专利名称：：一种固定化酵母干凝胶珠及制造方法
技术领域：
：本发明属于微生物细胞固定化
技术领域：
涉及酒精和啤酒的发酵技术。本世纪七十年代发展起来的微生物整体细胞的固定化技术是一门新兴的生物技术，而固定化酵母技术主要用于酒精和啤酒的发酵过程，该项技术在发酵过程中的应用可以加速发酵，增加产量，并且使操作稳定，便于控制，因而是酒精和啤酒行业发酵技术的发展方向之一，现有技术中，最常用的固定化酵母技术是海藻酸钙凝胶珠包埋法，(1989年第1期甘肃科学学报，“固定化增殖酵母工业应用的研究”)，其基本原理和操作是将含有酵母细胞的海藻酸钠水溶液一滴一滴地滴入氯化钙溶液中，使海藻酸钠中的钠离子交换成钙离子，在一定温度下硬化一段时间，便成为不溶性的水化凝胶珠。这种凝胶珠要求必须在专门的反应器上进行发酵反应，因为凝胶珠的粒度很小一般直径都在4mm以下，这种凝胶珠在大生产中，由于珠粒成堆，相互间的间隙过小，影响了醪液与载体的接触反应，也会因此而截留醪液中的浮渣和泥沙等杂物，这些杂物是杂菌滋生的温床，使杂菌污染机会增大，另一方面以海藻酸钙作载体，还会存在两大弱点，一是对磷酸盐的不稳定，二是由于内部CO2释放激烈和菌体增殖而使凝胶结构崩裂和膨胀松驰，这两大弱点都会导致凝胶珠丧失机械强度，从而使载体寿命难以延长，成本增加，并会造成设备堵塞等问题，另外细小的珠粒经受不起大生产发酵操作过程中如清洗、除杂、通风、活化等激烈翻滚的处理，以及珠粒之间、珠粒与发酵罐，特别是与阻隔之间的磨擦，排空时的挤压等情况，这些都加速了珠粒强度的减弱和载体凝胶损耗，使载体寿命更短促。本发明的目的是为了克服现有技术所存在的缺点，采用独特的液下分离成型法制成大粒度海藻酸钙固定化酵母湿凝胶珠后再通过干燥处理制成干凝胶珠。由于该干凝胶珠粒度大且结构緻密而坚硬，能够解决由于胶粒过小和海藻酸钙载体存在的两大弱点，而造成的设备堵塞，污染增大，使珠粒强度减弱，凝胶解体，载体寿命短促等问题。本发明的方法所制备的凝胶珠，是一种包埋了酵母活细胞的海藻酸钙大粒度干凝胶珠，其特点是凝胶珠被碳酸钙填充，质地緻密而坚硬，技术指标为干物质含量83-94％(W/W)酵母含量6-80亿/ml单粒体积0.07-3.0(cm)3当量直径5-18mm比重1.2-1.65单粒抗压强度30-100kg/粒本发明制备干凝胶珠的方法是先配成含有酵母的海藻酸钠溶液，该溶液浓度为2-4％，一般为3％(W/V)，酵母湿细胞含量为7-105g/L，即约1-15亿/ml，最佳值为5-6亿/ml，并在海藻酸钠溶液中加入碳酸钙作填充刘，加入量为3一12％(W/V)最佳值为8％，充分搅拌均匀，成为粘稠的混合母液，制备方法的特点是通过液下成型方法制珠即在氯化钙溶液液面下设置一个口径为8-32mm的喷管一般可以制成15mm，令混合母液从喷管中喷出，进入氯化钙交换液中，喷出部分的界面立即交换形成一层海藻酸钙凝胶薄膜，这样，喷出部分便成为由薄膜包裹的凸囊，待喷出部分达到所需珠粒长度，一般为15-20mm时，及时将薄膜凸囊挤断分离，成型为大粒度的珠粒状液囊，液囊珠粒再在交换液中4℃下浸泡24小时，便充分交换硬化成外形整齐，粒度均匀的大粒度固定化酵母加强型凝胶珠，再经35℃以下的低温干燥处理，令其均匀收缩干燥，直至其水分含量和粒度收缩都达到较为稳定状态，便制成了一种包埋了大量酵母活细胞并被大量碳酸钙所填充的大粒度海藻酵钙干凝胶珠。本发明所提供的制备凝胶珠的方法，与现有技术不同之处在于1)混合母液从浸于交换液液面以下的喷管口喷出，混合母液喷出后，是先做界面交换形成海藻酸钙薄膜包裹的凸囊，然后再用机械方法将其挤断分离成为珠状液囊，因而不受表面张力的限制，所制备出的凝胶粒度大，强度高，现有技术所制备的珠粒通常只有2-3mm直径，但本发明制备出的湿凝胶珠粒度可达Φ30mm，干燥后仍可达Φ18mm，干珠单粒抗压强度可达30-100kg/粒。2)本发明所提供方法制备的凝胶珠，质地緻密而坚硬，并含有大量的填充剂，因而有效地阻止了底物向珠粒内部的扩散渗透，使内部CO2释放和酵母增殖十分缓慢，避免珠粒的崩解，同时由于载体强度增加，使对磷酸盐的稳定性加强，完全避免了载体松散解体的问题。本发明所涉及的凝胶珠技术，与现有技术相比对于发酵试验的效果和载体的寿命对比列于表1中由表1数据可以看到，本发明的干凝胶珠可以达到粒度大，强度高，活性好，寿命长的优点，适用于常规发酵设备中使用推广。实例1、海藻酸钙固定化酵母干凝胶珠发酵甘蔗稀糖蜜快速生产酒精(一)材料1、菌种，AS、21190菌株、中科院微生物研究所供应。2、轻质碳酸钙广东省台山化工厂生产。4、氯化钙广东省台山化工厂生产，化学纯。5、培养基(1)试管斜面固体培养基常用米曲汁琼脂培养基。(2)摇瓶液体细胞培养基酵母浸出0.7％，尿素0.3％，蔗糖10％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.05，PH4.5-5.0，硫酸调节，1kg/cm230分钟灭菌。(3)发酵培养基55酸化6小时甘蔗糖蜜，稀释至24-26Bx，含糖约15％，PH4.0-4.5。6、液下分离固化成型装置Φ120mm漏斗一个，与Φ15mm平口玻管一根，用乳胶管连接起来，取Φ250mm玻璃缸一个，漏斗用固定支架固定在玻璃缸上方约400mm处，平口玻管则固定于玻璃缸内，即成。7、发酵罐聚氯乙烯制容积为1.5升锥底酒精发酵罐2个，锥部装3-4目不锈钢阻隔网，用于出料时将载体留在罐内。8、仪器设备鼓风干燥箱一个及常用微生物实验和化学分析仪器设备。(二)方法1、载体制备(1)凝胶珠固化成型①混合母液的配制试管斜面酵母菌种2支，分接8瓶摇瓶液体培养基，30℃下振荡培养24小时，离心取湿细胞备用。称取海藻酸钠30g，用无菌水800ml，溶解后加入56g酵母湿细胞，搅拌均匀后再加入60g轻质碳酸钙，然后用无菌水定容至1000ml。②液下分离成型制固化制珠，称取150g氯化钙用无菌水溶解后定容至3000ml，即成5％交换液，然后将之倒入玻璃缸中，并将平口玻管口浸于液面之下，再将混合母液倒入漏斗，令母液顺乳胶管流至平口玻管，控制流量令其缓缓流入交换液中，每至18mm左右长度，即时挤断分离，直至全部混合母液操作完毕，4℃下原液浸泡24小时，即成为短杆状的大粒度湿凝胶珠。(2)凝胶珠的干燥将制好的湿凝胶珠，放入已灭菌的糖瓷托盘中，然后在鼓风干燥箱内35℃下鼓风干燥，直至其粒度收缩和水分含量都达到较稳定的状态，珠粒成为坚硬的干凝胶结构，其粒度约为Φ8-8.5mm，即可投入发酵使用。2、单浓双罐批式发酵称取120g干凝胶珠，平均分别置于两个1.5立升罐中，即60g/罐，并标志记号分别为1#和2#罐，然后往1#罐中加入1200ml发酵培养基，32-34℃发酵10小时，然后全部醪液移至2#罐中，30-32℃下继续发酵约10小时，便完全成熟，排出递去蒸馏。1#罐醪液全部移走后，立即加回1200ml发酵培养基，32-34℃下发酵10小时后又全部移至2#罐继续发酵约10小时，如此重复操作，则约每10小时便有一批成熟醪，其酒分可达9.4％(V/V)左右，测试分析和微生物检验工作以及条件控制，清洗除杂，通风活化等操作与普通凝胶珠技术一致，只是更方便和容易。载体活性提高后可适当缩短发酵时间，当2#罐活性明显下降时，可作1#、2#对调操作。实例2、海藻酸钙固定化酵母干凝胶珠发酵12°麦芽汁快速生产啤酒。(一)材料1、菌种MIG2.101酵母菌株广东省微生物研究所菌种保藏中心供应。2、海藻酸钠青岛市产品，食用级，广东省化工总公司供应。3、活性碳酸钙广东省台山化工厂生产。4、氯化钙广东省台山化工厂生产，化学纯。5、培养基(1)试管斜而固体培养基麦芽汁琼脂培养基。(2)摇瓶液体细胞培养基、麦芽汁培养基。(3)发酵培养基12°麦芽汁，加酒花，由啤酒厂提供。6、液下分离固化成型制珠装置同实例1。7、发酵罐5立升啤酒发酵锥形罐，底部加设不锈钢阻隔网，规格4目。8、其它仪器设备电冰箱一台及其它常用微生物实验和化学分析仪器设备。(二)方法1、载体制备(1)凝胶珠固化成型在严格无菌操作下进行，环境温度在15℃以下。①混合母液的配制试管斜而菌种2支，分接8瓶含细胞培养基250ml瓶的三角瓶，15℃下振荡培养24小时以上，离心取湿细胞，2-4℃下备用。称取海藻酸钠35g，用800ml清水溶解后，105℃灭菌30分钟，凝却至4-10℃，加入酵母湿细胞28g，搅拌均匀，再加入87.5g活性碳酸钙，均匀后用4℃无菌水定容至100ml，充分搅拌均匀即成较粘稠的混合母液。②液下分离固化成型制珠称取150g氯化钙，用无菌水溶解后定容至3000ml，然后冷却至4℃，即成为5％的交换液。其后成型操作实施例一。(2)凝胶珠的干燥将制好的湿凝胶珠用无菌水(2-4℃)清洗3次，然后放入冰箱中，0-4℃无菌条件下进行干燥，直至成为坚硬的干凝胶珠，即可用于发酵。2、单罐批工发酵无菌条件下称取135g干凝胶珠，放入已灭菌的锥形罐中，加入发酵培养基，8-10℃下发酵48小时，弃去全部培养液，然后加入4500ml发酵培养基进行一罐式固定化酵母快速发酵生产啤酒，条件控制和发酵操作以及测试分析和微生物检验等均与普通凝胶珠技术相同，只是更方便和容易而矣。实例3、海藻酸钙固定化酵母干凝胶珠发酵木茨淀粉水解糖快速生产酒精。(一)材料1、菌种、南阳混合酵母菌株，由广东省微生物研究所菌种保藏中心供应。2、海藻酸钠青岛市产品，食用级，广东省化工总公司供应。3、轻质碳酸钙广东省台山化工厂生产4、油酸广州市化学试剂厂供应，化学纯。5、吐温80广州市化学试剂厂供应，化学纯。6、氯化钙广东省台山化工厂生产，化学纯。7、培养基(1)试管斜面固体培养基麦芽汁琼脂培养基。(2)摇瓶液体细胞培养基麦芽汁培养基。(3)发酵培养基木茨淀粉水解糖液由淀粉酒精厂提供，含糖约15％(W/V)。(4)液下分离固化成型制珠装置，同实施例一，但平口玻管改为Φ13mm。9、发酵罐3立升玻璃锥底酒精发酵罐，底部加设4目不锈钢阻隔网。10、仪器设备，同实例一。(二)方法1、载体的制备1、凝胶珠固化成型①混合母液的配制同实例一，只是菌种改为混合酵母，并在最后加入油酸6g和吐温806g充分搅拌均匀即成。②液下分离固化成型制珠同实例一，只是珠粒液囊长度改为15mm。(2)凝胶珠的干燥同实例1，干燥后的凝胶珠粒度约为Φ7mm。2、单罐批式发酵称取100g干凝胶珠，置于3立升发酵罐中，加入发酵培养基2.5L，30-32℃下发酵，约36小时即可成熟，成熟醪酒份为9.)％(V/V)左右，数批后，载体活性达至最高，约28小时即可成熟。发酵过程操作和测试分析及微生物检验工作均与普通凝胶珠技术一致，只是更容易和方便。表1</tables>权利要求1.一种包埋酵母活细胞的海藻酸钙大粒度干凝胶珠，其特征在于这种干凝胶珠被碳酸钙填充，质地緻密、坚硬，技术特点为干物质含量83-94％(W/W)酵母含量6-80亿/ml单粒体积0.07-3.0cm3当量直径5-18mm比重1.2-1.65单粒抗压强度30-100kg/粒。2.一种制备权利要求1中所述的干凝胶珠的方法，该方法先将含有酵母的海藻酸钠溶液加入3-12％(W/V)碳酸钙作填充剂，使之成为混合母液，其特征在于通过液下分离成型制珠，其方法为在氯化钙水溶液液面下设置一口径为8-32mm的喷管，令混合母液从喷管中喷出，进入氯化钙交换溶液，即形成海藻酸钙凝胶薄膜包裹的凸囊，等达到所需珠粒长度时，及时将薄膜凸囊挤断分离，成型为大粒度液囊，液囊珠粒再于4℃下，在交换液中浸泡24小时，便成为大粒度凝胶珠，后经低于35℃低温干燥处理便制得干凝胶珠。3.根据要利要求2中所述的方法，其特征在于所述的填充剂碳酸钙加入量为8％。4.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于氯化钙溶液液面之下的喷管口径为15mm。全文摘要本发明涉及酒精和啤酒的发酵技术。现有的海藻酸钙凝胶珠包埋法，它的不足之处是凝胶珠粒度很小，和载体易丧失机械强度，本发明采用液下分离成型法，在氯化钙溶液液面下设置喷管口，混合母液从喷管口喷出而成型，这种湿凝胶珠，直径可达30mm，干燥处理后直径可达18mm，单粒抗压强度可达30-100kg/粒，质地坚硬致密，因而解决了珠粒崩裂和不稳定而解体散失两大问题，而且这种干凝胶珠，粒度大，强度高，活性好，寿命长，适合于企业常规发酵设备使用。文档编号C12N11/00GK1155010SQ96119159公开日1997年7月23日申请日期1996年10月9日优先权日1996年10月9日发明者冯杰雄,周淑萍,李浩华,黄晓维申请人:广东省微生物研究所