状态与主要的整体平移流动叠加，结果产生高度混合流，而且混合流按规定的流动路径流动。
流体中层流向湍流的转变以及该流体的湍度取决于流体的移动速度，流体管道的参数和流体的粘度。通常由一个称为雷诺数(NRe)的无量纲的量来定义湍流(和层流)，雷诺数等于(LKV/θ)，其中的LK是管道的特征性长度，V＝流体整体的平均流速，θ＝流体运动粘滞度。“临界雷诺数”[NRe(crit)]是目标流体中层流向湍流转变时的NRe值。圆形管道的NRe(crit)为2000-4000，这取决于管壁粗糙度；即，NRe≤2000时，层流开始向湍流转变，而在NRe＝4000时完全处于湍流状态。NRe值没有特定的上限，已公知的表格都标有NRe高至108的湍流状态，但是一般物质流体在管道中流动能达到NRe为106的最大湍流状态，此后更高的NRe通常不再显著提高流体的湍度。在许多流体动力学手册和教科书中都有雷诺数的推导和解释；参见，Chilton(编)，Chemical Engineers’handbook，pp.5-4，5-20至5-26(第5版，1973)；Condon等(编)，Handbook of Physics，第3部分，Ch.2(1958)；Eshbach(编)，Handbook of Engineering Fundamentaals，第6册，第2，6，9部分(第2版，1952)；Weast(编)，Handbook of Chemistry andPhysics，p.F-330(第65版，1984)；和O’Brien等，Applied Fluid Mechanies，pp.105-110(第1版，1937)。
注意，在此提及湍流时，特别是将其论述为发生在反应容器内基本上整个水性培养基中时，应该理解为在非常靠近容器壁的边界层通常必定留存着少量的层流状态。已知在任何流动流体管道中，在器壁表面会形成一层粘滞Prandtl边界层，在该层中包括向流体主体中的湍流区域转变的靠近管壁的层流区域。流体主体的湍度会影响到紧靠容器壁的层流边界层的总体厚度，但不会使其消失。所以，本领域熟练技术人员应认识到，在本发明的中，尽管在系统中存在着很少量的层流，提及湍流控制是与流体的主体相关。参见，例如，McCabe等，Unit Operations of Chemical Engineering，pp.45-48(1956)。
本发明认为在部分充满的反应器中有两个不同的流体表面——一个靠近容器壁，与之相邻有一滞流亚层阻滞着湍流，另一个为自由流体表面，在此粘滞性不阻滞湍流的运动。还没有现有技术论及自由湍流表面的存在对高效调控闭合系中微生物生长的必要性。如果一个透明反应器被充满了培养基，粘滞性亚层将阻滞微生物在器壁透光(阳光或人工的光合作用用光)部分附近的运动，就无法通过湍度控制来有效地调控“闪光效应”。在充满的设备中，氧气的排除更成问题。而且，在所有表面都与流体接触的闭合反应容器中，滞流层阻碍生物颗粒离开器壁，由此可能污染反应器表面。如果这种污染发生在光照表面将与污染量成指数关系地减少透射入反应室的光，由此显著降低光合作用的可能性。本发明为了控制过程，要求在部分充满的生长单元中有一个自由液体培养基表面，和运动的、湍流的液体培养基，由此可使微生物的生长达到最佳，并由此使过程具有经济可行性。
在不同系统中或单个动态系统中并不在同一NRe时呈湍流状态，而且层流到完全湍流的转变NRe范围宽度是至少两个系统参数的函数流体流速和闭合流动管道的管壁表面特征，因此，闭合系统内的湍流调控要求操作者仔细检测这两个参数。由于表面特征，例如管壁的光滑度，只在很长时间内很慢地变化因而并不由操作者实时控制，所以，操作者利用流速来调控湍度。如上所述，根据管壁光滑度，NRe＜2000时会出现某种暂态的湍流，当NRe在4000至106范围内时出现完全湍流。本方法中，操作者将在此范围内进行湍流调控，来控制微生物可接触的光强，以获得最佳产率。这一水平将随着培养物的生长而改变，这是因为细胞密度增加造成的培养基实际粘度改变(可能降低湍度)，以及培养基对光透射不透明度的改变(要求更频繁地接近容器内流体的自由表面)。范围NRe＝4000至106是本发明中达到实际目的的最宽范围。NRe可能大于106(如前所述，常用表中可高至108)，但也正如前文所述，在本方法的操作中，NRe高于106时，湍度几乎没有或完全没有得到提高。实际上，如此高的湍度可能是不利的，因为更大的水流量需要更高的泵压，可能出现对生物体更严重的剪切(没有与此相抵偿的微生物生长情况的改善)，而且会打断微生物的长链结构。另一方面，NRe不能太低，因为如果没有完全湍流状态，微生物会从培养基中沉淀出来，系统将变得过于稠密而使光线几乎不能透过。所以，可以使用NRe＝2000至4000的范围，但由于湍度改变很大，而且可能存在相当程度的暂态湍流状态，所以，微生物的生长并不完全直接与NRe值相关，调控因此通常不够精确。较好的NRe值在4000至250,000之间，更好的是5000至50,000之间。迄今，现有技术还没有认识到或说明过湍度与将微生物的生长速度维持在由Ryther(同上)和Thomas等(同上)所指出的理论定义的最佳范围内之间的这种关系。
耗散速度的调控本发明的必要条件是基于我们对水性培养基湍度与其它微生物生长相关参数之间关系的发现。如果不严格限制设备的大小，当NRe被维持于我们所述的范围内时，这些其它参数也在各自最有利于微生物生长的范围内。例如，微生物生长情况是微生物细胞从培养基中汲取营养素(氮，磷等)速度的函数。在大规模微生物培养中，需要最优化的一个关键变量是营养吸收速度。“营养”在此广义地包括了从无机碳(CO2)，氮和磷到有机微营养素的各种分子。非湍流环境中的一个静止细胞会在一段时间后将其最近的区域中的全部营养汲取掉。这种汲取会产生一个浓度梯度。由此，吸收速度将通过Fichian扩散完全依赖于微生物附近的浓度梯度F＝-D dc/dz(1)F是营养素通量，C是被讨论的营养素的浓度，D是分子扩散系数，D对大分子而言约为1.5×10-9m2s-1；参见，Munk等，J.Marine Res.，11215-240(1952)。湍流有一系列连续的尺寸，小于Kolmogorov尺寸(定义为LK＝(ν3/ε)1/4)时，由滞流扩散过程向细胞传送营养素。细胞小于L，所以可保持其完整性。所以，一个静态微生物细胞吸收营养素的速度不可能比营养素以最小的旋涡形式通过扩散向其传递的速度更快。dz越小，扩散速度F越大。对大多数微生物，例如浮游植物而言，这一速度对生长是限制性的。在本方法中，通过提高ε并由此减小L来控制湍度，通过控制湍度来提高分子扩散速度，继而提高营养素向细胞的传递速度，由此避免了这一问题。所以，湍流耗散速度作为我们调控中的第二个参数而变得十分重要。
除了指定NRe之外，还可以将湍度控制认为是湍流能量耗散速度ε的函数，而这可规定出一个尺寸。在水中，即使穿越极短的距离，湍流也通过线性剪切而表现出来，线剪切的大小取决于湍流强度。剪切是流体的特性之一，不论有无微生物它都存在。
Mann等，Marine Ecosystem Dynamics(1991)中论述了湍流造成的扩散通量增加效应，他指出营养素通量的增加同时取决于湍流能量耗散速度ε和微生物细胞大小。例如，直径约50μm的细胞在湍流能量耗散速度ε＝10-3W/kg时，能够经历100％的营养素通量增加。本方法中，使用下文所述的系统，可产生10-3至10W/kg的湍流能量耗散速度。
湍流能量耗散速度为ε＝ν(u/z)2(2)ε是湍流能量耗散速度，ν是运动粘滞度(10-6m2s-1)，u/z是湍流区域内的速度梯度。在湍流中，参数z等于αLKNRe-1/2，所以，ε＝(νu2NRe)/α2LK2(3)u是管道中的流速，LK是管径，α是一个一阶常数，或者，直接取代NRe则ε＝u3/α2LK(4)ε对雷诺数和管径两者的依赖性可表示为ε＝(ν3NRe3)/α2LK(5)所以，很明显，操作者不仅要选择NRe以得到与光线接触的最佳湍度，而且还要选择尺寸LK以使营养素通过湍流传递给细胞。
设备结构示范结合一示范性微生物生长系统进行论述能够更好地理解在应用上述调控参数中涉及的基本理论和方法和上述假设机制。附图中以示意的方式说明了这样一个典型系统。可将该系统分为三项主要功能水的预处理，微生物生产和收获。这样的一个系统能够通过再循环所有未蒸发水最大程度地节约水资源。可以认为本发明的参数调控是在生物反应器生长单元14中进行的，即微生物生产部分。(可能有多个平行运行的生长单元14，但为了简练起见，本说明将按照单个生长单元14进行。)在水预处理阶段，用泵从水源2(淡水或海水)取水，最好通过一过滤器4，然后可将其泵送入大型储罐6。最好，储罐6的盖子由深色塑料材料，如黑色的聚乙烯制成，以防止预过滤水被污染，并且令预过滤后的水不受阳光照射而促进升温，因为受阳光照射会促进光合作用微生物在储罐中发生不需要的超前生长。可利用多种常规技术来进行过滤，例如适用于大水量的快速砂床过滤或适用于小水量的硅藻土过滤。在某些情况下，可能不需要过滤，例如使用贫营养区深海水时或使用取自地下含水层的无颗粒水时。如果水中已经不含颗粒物，就可以省略过滤。
水预热最好在加盖储罐(可以就是储罐6)中通过被动太阳能加热8进行。在水源很冷时，例如温度可能低于许多微生物的最适生长温度(约为24-35℃[75-95°F])的非地热地下水，可能必需进行预热。所以，预热使培养物的温度在被引入循环生长系统之前得以适当调整。在水源水已经处于合适的培养温度时可省略预热步骤。此外，虽然为了经济和环保的原因而优选太阳加热，但是也可以使用常规加热器等热源来进行必需的温度调整。
估计水中含有可能威胁生长于培养系统中的目标微生物存活的活性微生物或可能存在的有害菌时，必需进行灭菌步骤10。较好的灭菌方法是用紫外光、γ辐射、臭氧或其它非侵害性灭菌剂处理培养基，或者也可以利用其它常规方法进行。多数情况中，估计先前的过滤步骤能够去除活性颗粒物。如果对水源水或过滤效果的分析显示基本上没有不需要的微生物或可能存在的有害菌，则不需要灭菌步骤。
从配制容器42向合适的反应容器或“生物反应器”，在此称为生长单元14中加入微生物原料。在配制容器42中加入配制水(可以加入营养素或其它所需添加剂进行调配)和微生物接种物。例如，可以将30升的培养物用于接种，此时加入的配制水初始体积应约为150升。虽然，浓缩的实验室接种物与新鲜的配制水之比取决于微生物种类，而且最适比例的决定是经验性的，但此比值通常在5∶1至10∶1之间。在容器42中短时间稳定后，将水/接种物混合物送入生长单元14之一。接种物在单元14中有一段初始生长阶段，通常只持续几天。然后随着微生物的生长和生物群体的增加，手动或自动地不断加入新鲜的配制水和营养素，同时维持湍流状态。系统不断扩增直至完全运行容量只是简单的反复过程。
如在12处所示，通常将营养素加入水中而进入生长单元14中。在生产中，水从维持储罐6通过灭菌处理器10分配给各生长单元14。如果储罐的位置高于生长单元，可利用重力进行从储罐中的分配。否则，需要一台泵将水加入生长单元14。
生长单元14的体积应大于水性培养基的体积，即生长单元不被水性培养基完全充满。只有这样才能够达到有效的湍度。如果设备被充满，会有器壁效应使细胞在器壁上聚集而固定，由此导致这些细胞的光饱和，并因阻碍光线而导致水性培养基内部细胞的光饥饿。如果保持设备只是部分充满，则存在一个自由培养基表面，它可使培养基整体有效地湍动而防止停滞细胞体在管道壁上的聚集。此外，在细胞生长过程中放出大量氧气。如果设备充满了水性培养基，去除排出的氧气受到抑制，系统可能发生氧中毒。最后，保持该单元不被水性培养基完全充满，意味着系统可在基本上为大气压力而非高压下运行，由此可使用普通透明软管作为导管而不必使用昂贵的耐压硬管。充满量视方便而定，通常在30％至90％之间。如果充满量过于接近全充满，器壁效应和气体排放将成为主要问题，而如果充满量太低，系统得不到有效的利用。本领域熟练技术人员将能够容易地确定各种特定设备的合适的充满量。
通常，生长单元14是管状的且由聚乙烯制成，但也可使用对植物组织无害的各种硬质或柔性材料，只要材料是基本非水溶性且不透水、可透过可见光但不可透过近可见部分的紫外光。虽然，为此最好的是低密度聚乙烯(尤其是，如果其具有最小的厚度以同时降低光的弱化和成本)，其它可用的材料还有聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、非水溶性纤维素酯和聚酯膜，或者玻璃(较少选用)。
生长单元的大小应能够使设备大小与生长过程中维持的湍流旋涡大小成要求的比例。我们发现，流动流体反应室中的液位与旋涡大小(λk)之比应在0.1-1之间，以0.1-0.8为佳。如果此比值太高(即＜0.1∶1)会损伤细胞，使ε过高、NRe制约生长。相反，如果此比值太低(即＞1∶1)，旋涡大小会超过容器大小，旋涡就不能被适当维持于其三维搅拌过程中。如果使用很深很窄的管道就会出现后一种情况。应当认为在操作过程中的大多数时刻存在着大量的旋涡，有不同的旋涡大小。为了本发明的目的，我们将会提到“主旋涡体积”，通常定义为认为所有的实际旋涡大小均等时所具有的理论大小。换言之，即总旋涡体积均匀分配于相同数目的旋涡时的“平均”旋涡大小。本领域熟练技术人员很容易基于经验来使用该值，因为这基本上就可从操作过程中观察到的实际水性培养基总体湍流特性计算而得的统计学“平均”旋涡。
生长单元一般配有装置来收集生长于其中的微生物在光合作用中产生的溶解气体16，例如氧气。生长单元(下文将详细说明)的特征可认为是闭合、受控、适合光合作用微生物连续生长的环境。
收获通常通过分离过程进行，最好是多阶段过程，微生物生物质的浓度在每一步骤中逐步提高直至最终获得湿的或干的产物。但是，有些应用不需要对培养后的微生物物质进行后处理，而将收获的悬浮态培养物直接用作产品。例如，微生物不需要以脱水“湿”产品34或干燥产品38的形式收获时，例如在某些将其用作化学提取过程料浆的情况下，可省略收获步骤。此时，从生长单元14中输出的收获物可通过泵或利用重力被动进入这种次级加工系统18，可以是直接进入也可以间接地在中间储存容器(未显示)中储存后进入。
收获的第一步可以是絮凝20。收获水利用泵或重力从生长单元14中流出，冲出培养于其中的光合作用微生物。离开生长单元14后，收获水可通过一电絮凝器，形成大的微生物结块。或者，可以在培养基进入沉降罐时加入化学絮凝剂例如明矾来进行絮凝20。最好，絮凝产生的结块的沉降速度应高于构成结块的单个微生物细胞沉降速度两个数量级。有些微型藻类或植物组织会自发絮凝(例如Haematococcus)，此时不需要絮凝步骤。
离开絮凝器20后，收获水马上进入一系列沉降罐22中。沉降通常进行数小时，微生物浓缩约50倍，生成浓缩的絮凝物24和上清液26。
收获过程的下一步是离心28。可从沉降罐22中取出浓缩微生物絮凝物24送入大容量连续离心机中，在其中经离心分离(通常3,000至30,000rpm)生成上清液26’和含水70％至90％的浓缩微生物料浆30。高速连续离心是进一步的脱水步骤，使微生物浓缩20-50倍，由此生成所需的“湿产品”34。
沉淀罐22和离心机28产生的上清液26和26’经合并后可如40处所示以各种便利的方法进行处理，但最好送入渗滤区32，由此可再循环进入水源2(例如地下含水层)。地下或避光渗滤的作用在于杀灭所有残留在上清液中的光合作用微生物，使它们不被引入水源2。自然渗滤过程也有去除培养基中大部分溶解有机物和无机物的作用，由此向水源2提供大致纯净的循环水。
一可选性的收获步骤使用了干燥表面36。来自离心机28的微生物浓缩物在一混凝土、塑料、玻璃或大体光滑平整表面上分布成一薄层。将浓缩料浆30干燥成“干燥”产品38通常通过蒸发来进行，但也可使用热空气等辅助干燥。最好通过覆盖干燥表面和自动调控加盖棚内的相对湿度和温度来保持最大蒸发速度。
本调控方法的优点使用例如以上示范系统，本发明的调控方法具有现有技术不可能具有的优点。首先，本方法能达到的湍流能耗散速度ε，能够在合理的流速下加强营养素的吸收。其次，可以对ε进行更精密的调控，特别是使用大直径管道时。例如，根据方程(5)显示，对于直径25cm(10英寸)的管道，在NRe＞15,000时ε将处于强化营养素吸收速度的范围内(＞10-3W/kg)。如此管径，在流速大于约5cm/秒时可达到上述雷诺数。所以，在适当流速时产生的湍度可产生强化营养素吸收所需的ε值。
其次，从方程(4)和(6)可以看到，流速的很小变动将引起ε的巨大波动(因为ε∝ u3/LK)。所以，对于相同的ε，管径较大时，流速波动控制更精确。因为管径较小时，很小的流速升高就能使ε有一定的升高。但是，要在较大直径的管道中产生相同的ε升高，需要大得多的流速升高，也就需要流速作更多级增量变化，从而可进行更精确的调控。此外，由于ε＝kQ3/LK7(6)(其中K是常数，Q是面积流速(生产速度)， LK是管径)，对于一定的ε，微生物生产速度随管径按略大于平方的关系升高。所以，在维持相同ε(促进营养素的最佳吸收)的大管径系统中，实际生产速度要比小管径系统大得多。
利用流体流动中的湍度进行调控产生了许多理想的结果。湍流能够保持某些光合作用微生物细胞不从循环水中沉淀出来，尤其是在细胞没有鞭毛(例如硅藻类，或Bacillariophycae)因而不能自己移动时。湍流还能够保证生长培养基中的所有细胞与光线接触，否则在稠密的培养基中，在约等于培养液深度10％的深度就几乎完全无光。可将湍流循环/生长方式维持至足以检测和确定最适湍度的时间，并在最适湍度一经确定后使光合作用微生物在收获前生长至预定的最佳生物量。使用湍度调控可有效利用前述的“闪光效应”来强化生物数量的增长。闪光效应本质上是光合作用细胞仅能吸收光线中有限量的辐射能的一种功能。结果，间断的光照和连续光照对这类细胞的益处相当。实际上，假如持续光照对某些细胞有害，那么在湍流状态中细胞受以间断的光照将减少细胞损失。通过调控细胞经受的湍流，生长系统的操作者能够利用闪光效应尽可能扩大细胞的生产能力，同时尽可能减少过度曝光和剪切力引起的细胞损失。
有多种调控湍度的方式，其中分别或同时使用设备参数或流体参数。例如，根据NRe的定义可以看到，可以改变流速或生长管直径来调控湍度。一旦确定了要求的湍度，就可以相应调整流速和/或生长管的直径。所以，为了说明本发明，不提供具体的管径、流速或流体粘度，因为我们假定本发明的操作者会根据在此所述的方法确定待培养细胞所需的NRe值，而且能够相应调整管径和/或流速。
应当认为，在每个生长循环的过程中，用于生长单元14的调控参数是变化的，因为随着微生物生长，为提高细胞数量所需的光、营养素需求与传递、总气体产生情况等都会变化。所以，本发明方法应被认为是连续调控法，其中湍度调控水平在任一时刻都是微生物生长进程的函数。
在系统操作过程中，设置在系统中的几个检测站连续检测生长培养基的物理、化学和生物特性。一般，被检测的特性有pH、CO2浓度、温度、光密度(生物量)和流速。根据具体培养的微生物，各自的认可值范围有所不同，本领域熟练技术人员将能够容易地针对目标微生物确定这些特性的最适值。这些特性还会因微生物在生长单元中的停留时间而改变。作为指导，我们发现，将例如Haematococcus pluvialis，Spirulina platensis，Lyngbya lagerheimi，或Chlorellasorokiniensis培养在如图所示、直径24cm闭合管系统中时，参数的合适范围是NRe4000至106pH 6.5至9.5CO2浓度 100g/m3至溶解度极限温度 25-35℃(75-95°F)λK1-10流速 2-100cm/秒虽然最适pH根据被培养微生物的种类而不同，但pH通常在6.5至9.5之间最适于生长。湍度调控通常能够产生最适pH值。如有必要，可以通过添加化学试剂进一步调节pH；加CO2或酸(以HNO3为宜)可使高pH降低，加碱(以NH4OH为佳)可使低pH升高。此外，通过选用含氮的酸和碱，在pH调节的同时还向培养基中加入了营养素。根据被培养种类的营养需求，如果优选磷而不是氮作为主要限制性营养素，可使用磷酸化的酸和碱。这通过选择以气升式或气体交换式系统的长度为基础的λK来进行调控。
气体(CO2)浓度的最适范围也是依赖性于微生物种类的，但在所有情况中都大于100g/m3碳(无论是CO2、碳酸盐或碳酸氢盐形式)，而且都不能超过CO2在水中的溶解度。如果发现湍度调控形成的CO2浓度低于最适范围，可通过一补给罐向系统添加气体CO2。如上所述，CO2调节还可以用于pH调节。当CO2浓度低而营养素浓度高时，这是提高酸度的优选方法，但是当CO2浓度高而营养素浓度低时优选加酸。
利用光学方法测定光合作用微生物的生物量。在一种方法中，通过读取光密度来进行测定，但其它光学方法可能也适用，例如体外测量叶绿素或其它荧光颜料的萤光度。由于光密度和颜料浓度与微生物的生物量成正比，这些方法可提供培养物中各检测位置的微生物浓度。所以，相距需要已知穿越时间的已知距离的两个检测位置之间的细胞浓度差异可用于计算该时间段内产生的细胞量。这样，该系统的任何使用者都能够容易地测定和改进或优化生产能力。
温度调控也很重要。所有的光合作用微生物都能在相当窄的温度范围内生长得最好，但在温度低于最适范围2至3℃(3至4°F)时生长情况显著下降。生长最快的种类通常在25至35℃(75至95°F)时生长最佳；Eppley，Fishery Bull.U.S.，701063-1085(1972)。总的说来，随温度的升高，生长速度缓慢升高，然后在温度超过最适值时较快下降。湍流保证液体培养基中的温度混合均匀，不出现冷点。
在12处加入系统的营养素包括被培养的特定微生物生长最佳所必需的各种营养素。其中可能包括，例如过磷酸盐，尿素，硅酸盐，微量金属例如锌、铁、钒等，维生素以及其它生长强化原料。营养素一般以相对于其在生长系统中最终浓度的浓缩形式加入；典型的浓缩因数为约4000。通常，在收获/重新加料时间内，每隔3小时以约0.5ml/秒的速度将营养素加入新鲜的培养水。营养素的添加速度应调节为能够迅速地使培养基中的营养素浓度达到预定的最适水平。这些水平的选择是根据，所有的营养素都将在生长循环结束时被耗尽。或者，可以以相同于前述pH和CO2的调控方法对营养素的加入进行调控(例如根据置于系统合适位置的传感器读数用微处理器)。系统一般应储存操作生长单元14数月所需的营养素供给。
本发明的湍度调控法适用于多种微生物的生长。其中包括多种藻类、单细胞浮游植物，脉管植物组织、微型藻类组织等。其经济可行性生长可通过湍度调控来调控的具体的属和种的实例有甲藻纲，硅藻纲，Lyngbya lagerheimii(甲藻纲)，Spirulina platensis(甲藻纲)，Haematococcus pluvialis(甲藻纲)，Chlorella sorokiniensis(甲藻纲)，和植物组织细胞培养物。尤其适于利用本发明来生长的是Haematococcus pluvialis，Spirulina platensis，Lyngbyalagerheimii，和Chlorella sorokiniensis。本领域熟练技术人员马上就能认识到，以上名单并不是排他性的，相对其它种属也适合使用本发明湍度调控技术的生长过程。
这些微生物中的许多对于工业生长尤其有价值，因为它们天然地直接或间接生产某些化学物质，这些化学物质否则将从石油、煤基或类似原料合成。典型的可从这类微生物中获得的化学物质为染料，例如叶绿素，叶黄素和类胡萝卜素；脂肪酸，例如γ亚油酸，糖(例如葡萄糖)，醇(例如甘油)，石油烃，所有已经或可能会被发现天然存在于已知存在于自然界中的约30,000种微生物中的化合物。还包括潜在的有机体，如常被用作有价值的日用品，例如咖啡、烟草、巧克力、橡胶等来料的普通脉管植物组织。本领域熟练技术人员当然知道许多其它得自微生物的最终产品，这些微生物能够较好地使用利用了本发明湍度调控法的系统来生产。
很明显，本发明有许多实施方法，虽然在前文中没有特别说明，但很明显属于本发明的范围和精神之内。所以，以上说明书只应理解为是示范性的，本发明的实际范围仅由后续的权利要求来确定。
权利要求
1.一种调控水性微生物生长过程的方法，其特征在于，它包含将光合作用微生物质分散在反应室内的水性培养基中，所述的反应室能够透过可见光，所述的含有所述微生物悬浮物的水性培养基体积小于所述反应室的总体积；将所述微生物质在所述反应室中维持一段时间，期间，构成此生物质的微生物进行繁殖而使数量增加；在所述时段内向所述生物质提供营养素并从中排除放出的气体，以支持其繁殖；在整个所述时段内令一定量的水性培养基流过所述反应室；至少在所述时段的部分时间令所述反应室受的可见光源照射，使可见光透人所述的反应室被所述的微生物所利用以引发光合作用；在所述时段内，保持湍流状态，使湍流旋涡分布于整个水性培养基内；在所述时段内，维持所述反应室的尺寸与所述旋涡的尺寸之比在预定范围内；使得在湍流状态下，维持适于所述微生物繁殖的有效反应条件，直至所述时间足以使所述微生物增加至所需的数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的湍流状态定义为雷诺数在2000至106之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述的湍流状态定义为雷诺数在4000至106之间。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述的湍流状态定义为雷诺数在4000至250,000之间。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中所述的湍流状态定义为雷诺数在5000至50,000之间。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的比值应使流动流体反应室中液位相对于旋涡大小是在0.1-1反应室体积单位之间。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述的范围为0.1-0.8反应室体积单位。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的微生物生物质含有至少一种以下微生物单细胞浮游植物、脉管植物组织、巨型藻类组织等。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的微生物和上述植物的组织选自甲藻纲，硅藻纲，Lyngbya lagerheimii(甲藻纲)，Spirulina platensis(甲藻纲)，Haematococcus pluvialis(甲藻纲)，Chlorella sorokiniensis(甲藻纲)，和植物组织细胞培养物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，其中所述的微生物选自Haematococcus pluvialis，Spirulina platensis，Lyngbya lagerheimii，和Chlorellasorokiniensis。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述反应容器内的反应条件包括光照、营养素供给、沉降速度、总体温度、气体交换率和细胞完整性。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的湍流状态使得所述微生物在所述生物质内移动，从而使单个微生物与可见光的接触是间歇性的
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，其中所述的所述微生物与可见光的间歇性接触对所述微生物的光合作用产生一种闪光效应。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，其中所述微生物受可见光照射的累计时间比累计的不接触时间长约10倍。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括保持湍流能量耗散速度ε在10-3至10W/kg之间。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述含有的微生物生物质的水性培养基占所述反应室总体积的约30％-90％。
全文摘要
本发明公开了一种进行水性微生物生长过程的调控方法，它能够维持许多微生物的具有可行性的生长条件，这些微生物迄今还无法进行具有工业价值量的繁殖。主要调控参数为水性培养基内的湍度和设备尺寸相对于容器内湍流旋涡的大小，容器被水性培养基部分充满，它们直接影响着最佳生长情况所需的各种条件光照、营养素供给、沉降速度、总体温度、气体交换率和细胞完整性。可以根据雷诺数(N
文档编号C12M1/00GK1154140SQ95194302
公开日1997年7月9日 申请日期1995年7月21日 优先权日1994年7月22日
发明者M·E·亨特利, P·P·尼勒, D·雷德尔杰 申请人:水探索股份有限公司