促骨生长素的制作方法

专利名称：促骨生长素的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及与调节骨代谢有关的多肽。更具体地说，本发明涉及一种被称为促骨生长素(osteoprotegerin)的新多肽，它是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。所述多肽被用于治疗以骨换失增加为特征的骨疾病，如骨质疏松症。
背景技术：
多肽生长因子和细胞因子是分泌因子，它们通过与不同的表面结合受体特异性结合而表明细胞生长，分化和代谢变化的不同情况。作为一类蛋白，受体在其结构和信号传导模式方面有所不同。它们的特征在于具有与配体结合有关的细胞外结构域和传递适当的细胞内信号的胞质结构域。受体表达方式最终确定哪种细胞会应答一种特定的配体，而特定受体的结构确定由配体结合而诱导的细胞应答。已经表明受体通过激活蛋白酪氨酸，或蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸化作用(如血小板衍生的生长因子受体(PDGFR))或通过刺激G-蛋白活化(如β-肾上腺能受体)，然后通过调节与胞质信号传导蛋白(如TNFR-1和Fas/APO)(Heldin，细胞，80，213-223(1995))来传递细胞内信号。
肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族是I型跨膜蛋白，它们在细胞外结构域都具有一个重复3-6次的保守的Cys富集基元(Smith等人，细胞76，953-962(1994))。总的来说，这些重复单位形成这些受体的配体结合结构域(Chen等人，化学270，2874-2878(1995))。这些受体的配体是与TNFα同源的结构相关的蛋白组(Goeddel等人，Cold SpringHarbor Symp.Quart Biol.51，597-609(1986)；Nagata等人，科学267，1449-1456(1995))。TNFα与不同但紧密相关的受体TNFR-1和TNFR-2结合。TNFα在携带受体的细胞中产生各种生物反应，包括增殖，分化和细胞毒性以及细胞凋亡(Beutler等人，生物化学研究年鉴(Ann.Rev.Biochem)57，505-518(1988))。
认为TNFα介导了急性和慢性炎症反应(Beutler等人，生物化学研究年鉴57，505-508(1988))。全身施用TNFα诱发毒性休克和广泛的组织坏死。由于该原因，TNFα可能引起严重的疾病和与各种感染性疾病(包括脓毒症)有关的死亡。FasL(TNFR-相关受体Fas/APo的配体(Suda等人，细胞75，1169-1178(1993))突变与自体免疫有关(Fisher等人，细胞81，935-946(1995))，而FasL的过生产可能与药物诱发的肝炎有关。因此，各种TNFR相关蛋白的配体常常介导许多疾病的严重效应，表明中和这些配体活性的药剂有治疗价值。已经检测了可溶性TNFR-1受体和结合TNFα的抗体中和全身TNFα的能力(Loetscher等人，癌细胞3(6)，221-226(1991))。最近克隆了天然的分泌型TNFR-1的mRNA，检测了其产物的体外和体内中和TNFα活性的能力(Kohno等人，PNASUSA87，8331-8335(1990))。该蛋白中和TNFα的能力表明可溶性TNF受体有结合和清除TNF的功能，由此阻断对携带TNFR细胞的细胞毒性作用。
本发明的一个目的是鉴定TNFR超家族的新成员。新家族成员被认为是跨膜蛋白或含细胞外结构域，但没有跨膜和胞质结构域的其可溶形式。我们已经鉴定了一个TNFR超家族的新成员，它编码与TNFR-2紧密相关的一种分泌型蛋白。与可溶TNFR-1类似，TNFR-2相关蛋白可以负调节其配体的活性，因此可用于治疗特定的人类疾病。
发明综述从胎大鼠肠cDNA文库中鉴定了肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的一个新成员。得到了全长cDNA克隆并进行了测序。在转基因小鼠中表达大鼠cDNA表明骨密度(特别是在长骨，骨盆和脊椎中)有明显增加。将由该cDNA编码的多肽称为促骨生长素(OPG)，它在促进骨质积累方面起重要作用。
本发明提供了编码有至少一种OPG物活性的多肽的核酸。还提供了与图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEQ ID NO122)和9C-9D(SEQ ID NO124)所示的编码小鼠、大鼠或人OPG的核酸杂交的核酸。优选地，OPG是哺乳动物OPG，更优选是人OPG。重组载体和表达OPG的宿主细胞作为生产重组OPG的方法也被包括在内。本发明还公开了特异性结合所述多肽的抗体或其片段。
本发明还提供了治疗骨疾病的方法。所述多肽用于预防骨吸收并可用于治疗导致骨损失的任何疾病(如骨质疏松症，高血钙，变形性骨炎)和由于类风湿性关节炎或骨髓炎引起的骨损失等。可以用使用本发明核酸的反义或基因疗法来治疗骨疾病。本发明还包括含OPG核酸和多肽的药物组合物。
附图描述

图1A新EST LORF的FASTA分析。列出了与人TNFR-2序列相对比的推导的FRI-1氨基酸序列。B所示新EST LORF的图分析是与TNFR-图对比的推导的FRI-1的氨基酸序列。CTNFR超家族的结构图，表明与新FRI-1同源。
图2全长大鼠OPG基因的结构和序列，该基因是TNFR超家族的新成员。ApMOB-B1.1插入片段图谱。方框表示cDNA序列内LORF的位置(实线)。黑框表示信号肽，灰椭圆表示Cys富集的重复序列的位置。B，C大鼠OPG cDNA的核酸和蛋白序列。在预测的信号肽下划了线，N-连接的潜在糖基化位点用黑体的下划线字母表示。D，EOPG与TNFR超家族其它成员，fas(SEQ ID NO128)；tnfr1(SEQ IDNO129)；sru-t2(SEQ ID NO130)；tnfr2(SEQ ID NO131)；cd40(SEQ ID NO132)；osteo(SEQ ID NO133)；ngfr(SEQ IDNO134)；ox40(SEQ ID NO135)；41bb(SEQ ID NO136)的序列比较。
图3预测的大鼠OPG蛋白序列的PepPlot分析(Wisconsin GCGPackage，Version8.1)。A大鼠OPG的图表明了疏水(上)和亲水(下)氨基酸。B按Chou和Fasman(Adv.Enz.47，45-47(1948))定义的，是β折叠形成(上)和β折叠断裂(下)的氨基酸残基显示。Cα-螺旋和β折叠的特性测量值(Chou和Fasman，同上文)。1.00上的曲线表示α-螺旋和β折叠结构的特性。在曲线降到1.00以下的蛋白区，结构终止。D残基的显示是α-形成(上)或α-断裂(下)。E类似α和β结构的氨基末端所发现之典型序列的部分蛋白序列的显示(Chou和Fasman，同上文)。F类似α和β结构的羧基末端所发现之典型序列的部分蛋白序列的显示(Chou和Fasman，同上文)。G在转角处发现的部分典型蛋白序列的显示(Chou和Fasman，同上文)。H在所述序列的各位置，螺旋疏水moment的显示(Eisenberg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81，140-144(1984))。I以Kyte和Doolittle(J.Mol.Bio.157，105-132(1982))和Goldman等人(在Ann.Rev.Biophys.Biophys.Chem.15，321-353(1986)中的综述)的为基础，平均亲水性的显示。
图4人组织中OPG cDNA的mRNA表达图。用32P-标记的大鼠cDNA插入片段(A，左边两行)，或人cDNA插入片段(B，右边的行)检测Northern印迹。
图5在肝细胞中表达OPG cDNA的转基因小鼠的产生。在小鼠肝中HE-OPG转基因的Northern印迹表达。
图6在OPG转基因小鼠中，骨密度的增加。A-F行。对照小鼠。G-J，OPG表达小鼠。在尸检时，该所有动物拍射线照片并制作照片。在A-F，是对照动物和一个转基因非表达者(#28)的照片。注意骨有清晰界限的皮层和半透明的中心髓腔。相反，OPG(G-J)动物有不清楚的皮层，而且骨髓区的密度增加。
图7在OPG转基因小鼠中小梁骨的增加。A-D对照动物骨的代表型显微照片。在A和B中，是股骨的低倍(4X，10X)的图象(MassonTrichrome染色)。酒石酸抗性酸磷酸酶(TRAP)染色表明破骨细胞(见箭头)吸收了软骨(C)和小梁骨(D)。注意在小梁骨上，破骨细胞是平的。E-HOPG-表达动物的骨的代表性显微照片。在E和F中，给出了股骨的低倍(4X，10X)图象(Masson Trichrome染色)。清晰的区是生长板软骨，蓝色区是骨，红区是骨髓。注意，与对照相反，未吸收小梁骨，从而导致没有通常的骨髓腔。另外，所得的小梁呈不同的颜色，有蓝色和透明区。透明区是从未被再模型化的生长板软骨的残迹。以TRAP染色为基础，这些动物在生长板确实有破骨细胞(见箭头)，可能数量有所减少。但是，从生长板分开的小梁的表面事实上没有破骨细胞(H)，在与对照动物相反的方向(见D)。
图8HE-OPG表达者在单核细胞-巨噬细胞发育方面没有缺陷。小鼠石骨症的一个原因是因M-CSF基因中有一点突变而导致M-CSF生产有缺陷。这导致循环和基于组织的巨噬细胞明显不足。按照H1E分析评估的，OPG表达者的外周血含单核细胞。为了确定组织巨噬细胞的存在，用F480抗体进行免疫组织化学试验，该抗体识别鼠巨噬细胞上的细胞表面抗原。A和C是正常和CR1过表达者的脾的低倍(4X)显微照片。注意到这两种动物均有大量的F480阳性细胞。单核细胞-巨噬细胞也存在于正常(B)和HE-OPG过表达者(D)的骨髓中(40X)。
图9小鼠和人OPG cDNA克隆的结构和序列。A，B.小鼠cDNA和蛋白序列。C，D.人cDNA和蛋白序列。在预计的信号肽下划了线，用黑体字表明了潜在的N-连接的糖基化位点。E，F.大鼠，小鼠和人OPG氨基酸序列的序列排列和比较。
图10 TNFR-1和人OPG细胞外结构域中保守序列的比较。在实施例6中描述的TNFR1和OPG排列的PrettyPlot(Wisconsin GCG Package，Version8.1)。上面行，编码结构域1-4的人TNFR序列。底行，编码结构域1-4的人OPG序列。用长方形框标出了保守残基。
图11人OPG的三维结构。人OPG25-163残基的预计三维结构Molescript呈象的侧视图(宽线的)，与人TNFβ共结晶(细线)。作为方向的参考，沿OPG多肽骨架的粗箭头是从N末端指向C末端方向。沿多肽骨架插入单个Cys残基侧链的位置以帮助说明不同Cys富集结构域。按Banner等人(1993)所述排列TNFβ分子。
图12 OPG Cys富集结构域的结构。人(上线SEQ ID NO136)和小鼠(下线)OPG氨基酸序列的直线，标明了预计的OPG结构域结构。将所述多肽分成两半N末端(A)和C末端(B)。预计N末端半含四个Cys富集结构域(标为1-4)。用实线表示预计的链内二硫键，标为“SS1”，“SS2”或“SS3”。预计酪氨酸28和组氨酸75(下划线的)形成离子间相互作用。预计与OPG配体相互作用的那些氨基酸用实点在适当的残基上标明。用长方形框标明在OPG C末端半区的Cys残基。
图13全长和截短小鼠OPG-Fc融合蛋白的表达和分泌。A用箭头表示与人IgG1 Fc结构域融合的点。B从表达F1.Fc(在Leu401与Fc融合的全长OPG)或CT.Fc(在Thr180与Fc融合的羧-末端截短OPG)融合蛋白表达载体的细胞得到的条件培养基的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的银染。1道，亲本pCEP4表达载体细胞系；2道，F1.Fc载体细胞系；3道，CT.Fc细胞系。C用抗-人IgG1 Fc结构域(Pierce)检测的，从F1.Fc和CT.Fc融合蛋白表达载体得到的条件培养基的Western印迹。1道，亲本pCEP4表达载体细胞系；2道，F1.Fc载体细胞系；3道，CT.Fc细胞系。
图14在大肠杆菌中表达人OPG。A构建细菌表达载体。用PCR扩增人OPG的LORF，然后与寡核苷酸接头片段(顶链是SEQ ID NO137)相连，接着连接到pAMG21载体DNA中。所得的载体能够表达与N末端Met残基相连的OPG32-401残基。B未诱导的和诱导的含pAMG21-人OPG-32-410质粒的细菌的SDS-PAGE分析。道1MW标准；道2未诱导的细菌；道330℃保温；道437℃保温；道5来自37℃保温的全细胞溶解产物；道6全细胞溶解产物的可溶组分；道7全细胞溶解产物的不可溶组分；道8从全细胞溶解产物得到的纯化的包含体。
图15用SDS-PAGE和Western印迹分析在CHO细胞中生产的重组鼠OPG。将等量的CHO条件培养基用于表明的各道，是通过用还原样品缓冲液(左道)或非还原样品缓冲液(右道)处理制备的。电泳后，将分辨的蛋白转移到尼龙膜上，然后用抗-OPG抗体检测。用箭头标明了OPG55kd单体和100kd二聚体形式的相对位置。
图16 CHO细胞中生产的重组鼠OPG的脉冲追踪分析。用35S-Met/Cys脉冲标记CHO细胞，然后按标明的时间追踪。将代谢标记的培养物分成条件培养基和细胞，然后用去污剂抽提，澄清，然后用抗-OPG抗体免疫沉淀。用SDS-PAGE分辨免疫沉淀物，然后暴露胶片。上面的左右道；在非还原条件下分析的样品。靠下的左右道；在还原条件下分析的样品。顶和底部的左道；细胞提取物。顶和底部的右道；条件培养基提取物。箭头表示OPG 55kd单体和100kd二聚体形式的相对迁移率。
图17在CTLL-2细胞系中表达OPG。制备浓缩来自CTLL-2和CHO-mu OPG[1-401]转染细胞的无血清条件培养基，然后用非还原SDS-PAGE和Western印迹分析。左道CTLL-2条件培养基。右道CHO-muOPG条件培养基。箭头表示OPG 55kd单体和100kd二聚体形式的相对迁移率。
图18检测在从对照和OPG转基因小鼠中得到的血清样品和肝提取物中OPG的表达情况。按照实施例4中所述构建转基因小鼠。用抗-OPG抗体在SDS-PAGE，然后用Western印迹肉眼观测OPG表达。
图19 huOPG[22-401]-Fc融合蛋白体外对破骨细胞形成的影响。在没有(对照)或存在标明量huOPG[22-401]-Fc融合蛋白的情况下，按照实施例11A中所述完成破骨细胞形成试验。通过酒石酸磷酸酶(TRAP)的组织化学染色观察破骨细胞形成。A加入100ng/ml的OPG。D加入0.1ng/ml的OPG。E加入0.01ng/ml的OPG。F加入0.001ng/ml的OPG。G；对照，不加OPG。
图20随OPG量的增加，破骨细胞培养物中的TRAP活性降低。将标明浓度的huOPG[22-401]-Fc融合蛋白加到破骨细胞形成试验中，按照实施例11A所述确定TRAP活性。
图21 OPG对破骨细胞分化后期的影响。在破骨细胞成熟中期(5-6天；OPG-CTL)或在破骨细胞成熟晚期(7-15天；CTL-OPG)将huOPG[22-401]-Fc融合蛋白加到破骨细胞形成试验中。确定TRAP活性，然后与没有OPG(CTL-CTL)或始终存在OPG(OPG-OPG)的条件下观察的活性进行比较。
图22 IL-1β，IL-1α和OPG对小鼠中血离子钙的影响。在分别单独注射了IL-1β，IL-1α，IL-1β加muOPG[22-401]-Fc，IL-1α加muOPG[22-401]-Fc和单独注射muOPG[22-401]-Fc后监测血离子钙的水平。对照小鼠只注射磷酸盐缓冲液。A中为IL-1B试验；B中为IL-1α试验。
图23在对照和IL1处理的小鼠中，OPG对颅骨破骨细胞的影响。在实施例11B中描述了分析小鼠颅骨骨样品的组织学方法。每天注射4次PBS的小鼠(A)，每天注射一次IL-1和三次PBS的小鼠(B)，每天注射一次PBS和三次OPG的小鼠(G)，每天注射一次IL-1和三次OPG的小鼠的颅骨样品。
图24在正常小鼠骨髓腔中骨积累的射线照相分析。给小鼠皮下注射盐(A)或注射14天muOPG[22-401]-Fc融合蛋白(5mg/kg/d)(B)，然后按照实施例11C所述确定骨密度。
图25正常小鼠骨髓腔中骨积累的组织形态测量分析。按照实施例11C所述完成注射试验和骨组织学。
图26正常小鼠骨髓腔中骨积累的组织学分析。按照实施例11C所述完成注射试验和骨组织学。A盐注射；B注射muOPG[22-401]-Fc融合蛋白。
图27施用的OPG对卵巢切除大鼠的活性。在所述两星期的试验中，降低骨密度的倾向因OPG或其它抗吸收治疗而被阻断。在卵巢切除时和在治疗后的1和2星期取DEXA测量值。结果表示为从起始骨密度变化的％(平均值+/-SEM)。
图28用组织形态测量法测量，在卵巢切除的大鼠(OVX)中倾向于比卵巢切除后17天的人假手术动物(SHAM)的股骨骺端的骨密度低。该作用可以用OPG-Fc阻断，用OPG-Fc处理的卵巢切除大鼠(OVX+OPG)比载体处理的卵巢切除的大鼠(OVX)有显著高的骨密度。(平均值+/-SEM)。
发明详述肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的新成员被鉴定为从胎大鼠肠cDNA文库分离的表达的序列附属物(tag)(EST)。按照实施例1和6中所述确定全长大鼠cDNA克隆和相应的小鼠人cDNA克隆的结构。大鼠、小鼠和人基因分别列于图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEQID NO122)，和9C-9D(SEQ ID NO124)。所有这三个序列均与TNFR家族成员的细胞外结构极为相似。没有一个分离的全长cDNA克隆编码预期是用于膜结合受体的跨膜和胞质结构域，表明这些cDNA编码可溶的分泌型蛋白，而不是细胞表面受体。图9D中所示的跨1200-1353核苷酸的部分人基因已于1995年11月22日保藏在Genebank数据库中，登记号为17188769。
按照实施例2所述确定大鼠和人mRNA的组织分布。在大鼠中，在肾，肝，胎盘和心中检测mRNA表达，结果在肾中的表达最高。还检测了在骨骼肌和胰腺中的表达。在人中，在相同的组织以及淋巴结，胸腺，脾和阑尾中检测了表达情况。
用肝特异性ApoE启动子表达系统，在转基因小鼠中表达大鼠cDNA(实施例3)。表达分析表明，骨密度，特别是长骨(股骨)，脊椎和平骨(骨盆)的骨密度有显著增加。有严重骨质疏松症的骨染色切片的组织学分析(实施例4)表明在骨形成和吸收之间有明显的不平衡，这会导致骨和软骨的积累。在OPG表达动物骨中小梁破骨细胞数量的降低表明TNFR-相关蛋白的大部分活性是为了抑制骨吸收，一种由破骨细胞介导的过程。从在转基因表达者中的活性看，将本文描述的TNFR相关蛋白称为OPG。
用大鼠cDNA序列，分离小鼠和人cDNA克隆(实施例5)。在实施例7和8中描述了在293细胞中表达小鼠OPG，在大肠杆菌中表达人OPG。将小鼠OPG生产成Fc融合蛋白，用蛋白A亲和层析纯化。在实施例7中还描述了在CHO和293细胞中将全长和截短的人和小鼠OPG多肽表达为于人IgG1 Fc区的融合多肽或非融合多肽。在实施例8中描述了在大肠杆菌中将全长和截短人和小鼠OPG表达为Fc融合多肽或非融合多肽。在实施例10中描述了纯化重组生产的哺乳动物和细菌OPG。
用体外破骨细胞成熟试验，白细胞介素-1(IL-1)诱导的高血钙的体内模型，和正常小鼠中的骨密度的注射研究来确定OPG的生物活性(参见实施例11)。通过在大肠杆菌破骨细胞中的成熟试验确定下列在CHO或293细胞中生产的OPG重组蛋白muOPG[22-185]-Fc，muOPG[22-194]-Fc，muOPG[22-401]-Fc，muOPG[22-401]，huOPG[22-201]-Fc，huOPG[22-401]-Fc。在CHO细胞中生产的muOPG[22-180]-Fc和大肠杆菌中生产的huOPG met[32-401]在体外试验中没有活性。
将来自几种来源的OPG制备成二聚体，而且在某种程度上作为高多聚体。当在非还原SDS凝胶上分析时，在转基因小鼠中生产的大鼠OPG[22-401]，在CHO细胞中作为重组多肽生产的muOPG[22-401]和huOPG[22-401]以及来自细胞毒T细胞系，作为天然产物表达的OPG大部分是二聚体和三聚体(参见实施例9)。在氨基酸186-401区有缺失的截短的OPG多肽(如OPG[1-185]和OPG[1-194])主要是单体，表明186-401区可能与OPG多肽的自身相连有关。然而，在大肠杆菌中生产的huOPG met[32-401]大部分是单体。
OPG在调节骨吸收中是很重要的。该蛋白可能是作为TNF家族的可溶性受体，而且可以抑制溶骨途径中受体-配体的相互作用。调节的一个方面看来是降低破骨细胞的数量。
核酸本发明提供了分离的核酸，所述核酸编码具有至少一种OPG生物活性的多肽。如本文所述，OPG的生物活性包括但不限于，涉及骨新陈代谢的任何活性，特别是包括增加骨密度。本发明的核酸选自下列a)如图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEO ID NO122)，和9C-9D(SEQ ID NO124)中所示的核酸序列或其互补链；b)在严紧条件下，与图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEQ ID NO122)，和9C-9D(SEQ ID NO124)中的多肽编码区杂交的核酸；和c)在严紧条件下，与图1A中所示的核苷酸148-337杂交的核酸。
d)与(a)和(b)中的序列简并的核酸序列。
本发明提供了编码大鼠，小鼠和人OPG的核酸以及与编码多肽的序列杂交的核酸序列，所述多肽具有至少一种OPG生物活性。还提供了与包括图1A所示148-337核苷酸的大鼠OPG EST杂交的核酸。杂交条件主要是说明书实施例1中描述的高严紧度条件如5xSSC，50％甲酰胺和42℃。通过调节盐和有机溶剂浓度和温度很容易得到与这些条件相等的严紧度。(b)中的核酸包括编码OPG-相关多肽的序列，所示多肽与TNF受体超家族的其它已知成员没有可检测的杂交。在优选的实施方案中，所述核酸是图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEQ ID NO122)，和9C-9D(SEQ ID NO124)所示的。
本发明杂交核酸的长度是可变的，因为杂交可以发生在部分或全部图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEQ ID NO122)，和9C-9D(SEQ ID NO124)所示的多肽-编码区中，而且还可发生在相邻的非编码区。因此，杂交核酸可以是图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEQ ID NO122)，和9C-9D(SEQ ID NO124)所示序列的截短部分或延伸部分。本发明包括截短的或延伸的核酸，只要它们保留了一种或多种OPG的生物活性。杂交核酸还包括是OPG编码区的5’和/或3’的相邻的非编码区。非编码区包括与OPG表达有关的调节区，如启动子，增强子，翻译启始位点，转录终止位点等。
Sambrook等人，分子克隆实验室操作手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)中描述了核酸的杂交条件。
在质粒pMO-B1.1中提供了编码大鼠OPG的DNA，该质粒于1995年12月27日保藏于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，保藏号为69970。在质粒pRcCMV-鼠OPG中提供了编码大鼠OPG的DNA，该质粒于1995年12月27日保藏于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，保藏号为69971。在质粒pRcCMV-人OPG中提供了编码大鼠OPG的DNA，该质粒于1995年12月27日保藏于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，保藏号为69969。本发明核酸在严紧条件下，与ATCC69969，69970和69971的DNA插入片段杂交并且有至少一种OPG生物活性。
本发明还提供了图2B，9A和9B所示核酸序列的衍生物。如本文所用的，衍生物包括含有一个或多个残基的添加，替换，插入或缺失的核酸序列，以便所得序列编码具有已经添加，缺失，插入或替换了一个或多个氨基酸残基的多肽，而且所得多肽具有OPG活性。核酸衍生物可以是天然的，如通过剪接变异或多态型，或可以用本领域专业人员可使用的定点诱变技术来构建。OPG天然变异体的一个实例是编码前导序列内位置3的Lys变成Asn的核酸(参见实施例5)。认为核酸衍生物编码至少可能破坏生物活性的分子区内的氨基酸改变。其它衍生物包括编码具有图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEQ ID NO122)，和9C-9D(SEQ ID NO124)所示细胞外结构域和跨膜及胞质结构域之OPG膜-结合形式的核酸。
在一实施方案中，OPG衍生物包括编码从羧基末端缺失了一个或多个氨基酸之OPG的截短形式的核酸。编码OPG的核酸从羧基末端缺失了1-216氨基酸。可选地，抗体Fc区可从新羧基末端延伸以产生有生物活性的OPG-Fc融合多肽(见实施例11)。在优选的实施方案中，核酸编码含有22-185，22-189，22-194或22-201残基(用在图9E-F中的编号)的氨基酸序列，而且可选地，编码人IgG的Fc区。
本发明还包括编码OPG截短形式的核酸，所述OPG截短形式从氨基末端缺失了一个或多个氨基酸。截短形式包括没有部分或所有含前导肽的21个氨基酸。另外，本发明提供了编码缺失了成熟氨基末端(残基22)的1-10氨基酸，和可选地，从羧基末端(在残基401)缺失了1-216氨基酸之OPG的核酸。可选地，所述核酸可以编码氨基末端的甲硫氨酸残基。在实施例8中描述了所述OPG截短多肽的实例。
本发明核酸的实例包括cDNA，基因组DNA，合成的DNA和RNA。cDNA得自从mRNA制备的文库，所述mRNA是从表达OPG的各种组织中分离的。在人中，OPG的组织源包括肾，肝，胎盘和心。编码OPG的基因组DNA是从来自不同种的市售基因组文库中得到的。合成DNA是通过化学合成重叠寡核苷酸片段，然后组装所述片段以重建部分或全部编码区和侧序列而得到的(见美国专利4695623描述了化学合成干扰素基因)。RNA通过指导高水平合成mRNA的原核表达载体最易得到，如用T7启动子和RNA聚合酶的载体。
本发明的核酸序列用于检测生物样品中的OPG以便确定哪种细胞或组织表达OPG mRNA。还可以用所述序列筛选与OPG有关之序列的cDNA和基因组文库。用适当的杂交条件以检测同源序列，所述筛选在本领域专业人员的能力范围之内。所述核酸还用于通过反义疗法或基因治疗来调节OPG的表达水平。所述核酸还用于转基因动物的发育，所述动物用于生产多肽或进行生物活性研究(见实施例3)。
载体和宿主细胞本发明还提供了含编码OPG之核酸序列的表达载体，用所述载体转化的宿主细胞和用于生产OPG的方法。在酶学方法，185卷，Goeddel，D.V.编，学术出版社(1990)中可以找到重组蛋白表达方面的综述。
用于生产OPG的宿主细胞包括原核宿主细胞(如大肠杆菌〕，酵母，植物，昆虫和哺乳动物宿主细胞。大肠杆菌菌株如HB101或JM101适用于表达。优选的哺乳动物宿主细胞包括COS，CHOd-，293，CV-1，3T3，幼仓鼠肾(BHK)细胞和其它细胞。当翻译后修饰，如糖基化和多肽加工对于OPG活性很重要时，哺乳动物宿主细胞是优选的。哺乳动物表达使得可以生产可从生长培养基中回收的分泌型多肽。
用于表达OPG的载体含载体增殖和克隆插入片段表达所需的最少序列。这些序列包括复制源点，选择性标记，启动子，核糖体结合位点，增强子序列，RNA剪接位点转录终止位点。很容易得到适用于在上述宿主细胞中表达的载体，用标准DNA技术将本发明的核酸插入到所述载体中。还包括组织特异性表达OPG的载体。所述载体包括在小鼠的肝，肾或其它器官中特异性发挥功能的启动子，以及用于在靶人细胞中表达OPG的病毒载体。
使用适当的宿主-载体系统，在生产OPG的条件下，通过培养用含有编码OPG之核酸序列的表达载体转化的宿主细胞，然后分离表达产物，可以重组生产OPG。在转染哺乳动物细胞的上清液或在转化细菌宿主细胞的包含体中生产OPG。用下文描述的本领域专业人员熟知的方法可以纯化所生产的OPG。在实施例7和8中描这了在哺乳动物和细菌宿主系统中表达OPG。举证性的哺乳动物表达载体是质粒，例如在PCT申请09/14363中描述的pDSRα。举证性的用于细菌宿主细胞的表达载体是在实施例8中描述的质粒pAMG21和pAMG22-His。已将质粒pAMG21于1996年7月24日保藏在美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，保藏号为98113。已将质粒pAMG22-His于1996年7月24日保藏在美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，保藏号为98112。认为所描述的具体质粒和宿主细胞是用于说明目的的，也可以使用其它可得到的质粒和宿主细胞以表达所述多肽。
本发明还提供了通过体内或间接体内重组以调节来自宿主染色体的OPG，从而从内源核酸表达OPG。还包括通过导入能够指导从内源OPG编码区生产OPG的外源调节序列(如启动子或增强子)而表达OPG。本发明还提供了刺激能够指导OPG生产的内源调节序列的方法(例如通过暴露于转录增强因子)。
多肽本发明提供了OPG，TNF受体超家族的一个新成员，具有与骨新陈代谢相关的活性，特别是具有抑制骨吸收，由此增加骨密度的活性。OPG指含有小鼠，大鼠或人OPG之氨基酸序列的多肽或其具有至少一种OPG生物活性的衍生物。大鼠，小鼠和人OPG的氨基酸序列分别列于图2B-2C(SEQ ID NO121)，9A-9B(SEQ ID NO123)和9C-9D(SEQID NO125)。OPG的衍生物指有一个或多个氨基酸添加，缺失，插入或取代以便所得多肽有至少一种OPG生物活性。OPG的生物活性包括但不限于与骨代谢有关的活性。优选所述多肽除去了21个氨基酸的氨基末端前导序列。
本发明的OPG多肽包括大鼠[1-401]，大鼠[22-180]，大鼠[22-401]，大鼠[22-401]-Fc融合蛋白，大鼠[1-180]-Fc融合蛋白，小鼠[1-401]，小鼠[1-180]，小鼠[22-401]，人[1-401]，小鼠[22-180]，人[22-401]，人[22-180]，人[1-180]，人[22-180]-Fc融合蛋白和met-32-401。氨基酸编号按照SEQ IDNO121(大鼠)，SEQ ID NO123(小鼠)和SEQ ID NO125(人)中所示。还包括OPG180-401的部分或全部氨基酸残基有缺失或羧基末端截短的；180-401残基中有一个或多个残基改变的；缺失了部分或全部Cys-富集结构域，特别是缺失了末端(羧基末端)Cys-富集结构域；和在Cys-富集结构域，特别是末端(羧基末端)Cys-富集结构域的氨基酸有一个或多个改变的多肽衍生物。在一实施方案中，OPG从羧基末端缺失了1-约216个氨基酸。在另一实施方案中，OPG从成熟氨基末端缺失了约1-10个氨基酸(其中成熟氨基末端在22残基)，而且可选地，从羧基末端缺失了1-约216个氨基酸。
本发明包括的其它OPG多肽包括人[22-180]-Fc融合蛋白，人[22-201]-Fc融合蛋白；人[22-401]-Fc融合蛋白，小鼠[22-185]-Fc融合蛋白，小鼠[22-194]-Fc融合蛋白。这些多肽是在哺乳动物宿主细胞中生产的。在原核宿主细胞中表达的，本发明包括的其它OPG多肽是人met[22-401]，Fc-人met[22-401]融合蛋白(按照实施例8所述，Fc区在全长OPG的氨基末端融合)，人met[22-401]-Fc融合蛋白(Fc区与全长OPG序列融合)，Fc-小鼠met[22-401]融合蛋白，小鼠met[22-401]-Fc融合蛋白，人met[27-401]，人met[22-185]，人met[22-189]，人met[22-194]，人met[22-194](P25A)，人met[22-194](P26A)，人met[27-185]，人met[27-189]，人met[27-194]，人met-arg-gly-ser-(his)6[22-401]，人met-lys[22-401]，人met-(lys)3-[22-401]，人met[22-401]-Fc融合蛋白(P25A)，人met[22-401](P25A)，人met[22-401](P26A)，人met[22-401](P26D)，小鼠met[22-401]，小鼠met[27-401]，小鼠met[32-401]，小鼠met[27-180]，小鼠met[22-189]，小鼠met[22-194]，小鼠met[27-189]，小鼠met[27-194]，小鼠met-lys[22-401]，小鼠HEK[22-401](A45T)，小鼠met-lys-(his)7-[22-401]，小鼠met-lys-[22-401]-(his)7，和小鼠met[27-401](P33E，G36S，A45P)。应当理解，在原核宿主细胞中生产的上述OPG多肽在氨基末端有一甲硫氨酸残基，如果未说明所述残基的话。在具体的实施例中，用人IgG1-γ1的227个氨基酸区生产OPG-Fc融合蛋白，所述IgG1-γ1具有Ellison等人(核酸研究，10，4071-4079(1982))所示的序列。然而也可使用人IgG Fc区的变异体。
分析与人IgG1 Fc区融合的羧基末端OPG截短物的生物活性表明约164个氨基酸的OPG部分是活性所必需的。该区包含氨基酸22-185，优选在图9C-9D(SEQ ID NO125)中的那些，而且含有四个Cys富集结构域，所述结构域是TNFR细胞外结构域的特征Cys富集结构域。
利用OPG与TNF受体家族成员细胞外配体结合结构域之间的同源性，根据已知TNFR-I细胞外结构域的晶体结构得到OPG的一个三维模型(见实施例6)。用该模型鉴定OPG内，对生物活性很重要的那些残基。鉴定了与保持四个Cys-富集结构域的结构有关的Cys残基。在该模型中鉴定了下列二硫键结构域1cys41-cys54，cys44-cys62，tyr23和his66可以稳定该结构域的结构。结构域2cys65-cys80，cys83-cys98，cys87-cys105；结构域3cys107-cys118，cys124-cys142；结构域4cys145-cys160，cys166-cys185。还鉴定了如图11和12A-12B中显示的，接近TNFβ的氨基。在该模型中，设想OPG与相应的配体结合；用TNFβ作为模型配体以刺激OPG与其配体的相互作用。以该模型为基础，OPG中的下列残基对于配体结合是很重要的glu34，lys43，pro66-gln91(特别是pro66，his68，tyr69， tyr70，thr71，asp72，ser73，his76，ser77，asp78，glu79，leu81，tyr82，pro85，val86，lys88，glu90和gln91)，glu153和ser155。
这些氨基酸残基的改变，单个的或组合的，都会改变OPG的生物活性。例如同源性cys残基的改变可以改变一个cys富集结构域的结构，而改变对于配体结合很重要的残基可以影响OPG与配体的生理学作用。结构模型有助于鉴定有更合理特性，如生物活性增强，更稳定或更容易形成的类似物。
本发明还提供由OPG单体组成的多聚体。OPG作为多聚体(如二聚体，三聚体或有更高的单体数目的)是有活性的。优选OPG是二聚体或三聚体。OPG多聚体可含有具有足以启动多聚体形成的OPG氨基酸序列的单体，或可以含有具有异源序列，如抗体Fc区的单体。OPG的羧基末端缺失分析表明至少部分186-401区与OPG多肽有关。本发明还包括用能够自我相连的氨基酸序列取代部分或全部OPG氨基酸186-401区。另外，通过定点诱变可以修饰OPG多肽或其衍生物以得到不配对的cys残基，所述cys残基通过光化学交联如暴露于紫外光，或通过与双功能接头分子如双功能聚乙二醇等化学交联而形成链间二硫键以形成二聚体或多聚体。
本发明包括OPG多肽的修饰，并包括翻译后修饰(如N-连接或O连接的碳水化合物链，N末端或C末端加工)，将化学基元连于氨基酸骨架上，N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰，以及由于原核宿主细胞表达而在N末端增加了甲硫氨酸残基。还可用可检测标记，如酶，荧光，同位素或亲和标记修饰所述多肽以检测并分离所述蛋白。
OPG的进一步修饰物包括其中OPG与并源氨基酸序列融合的嵌合蛋白。异泊序列可以是使所得融合蛋白保持OPG活性的任何序列。异源序列包括例如免疫球蛋白融合蛋白，如Fc融合蛋白，这样有助于纯化所述蛋白。促进OPG单体形成二聚体和三聚体和其它高聚形式的异源序列是优选的。
将本发明多肽与组织，细胞系和表达OPG的转化宿主细胞内存在的其它多肽分离并进行纯化，或从含分泌蛋白的细胞培养物内的组分中纯化。在一实施方案中，所述多肽不含其它人蛋白，如细菌宿主细胞的表达产物。
本发明还提供有其它优点(如稳定性提高和多肽循环时间延长或免疫原性降低〕的化学修饰的OPG衍生物(见美国专利4179337)。用于衍生的化学基元可以选自水溶性聚合物，如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇等。可以在分子内的随机位置，或在分子内预定的位置修饰所述多肽，而且可包含一个，二个，三个或更多相连的化学基元。
聚合物可以是任何分子量的，而且可以是支链或直链的。对于聚乙二醇，优选的分子量在约1kDa到约100kDa之间(术语“约”表示在聚乙二醇的制备中，有些分子比标明的分子量重，有些轻)以便于处理和操作。根据所需的治疗方式(如所需的持续释放期，影响，如果对生物活性有影响的话，处理的容易程度，抗原性或没有抗原性以及聚乙二醇对治疗蛋白或类似物的其它已知影响)可以使用其它大小的分子。
聚乙二醇分子(或其它化学基元)应考虑对蛋白功能或抗原结构域的影响而与所述蛋白相连。本领域专业人员有许多连接方法，如EP0401384(引入本文作为参考)(将PEG与G-CSF相连)，见Malik等人Exp.Hematol.201028-1035(1992)(报告了使用tresyl chloride的GM-CSF聚乙二醇化)。例如可以经反应基团，如游离氨基或羧基，通过氨基酸残基共价结合聚乙二醇。反应性基团是可以结合活化聚乙二醇分子的那些基团。含有游离氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；含有游离羧基的基团可包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。也可以用巯基作为反应性基团用于连接聚乙二醇分子。对于治疗优选的是在氨基上连接，如在N末端或赖氨酸基团上相连。
人们可以特异性地得到N末端化学修饰的蛋白。用聚乙二醇作为本发明组合物的例示，人们可以选择各种聚乙二醇分子(非离子，支链等)，聚乙二醇分子与蛋白(或肽)分子在反应混合物中的的比例，待完成的聚乙二醇化类型，得到所选N末端聚乙二醇化蛋白的方法。得到N末端聚乙二醇化蛋白制剂的方法(即如果需要将该部分与其它单聚乙二醇化基元分开)可以是通过从聚乙二醇化蛋白分子群中纯化N末端聚乙二醇化蛋白。通过反应性烷基化可以选择性化学修饰N末端，这是利用在特定蛋白中，不同类型一伯氨基基团(赖氨酸对N末端)的不同反应性。在适当的反应条件下，可以用含聚合物的羧基在N末端，基本上选择性地衍生所述蛋白。
通过各种化学交联方法可以制备合成的OPG二聚体。可以以保持或增强OPG生物活性的方式连接OPG单体。根据所需蛋白二聚体的特性，可以使用不同的化学交联剂。交联剂例如可以是短和相对刚性的，或较长而更柔软的，可以是生物学可逆转的，而且可以提供降低的免疫原性或更长的药物动力学半衰期。
在一实施例中，用两步合成法，通过氨基末端连接OPG分子(见实施例12)。在第一步中，化学修饰OPG的氨基末端以导入被保护的硫醇，被保护的硫醇在纯化后去保护，用作通过不同交联剂与第二个OPG分子点特异性相连的点。氨基末端交联包括，但不限于二硫键，使用短链的硫醚键，双功能两性交联剂，和可变长度硫醚键，双功能聚乙二醇交联剂(PEG“哑铃”)。通过PEG哑铃合成OPG二聚体还包括所述合成的副产物，称为“单铃(monobell)”。一个OPG单铃由与具有游离聚合物末端的线性双功能PEG结合的单体组成。另外，通过胺特异性同双功能交联技术，可以直接交联OPG，所述交联技术包括试剂例如二亚乙基三胺五乙酸二酐(DTPA)，对苯醌(pBQ)或双(代硫琥珀酰亚氨基〕辛二酸(BS3)以及本领域已知的其它试剂。还可以用试剂，例如亚氨基硫代戊环，在存在不同双功能硫醇特异性交联剂，如PEG双马来酰亚胺的条件下直接硫醇化OPG，从而在一步中得到二聚和/或哑铃状产物。
还包括从天然源和转染的宿主细胞中纯化OPG的方法。纯化方法可以使用一个或多个适当顺序的标准蛋白纯化步骤以得到纯化的蛋白。层析步骤可包括离子交换，凝胶过滤，疏水作用，反相，色谱聚焦(chromatofocusing)，用抗OPG抗体的亲和层析或生物素-链霉抗生物素蛋白亲和复合物等。
抗体本发明还包括特异性结合OPG的抗体。用于产生抗体的抗原可以是全长多肽或跨OPG序列一部分的肽。产生与OPG反应的多克隆或单克隆抗体的方法是本领域专业人员熟知的(参见例如Harlow和Lane，抗体实验室手册，冷泉港，实验室出版社，冷泉港纽约(1988))。用标准酶联免疫吸附试验表征所产生抗体的结合特异性和表位识别。抗体还包括含有衍生于不同种的可变和恒定结构域的嵌合抗体。在一实施方案中，嵌合抗体是具有鼠可变结构域和人恒定结构域的人化抗体。还包括移植到人骨架的互补抗原决定区(称为CDR移植的抗体)。用本领域专业人员熟知的方法可以通过重组制备嵌合和CDR移植的抗体。包括在小鼠制备的人抗体。
可以用本发明的抗OPG抗体作为亲和试剂，从生物学样品中纯化OPG(见实施例10)。用一种方法，可将抗体固定于CnBr-激活的Sepharose上，然后用抗体-Sepharose结合物的柱从液体样品中取出OPG。还可用抗体作为诊断试剂以用下述方法检测生物学样品中的OPG并确定其含量。
药物组合物本发明还提供了含治疗有效量的本发明多肽以及可药用稀释剂，载体，增溶剂，乳化剂，防腐剂和/或佐剂的药物组合物。术语“治疗有效量”指对特定的击靶和施用途径可产生治疗效果的量。所述组合物可以是液体或冻干形式，并含有有不同pH和离子强度的稀释剂(Tris，乙酸盐或磷酸盐缓冲液)，增溶剂，如吐温或聚山梨糖醇、载体，如人血清白蛋白或明胶，防腐剂，如硫柳汞或苄醇，和抗氧化剂如抗坏血酸或焦亚硫酸钠。还包括含有用水溶性聚合物修饰的OPG以提高溶解度或稳定性。组合物还可将OPG掺入到脂质体，微乳剂或胶粒或载体中，以在延长的时间内控制其传递。具体地说，OPG组合物可包括掺入聚合物基质如水凝胶、硅氧烷、聚乙烯、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物或生物可降解聚合物。水凝胶的实例包括多羟基烷基异丁烯酸酯(p-HEMA)，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇和各种聚电解质复合物。生物可降解聚合物包括聚乳酸(PLA)，聚乙醇酸(PGA)，PLA和PGA的共聚物，聚酰胺和聚酰胺和聚酯的共聚物。其它可控制释放制剂包括微胶囊，微球，大分子复合物和可通过注射施用的聚合珠。
特定组合物的选择取决于许多因素，包括待治疗的疾病，施用途径和所需的药物动力学参数。在Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thed.A.R.Gennaro，ed，Mack，Easton，PA(1980)中可以找到适用于药物组合物的更详细的组分综述。
通过注射、皮下、静脉内或肌肉内，或通过口服、鼻、肺或直肠施用本发明组合物。最终所选的施用途径取决于许多因素，而且是本领域专业人员可以确定的。
本发明还提供含治疗有效量本发明核酸和可药用佐剂的药物组合物。核酸组合物适用于将部分或全部OPG编码区传递给细胞和组织，作为反义或基因治疗方案的一部分。
治疗方法骨组织给身体提供支持并由矿物质(大量的钙和磷)，胶质和非胶质蛋白基质和细胞组成。在骨中发现的细胞类型，骨细胞，成骨细胞和破骨细胞，均与骨连续形成并吸收的动态过程有关。成骨细胞促进骨组织的形成，而破骨细胞与吸收有关。与骨形成相比，骨基质和矿物质的吸收或溶剂是一个快速有效的过程，而且可以从骨中释放大量的矿物质。破骨细胞调节骨骼组织的正常重建，并且与激素诱导的吸收有关。例如，通过分泌甲状旁腺激素应答细胞外体液中钙离子浓度的降低可以刺激吸收。相反，降钙素的主要功能是抑制吸收。另外，维生素D的代谢也改变骨对甲状旁腺和降钙素的反应。
在骨骼成熟后，骨骼中的骨量反映了骨形成和骨吸收之间的平衡(或不平衡)。骨骼成熟后，四十岁之前，骨量达到峰值。在四十和五十岁之间，平衡发生移动，骨吸收开始占上锋。随着年龄的增加，骨量的减少不可避免，在女性中比在男性中开始的更早，而且在有些女性中，绝经后明显加速(主要是高加索和亚洲血统的人)。
骨质稀少是一种主要与骨量降低到正常水平下有关的疾病。这种疾病产生于骨合成率的降低或骨破坏率的增加或两者同时。骨质稀少的最常见形式主要是骨质疏松症，也称为绝经后和老年骨质疏松症。骨质疏松症的这种形式是随年龄增加骨大量流失的结果，而且通常是与骨形成的正常速率相比，骨吸收增加的结果。在美国，约25-30％的白人女性有骨质疏松症的症状。在45岁和年龄更大的妇女中，骨质疏松症和髋骨，股骨，颈和转子间骨折之间有直接关系。在50-70岁之间的男性中也有骨质疏松症的症状，但这种病主要影响女性。
绝经和老年骨质疏松症的原因尚不清楚。已经确定了一些可能导致这种疾病的因素。它们包括随年龄增加的激素水平改变，因肠的钙和其它矿物质吸收减少而使可供消耗的钙不足。治疗通常包括激素治疗或食物补充以延缓该过程。但是，迄今为止，尚没有一种有效治疗钙损失的方法。
本发明用治疗有效量的OPG提供了治疗骨疾病的方法。骨疾病可以是任何以净骨损失为特征的疾病(骨质稀少或骨溶解)总之，当需要抑制骨吸收率时，用OPG治疗是可行的。因此，若吸收率高于正常时可以进行治疗以降低骨吸收率，或使骨吸收降到正常以下以补偿低于正常的骨形成水平。
可用OPG治疗的疾病包括如下骨质疏松症，如原发性骨质疏松症，内分泌骨质疏松症(甲状腺功能亢进，甲状旁腺功能亢进，库兴氏综合征和肢端肥大症)，遗传性和先天形成的骨质疏松症(成骨不全，高胱氨酸尿症，卷发症和家族性植物神经功能异常综合征)和因肢端固定而引起的骨质疏松症。
成人和青少年中的变形性骨炎(畸形性骨炎)。
骨髓炎，或骨的感染性损伤而导致的骨损伤。
因实质肿瘤(胸腺，肺和肾)和血液恶性病(多发性骨髓瘤，淋巴瘤和白血病)而引起的高血钙，特发性高血钙和与甲状腺功能亢进和肾功能失调相关的高血钙。
手术后，由施用类固醇诱发的、并与小肠和大肠失调以及慢性肝和肾病相关的骨质稀少。
与创伤损伤或与葡糖脑苷脂病，镰状细胞贫血，全身性红斑狼疮和其它疾病相关的非创伤坏死相关的骨坏死或骨细胞死亡。
因类风湿性关节炎引起的骨损失。
牙周骨损失。
溶骨转移瘤。
应理解可以单独或与其它因子结合使用OPG以用于治疗骨失调。在一实施方案中，osteoprotegerein与治疗有效量的刺激骨形成的因子结合使用。所述因子包括，但不限于被称为BMP-1到BMP-12的骨形态形成因子，转化生长因子-β(TGF-β)和TGF-β家族的成员，白细胞介素-1抑制剂，TNFα抑制剂，甲状旁腺激素和其类似物，甲状旁腺相关蛋白和其类似物，E系列的前列腺素，二磷酸化物(例如alendronate等)和骨增强矿物质如氟化物和钙。
下列实施例是为了更全面地说明本发明，但不对其范围构成任何限制。
实施例1鉴定并分离大鼠OPG cDNA在Maniatis等人(同上文)的文献中描述了用于cDNA克隆和分析的材料和方法。使用PCR反应混合物(Biehringer-Mannheim)和制造商说明的引物浓度，用Perkin-Elmer9600热循环仪完成聚合酶链反应。总之，将25-50μl的反应物在94℃变性，然后于94℃5秒，50-60℃5秒，72℃3-5分钟，共20-40个循环。将反应物在72℃处理3-5分钟。然后按Maniatis等人(同上文)所述通过凝胶电泳分析反应物。
用从用于EST分析(Adams et al.，Science252，1651-1656(1991))的胚胎d20肠分离的mRNA构建cDNA文库。剥离大鼠胚胎，取出完整的正在发育的小肠和大肠，并用PBS洗涤。通过酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取(Chomczynski and Sacchi Anal.Biochem.162156-159(1987))纯化总细胞RNA。按照制造商说明的方法，通过吸附于并从DynabeadsOligo(dT)25(Dynal Corp)洗脱，而从总RNA制品中得到poly(A+)mRNA。用Superscript质粒系统(Gibco BRL，Gaithersburg，Md)制备随机引发的cDNA文库。用含内Not I限制位点的随机cDNA引物启始第一链的合成，所述引物含下列序列5’-AAAGGAAGGAAAAAAGCGGCCGCTACANNNNNNNNT-3’Not I(SEQ ID NO1)为了合成第一链，要组合三个不同的反应，含25μg的poly(A+)RNA和120ng，360ng或1080ng的随机引物。合成第二条链后，将反应产物分别与酚∶氯仿∶异戊醇(25∶25∶1)混合物提取，然后进行乙醇沉淀。将三个反应的双链(ds)cDNA产物组合并与下列双链寡核苷酸衔接头连接5’-TCGACCCACGCGTCCG-3’(SEQ ID NO 2)3’-GGGTGCGCAGGCp-5’(SEQ ID NO3)连接后，用NotI消化cDNA，然后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶25∶1)混合物提取，然后进行乙醇沉淀。按照制造商的说明，用预先制备的备有Superscript质粒系统(Gibco BRL，Gaithersburg，Md)，通过凝胶过滤按大小分级分离重悬的cDNA。收集含最大cDNA产物的两个级份，将其进行乙醇沉淀，然后定向连接到NotI和SalI消化的pMOB载体DNA(Strathmann et al.，1991)中。用电穿孔将连接的cDNA导入到感受态ElectroMAX DH10B大肠杆菌中(Gibco BRL，Gaithersburg，Md)。为了进行自动序列分析，将约10000个转化体铺在20cm×20cm含氨苄青霉素补充的LB培养基的琼脂板上。捡出生长出的菌落，然后排列到含200mlL-肉汤，7.5％甘油和50μg/ml氨苄青霉素的96孔微滴定板上。37℃使培养物生长过夜，用灭菌96针复制工具制备两组微滴定板，经两组均于-80℃贮存以用于进一步分析。为了克隆全长cDNA，将约1百万个转化体铺在各含约10000个克隆的96孔细菌氨苄青霉素板上。用Qiagen PlasmidMaxi试剂盒(Qiagen Corp.，Germany)分别分离来自各池的质粒DNA，然排列到96孔微滴定板中用于PCR分析。
为了测定随机胎大鼠肠cDNA克隆的序列，将甘油原种融解，用蒸馏水以1∶25稀释小样。将约3.0μl稀释的细菌培养物加到含下列寡核苷酸的PCR反应混合物(Boehringer-Mannheim)中5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO4)5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’(SEQ ID NO5)用下列循环条件，将反应物保温在热循环仪(Perkin-elmer9600)中94℃2分钟；30个循环的94℃5秒，50℃5秒，和72℃3分钟；然后72℃4分钟。在热循环仪中保温后，用2.0ml水稀释反应物。按照制造商说明的方法，用Centricon柱(Princeton Separations)进一步纯化扩增的DNA片段。按照制造商说明的方法，用T3引物(寡核苷酸353-23；5’-CAATTAACCCTCACTAAAGG-3’)(SEQ ID NQ6)Taq染料-终止反应物(Applied Biosystems)，在Applied Biosystems373A自动DNA测序仪上对PCR反应产物进行测序。
翻译从随机捡出的cDNA克隆得到的5’核苷酸序列，然后用改进的FASTA程序(Pearson et al.Meth.Enzymol.183，(1990))与现有已知蛋白序列数据库进行比较。用Gribskov等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，4355-4359(1987))，后由Luethy等人改进的(Protein Science3，139-146(1994))序列图谱方法，分析翻译的序列是否操作在所有已知肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员中发现的特异性Cys富集蛋白基元(Smith et al.，Cell76，959-962(1994))。
用FASTA和图谱检索数据，鉴定出EST，FRI-1(胎大鼠肠-1)可能是YNFR超家族的新成员。FRI-1含有约600bp的带有约150个氨基酸的LORF的插入片段。在数据库中，最接近的匹配是人TNFRII型(TNFR-2)。区比较表明在这150个氨基酸的LORF上，TNFR-2和FRI-1之间有～43％的同源性。用TNFR超家族的第一和第二Cys富集重复片段的图谱分析得到～8个Z记录，表明，FRI-1基因可能编码一个新的家族成员。为了推测FRI-1产物的结构，就全长克隆而筛选胎大鼠肠cDNA文库。下列寡核苷酸得自源FRI-1序列5’-GCATTATGACCCAGAAACCGGAC-3’(SEQ ID NO7)5’-AGGTAGCGCCCTTCCTCACATTC-3’(SEQ ID NO8)在PCR反应使用这些引物以筛选96池的质粒DNA，各池含来自10000个独立cDNA克隆的质粒DNA。在PCR反应混合物(Boehringer-Mannheim)中，用Perkin-Elmer96孔热循环仪，在下列条件下扩增约1μg的质粒池DNA94℃2分钟，1个循环；94℃15秒，然后65℃45秒，30个循环；65℃7分钟，1个循环。就预期的相关分子量而言，96个质粒DNA池中的13个有扩增的DNA产物。
用来自一阳性池的DNA转化上述感受态ElectroMAX大肠杆菌(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)。将约40000个转化体铺在无菌的硝酸纤维素滤纸(BA-85，Schleicher and Schuell)上，然后用32P-dCTP标记的上述PCR产物，通过菌落杂交来筛选。在5X SSC，50％去离子甲酰胺，5X Denhardt’s溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DAN中，将滤纸于42℃预杂交2-4小时。然后，在5X SSC，50％去离子甲酰胺，2XDenhardt’s溶液，0.1％SDS和100μg/ml变性鲑精DAN和～5ng/ml标记的探针中，将滤纸于42℃预杂交～18小时。然后在RT，用2X SSC洗涤滤纸10分钟，在55℃用1X SSC洗涤10分钟，最后，在55℃，用0.5X SSC洗涤10-15分钟。放射自显影后检测杂交的克隆，然后复制到硝酸纤维素滤纸上以进行二次筛选。在二次筛选后，分离一质粒克隆(pB1.1)，然后在含100μg/ml氨苄青霉素的L肉汤培养基中扩增，得到质粒DNA。将2.4kb pB1.1插入片段的两条链进行测序。
用pB1.1插入片段序列检索公共数据库以检测任何存在的序列匹配和/或相似性。尽管与人和小鼠TNFR-2基因有约45％的相似性，但未发现与任何已知基因或EST匹配。在核苷酸序列的124bp发现了Met启始密码子，其后为编码401个氨基酸残基的，终止于1327bp的LORF。预计所述401个氨基酸残基的产物在其N末端有约31个残基的疏水信号肽，和4个潜在的N-连接的糖基化位点。用Pepplot程序(Wisconsin GCG软件包，8.1版)没有鉴定出跨膜疏水序列。然后用推导的401个氨基酸的序列检索蛋白数据库。同样，不存在匹配，尽管似乎与TNFR超家族的许多成员，特别是人和小鼠TNFR-2有很强的相似性。用Pileup程序，然后通过PrettyPlot(Wisconsin GCG包，8.1版)修改，制备所述新蛋白与TNFR-超家族已知成员的序列排列。该排列表明，在全长FRI-1基因产物和所有其它TNFR家族成员之间显然有同源性。同源区标在TNFR家族成员的细胞外结构域，并相应于在这些蛋白的配体结合结构域中发现的3或4个Cys富集重复片段。这表明FRI-1基因编码一新TNFR家族成员。由于为检测到跨膜区，所以我们预测这可能是一分泌的受体，与TNFR-1衍生的可溶性受体(Kohno等，美国国家科学院进展87，8331-8335(1990))相似。由于FRI-1基因的显著生物活性(参看下文)，所以将该产物命名为促骨生长素(OPG)。
实施例2OPG mRNA在组织中的表达图谱用32P-dCTP标记的FRI-1PCR产物探测多种人组织的Northern印迹(Clonetech)以检测人转录本的大小并确定表达图谱。在5X SSC，50％去离子甲酰胺，5X Denhardt’s溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DAN中，将滤纸于42℃预杂交2-4小时。然后，在5X SSC，50％去离子甲酰胺，2X Denhardt’s溶液，0.1％SDS和100μg/ml变性鲑精DAN和～5ng/ml标记的探针中，将滤纸于42℃预杂交18-24小时。然后在RT，用2X SSC洗涤滤纸10分钟，在55℃用1X SSC洗涤10分钟，最后，在55℃，用0.5X SSC洗涤10-15分钟。
用衍生于大鼠基因的探针，在数种组织，包括肾，肝，胎盘和心中，检测有相应分子量为约2.4kb的显著的mRNA种。在肾中检测到最高水平。在骨骼肌和胰腺中检测到Mr为4.5和7.5kb的大mRNA种。在人胎儿组织中，发现肾中表达相对高水平的2.4kb mRNA。用人探针(参见下文)，只在这些相同的组织中检测到2.4kb转录本。另外，在淋巴结，胸腺，脾和阑尾中检测到相对高水平的2.4kb转录本。大鼠和人osteosprotegerin基因检测的转录本的大小与大鼠pB1.1 FRI-1插入片段的长度几乎相同，表明该插入片段是一全长cDNA克隆。
实施例3在转基因小鼠中全身输送OPG用大鼠OPG克隆pB1.1为模板，PCR扩增编码区，以便将所述编码区亚克隆到ApoE-肝特异性表达载体(Simonet等人，临床研究期刊，94，1310-1319(1994)和PCT申请No.US94/11675和共有的美国系列08/221,767)中。分别用下列5’和3’寡核苷酸引物进行PCR扩增5’-GACTAGTCCCACAATGAACAAGTGGCTGTG-3’(SEQ IDNO9)5’-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATGAAACAGCCCAGTGACC-ATTC-3’(SEQ ID NO10)按如下处理PCR反应混合物(Boehringer-Mannheim)94℃，1分钟，1个循环；94℃20秒，62℃30秒和74℃1分钟，25个循环。扩增后，在QiagenPCR柱上纯化样品，用SpeI和NotI限制酶过夜消化。抽提并沉淀消化产物，然后亚克隆到Apo启动子表达载体中。在微注射所得的克隆，HE-OPG前，将其测序以确保它是无突变的。
通过两轮CsCl密度梯度离心纯化HE-OPG质粒。用XhoI和AseI消化纯化的质粒DNA，用凝胶电泳纯化3.6kb的转基因插入片段。用5mMTris，pH7.4，0.2mM EDTA将纯化的片段稀释成1μg/ml的原种注射溶液。基本按所述(Brinster等人，美国国家科学院进展，82，4338(1985))，注射来自BDF1×BDF1-育种小鼠的单细胞胚胎，除注射针头成锐角并在使用前硅化处理外。在CO2保温箱中过夜培养胚胎，将15-20个2-细胞胚胎转移到假孕CD1雌性小鼠的输卵管中。
在足孕后，从微注射胚胎的植入中得到49个后代。通过PCR扩增在基因组DNA样品中整合的转基因，从而筛选后代。扩增的靶区是包括在所述表达载体中的人Apo E内含子的369bp区。用于PCR扩增的寡核苷酸如下5’-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3’(SEQ ID NO11)5’-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3’(SEQ ID NO12)PCR条件是94℃2分钟，1个循环；94℃1分钟，63℃20秒，和72℃30秒，30个循环。在49个后代中，鉴定出有9个为PCR阳性转基因建立者。
在8-10周龄，杀死5个转基因建立者(2，11，17，17和28)和5个对照(1，12，15，17和30)进行尸检和病理学分析。通过部分肝切除，从剩下的4个建立者中分离肝。为了进行部分肝切除，经小鼠麻醉，然后外科手术取出肝叶。按照所述(Mcdonald等人，酶学方法，152，219(1987))从所有转基因建立者和5个阴性对照同窝幼畜的肝中分离总细胞RNA。对这些样品进行Northern印迹分析以评估转基因表达的水平。用电泳变性凝胶(Ogden等人，酶学方法152，61(1987))分辨约10μg来自动物肝的总RNA，然后转移到HYBOND-N尼龙膜(Amersham)上，用P-dCTP标记的pB1.1插入片段DNA检测。42℃，在50％甲酰胺，5X SSPE，0.5％SDS，5X Denhardt’s溶液，100μg/ml变性鲑精DNA和2-4×106cpm标记的体重/ml杂交缓冲液中过夜杂交。杂交后，用2X SSC，0.1％SDS室温将印迹洗涤两次，每次5分钟，然后用0.1X SSC，0.1％SDS于55℃洗涤，每次5-10分钟。放射自显影后，确定转基因在建立者和对照同窝幼畜中的表达。
Northern印迹数据表明，7个转基因建立者表达了可检测水平的转基因mRNA(动物#2，11，16，17，22，33和45)。阴性对照和1个建立者(#28)未表达转基因相关的mRNA。由于预计OPG是分泌蛋白，所以转基因mRNA的过表达代表了全身传递基因产物的水平。PCR和Northern印迹阳性小鼠，动物2，17和22表达了最高水平的转基因mRNA，而且对宿主细胞和组织有更强的生物作用。
实施例4OPG的生物活性杀死5个转基因建立者(2，11，17，17和28)和5个对照(1，12，15，17和30)进行尸检并用下列方法进行病理学分析。在安死术前，所有动物有其确定的身份号码，然后将其称重，麻醉并抽血。将血液保存为血清和全血以进行血清化学和血液学分析。在用致死的CO2吸入最终麻醉后，和全身解剖前立即进行射线照相。此后，取出组织并用10％合成的锌福尔马林固定以进行组织学检测。收集的组织包括肝，脾、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、肾、生殖器官、皮肤和乳腺、骨、脑、心、肺、胸腺、气管、食管、甲状腺、空肠、盲肠、直肠、肾上腺、膀胱和骨骼肌。在固定全器官前，确定肝、胃、肾、肾上腺、脾和胸腺的重量。固定后，将组织加工成石蜡块，得到3μm的切片。用甲酸溶液将骨组织脱钙，然后用苏木精和曙红将所有切片染色。另外，在特定的组织上用Gomori’s网硬蛋白(reticulin)和Masson’s三色(trichrome)染色。完成酶组织化学分析以确定酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP)(一种由破骨细胞高度表达的酶，所述破骨细胞是单核细胞巨嗜细胞谱系的多核骨吸收细胞)的表达。完成BrdU和F480单核细胞-巨嗜细胞表面抗原的免疫组织化学分析以分别检测正在复制的细胞和单核细胞-巨嗜细胞谱系的细胞。为了检测F480表面抗原的表达，将福尔马林固定的，石蜡包埋的4μm切片去石蜡，然后与去离子水水合。用3％过氧化氢将所述切片猝冷，用Protein Block(Lipshaw，Pittsburgh，PA)阻断，然后在大鼠单考虑抗小鼠F480(Harlan，Indianapolis)中保温。用生物素化的兔抗-大鼠免疫球蛋白，与DAB为色原(BioTek，Santa Barbara，CA)的链霉抗生物素蛋白(BioGenex SanRamon，CA)结合的过氧化物酶检测所述抗体。用苏木精复染切片。
在大体解剖并观察了内脏组织后，在转基因表达者或对照同窝幼畜中没有发现异常。器官重量分析表明，相对于对照而言，转基因小鼠的脾的大小增加了约38％。在转基因表达者中，血小板大小有轻微增加，而且正在循环的未染色的细胞有所增加。在转基因表达者中，血小板水平有临界性降低。另外，在转基因表达者中，血清尿酸，尿氮和碱性磷酸酶水平均有降低的倾向。发现表达者的的骨骼，包括长骨(股骨)，脊椎和平骨(骨盆)的放射性密度增加。在表达者中，股骨的相对大小与对照小鼠没有差异。
来自OPG表达者骨的染色切片的组织学分析表明，有严重的骨硬化病，在股骨骨干中的骨梁内见到了来自原发性松质的软骨残留物。在股骨的切片中，鉴定不到界限清楚的皮质。在正常动物中，皮质骨干中充满了骨髓。脊椎切片还表明，骨硬化病的变化说明OPG诱导的骨骼改变是全身性的。残留的骨髓表明了显著的髓样成分。存在巨核细胞。网硬蛋白染色表明没有网硬蛋白沉积。为了进行F480(有小鼠中单核细胞-巨嗜细胞衍生之细胞表达的一种细胞表面抗原)的免疫组织化学分析表明，在髓隙内存在F480阳性细胞。总而言之，在与骨小梁表面直接相邻处，可以见到平的F480阳性细胞。
将嵌入骨小梁的间质细胞弄平，而且它们似乎无活性。以H&E和TRAP染色为基础，在OPG表达者中，在小梁骨表面上很少见到破骨细胞。相反，在生长面吸收软骨区，破骨细胞和/或破软骨细胞，但与对照相比，其数量减少。另外，在模型活性通常很强的干骺端的皮质表面上也存在破骨细胞。表达者和对照之间的显著差异是，在脊椎和股骨中，小梁破骨细胞减少了很多。骨积累的程度直接与用总肝RNA的Northern印迹检测的OPG转基因mRNA水平有关。
由于血细胞生成的增加，OPG表达者的脾随着扩大，红髓的量增加。表示了所有血细胞生成谱系。在对照和OPG表达者的红髓中均有F480阳性细胞。两个表达者，在肝内有髓外血细胞生成灶，这可能是由于骨硬化髓而引起的。
在胸腺，淋巴结，胃肠道，胰管-肝胆管道，呼吸道，生殖系统，泌尿生殖系统，神经系统，心和主动脉，胸腺，骨骼肌和脂肪中没有观察到异常。
实施例5分离小鼠和人OPG cDNA通过PCR扩增，从小鼠肾cDNA文库(Clontech)中分离相当于小鼠OPG mRNA 5’端的cDNA克隆。寡核苷酸衍生于大鼠OPG cDNA，并示于下5’-ATCAAAGGCAGGGCATACTTCCTG-3’(SEQ ID NO13)5’-GTTGCACTCCTGTTTCACGGTCTG-3’(SEQ ID NO14)5’-CAAGACACCTTGAAGGGCCTGATG-3’(SEQ ID NO15)5’-TAACTTTTACAGAAGAGCATCAGC-3’(SEQ ID NO16)5’-AGCGCGGCCGCATGAACAAGTGGCTGTGCTGCG-3’(SEQID NO17)5’-AGCTCTAGAGAAACAGCCCAGTGACCATTCC-3’(SEQ IDNO18)将在该过程中得到的部分和全长cDNA产物测序。用NotI和XbaI消化全长产物，然后定向克隆到质粒载体pRcCMV中。将所得的质粒命名为pRcCMV-Mu-OPG。将克隆产物的核苷酸序列与大鼠OPG的cDNA序列进行比较。在OPG LORF的1300bp的区域内，大鼠和小鼠DNA序列有约88％的相同性。小鼠cDNA序列含401个氨基酸的LORF，将其与大鼠OPG蛋白序列进行比较，发现～94％相同，没有缺口。这表明分离的小鼠cDNA序列编码属OPG蛋白，在整个进化过程中，序列和结构是高度保守的。小鼠OPG蛋白序列在其N末端含一相同的推测的信号肽，所有4个潜在的N-连接糖基化位点均是保守的。
用下列大鼠特异性寡核苷酸，从人肾cDNA文库中克隆部分人OPGcDNA5’-GTG AAG CTG TGC AAG AAC CTG ATG-3’(SEQ ID NO19)5’-ATC AAA GGC AGG GCA TAC TTC CTG-3’(SEQ ID NO20)
将该PCR产物测序并用其设计作为模板的引物，所述引物用于利用在λ中的人OPG基因组克隆扩增人cDNA的3’末端5’-TCCGTAAGAAACAGCCCAGTGACC-3’(SEQ ID NO29)5’-CAGATCCTGAAGCTGCTCAGTTTG-3’(SEQ ID NO21)将扩增的PCR产物测序，然后与5’末端序列一起用来设计用于扩增完整人OPG cDNA编码序列的5’和3’人特异性引物5’-AGCGCGGCCGCGGGGACCACAATGAACAAGTTG-3’(SEQID NO22)5’-AGCTCTAGAATTGTGAGGAAACAGCTCAATGGC-3’(SEQID NO23)将全长人PCR产物测序，然后用NotI和XbaI定向克隆到质粒载体pRcCMV(Invitrogen)中。将所得质粒命名为pRcCMV-人OPG。将克隆产物的核苷酸序列与大鼠和小鼠OPG cDNA序列进行比较。在跨OPG LORF的1300bp区域内，大鼠和小鼠DNA序列与人OPG cDNA有与78-88％的相同性。人OPG cDNA序列还含有401个氨基酸的LORF，将其与大鼠和小鼠蛋白序列进行比较。预期的人OPG蛋白与大鼠和小鼠蛋白分别有约85％和～90％的相同性。大鼠，小鼠和人蛋白的序列排列表明，在进化过程中它们是高度保守的。预期人蛋白有一N末端信号肽，5个潜在的N-连接的糖基化位点，其中4个在大鼠和小鼠OPG蛋白之间是保守的。
在图9A和9B(SEQ ID NO122)中列出了小鼠OPG的DNA和推测的氨基酸序列。在图9C和9D(SEQ ID NO124)中列出了人OPG的DNA和推测的氨基酸序列。在图9E和9F中列出了大鼠，小鼠和人OPG氨基酸序列的比较。
分离其它人OPG cDNA克隆表明，在图9C中所列DNA序列的位置103，G变成了C碱基。所述核苷酸改变导致图9C所列氨基酸序列位置3的赖氨酸被精氨酸所取代。包含所述改变之克隆中的其余序列与图9C和9D中的相同。
实施例6OPG三维结构模型OPG氨基末端部分与TNFR超家族的所有已知成员的细胞外部分有同源性(图1C)。在该TNFR相关基因的区域中，最值得注意的基元是～40氨基酸，折叠成不同结构的Cys富集的重复序列(Bannerd等人，细胞73，431-445(1993))。该基元通常以4(3-6)个串联重复片段(见图1C)的形式出现，而且已知与配体结合有关(Beutler and van Huffel，科学，264，667-663(1994))。各重复片段通常含6个间隙Cys残基，它们与形成结3个构域内的二硫键(称为SS1，SS2和SS3)有关(Bannerd等人，出处同上)。在某些受体如TNFR2，CD30和CD40中，一些重复片段结构域只含有两个链内二硫键(SS1和SS3)。
用Luethy等人(出处同上)所述的方法，将人OPG蛋白序列与TNFR1细胞外结构域图谱进行排列，用来自Wisconsin软件包，8.1版(GeneticsComputer Group，Madison，WI)的PrettyPlot程序图示表示结果(图10)。排列表明Cys残基的保守性显然与结构域1-4的形成有关。然后用已知的p55 TNFR1细胞外结构域的3-D结构(Bannerd等人，出处同上)为模板，用该排列构建人OPG N末端结构域的三维(3-D)模型。为了完成这项工作，从TNFR1的晶体结构坐标复制肽骨架和相同残基侧链的原子坐标。此后，用LOOK程序(Molecular Applications Group，Palo Alto，CA)得到插入和不同侧链的剩余的坐标。然后用LOOL通过将其构象能量最小化来改进3-D模型。
通过与其它TNFR家族成员比较，设想OPG与一配体结合。为了模型化OPG与其配体间的相互作用，用TNF-β的晶体结构模拟“OPG配体”3-D结构的图象。用Molscript(Kraulis，J.Appl.Cryst.24，946-950，1991)图示该数据。构建有3个TNFβ和3个OPG分子的OPG/配体配合物的模型，其中OPG的相对位置与晶体结构中TNFR1的相同。然后用该模型经下列方法，找到可以与其配体相互作用的OPG的残基。计算在配合物和一个OPG模型中所有残基的溶剂可接近区。在所述配合物而不是单体中有不同可及性的残基可能与配体相互作用。
利用该资料再排列人和小鼠的OPG氨基酸序列以突出含各Cys富集结构域1-4(图12A和12B)的序列。各结构域有可以预测的各自的结构特征
结构域1含4个与SS2(C41-C54)和SS3(C44-C62)二硫键有关的Cys。尽管SS1键不是以二硫键为基础的，但在位置28保守的酪氨酸与TNFR1中的Y20同源，而已知后者与有助于结构域形成的H66相互作用。OPG在位置75有一同源组氨酸，表明在天然蛋白中，OPG Y28和H75叠加在一起，与TNFR1中同源残基的一样。因此，这两个残基确实对于生物活性是很重要的，到并超过Y28的N末端OPG截断物的活性可能会有所改变。另外，预期残基E34和K43与基于我们的3-维模型的结合配体相互作用。
结构域2含有6个Cys，而且预计含有SS1(C65-C80)，SS2(C83-C98)和SS3(C87-C105)二硫键。OPG的该区还含有P66-Q91的区域，该区域与部分TNFR1结构域2排列，所述部分TNFR1结构域2与TNFβ形成很近的接触(见上文)，所述OPG的该区与OPG配体相互作用。具体地说，预计残基P66，H68，Y69，Y70，T71，D72，S73，H75，T76，S77，D78，E79，L81，Y82，P85，V86，K88，E89，L90和Q91与基于我们结构数据的结合配体相互作用。
结构域3含有4个与SS1(C107-C118)和SS3(C124-C142)二硫键有关的Cys，但没有SS2键。基于我们的结构数据，预计残基E115，L118和K119与OPG配体相互作用。
结构域4含有4个与SS1(C107-C118)和SS3(C124-C142)二硫键有关的Cys，但没有SS2键，与结构域3相似。我们的结构数据预计E153和S155与OPG配体相互作用。
因此，预期的OPG结构模型确定了许多可能对于其生物活性重要的高度保守的残基。
实施例7在哺乳动物细胞中生成重组分泌型OPG蛋白为了确定OPG是否确实是分泌蛋白，将小鼠OPG cDNA与作为标记的人IgG1 Fc结构域融合(Capon等人，自然337，525-531(1989))，然后在人293成纤维细胞中表达。用载体pFc-A3完成Fc融合。pFc-A3含有编码人免疫球蛋白IgG-γ1重链Fc部分(Ellison等人，出处同上)的区域，该区域从铰链结构域(Glu-99)的第一个氨基酸到羧基末端，而且两侧为5’-融合位点和3’-SalI和XbaI位点。通过PCR扩增人脾cDNA文库(Clotech)来构建该质粒。PCR反应是在100μl的终体积中，使用在20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10μm(NH4)2SO4，0.1％Triton X-100中的2单位的VentDNA聚合酶(New England Biolabs)和各400μm的dNTP，1ng待扩增的cDNA文库和1μm的各引物。在95℃经2分钟变性来启始反应，然后95℃30秒，55℃30秒和73℃2分钟，30个循环。5’引物5’ATAGCGGCCGCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC3’(SEQ ID NO24)在紧接IgG-γ1铰链结构域的第一个残基(Glu-99)处掺入一NotI位点。3’引物5’-TCTAGAGTCGACTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-TT-3’(SEQ ID NO25)掺入了SalI和XbaI位点。用NotI和SalI消化717bp的PCR产物，通过1％琼脂糖(FMC公司)电泳分离，用Geneclean方法(BIO101，公司)纯化，然后克隆到NotI，SalI消化的pBluescriptII KS载体(Stratagene)中。确定在所得质粒中的插入片段pFc-A3的序列以确定PCR反应的保真性。
用下列两组引物对扩增在质粒pRcCMV-MuOPG中克隆的小鼠cDNA引物对15’-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3’(SEQ ID NO26)5’-CCTCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTCACGGATTGAACCTG-3’(SEQ ID NO27)引物对25’-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3’(SEQ ID NO28)5’-CCTCTGCGGCCGCTGTTGCATTTCCTTTCTG-3’(SEQ ID NO30)第一对引物扩增全部OPG LORF，并产生与Fc融合载体pFcA3框架中的NotI位点相容的NotI限制位点。通过将NotI限制位点与人IgG1 Fc cDNA天冬氨酸残基216的5’相连来制备pFcA3。该构建体导入了一编码两个不相关氨基酸的接头，所述接头跨OPG蛋白和IgG Fc区之间的结合部位。该产物，当与Fc部分相连时，将编码所有401OPG残基到人IgG1 Fc区(F1.Fc)的所有227个氨基酸残基。第二个引物对扩增编码OPG前180个氨基酸的DNA序列，所述DNA序列包括其推测的配体结合结构域。如上所述，3’引物产生人工NotI限制位点，该位点为向IgG1 Fc结构域的位置180苏氨酸融合C末端截断的OPG LORF(CT.Fc)。
可以按如下修饰连接OPG401残基和人Fc区天冬氨酸残基221的氨基酸序列结合部分可以按下述缺失编码人Fc区的残基216-220，或将相应于人Fc区C220的半胱氨酸残基突变为丝氨酸或丙氨酸。可以将由这些修饰载体编码的OPG-Fc融合蛋白转染到人293细胞或CHO细胞中，然后按下述纯化重组OPG-Fc融合蛋白。
将两种产物均定向克隆到质粒载体pCEP4(Invitrogen)中。pCEP4含有EB病毒复制源，而且能够在293-EBNA-1细胞中作为附加体来复制。按照制造商说明的方法，将亲本pCEP4和pCEP4-F1.Fc和pCEP4-CT.Fc载体脂染到293-EBNA-1细胞中。然后在100μg/ml潮霉素中筛选转染的细胞以选择载体表达，使所得的药物抗性培养基生长到汇合。然后将细胞在无血清培养基中培养72小时，除去条件培养基，用SDS-PAGE分析。银染聚丙烯酰胺凝胶检测到有药物抗性293培养物生产的主要条件培养基蛋白。在pCEP4-F1.Fc和pCEP4-CT.Fc条件培养基中，分泌出丰富的有预期大小的特有的带(见图13B和13C)。全长Fc融合蛋白积累到高浓度，这表明它是稳定的。在Western印迹上，用抗人IgG1 Fc抗体(Pierce)检测这两种Fc融合蛋白，表明它们是重组OPG产物。
用Protein-A柱层析(Pierce)，按照制造商说明的方法纯化全长OPG-Fc融合蛋白。然后基本上按照Matsudaira等人(生物化学期刊，262，10-35(1987))的描述，用自动Edman降解，对所述蛋白进行N末端序列分析。在19个循环后，读出下列氨基酸序列NH2-ETLPPKYLHYDPETGHQLL-CO2H(SEQ ID NO31)该序列与从氨基酸22开始的预期的小鼠OPG的氨基酸序列相同，这表明天然哺乳动物前导裂解位点在氨基酸残基Q21-E22之间，而不在原来所预期的Y31-D32之间。用pCEP4-F1.Fc和pCEP4-CT.Fc在293-EBNA细胞中完成表达试验表明OPG是分泌蛋白，而且可全身性地结合其配体。
用与由于构建并表达muOPG[22-180]-Fc和muOPG[22-401]-Fc融合蛋白相似的方法构建并表达其他小鼠和人OPG-Fc融合蛋白。
按如下方法构建编码与人IgG1 Fc区融合的氨基酸1-185的鼠OPGcDNA[muOPG Ct(185).Fc]。在按照上述的聚合酶链反应中用下列引物对扩增来自质粒pRcCMV促骨生长素(实施例5中所述)的鼠OPG cDNA1333-825’-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3’(SEQ ID NO32)1333-805’-CCT CTG CGG CCG CAC ACA CGT TGT CAT GTG TTG C-3’(SEQ ID NO33)该引物对扩增编码图9A所示OPG阅读框架中的氨基酸残基63-185的鼠OPG cDNA区。3’引物含有与Fc融合载体pFcA3框架中的NotI位点相容的NotI限制位点。该产物还跨位于436bp的特有的EcoRI限制位点。纯化扩增的PCR产物，用NotI和EcoRI裂解，然后纯化所得的EcoRI-NotI限制片段。用EcoRI和NotI裂解含有鼠1-401 OPG-Fc融合插入片段的载体pCEP4，纯化，然后与上述产生的PCR产物相连。所得的基于pCEP4的表达载体编码OPG残基1-185直接接人IgG1 Fc区的所有227个氨基酸残基。将鼠OPG1-185.Fc融合载体转染到293细胞中，进行药物筛选，然后按上述产生条件培养基。用Protein-A柱层析(Pierce)，按照制造商说明的方法纯化所分泌的鼠OPG1-185.Fc融合蛋白。
按如下方法构建编码与人IgG1 Fc区(muOPGCt(194).Fc)融合的氨基酸1-194的鼠OPG cDNA。在按照上述的聚合酶链反应中用下列引物对扩增来自质粒pRcCMV促骨生长素(实施例5中所述)的鼠OPG cDNA1333-825’-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3’(SEQ ID NO34)1333-815’-CCT CTG CGG CCG CCT TTT GCG TGG CTT CTC TGT T-3’(SEQ ID NO35)该引物对扩增编码OPG阅读框架氨基酸残基70-194(相应于298-672bp)的鼠OPG cDNA区。3’引物含有与Fc融合载体pFcA3框架中的NotI位点相容的NotI限制位点。该产物还跨位于436bp的特有的EcoRI限制位点。将扩增的PCR产物克隆到上述鼠OPG[1-401]Fc融合载体中。所得的基于pCEP4的表达载体编码OPG残基1-194接人IgG1 Fc区的所有227个氨基酸残基。将鼠OPG1-194.Fc融合载体转染到293细胞中，进行药物筛选，然后按上述产生条件培养基。用Protein-A柱层析(Pierce)，按照制造商说明的方法纯化所分泌的鼠OPG1-194.Fc融合蛋白。
按照如下方法构建编码与人IgG1的Fc区融合的氨基酸1-401的人OPG DNA。用下列寡核苷酸引物扩增在质粒pRcCMV-hu促骨生长素(实施例5中所述)中的人OPG DNA1254-905’-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3’(SEQ ID NO36)1254-955’-CCT CTG CGG CCG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG AAT GG-3’(SEQ ID NO37)所得的PCR产物编码全长人OPG蛋白，并产生与Fc融合载体pFcA3框架中的NotI位点相容的NotI限制位点。按上述将所述PCR产物定向克隆到质粒载体pCEP4中。所得的表达载体编码OPG残基1-401接人IgG1Fc区的所有227个氨基酸残基。得到来自转染和药物筛选细胞的条件培养基，用Protein-A柱层析(Pierce)，按照制造商说明的方法纯化所分泌的hu OPG1 F1.Fc融合蛋白。
按照如下方法构建编码与人IgG1的Fc区融合的氨基酸残基1-201的人OPG DNA[huOPGCt(201).Fc]。用下列寡核苷酸引物扩增在质粒pRrCMV-hu促骨生长素中的人OPG DNA1254-905’-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3’(SEQ ID NO38)1254-925’-CCT CTG CGG CCG CCA GGG TAA CAT CTA TTC CAC-3’(SEQ ID NO39)该引物对扩增编码OPG阅读框架氨基酸残基1-201的人OPG cDNA区，并在3’末端产生与Fc融合载体pFcA3框架中的NotI位点相容的NotI限制位点。当与Fc部分相连时，该产物编码OPG残基1-201接IgG1 Fc区的所有221个氨基酸残基。将所述PCR产物定向克隆到上述质粒载体pCEP4中。得到来自转染和药物筛选细胞的条件培养基，然后用Protein-A柱层析(Pierce)，按照制造商说明的方法纯化所分泌的huOPGCt(201).Fc融合蛋白。
用下列方法构建并表达未融合的小鼠和人OPG。
通过PCR扩增来自pRcCMV-Mu促骨生长素的鼠OPG cDNA插入片段，来得到用于哺乳动物表达全长鼠OPG(残基1-401)的质粒，然后亚克隆到表达载体pDSRα(DeClerek等人，生物化学期刊，266，3893(1991))中。用下列寡核苷酸引物1295-265’-CCG AAG CTT CCA CCA TGA ACA AGT GGC TGT GCT GC-3’(SEQ ID NO40)1295-275’-CCT CTG TCG ACT ATT ATA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATTG-3’(SEQ ID NO41)按上述用PCR扩增鼠OPG全长阅读框架。纯化PCR产物，用限制内切酶HindIII和XbaI(Boehringer Mannheim，Indianapolis)在制造商说明的条件下消化，然后与HindIII和XbaI消化的pDSRα相连。通过限制内切酶消化，检测，然后测序以确保在PCR扩增步骤中没有产生突变。
通过钙介导的转染(Wigler等人，细胞11，233(1977))将所得质粒pDSRα-muOPG导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。基于质粒载体中二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的表达来筛选单个菌落，然后分离数个克隆。用Western印迹分析CHO细胞条件培养基来监测鼠OPG重组蛋白的表达。筛选高表达水平的细胞，按所述(DeClerck等人，出处同上)，通过氨甲喋呤处理来进一步扩增OPG表达制备来自CHO细胞素的条件培养基以进一步纯化重组的分泌型鼠OPG蛋白。
通过将pRcCMV-hu促骨生长素中的cDNA定向亚克隆到pDSRα(DeClerck等人，出处同上)中，而产生用于哺乳动物表达全长人OPG(氨基酸1-401)的质粒。用NotI完全消化pRcCMV-OPG质粒，用Klenow补平，然后用XbaI完全消化。用HindIII消化载体DNA，用Klenow补平，然后用XbaI消化，接着与OPG插入片段相连。测定重组质粒的序列以确定人OPG cDNA的适当方向。
按照上述，将所得质粒pDSRα-huOPG导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。基于质粒载体中二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的表达来筛选单个菌落，然后分离数个克隆。用Western印迹分析CHO细胞条件培养基来监测人OPG重组蛋白的表达。筛选高表达水平的细胞，按所述(DeClerck等人，出处同上)，通过氨甲喋呤处理来进一步扩增OPG表达。生产来自表达人OPG的CHO细胞系的条件培养基，以用于蛋白纯化。
按如下方法构建用于编码残基1-185的鼠OPG的表达载体。用下列寡核苷酸引物扩增来自pRcCMV-Mu OPG的鼠OPG cDNA1333-825’-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3’(SEQ ID NO42)1356-125’-CCT CTG TCG ACT TAA CAC ACG TTG TCA TGT GTT GC-3’(SEQ ID NO43)该引物对扩增编码OPG阅读框架氨基酸63-185(bp278-645)的鼠OPG cDNA区，并含有在半胱氨酸密码子(C185)后的人工终止密码子，该终止密码子在人工SalI限制内切酶位点之前。预期的产物含用于亚克隆到现有载体中的内部EcoRI限制位点。PCR扩增后，用EcoRI和SalI限制内切酶裂解所纯化的产物，凝胶纯化大片段。然后将纯化产物亚克隆到EcoRI和SalI消化的上述pBluescript-muOPGF1.Fc的大限制性片段中。用HindIII和XhoI消化所得的质粒，然后凝胶纯化小片段。然后，将含编码残基1-185之开放阅读框架的所述片段亚克隆到HindIII和XhoI消化的表达载体pCEP4中。所得的载体，pmuOPG[185]编码终止于位置185上的半胱氨酸残基的截断的OPG多肽。按上述方法生产来自转染的和药物筛选的细胞的条件培养基。
1333-825’-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3’(SEQ ID NO44)1356-135’-CCT CTG TCG ACT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TT-3’(SEQ ID NO45)该引物对扩增编码OPG阅读框架氨基酸70-194(bp298-672)的鼠OPG cDNA区，并含有在赖氨酸密码子(K194)后的人工终止密码子，该终止密码子在人工SalI限制内切酶位点之前。预期的产物含用于亚克隆到现有载体中的内部EcoRI限制位点。PCR扩增后，用EcoRI和SalI限制内切酶裂解所纯化的产物，凝胶纯化大片段。然后将纯化产物亚克隆到EcoRI和SalI消化的上述pBluescript-muOPGF1.Fc的大限制片段中。用HindIII和XhoI消化所得的质粒，然后凝胶纯化小片段。然后，将含编码残基1-185之开放阅读框架的所述片段亚克隆到HindIII和XhoI消化的表达载体pCEP4中。所得的载体，pmuOPG[1-185]编码终止于位置194上的半胱氨酸残基的截断的OPG多肽。按上述方法生产来自转染的和药物筛选的细胞的条件培养基。
在OPG的残基22-32之间导入了氨基酸取代或缺失的huOPG[22-401]-Fc基因的5’末端产生数个突变。按照制造商说明的条件，用“QuickChangeTM定点诱变试剂盒”(Stratagene，San Diego，CA)产生所有突变。总之，存在脱氧核苷酸的条件下，用Pfu聚合酶处理含huOPG[22-401]-Fc质粒DNA模板和诱变引物的反应混合物，然后按上述在热循环仪中扩增。然后用热休克将一份反应混合物转染到感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞中，接着铺板。将来自转化体的质粒DNA测序以确定突变。
用下列引物对缺失人OPG基因的残基22-26，以生产huOPG[27-401]-Fc融合蛋白1436-115’-TGG ACC ACC CAG AAG TAC CTT CAT TAT GAC-3’(SEQ IDNO140)1436-125’-GTC ATA ATG AAG GTA CTT CTG GGT GGT CCA-3’(SEQID NO141)用下列引物对删除人OPG基因的残基22-28，以生产huOPG[29-401]-Fc融合蛋白1436-175’-GGA CCA CCC AGC TTC ATT ATG ACG AAG AAA C-3’(SEQID NO142)1436-185’-GTT TCT TCG TCA TAA TGA AGC TGG GTG GTC C-3’(SEQID NO143)
用下列引物对删除人OPG基因的残基22-31，以生产huOPG[32-401]-Fc融合蛋白1436-275’-GTG GAC CAC CCA GGA CGA AGA AAC CTC TC-3’(SEQ IDNO144)1436-285’-GAG AGG TTT CTT CGT CCT GGG TGG TCC AC-3’(SEQ IDNO145)用下列引物对将人OPG基因的残基28酪氨酸的密码子变成苯丙氨酸的密码子，以生产huOPG[22-401]-Fc Y28F融合蛋白1436-295’-CGT TTC CTC CAA AGT TCC TTC ATT ATG AC-3’(SEQ IDNO146)1436-305’-GTC ATA ATG AAG GAA CTT TGG AGG AAA CG-3’(SEQ IDNO147)用下列引物对将人OPG基因的残基26脯氨酸的密码子变成丙氨酸的密码子，以生产huOPG[22-401]-Fc P26A融合蛋白1429-835’-GGA AAC GGT TCC TGC AAA GTA CCT TCA TTA TG-3’(SEQID NO148)1429-845’-CAT AAT GAA GGT ACT TTG CAG GAA ACG TTT CC-3’(SEQ ID NO149)然后将所得的含适当突变的muOPG[22-401]-Fc质粒转染到人293细胞中，按上述从条件培养基中纯化突变体OPG-Fc融合蛋白。按照实施例11中所述，用体外破骨细胞形成试验评估各蛋白的生物活性。
实施例8在大肠杆菌中表达OPGA.细菌表达载体pAMG21
可以从Amgen表达载体pCFM1656(ATCC#69576)衍生表达质粒pAMG21，pCFM1656又是从美国专利4710473中所述的Amgen表达载体系统衍生的。可以按照如下方法，从所述的pCFM836质粒(美国专利4710473)衍生pCFM1656质粒(a)通过用T4聚合酶补平末端，然后连接平整末端而破坏两个内源NdeI限制位点；(b)用从含PL启动子的pCFM636(专利4710473)得到的相似片段取代特有的AatII和ClaI限制位点间含合成的PL启动子的DNA序列AatII5′CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT-3′TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA-- AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA-- TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT-- TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3′(SEQ ID NO53)- ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC5′(SEQ ID NO54)ClaI然后，(c)用下列寡核苷酸取代特有ClaI和KpnI限制位点间的小DNA序列5′ CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3′(SEQ ID NO48)3′TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC5′(SEQ ID NO49)ClaIKpnI通过PCR重叠寡核苷酸诱变和DNA序列取代，产生一系列的定点碱基改变，可以从pCFM1656衍生表达质粒pAMG21。从质粒复制启动子PcopB的5’端的BglII位点(质粒bp#180)开始，向质粒复制基因的方向，按如下改变碱基对
pAMG21 bp #pCFM1656中的碱基对 pAMG21中的碱基对变为# 204T/AC/G# 428A/TG/C# 509G/CA/T# 617- -插入两个G/C碱基对# 679G/CT/A# 980T/AC/G# 994G/CA/T# 1004 A/TC/G# 1007 C/GT/A# 1028 A/TT/A# 1047 C/GT/A# 1178 G/CT/A# 1466 G/CT/A# 2028 G/C碱基对缺失# 2187 C/GT/A# 2480 A/TT/A# 2499-2502 AGTG GTCATCAC CAGT# 2642 TCCGAGC7碱基对缺失AGGCTCG# 3435 G/CA/T# 3446 G/CA/T# 3643 A/TT/A用下列DNA序列取代单一的AatII(pCFM1656中的位置#4364)和SacII(pCFM1656中的位置#4585)限制位点之间的DNA序列[AatII粘性末端] 5′GCGTAACGTATGCATGGTCTCC-(pAMG21中的位置#4358)3′TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGG--CCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT--GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA--GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGC--CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCG--CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGC--GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG--CATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGT--GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCA-AatII-TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC--AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCATGAATTG--TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACTTTGGCAGC--AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG--GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGCGCTTAC--CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCACGCGAATG--TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTTTTCCTTCGCATGCCCACGCTAAAC--ATGTCGGATTATAAAAACTTTATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGCGATTTG--ATTCTTTTTCTCTTTTGGTTAAATCGTTGTTTGATTTATTATTTGCTATATTTATTTTTC--TAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGCAACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAAAAAG--GATAATTATCAACTAGAGAAGGAACAATTAATGGTATGTTCATACACGCATGTAAAAATA--CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACATTTTTAT--AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT--TTGATAGATATATCAACAGAAAGAGACTTACACGTTTTGATTCGTAAGGCTTCGGTAATA--TAGCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACCTGATGATTTCGCTTCTTTAA--ATCGTCATACTTATCCCTTTGATTTGGGTCACTATTCTGGACTACTAAAGCGAAGAAATT--TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTG--AATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTCGTAACAAAAGTTTATATAAGGTTAATTAGCCAC--AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTCATCAT--TTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATTTAATCGCAGTAGTA--AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAG--TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTGGTATC--AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG--TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTC--ATAAGCATTGATTAATATCATTATTGCTTCTACAGGCTTTAATTTTATTAATTATTCTGT--TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATGTCCGAAATTAAAATAATTAATAAGACA---AAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCTTTATCCTTACCTATTGTTTGTC--TTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG--GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAA--CGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT--ATTGGATTTTTGTCACACTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTG--TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC--TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATT--ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA--CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGA--GATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCT-SacII-GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAA--CGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTT--GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATA--CTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTAT--ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGG--TGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCC-
在连接该取代DNA序列粘性末端的过程中，破坏了外部AatII和SacII位点。在取代的DNA中有单一的AatII和SacII位点。
pAMG22-His通过用下列寡核苷酸双螺旋取代单一的NdeI(#4795)和EcoRI(#4818)之间的小DNA序列，可以从Amgen表达载体pAMG22衍生表达质粒pAMG22-HisNdeI NheI EcoRI5′ TATGAAACATCATCACCATCACCATCATGCTAGCGTTAACGCGTTGG 3′(SEQ ID NO51)3′ ACTTTGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACGATCGCAATTGCGCAACCTTAA 5′(SEQ ID NO52)MetLysHisHisHisHisHisHisHisAlaSerValAsnAlaLeuGlu(SEQ ID NO168)pAMG22可以从Amgen表达载体pCFM1656(ATCC#69576)衍生表达质粒pAMG22，pCFM1656又是从美国专利4710473(1987年12月1日授权)中所述的Amgen表达载体系统衍生的。可以按照如下方法，从所述的pCFM836质粒(美国专利4710473)衍生pCFM1656质粒(a)通过用T4聚合酶补平末端，然后连接平整末端而破坏两个内源NdeI限制位点；(b)用从含PL启动子的pCFM636(专利4710473)得到的相似片段取代单一的AatII和ClaI限制位点间含合成的PL启动子的DNA序列AatII5′CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT-3′TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA--AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA--TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT--TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3′(SEQ ID NO53)-ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC5′(SEQ ID NO54)ClaI
然后，(c)用下列寡核苷酸取代单一的ClaI和KpnI限制位点间的小DNA序列5′CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3′(SEQ ID NO55)3′ TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5′(SEQ ID NO56)ClaIKpnI通过PCR重叠寡核苷酸诱变和DNA序列取代，产生一系列的定点碱基改变，可以从pCFM1656衍生表达质粒pAMG21。从质粒复制启动子PcopB的5’端的BglII位点(质粒bp#180)开始，向质粒复制基因的方向，按如下改变碱基对pAMG22 bp #pCFM1656中的碱基对pAMG21中的碱基对变为# 204T/AC/G# 428A/TG/C# 509G/CA/T# 617- -插入两个G/C碱基对# 679G/CT/A# 980T/AC/G# 994G/CA/T# 1004A/TC/G# 1007C/GT/A# 1028A/TT/A# 1047C/GT/A# 1178G/CT/A# 1466G/CT/A# 2028G/C碱基对缺失# 2187C/GT/A# 2480A/TT/A# 2499-2502 AGTG GTCATCAC CAGT# 2642TCCGAGC7碱基对缺失AGGCTCG-# 3435G/CA/T# 3446G/CA/T# 3643A/TT/A用下列DNA序列取代特有AatII(pCFM1656中的位置#4364)和SacII(pCFM1656中的位置#4585)限制位点之间的DNA序列(pAMG22中的位置#4358)5′GCGTAACGTATGCATGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA-3′TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGGGGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTT--ATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTG--TATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGACCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCAC--AACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGG--TTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCGGCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCC--CCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAG--GGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCGGTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTC--GCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAAT--CGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTA-AatII-ACATTCAAATATGGACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTC--TGTAAGTTTATACCTGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAG--TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGTTT--AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGATCTAAACTCA--TAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGAGCTCACTAGTGT--ATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCACA-SacII-CGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAGAA--GCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTTCTTCTTCTTCTT--GAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACC--CTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATTGG--CCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTTCA--GGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCCTTGGCGAGAAGT--CGCTCTTCACGC 3′(SEQ ID NO58)-GCGAGAAGTG 5′(SEQ ID NO57)[SacII粘性末端](pAMG22中的位置#5024)在连接该取代DNA序列粘性末端的过程中，破坏了外部AatII和SacII位点。在取代的DNA中有特有的AatII和SacII位点。
B.人OPG Met[32-401]在本实施例中，所用的表达载体是pAMG21，pCFM1656(ATCC69576)的衍生物，该载体含有用于插入lux PR启动子下游基因的适当限制位点。(参见美国专利5169318对lux表达系统的描述)。所用的宿主细胞是GM120(ATCC 55764)。该宿主含有整合到原养大肠杆菌K12宿主染色体第二位点中的lacIQ启动子和lacI基因。也可以其它常用的大肠杆菌表达载体和宿主细胞进行表达。
按下述，在质粒表达载体pAMG21中，将编码人OPG多肽N末端Met和氨基酸32-401的DNA序列置于lux PR启动子的控制下。为了得到这一目的，用作为模板的含人OPG cDNA的质粒pRcCMV-Hu OPG DNA完成以寡核苷酸#1257-20和#1257-19为引物的PCR，进行30个循环的热循环，各循环为94℃20秒，然后37℃30秒，72℃30秒。在琼脂糖凝胶上分辨所得的PCR样品，切下PCR产物，纯化，然后用KpnI和BamHI限制内切酶限制并纯化。用T4多核苷酸激酶和ATP将合成的寡核苷酸#1257-21和#1257-22各个磷酸化，然后混合在一起，在94℃加热，使其缓慢冷却到室温以形成含NdeI和KpnI粘性末端的寡核苷酸接头双螺旋。用标准重组DNA方法(参见图14A和下文序列)，将在寡核苷酸#1257-21和#1257-22之间形成的磷酸化接头双螺旋定向插入到质粒载体pAMG21的两个位点间，即NdeI和BamHI位点之间，所述接头含NdeI和KpnI粘性末端(见图14A)和用寡核苷酸引物#1257-20和#1257-19产生的、KpnI和BamHI消化并纯化的PCR产物。合成的接头使用大肠杆菌密码子并有N末端Met。
筛选两个克隆，分离质粒DNA，随后确定人OPG插入片段的DNA序列。将所得的pAMG21质粒称为pAMG21-huOPG met[32-401]或pAMG21-huOPG met[32-401]，所述质粒含紧接在Met之后的人OPG多肽的氨基酸32-401。
Oligo#1257-195′-TACGCACTGGATCCTTATAAGCAGCTTATTTTTACTGATTGGAC-3′(SEQ ID NO59)Oligo#1257-205′-GTCCTCCTGGTACCTACCTAAAACAAC-3′(SEQ ID NO60)Oligo#1257-215′-TATGGATGAAGAAACTTCTCATCAGCTGCTGTGTGATAAATGTCCGCCGGGTAC -3′(SEQ ID NO61)Oligo#1257-225′-CCGGCGGACATTTATCACACAGCAGCTGATGAGAAGTTTCTTCATCCA-3′(SEQ ID NO47)
在诱导前，于30℃在含20μg/ml卡那霉素的2XYT培养基中培养大肠杆菌GM120中的pAMG21-huOPG met[32-401]培养物。在将合成的自诱导剂N-(3-氧己酰)-DL-高丝氨酸内酯加到培养基至30ng/ml的终浓度后，诱导从luxPR启动子的huOPG met[32-401]表达，在30℃或37℃将培养物再培养6小时。6小时后，用显微镜检测细菌培养物中是否存在包含体，然后离心沉淀。在诱导的培养物中观察到折光包含体，表明有些重组huOPGmet[32-401]基因产物在大肠杆菌中是以不可溶形式生产的。将一些细菌沉淀再悬于10mM Tris-HCl/pH8，1mM EDTA中通过加入2X Laemlli样品缓冲液到1X的终浓度，β-巯基乙醇到5％终浓度而直接溶解沉淀，然后用SDS-PAGE分析。在SDS-PAGE凝胶上观察到一实质上更强的、约42Kda的考马斯染色带，所述凝胶含30℃和37℃诱导培养物的总细胞溶解产物对30℃非诱导培养物的总细胞溶解产物的道2(图14B)。预期的基因产物370个氨基酸长，而且预期的分子量为约42.2KDa。在37℃诱导6小时后，将再培养物沉淀，然后加工以分离包含体(见下文)或通过微流化(microfluidizing)加工。将加工后用于微流化的沉淀重悬在25mM Tris-HCl/ph8，0.5M NaCl缓冲液中，通过Microfulidizer1108型(Microfulidics Corp.)20次并收集。取出一份收集的样品(微流化的总溶解产物)，将剩下的以20000xg离心20分钟。除去离心后的上清液(微流化可溶级分)，将沉淀重悬在25mM Tris-HCl/ph8，0.5M NaCl，6M脲溶液(微流化不可溶级分)中。将一份总可溶的或不可溶级分加到等体积的2XLaemalli样品缓冲液中，并加入β-巯基乙醇至5％的终浓度。然后用SDS-PAGE分析。在不可溶级分中有显著量的重组huOPG met[32-401]基因产物。为了纯化重组蛋白，按如下纯化包含体用备有JS-4.2转子的Beckman J-6B离心机，以4900xg于4℃将通过密度梯度离心得到培养基离心15分钟分离细菌细胞。将细菌沉淀重悬的5ml水中，然后用水稀释到10的终体积。将所述悬浮液转移到在冰上冷却的不锈钢帽中，然后用备有标准针(力量设置＝5，工作循环＝95％，80burst)的BransonSonifer进行声破碎。用备有Beckman Optima TLX超离心机于23℃，以195000xg，将声处理的细胞悬浮液离心5-10分钟。弃去上清液，用来自注射器的水流漂洗沉淀。用微刮刀刮来收集沉淀，然后转移到玻璃匀浆器(15ml容量)中。将5ml Percoll溶液(75％液体Percoll，0.15M氯化钠)加到匀浆器中，将内含物匀浆直到均匀悬浮。通过加入Percoll溶液，使体积增加到19.5ml，混合并分散到3个Beckman Quich-Seal试管(13×32mm)中。按照制造商的说明密封试管。23℃，用Beckman TLA100.3，以20000rpm(21600xg)离心试管。检测试管是否存在适当的带谱。为了回收refractile包含体，回收梯度级分并集成池，然后用水稀释。离心沉淀所述包含体，在SDS-PAGE后评估蛋白浓度。
将上述一份分离的包含体溶解在含5％β-巯基乙醇的1X Laemlli样品缓冲液中，然后在SDS-PAGE凝胶上分辨，分离的包含体得到高纯度的huOPG[32-401]基因产物。从分离的凝胶上切下在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分辨包含体后观察到的主要的～42kDa带，基本上按所述(Matsudaira等人，生物化学期刊，262，10-35(1987))确定N末端氨基酸序列。在19个循环后确定下列序列NH2-MDEETSHQLLCDKCPPGTY-COOH(SEQ ID NO62)发现该序列与pAMG21 Hu-OPG met[32-401]表达载体编码的、由细菌表达载体提供的甲硫氨酸残基生产的前19个氨基酸相同。
C.人OPG met[32-401]按如下所述将编码N-甲硫氨酸和人OPG氨基酸残基22-401的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用KpnI和BamHI限制内切酶裂解分离的pAMG21-huOPG met[32-401]的质粒DNA，然后在琼脂糖凝胶上分辨所得的片段。用标准方法，从所述凝胶上分离B片段(～1064bp片段)。用B节中所述的方法，将合成的寡核苷酸(寡核苷酸)#1267-06和#1267-07单独磷酸化，使其形成寡核苷酸接头双螺旋，所述接头含NdeI和KpnI粘性末端。所述合成的接头双螺旋使用大肠杆菌密码子，并提供N末端甲硫氨酸。用标准重组DNA方法，将含NdeI和KpnI粘性末端和用KpnI和BamHI限制内切酶消化分离的pAMG21-huOPG met[32-401]的～1064bp片段的磷酸化寡核苷酸接头定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点。用电穿孔，按照制造商的方法，将连接混合物转化到大肠杆菌393中。筛选克隆，分离质粒DNA，将DNA测序以确定huOPG met[32-401]基因的DNA序列。
Oligo #1267-065′-TAT GGA AAC TTT TCC TCC AAA ATA TCT TCA TTA TGA TGAAGA AAC TTC TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TCC GCC GGGTAC-3′(SEQ ID NO63)Oligo #1267-075′-CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAG AAG TTTCTT CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG GAA AAG TTT CCA-3′(SEQ ID NO64)将在大肠杆菌宿主393中的pAMG21-huOPG met[32-401]培养物铺在含20μg/ml卡那霉素的2XYT培养基，然后在诱导前，于30℃培养。在将合成的自诱导剂N-(3-氧己酰)-DL-高丝氨酸内酯加到培养基至30ng/ml的终浓度后，诱导从luxPR启动子的huOPG met[32-401]表达，在30℃或37℃将培养物再培养6小时。6小时后，离心(＝30℃I+6或37℃I+6)沉淀细菌培养物。在诱导(＝30℃PreI)前沉淀细菌或不再将自诱导剂加到分离的培养物中，以使其在30℃再培养6小时以得到非诱导(UI)培养物(＝30℃UI)。重悬30℃PreI、30℃UI、30℃I+6或37℃I+6，溶解，然后按照上述节B中所述，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。用考马斯蓝染色和/或转移到硝酸纤维素上的Western分析，然后按照实施例10所述用兔抗-mu OPG-Fc多克隆抗体进行免疫检测。在诱导后基因产物的水平与未诱导的(30℃UI)或预诱导的(30℃PreI)样品进行比较。
D.鼠OPG met[22-401]按下述，将编码N末端甲硫氨酸和鼠(mu)OPG(OPG)多肽的氨基酸22-401的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用寡核苷酸#1257-16和#1257-15作为引物，质粒pRcCMV-Mu OPGDNA为模板，以及节B中所述的热循环条件完成PCR。按照节B中所述纯化PCR产物，用KpnI和BamHI限制内切酶裂解。用节B中所述的方法，将合成寡核苷酸#1260-61和#1260-82各个磷酸化并使其形成带有NdeI和KpnI粘性末端的寡核苷酸接头双螺旋。所述合成的接头双螺旋使用大肠杆菌密码子并提供N末端甲硫氨酸。用标准方法，将在#1260-61和#1260-82之间形成的、含NdeI和KpnI粘性末端的磷酸化的接头双螺旋和用#1257-16和#1257-15产生的，KpnI和BamHI消化并纯化的PCR产物定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，确定DNA序列以证实MuOPG met[22-401]基因的DNA序列。
用节C中所述的方法，确定诱导后在含质粒pAMG21-MuOPGmet[22-401]多肽的393细胞培养物中，重组muOPG met[22-401]的表达。
Oligo #1257-155′-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTC ACGGAT TGA AC-3′(SEQ ID NO65)Oligo #1257-i65′-GTG CTC CTG GTA CCT ACC TAA AAC AGC ACT GCA CAGTG-3′(SEQ ID NO66)Oligo #1260-615′-TAT GGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA CGATCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCCGGG TAC-3′(SEQ ID NO67)Oligo #1260-825′-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAGTTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CCA-3′(SEQ ID NO68)E.鼠OPG met[32-401]按下述，将编码N末端甲硫氨酸和鼠(mu)OPG(OPG)多肽的氨基酸32-401的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。为了达到所述目的，用节B中所述的方法，将合成寡核苷酸#1267-08和#1267-09各个磷酸化并使其形成带有寡核苷酸接头双螺旋。所述合成的接头双螺旋使用大肠杆菌密码子并提供N末端甲硫氨酸。用标准方法，将在#1267-08和#1267-09之间形成的、含NdeI和KpnI粘性末端的磷酸化的接头双螺旋和上述KpnI和BamHI消化并纯化的PCR产物(见节D)定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，确定DNA序列以证实MuOPG met[32-401]基因的DNA序列。
用节C中所述的方法，确定诱导后在含质粒pAMG21-MuOPGmet[32-401]的393细胞培养物中，重组muOPG met[32-401]多肽的表达。
Oligo #1267-085′-TAT GGA CCC AGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGATAA ATG TGC TCC GGG TAC-3′(SEQ ID NO69)Oligo #1267-095′-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAGTTT CTG GGT CCA-3′(SEQ ID NO70)F.鼠OPG met-lys[22-401]按下述，将编码N末端甲硫氨酸后接赖氨酸残基和鼠(mu)OPG(OPG)多肽的氨基酸22-401的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。为了达到所述目的，用节B中所述的方法，将合成寡核苷酸#1282-95和#1282-96各个磷酸化并使其形成带有寡核苷酸接头双螺旋。所述合成的接头双螺旋使用大肠杆菌密码子并提供N末端甲硫氨酸。用标准方法，将在#1282-95和#1282-96之间形成的、含NdeI和KpnI粘性末端的磷酸化的接头双螺旋和上述KpnI和BamHI消化并纯化的PCR产物(见节D)定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，确定DNA序列以证实MuOPG met-lys[22-401]基因的DNA序列。
用节C中所述的方法，确定诱导后在含质粒pAMG21-MuOPG met-lys[2-401]的393细胞培养物中，重组muOPG met-lys[22-401]多肽的表达。
Oligo #1282-955′-TAT GAA AGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTACGA TCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGCTCC GGG TAC-3′(SEQ ID NO71)Oligo #1282-965′-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAGTTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTTTCA-3′(SEQ ID NO72)
G.鼠OPG met-lys-(His)7[22-401]按下述，将编码N末端残基Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His(＝MKH)和鼠OPG氨基酸22-401的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用寡核苷酸#1300-50和#1257-15作为引物，质粒pAMG21-muOPG-met[22-401]DNA为模板完成PCR。热循环条件按照节B中所述。在琼脂糖凝胶上分辨所得的PCR样品，切下PCR产物，纯化用NdeI和BamHI限制内切酶消化并纯化。用标准方法，将用#1300-50和#1257-15产生的，NdeI和BamHI消化并纯化的PCR产物定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，确定DNA序列以证实muOPG MKH[22-401]基因的DNA序列。
用节C中所述的方法，确定诱导后在含重组质粒pAMG21的转化393细胞培养物中，重组MuOPG MKH[22-401]的表达。
Oligo #1300-505′-GTT CTC CTC ATA TGA AAC ATC ATC ACC ATC ACC ATCATG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC ATT ACG AT-3′(SEQID NO73)Oligo #1257-15(见D部分)H.鼠OPG met-lys[22-401](His)7按下述，将编码N末端残基Met-Lys和鼠OPG氨基酸22-401和氨基酸401后的7个His的DNA序列(＝muOPG MK[22-401]-H7)置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用寡核苷酸#1300-49和#1300-51作为引物，质粒pAMG21-muOPG-met[22-401]DNA为模板完成PCR。热循环条件按照节B中所述。在琼脂糖凝胶上分辨所得的PCR样品，切下PCR产物，纯化用NdeI和BamHI限制内切酶消化并纯化。用标准方法，将用#1300-49和#1300-51产生的，NdeI和BamHI消化并纯化的PCR产物定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，确定DNA序列以证实muOPG MK[22-401]-H7基因的DNA序列。
用节C中所述的方法，确定诱导后在含重组质粒pAMG21的转化393细胞培养物中，重组MuOPG MK[22-401]H7多肽的表达。
Oligo #1300-495′-GTT CTC CTC ATA TGA AAG AAA CTC TGC CTC CAA AATACC TGC A-3′(SEQ ID NO74)Oligo #1300-515′-TAC GCA CTG GAT CCT TAA TGA TGG TGA TGG TGA TGATGT AAG CAG CTT ATT TTC ACG GAT TGA ACC TGA TTC CCT A-3′(SEQ ID NO75)I.鼠OPG met[27-401]按下述，将编码N末端残基Met和鼠OPG氨基酸27-401的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用寡核苷酸#1300-74和#1257-15作为引物，质粒pAMG21-muOPG-met[22-401]DNA为模板完成PCR。热循环条件按照节B中所述。在琼脂糖凝胶上分辨所得的PCR样品，切下PCR产物，纯化用NdeI和BamHI限制内切酶消化并纯化。用标准方法，将用#1300-74和#1257-15产生的，NdeI和BamHI消化并纯化的PCR产物定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，确定DNA序列以证实muOPG-met[27-401]基因的DNA序列。
用节C中所述的方法，确定诱导后在含重组质粒pAMG21的转化393细胞培养物中，重组muOPG-met[27-401]多肽的表达。
Oligo#1309-745′-GTT CTC CTC ATA TGA AAT ACC TGC ATT ACG ATC CGGAAA CTG GTC AT-3′(SEQ ID NO76)Oligo#1257-15(见D部分)
J.人OPG met[27-401]按下述，将编码N末端残基Met和人OPG氨基酸27-401的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用寡核苷酸#1309-75和#1309-76作为引物，质粒pAMG21-huOPG-met[22-401]DNA为模板完成PCR。热循环条件按照节B中所述。在琼脂糖凝胶上分辨所得的PCR样品，切下PCR产物，纯化用NdeI和BamHI限制内切酶消化并纯化。用标准方法，将用#1309-75和#1309-76产生的，NdeI和BamHI消化并纯化的PCR产物定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，确定DNA序列以证实huOPG met[27-401]基因的DNA序列。
用节C中所述的方法，确定诱导后在含重组质粒pAMG21的转化393细胞培养物中，重组huOPG-met[27-401]多肽的表达。
Oligo #1309-755′-GTT CTC CTA TTA ATG AAA TAT CTT CAT TAT GAT GAAGAA ACT T-3′(SEQ ID NO77)Oligo #1309-765′-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTT ACTGAT T-3′(SEQ ID NO78)K.鼠OPG met[22-180]按下述，将编码N末端残基Met和鼠OPG氨基酸22-180的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用寡核苷酸#1309-72和#1309-73作为引物，质粒pAMG21-muOPG-met[22-401]DNA为模板完成PCR。热循环条件按照节B中所述。在琼脂糖凝胶上分辨所得的PCR样品，切下PCR产物，纯化用NdeI和BamHI限制内切酶消化并纯化。用标准方法，将用#1309-72和#1309-73产生的，NdeI和BamHI消化并纯化的PCR产物定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，确定DNA序列以证实muOPG met[22-180]基因的DNA序列。
用节C中所述的方法，确定诱导后在含重组质粒pAMG21的转化393细胞培养物中，重组muOPG-met[22-180]多肽的表达。
Oligo #1309-725′-GTT CTC CTC ATA TGG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACCTGC A-3′(SEQ ID NO79)Oligo #1309-735′-TAC GCA CTG GAT CCT TAT GTT GCA TTT CCT TTC TGAATT AGC A-3′(SEQ ID NO80)L.鼠OPG met[27-180]按下述，将编码N末端残基Met和鼠OPG氨基酸27-180的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用寡核苷酸#1309-72和#1309-73作为引物，质粒pAMG21-muOPG-met[22-401]DNA为模板完成PCR。热循环条件按照节B中所述。在琼脂糖凝胶上分辨所得的PCR样品，切下PCR产物，纯化用NdeI和BamHI限制内切酶消化并纯化。用标准方法，将用#1309-74(见节I)和#1309-73(见节K)产生的，NdeI和BamHI消化并纯化的PCR产物定向插入到pAMG21的NdeI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，确定DNA序列以证实muOPGmet[27-180]基因的DNA序列。
用节C中所述的方法，确定诱导后在含重组质粒pAMG21的转化393细胞培养物中，重组muOPG-met[27-180]多肽的表达。
M.鼠OPG met[22-189]和met[22-194]将编码N末端met和鼠OPG氨基酸22-189或22-194的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用B节中的方法，将合成寡核苷酸#1337-92和#1337-93(＝muOPG-189)或#1333-57和#1333-58(＝muOPG-194)各个磷酸化并使其形成一寡核苷酸接头双螺旋对。用KpnI和BspEI限制内切酶裂解纯化的pAMG21-muOPG-met[22-401]质粒DNA，在琼脂糖凝胶上分辨所得的DNA片段。用标准重组DNA方法，分离～413bp的B片段。用标准方法，将在寡核苷酸#1337-92和#1337-93(muOPG-189接头)或#1333-57和#1333-58(muOPG194接头)之间形成的含BspEI和BamHI粘性末端的磷酸化的寡核苷酸接头双螺旋，和用上述KpnI和BspEI限制内切酶消化的、分离的质粒pAMG21-muOPG-met[22-401]的～413bp的B片段定向插入到pAMG21-muOPG-met[22-401]的KpnI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将各连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，完成DNA测序以确定muOPG met[22-189]或muOPG-met[22-194]基因的DNA序列。
用C节中描述的方法，确定转化到393细胞中的重组pAMG21质粒表达重组muOPG met[22-189]和muOPG-met[22-194]多肽的情况。
Oligo #1337-925′-CCG GAA ACA GAT AAT GAG-3′(SEQ ID NO81)Oligo #1337-935′-GAT CCT CAT TAT CTG TTT-3′(SEQ ID NO82)Oligo #1333-575′-CCG GAA ACA GAG AAGCCA CGC AAA AGT AAG-3′(SEQ ID NO83)Oligo #1333-585′-GAT CCT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TTT-3′(SEQ ID NO84)N.鼠OPG met[27-189]和met[27-194]将编码N末端met和鼠OPG氨基酸27-189或27-194的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用标准方法，将含BspEI和BamHI粘性末端的、磷酸化的寡核苷酸接头“muOPG-189接头”或“muOPG194接头”(参见M节)，和用KpnI和BspEI限制内切酶消化的、分离的质粒pAMG21-muOPG-met[22-401]的～413bp的B片段定向插入到pAMG21-muOPG-met[22-401]的KpnI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将各连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，完成DNA测序以确定muOPG met[27-189]或muOPG-met[27-194]基因的DNA序列。
用C节中描述的方法，确定转化到393细胞中的重组pAMG21质粒表达重组muOPG met[27-189]和muOPG-met[27-194]多肽的情况。
O.人OPG met[22-185]、met[22-189]、met[22-194]按如下方法，将编码N末端met和人OPG氨基酸22-185、22-189或22-194的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用B节中的方法，将合成寡核苷酸#1331-87和#1331-88(＝huOPG-185接头)、#1331-89和#1331-90(＝huOPG-189接头)或#1331-91和#1331-92(＝huOPG-194接头)各个磷酸化并使其形成一寡核苷酸接头双螺旋对。用KpnI和NdeI限制内切酶裂解纯化的pAMG21-huOPG-met[27-401]质粒DNA，在琼脂糖凝胶上分辨所得的DNA片段。用标准重组DNA方法，分离～407bp的B片段。用标准方法，将在寡核苷酸#1331-87和#1331-88(＝huOPG-185接头)、#1331-89和#1331-90(＝huOPG-189接头)或#1331-91和#1331-92(＝huOPG-194接头)[各接头均含NdeI和BamHI粘性末端]之间形成的、磷酸化的寡核苷酸接头双螺旋，和用上述KpnI和NdeI限制内切酶消化的、分离的质粒pAMG21-huOPG-met[27-401]的～407bp的B片段定向插入到pAMG21-huOPG-met[22-401]的KpnI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将各连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，完成DNA测序以确定huOPGmet[22-185]、huOPG met[22-189]或huOPG-met[22-194]基因的DNA序列。
用C节中描述的方法，确定转化到393细胞中的重组pAMG21质粒表达重组huOPG met[22-185]、huOPG met[22-189]或huOPG-met[22-194]多肽的情况。
Oligo #1331-875′-TAT GTT AAT GAG-3′(SEQ ID NO85)Oligo #1331-885′-GAT CCT CAT TAA CA-3′(SEQ ID NO86)1-90Oligo #1331-895′-TAT GTT CCG GAA ACA GTT AAG-3′(SEQ ID NO87)Oligo #1331-905′-GAT CCT TAA CTG TTT CCG GAA CA-3′(SEQ ID NO88)
Oligo #1331-915′-TAT GTT CCG GAA ACA GTG AAT CAA CTC AAA AATAAG-3′(SEQ ID NO89)Oligo #1331-925′-GAT CCT TAT TTT TGA GTT GAT TCA CTG TTT CCG GAACA-3′(SEQ ID NO90)P.人OPG met[27-185]、met[27-189]、met[27-194]按如下方法，将编码N末端met和人OPG氨基酸27-185、27-189或27-194的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用标准方法，将均含NdeI和BamHI粘性末端的、磷酸化的寡核苷酸接头“huOPG-185接头”、“huOPG-189接头”或“huOPG-194接头”(见O节)，和用上述KpnI和Nde I限制内切酶消化的、分离的质粒pAMG21-huOPG-met[27-401]的～407bp的B片段定向插入到pAMG21-huOPG-met[27-401]的KpnI和BamHI位点之间。用制造商的方法，通过电穿孔将各连接混合物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，分离质粒DNA，完成DNA测序以确定huOPG met[27-185]、huOPG met[27-189]或huOPG-met[27-194]基因的DNA序列。
用C节中描述的方法，确定动转化到393细胞中的重组pAMG21质粒表达重组huOPG met[27-185]、huOPG met[27-189]或huOPG-met[27-194]多肽的情况。
Q.鼠OPG met[27-401](P33E，G36S，A45P)按如下方法，将编码N末端met和人OPG的氨基酸27-48，接鼠OPG的氨基酸残基49-401的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用标准重组DNA方法，经AatII和KpnI限制内切酶裂解纯化的pAMG21-huOPG-met[27-401]质粒DNA，然后从琼脂糖凝胶上分离～1075bp的B片段。另外，用KpnI和BamHI限制内切酶消化质粒pAMG21-muOPG-met[22-401]DNA(见D节)，然后按上述分离～1064bp的B片段。用标准重组DNA方法，连接分离的、含AatII和KpnI粘性末端(见上述)的～1075bp的pAMG21-huOPG-met[27-401]限制片段，含KpnI和BamHI粘性末端的～1064bp的pAMG21-muOPG-met[22-401]限制片段和含AatII和BamHI粘性末端并相应于AatII和BamHI之间的pAMG21之核酸序列的～5043bp限制片段。按照制造商的方法，通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌宿主393中。筛选克隆，用标准DNA方法确定质粒中重组插入片段的存在。muOPG-27-401(P33E，G36S，A45P)基因。在muOPG中，氨基酸从脯氨酸-33变成谷氨酸-33、甘氨酸-36变成丝氨酸-36和丙氨酸-45变成脯氨酸-45产生于用huOPG残基27-48取代了muOPG残基27-48。
用C节中所述的方法，确定含重组pAMG21质粒的转化393细胞表达重组muOPG-met[27-401](P33E，G36S，A45P)的情况。
R.鼠OPG met-lys-(his)7-ala-ser-(asp)4-lys[22-401](A45T)将编码N末端His标记和肠激酶识别序列(NH2-COOH末端)Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Ala-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(＝HEK)，接鼠OPG多肽之氨基酸22-401的DNA序列置于原核质粒表达载体pAMG21中luxPR启动子的控制下。用NheI和BamHI限制内切酶消化pAMG22-His(见A节)，用标准重组DNA方法从琼脂糖凝胶中分离大片段(A片段)。将寡核苷酸#1282-91和#1282-92各个磷酸化，用前述方法(见B节)使其形成寡核苷酸接头双螺旋。用标准重组DNA方法，连接在寡核苷酸#1282-91和#1282-92之间形成的，含NheI和KpnI粘性末端的磷酸化接头双螺旋和所述KpnI和BamHI消化并纯化的PCR产物(见D节)，以及用NheI和BamHI消化的载体pAMG22-His的A片段。按照制造商的方法，通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌宿主GM120中。筛选克隆，分离质粒DNA，完成DNA测序以确定muOPG-HEK[22-401]基因的DNA序列DNA测序表明，在天然muOPG中有一假突变，它导致muOPG多肽中的一个氨基酸丙氨酸-45变成了苏氨酸。
用与C节所述相似的方法，除不加入合成的自诱导剂，而加入IPTG，达到0.4mM的终浓度以完成诱导外，从而确定含重组pAMG21质粒的GM120细胞表达重组muOPG-HEK[22-401](A45T)的情况。
Oligo #1282-915′-CTA GCG ACG ACG ACG ACA AAG AAA CTC TGC CTC CAAAAT ACC TGC ATT ACG ATC CGG AAA CTG GTC ATC AGC TGC TGTGTG ATA AAT GTG CTC CGG GTA C-3′(SEQ ID NO91)Oligo #1282-925′-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAGTTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTTTGT CGT CGT CGT CG-3′(SEQ ID NO92)S.人OPG met-arg-gly-ser-(his)6[22-401]设计8个寡核苷酸(1338-09到1338-16，下文所示)以产生175个碱基的、重叠的双链DNA。将寡核苷酸退火，连接，用5’和3’寡核苷酸作为PC引物以产生大量175个碱基的片段。用限制内切酶ClaI和KpnI消化最终PCR基因产物以得到一取代人OPGN末端28个密码子的片段。将ClaI和KpnI消化的PCR产物插入到也已经用ClaI和KpnI裂解的pAMG21-huOPG[27-401]中。将连接的DNA转化到大肠杆菌菌株393的感受态细胞中。筛选克隆生产重组蛋白产物的能力并评估具有正确核苷酸序列的基因融合。从50ml振荡烧瓶的研究中确定蛋白的表达水平。用鼠抗OPG抗体，通过考马斯蓝染色的PAGE凝胶和Western分析全细胞溶解产物和声处理沉淀表达所述构建体的情况。huOPG Met-Arg-Gly-Ser-(His)6[22-401]的表达使得形成大量的包含体，而蛋白在不可溶(沉淀)级分中。
1338-09ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GA (SEQ ID NO93)1338-10TTT GTT TTA ACT AAT TAA AGG AGG AAT AAA ATA TGA GAG GAT CGC ATC AC(SEQ ID NO94)1338-11CAT CAC CAT CAC GAA ACC TTC CCG CCG AAA TAC CTG CAC TAC GAC GAA GA(SEQ ID NO95)1338-12AAC CTC CCA CCA GCT GCT GTG CGA CAA ATG CCC GCC GGG TAC CCA AAC A(SEQ ID NO96)
1338-13TGT TTG GGT ACC CGG CGG GCA TTT GT(SEQ ID NO97)1338-14CGC ACA GCA GCT GGT GGG AGG TTT CTT CGT CGT AGT GCA GGT ATT TCG GC(SEQ ID NO98)1338-15GGG AAG GTT TCG TGA TGG TGA TGG TGA TGC GAT CCT CTC ATA TTT TAT T(SEQ ID NO99)1338-16CCT CCT TTA ATT AGT TAA AAC AAA TCT AGT ATC AAA TCG ATT GTG TTT GT(SEQ ID NO100)T.人OPG met-lys[22-401]和met(lys)3[22-401]为了构建人OPG[22-401]的met-lys和met(lys)3版本，设计重叠的寡核苷酸以加入适当数量的赖氨酸残基。设计各构建体的两个寡核苷酸以重叠，使两轮PCR最终产生出终产物。第一个PCR的模板是含人OPG22-401基因的质粒DNA制品。第一个PCR增加了赖氨酸残基。第二个PCR使用前一轮的产物并将序列加到第一限制位点，ClaI。
用限制内切酶ClaI和KpnI消化最终PCR基因产物，取代人OPGN末端的28个密码子，然后连接到也已经用计所述两种限制内切酶消化的质粒pAMG21-hu OPG[27-401]中。将连接的DNA转化到大肠杆菌菌株393的感受态细胞中。筛选克隆生产重组蛋白产物的能力并评估具有正确核苷酸序列的基因融合。从50ml振荡烧瓶的研究中确定蛋白的表达水平。用鼠抗OPG抗体，通过考马斯蓝染色的PAGE凝胶和Western分析全细胞溶解产物和声处理沉淀表达所述构建体的情况。既没有可检测水平的蛋白表达水平，也看不到包含体。通过DNA测序确定DNA序列。
制备Met-Lys huOPG[22-401]的寡核苷酸引物
1338-17ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATTAAA GGA GGA ATA AAA TG (SEQ ID NO101)1338-18CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAG AAA CTT TTC CTC CAAAAT ATC (SEQ ID NO102)1338-20TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (SEQ IDNO103)Oligonucleotide primers to prepare Met-(Lys)3-huOPG[22-401]1338-17ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATTAAA GGA GGA ATA AAA TG (SEQ ID NO104)1338-19CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAA AAA AAG AAA CTT TTCCTC CAA AAT ATC (SEQ ID NO105)1338-20TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (SEQ IDNO106)构建4种OPG-Fc融合蛋白，其中在人或鼠促骨生长素的氨基酸22-401的N末端(称为Fc/OPG[22-401])或C末端(OPG[22-401]/Fc)融合人IgG1 Fc区。用实施例7中所述的融合载体pFc-A3构建融合物。
用标准PCR技术构建所有融合基因。PCR反应的模板是含靶基因的质粒制品。设计重叠寡核苷酸以便将一个基因的C末端部分与另一基因的N末端部分组合在一起。该方法可以在已经完成适当的PCR反应后，将两个基因正确地融合在阅读框架中。首先将各基因的一个“融合”寡核苷酸放在含有通用引物的PCR反应中，所述通用引物是用于携带靶基因的载体的。用互补“融合”寡核苷酸与通用引物一起使用以PCR另一基因。在所述第一PCR反应结束时，得到两种不同的产物，每个基因均有融合位点，产生足够的重叠以启动第二轮PCR并产生所需的融合。在第二轮PCR中，用通用引物并经重叠区将前两个PCR引物组合在一起，产生全长融合DNA序列。
用限制内切酶XbaI和BamHI消化最终的PCR基因产物，然后连接到已经用同样两种限制内切酶消化的载体pAMG21中。将连接的DNA转化到大肠杆菌菌株393的感受态细胞中。根据生产重组蛋白产物的能力和是否拥有具有正确核苷酸序列的基因融合来筛选克隆。从40ml振荡烧瓶研究确定蛋白的表达水平。用鼠抗OPG抗体，通过考马斯蓝染色的PAGE凝胶和Western印迹分析全细胞溶解产物，声处理沉淀和上清液表达融合蛋白的情况。
Fc/huOPG[22-401]在考马斯蓝染色的PAGE凝胶和Western印迹上检测Fc/hu OPG[22-401]融合肽的表达。所述细胞后大量的包含体，大部分主要产物在不可溶(沉淀)级分中。用下列引物构建所述OPG-Fc融合1318-48CAG CCC GGG TAA AAT GGA AAC GTT TCC TCC AAA ATA TCT TCATT (SEQ ID NO107)1318-49CGT TTC CAT TTT ACC CGG GCT GAG CGA GAG GCT CTT CTG CGTGT (SEQ ID NO108)Fc/muOPG[22-401]在考马斯蓝染色的PAGE凝胶和Western印迹上检测Fc/huOPG[22-401]融合肽的表达。所述细胞后大量的包含体，大部分主要产物在不可溶(沉淀)级分中。用下列引物构建所述OPG-Fc融合1318-50CGC TCA GCC CGG GTA AAA TGG AAA CGT TGC CTC CAA AAT ACCTGC (SEQ ID NO109)1318-51CCA TTT TAC CCG GGC TGA GCG AGA GGC TCT TCT GCG TGT(SEQ ID NO110)muOPG[22-401]/Fc在考马斯蓝染色的PAGE凝胶和Western印迹上检测融合肽的表达。重组产物的量少于在N末端有Fc区的OPG融合蛋白的。检测不到明显的包含体。大部分产物似乎是在不可溶(沉淀)级分中。用下列引物构建OPG-Fc融合1318-54GAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC(SEQ ID NO111)1318-55CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G(SEQ ID NO112)huOPG[22-401]/Fc在考马斯染色凝胶上检测不到融合肽的表达，尽管有模糊的Western阳性信号。检测不到明显的包含体。用下列引物构建OPG-Fc融合1318-52AAA AAT AAG CTG CTT AGCTGC AGC TGA ACC AAA ATC(SEQ ID NO113)1318-53CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG ATT GG(SEQ ID NO114)V.人OPGmet[22-401]-Fc融合(P25A)该构建体含有位置25脯氨酸到丙氨酸的氨基酸改变(P25A)和huOPGmet[22-401]-Fc融合。用限制内切酶ClaI和KpnI消化质粒，经所述消化除去该基因N末端的28个密码子，凝胶纯化所得的小(少于200个碱基对)片段。然后将含脯氨酸到丙氨酸改变的片段连接到已经用同样两种限制内切酶消化的质粒pAMG21-huOPg[22-401]-Fc融合中。将连接的DNA转化导航大肠杆菌菌株393的感受态宿主细胞中，根据生产重组蛋白产物的能力并评估具有正确核苷酸序列的基因融合来筛选克隆。从50ml振荡烧瓶研究确定蛋白表达水平。用鼠抗体OPG抗体，通过考马斯蓝染色的PAGE凝胶和Western印迹，分析全细胞溶解产物和声处理的沉淀。在考马斯染色PAGE凝胶和Western印迹上检测融合肽的表达水平。蛋白在不可溶(沉淀)级分中。细胞有大量包含体。
W.人OPG met[22-401](P25A)按如下所述，构建编码N末端甲硫氨酸和人OPG氨基酸22-401(位置25的脯氨酸被丙氨酸所取代)的DNA序列置于原核表达载体pAMG21luxPR启动子的控制下将合成的寡核苷酸#1289-84和#1289-85退火以形成含XbaI和KpnI粘性末端的寡核苷酸接头双螺旋。所述合成接头双螺旋使用最佳的大肠杆菌密码子，并编码N末端甲硫氨酸。该接头还包括在源序列中没有的SpeI限制位点。用标准方法，将接头双螺旋定向插入到pAMG21-huOPG-22-401的XbaI和KpnI位点之间。通过转化，将连接混合物导入到大肠杆菌宿主GM221中。首先筛选能够生产重组蛋白的克隆。从阳性克隆中分离质粒DNA，完成DNA测序以确定HuOPG-Met[22401](P25A)基因的DNA序列。用下列寡核苷酸产生XbaI-KpnI接头Oligo #1289-845′-CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TGC TCCAAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TAG TCA TCA GCT GCTGTG TGA TAA ATG TCC GCC GGG TAC -3′(SEQ ID NO115)Oligo #1289-855′-CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC TAGTTT CTT CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG CAA AAG TTT CCATAT GTT ATTCCT CCT T-3′(SEQ ID NO116)X.人OPG met[22-401](P26A)和(P26D)按如下所述，构建编码N末端甲硫氨酸和人OPG氨基酸22-401(位置26的脯氨酸被丙氨酸所取代)的DNA序列置于原核表达载体pAMG21luxPR启动子的控制下将合成的寡核苷酸#1289-86#1289-87退火以形成含XbaI和SpeI粘性末端的寡核苷酸接头双螺旋。所述合成接头双螺旋使用最佳的大肠杆菌密码子，并编码N末端甲硫氨酸。该接头还包括在源序列中没有的SpeI限制位点。用标准方法，将接头双螺旋定向插入到pAMG21-huOPG-22-401的XbaI和KpnI位点之间。通过转化，将连接混合物导入到大肠杆菌宿主GM221中。首先筛选能够生产重组蛋白的克隆。从阳性克隆中分离质粒DNA，完成DNA测序以确定HuOPG-Met[22-401](P26A)基因的DNA序列。发现一被测序的克隆是用天冬氨酸而不是丙氨酸取代26位脯氨酸，将该克隆称为huOPG-Met[22-401](P26D)。用下列寡核苷酸产生XbaI-KpnI接头Oligo #1289-865′- CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TCCTGC TAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AA - 3′(SEQ ID NO117)Oligo #1289-875′-CTA GTT TCT TCA TCA TAA TGA AGA TAT TTA GCAGGA AAA GTT TCC ATA TGT TAT TCC TCC TT - 3′(SEQ ID NO118)Y.人OPG met[22-194](P25A)按如下所述，构建编码N末端甲硫氨酸和人OPG氨基酸22-194(位置25的脯氨酸被丙氨酸所取代)的DNA序列置于原核表达载体pAMG21luxPR启动子的控制下用KpnI和BamHI内切酶分别消化质粒pAGM21-huOPG[27-194]和pAGM21-huOPG[22-401](P25)。从pAGM21-huOPG[27-194]中分离450bp片段，从pAGM21-huOPG[22-401](P25A)分离6.1kbp片段。将这些片段连在一起，通过转化，导入到大肠杆菌宿主GM221中。首先筛选能够生产重组蛋白的克隆。从阳性克隆中分离质粒DNA，完成DNA测序以确定HuOPG-Met[22-194](P25A)基因的DNA序列。
实施例9缔合OPG单体用过表达muOPG[22-401]的工程CHO细胞产生条件培养基，以便用兔多克隆抗-OPG抗体分析分泌的重组OPG。将一份条件培养基浓缩20倍，然后通过还原和非还原SDS-PAGE分析(图15)。在还原条件下，蛋白迁移为Mr50-55kd的多肽，与预期的，如果在其一个或多个一致的N-连接糖基化位点糖基化成熟产物的结果相同。令人惊奇的是，当用非缓和SDS-PAGE分析相同样品时，大部分蛋白迁移为约100kd的多肽，两倍于还原蛋白。另外，有少量Mr 50-55kd的多肽。在SDS-PAGE的该图谱与OPG产物通过游离巯基氧化形成二聚体的看法一致。
预期的成熟OPG多肽含23个半胱氨酸残基，预计其中18个与形成含有4个半胱氨酸富集结构域的链内二硫键有关(图12A)。另5个C末端半胱氨酸残基与二级结构无关，可能与其它TNFR家族成员的同源性有关的。总而言之，半胱氨酸残基的净数量不均匀，形式上的可能性是，至少一个残基是游离的，以在两个OPG单体之间形成分子间二硫键。
为了有助于阐明OPG运动和单体缔合方式，完成了脉冲-追踪标记研究。按上述，在含32S甲硫氨酸和半胱氨酸的无血清培养基中，将表达muOPG[22-401]的CHO细胞标记30分钟。此后，除去培养基，用含未标记甲硫氨酸和半胱氨酸(在超过放射性氨基酸原浓度约2000倍的水平)的完全培养基代替。在加入后30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和12小时，通过取出条件培养基来收集培养物，然后制备条件培养基和黏附单层的溶解产物。按上述澄清培养基和细胞溶解产物，然后用抗-OPG抗体免疫沉淀。洗涤免疫沉淀物后，通过在非还原SDS-PAGE缓冲液中煮沸而将其释放，然后分成相等的两半。向一半，加入还原剂β-巯基乙醇至5％(v/v)的终浓度，而将另一半在非还原条件下保持。按照上述，用SDS-PAGE分析两组免疫沉淀物，然后进行放射自显影并暴露于胶片。结果列于图16中。下面两组描述了用SDS-PAGE分析的样品。合成后，将OPG多肽迅速加工成稍微大一些的多肽，这种多肽可以用N-连接糖基化表示修饰。在约1-2小时后，细胞中的OPG水平明显下降，在培养上清液中也同时出现这种情况。这似乎是在这段时间内，OPG从细胞中媒体运输到培养基中的结果，与OPG是天然分泌蛋白的看法一致。在非还原条件下分析相同的免疫沉淀物表明了OPG二聚体形成与分泌到条件培养基中的关系(图16上组)。在前30-60分钟，通过明显的糖基化作用，在细胞中加工OPG单体，随后二聚体形成。此后，使OPG单体的主体形成二聚体，所述二聚体随后从细胞中消失。在合成开始后约60分钟，OPG二聚体似乎在条件培养基中，并在试验过程中积累。在该过程后，二聚体形成，然后被分泌到培养基中。在这段时间内，细胞内的OPG保持低水平，而少量也在培养基中。这看来不是共价OPG二聚体断裂的结果，而是在细胞和随后的分泌中产生了亚化学计量的单体。
从转染的CHO细胞中重组生产的OPG大部分是二聚体。为了确定二聚化是否是OPG合成中的一个天然过程，我们分析了天然表达OPG的细胞系的条件培养基。发现CTLL-2细胞系，鼠细胞毒T淋巴细胞系(ATCCTIB-214)在筛选的组织和细胞系RNA中表达OPGmRNA。发现OPG转录本与从肾克隆并测序的2.5-3.0kb RNA相同，而且发现编码一分泌的分子。从CTLL-2细胞得到的条件培养基的Western印迹分析表明大部分(如果不是全部的话)分泌的OPG蛋白是二聚体(图17)。这说明OPG二聚化和分泌不是细胞系中过表达的人为现象，而可能是有表达细胞生产之产物的主要形式。
分析正常和转基因小鼠的组织和血清以确定在OPG转基因小鼠中表达的OPG分析的性质。由于在控制肝细胞对照元素的条件下表达大鼠OPGcDNA，所以分析在非还原条件下，从对照和转基因小鼠的实质制备的提取物(图18)。在来自转基因，而不是对照小鼠的提取物中，很容易检测到OPG二聚体，与亚化学计量的单体。OPG二聚体和单体似乎与在遗传工程CHO细胞中表达的重组鼠蛋白相同。这有力的说明，OPG二聚体确实是所述基因产物的天然形式，而且可能是关键的活性组分。用Western印迹相似地分析来自对照和转基因小鼠的血清样品。在对照小鼠中，大部分OPG蛋白迁移为二聚体，而也检测到少量单体。另外，检测到显著量的较大的OPG相关蛋白，它们以与共价相连的三聚体的预期大小一致的相对分子量迁移。因此，在OPG转基因小鼠中，重组OPG主要是被表达为二聚体蛋白，而且二聚体形式可能是OPG小鼠中骨硬化表型的基础。OPG重组蛋白也可以以较大的分子量“三聚体”形式存在。
为确定在同二聚过程中，OPG的5个C末端半胱氨酸残基是否起作用，按照上述，用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，San Diego，CA)将半胱氨酸残基195(C195)、C202、C277、C319和C400的鼠OPG密码子变成丝氨酸。将muOPG基因亚克隆到pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen，San Diego，CA)的NotI和XbaI位点之间。存在脱氧核苷酸的条件下，用Pfu聚合酶处理所得的质粒pcDNA3.1-muOPG和诱变引物，然后按照上述用热循环仪扩增。通过热休克，将一份反应物转染到感受态大肠杆菌XL1-Blue中，然后铺板。然后将来自转化体的DNA的质粒DNA测序以证实突变。
用下列引物对将鼠OPG基因的半胱氨酸残基195变成丝氨酸，以便生产muOPG[22-401]C195S蛋白
1389-195’-CAC GCA AAA GTC GGG AAT AGA TGT CAC-3’(SEQ IDNO150)1406-385’-GTG ACA TCT ATT CCC GAC TTT TGC GTG-3’(SEQ IDNO151)用下列引物对将鼠OPG基因的半胱氨酸残基202变成丝氨酸，以便生产muOPG[22-401]C202S蛋白1389-215’-CAC CCT GTC GGA AGA GGC CTT CTT C-3’(SEQ ID NO152)1389-225’-GAA GAA GGC CTC TTC CGA CAG GGT G-3’(1389-22)(SEQ ID NO153)用下列引物对将鼠OPG基因的半胱氨酸残基277变成丝氨酸，以便生产muOPG[22-401]C277S蛋白1389-235’-TGA CCT CTC GGA AAG CAG CGT GCA-3’(SEQ ID NO154)1389-245’-TGC ACG CTG CTT TCC GAG AGG TCA-3’(SEQ ID NO155)用下列引物对将鼠OPG基因的半胱氨酸残基319变成丝氨酸，以便生产muOPG[22-401]C319S蛋白1389-175’-CCT CGA AAT CGA GCG AGC AGC TCC-3’(SEQ ID NO156)1389-185’-CGA TTT CGA GGT CTT TCT CGT TCT C-3’(SEQ ID NO157)
用下列引物对将鼠OPG基因的半胱氨酸残基400变成丝氨酸，以便生产muOPG[22-401]C400S蛋白1406-725’-CCG TGA AAA TAA GCT CGT TAT AAC TAG GAA TGG-3’(SEQ ID NO158)1406-755’-CCA TTC CTA GTT ATA ACG AGC TTA TTT TCA CGG-3’(SEQ ID NO159)然后将含适当突变的各个所得muOPG[22-401]质粒转染到人293细胞中，按照上述从条件培养基中纯化突变OPG-Fc融合蛋白。按照实施例11所述的体外破骨细胞形成试验评估各蛋白的生物活性。用非还原SDS-PAGE和Western印迹，用抗OPG抗体分析来自各转染体的条件培养基。
5个C末端半胱氨酸残基的任何突变均会导致大部分(＞90％)生产单体55kdOPG分子。这有力地说明，C末端半胱氨酸残基在OPG同二聚中均起作用。
构建C末端OPG缺失突变体以描绘出OPG-C末端结构域的图谱，所述结构域对于OPG同二聚是很重要的。用在鼠OPGC末端区导入预成熟终止翻译信号的引物，通过PCR扩增构建这些OPG突变体。设计MuOPG启始密码子的5’寡核苷酸(含HindIII限制位点)，并设计3’寡核苷酸(含终止密码子和XhoI位点)以便在muOPG的C末端区于苏氨酸残基(CT200)、脯氨酸212(CT212)、谷氨酸293(CT-293)或丝氨酸(CT-355)截短。
用下列引物构建muOPG[22-200]1091-395’-CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3’(SEQ ID NO160)1391-915’-CCT CTC TCG AGT CAG GTG ACA TCT ATT CCA CAC TTT TGCGTG GC-3’(1391-91)(SEQ ID NO161)用下列引物构建muOPG[22-212]1091-39
5’-CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3’(SEQ ID NO162)1391-905’-CCT CTC TCG AGT CAA GGA ACA GCA AAC CTG AAG AAG GC-3’(SEQ ID NO163)用下列引物构建muOPG[22-293]1091-395’-CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3’(SEQ ID NO164)1391-895’-CCT CTC TCG AGT CAC TCT GTG GTG AGG TTC GAG TGG CC-3’(SEQ ID NO165)用下列引物构建muOPG[22-355]1091-395’-CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3’(SEQ ID NO166)1391-885’CCT CTC TCG AGT CAG GAT GTT TTC AAG TG TTG AGG GC-3’(SEQ ID NO167)然后将含适当突变的各个所得muOPG-CT质粒转染到人293细胞中，按照上述从条件培养基中纯化突变OPG-Fc融合蛋白。按照实施例11所述的体外破骨细胞形成试验评估各蛋白的生物活性。用非还原SDS-PAGE和Western印迹，用抗OPG抗体分析来自各转染体的条件培养基。
截短OPG的C末端影响OPG形成同二聚体的能力。CT355大部分是单体，尽管也形成了一些二聚体。CT293似乎形成了等摩尔的单体和二聚体，以及高分子量聚集物。
实施例10纯化OPGA.纯化哺乳动物OPG-Fc融合蛋白按下述制备5L表达OPG-Fc融合蛋白之293细胞的条件培养基。将冷冻细胞样品融解到10ml 293S培养基(DMEM-高葡萄糖，1xL-谷氨酰胺，10％热灭活的胎牛血清(FBS)和100μg/ml潮霉素)中，1天后用新鲜培养基补料。3天后，将细胞以1∶10和1∶20的稀释度分到两个T175烧瓶中。作另两个1∶10分开物，达到200 T175烧瓶的规模。细胞在此融解后点5天。使细胞生长到接近汇合(约3天)，此时吸出含血清的培养基，用每烧瓶25ml PBS将细胞洗涤1次，将25ml SF培养基(DMEM-高葡萄糖，1x L-谷氨酰胺)加到各烧瓶中。将细胞在5％CO2中保持3天，然后收集培养基，离心并通过0.45m纤维素硝酸滤纸(Corning)过滤。
利用经PBS平衡的Pretein G Sepharose柱(Pharmacia)纯化OPG-Fc融合蛋白。柱的大小取决于起始的培养基体积。将按上述制备的条件培养基负载到所述柱上，用PBS洗涤所述柱，用100mM甘氨酸pH2.7洗脱纯化蛋白。将馏份收集到含1M Tris pH9.2的试管中以便尽可能的迅速中和。将含馏份的蛋白集池，用Amicon Centricon10或Centriprep10浓缩，然后透析到PBS中。将纯化蛋白于-802贮存。
用该方法纯化鼠[22-401]-Fc、鼠[22-180]-Fc、鼠[22-194]-Fc、人[22-401]-Fc和人[22-201]-Fc。用该方法纯化鼠[22-185]-Fc。
B.制备抗OPG抗体给三只新西兰白兔(开始重5-8磅)皮下注射muOPG[22-401]-Fc融合蛋白。在1天，用乳化在等体积弗氏完全佐剂中的50μg抗原免疫各兔。用相同的方法，只是用不完全佐剂代替进行加强免疫(14天和28天)。用EIA监测抗体滴定度。第二次加强免疫后，抗血清有高抗体滴定度，并从各动物中得到25ml生产血。使血清先通过固定鼠OPG-Fc的亲和柱。用含1％冰醋酸的Pierce Gentle洗脱缓冲液洗脱抗OPG抗体。然后将洗脱的蛋白透析到PBS中，通过Fc柱以去除任何OPG融合蛋白Fc特异性的抗体。将含抗OPG特异性抗体的流过级分透析到PBS中。
C.纯化鼠OPG[22-401]抗体亲和层析将亲和纯化的抗OPG抗体透析到结合缓冲液(0.1M碳酸钠pH8.3，0.5MNaCl)中，在室温与CNBr激活的琼脂糖珠(Pharmacia)混合2小时。室温下，在用1M乙醇胺(pH8.0)经2小时阻断未占据的位点前，用结合缓冲液剧烈洗涤树脂。然后用低pH(0.1M醋酸钠pH4.0，0.5MNaCl)洗涤树脂，然后用高pH(0.1M Tris-HCl pH8.0，0.5MNaCl)洗涤。最后用PBS平衡树脂，然后装到柱上。装柱后，用PBS洗涤树脂。用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)进行空白洗脱，然后用PBS再平衡。
将来自表达muOPG[22-401]的CHO细胞的浓缩条件培养基以低流速用于所述柱。用PBS洗涤该柱，直到在280nm测量的UV吸收值恢复到基线。用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)先从所述柱上洗脱蛋白，用PBS再平衡，用第二种缓冲液(0.1M CAPS，pH10.5，1M NaCl)洗脱。将两个洗脱合并液分别渗滤到PBS中，在于-20℃冷冻前无菌过滤。
常规层析用Amicon spiral wound cartrige(S10Y10)将CHO细胞条件培养基浓缩23倍，然后渗滤到20mM Tris pH8.0中。然后将渗滤的培养基应用到已经用20mM Tris pH8.0平衡的Q-琼脂糖HP(Pharmacia)柱。洗涤该柱直到在280nm的吸收值达到基线。用20倍柱体积在Tris pH8.0中的0-300mM NaCl的梯度洗脱蛋白。用柱馏份的Western印迹检测OPG蛋白。
将含OPG的级分合并，然后放到终浓度为300mM NaCl，0.2mM DTT中。使用20mM Tris pH8.0，300mM NaCl，0.2mM DTT平衡NiNTA琼脂糖(Qiagen)柱，然后将合并的馏份应用于其上。用平衡缓冲液洗涤该柱，直到达到基线吸收值。用在平衡缓冲液中0-30mM咪唑梯度从柱上洗脱蛋白。用1M咪唑洗涤掉柱上剩余的蛋白。再用Western印迹检测含OPG的馏份。
将来自NiNTA柱的合并的馏份透析到10mm磷酸钾pH7.0，0.2mMDTT中然后将透析的合并液应用到已经用10mM磷酸盐缓冲液平衡的陶瓷的羟磷灰石层析柱(Bio-Rad)。洗涤柱后，用20个柱体积的10-100mM磷酸钾梯度洗脱蛋白。然后用20柱体积的100-400mM磷酸盐梯度洗涤。
用考马斯蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶和Western印迹检测OPG。将级分合并，然后透析到PBS中，并于-80℃贮存。纯化的蛋白分离为单体，而且在透析到PBS中后也是如此。当冷冻或于4℃pH5贮存时，单体是稳定的。但是，如果4℃贮存于PBS中，则将在1星期后形成二聚体而且可能形成三聚体。
D.从大肠杆菌中纯化人OPG met[22-401]5℃，用低剪切匀浆器，将细菌细胞浆悬浮到10mM EDTA中，达到15％(w/v)的浓度。然后通过在5℃各以15000psi匀浆两次来破碎细胞。用低剪切匀浆，以原匀浆体积，将离心沉淀洗涤到水中，然后按前述离心。然后在室温，用6M(终浓度)盐酸胍，10mM二硫苏糖醇，10mM TrisHCl，pH8.5溶液经30分钟，将洗涤的沉淀溶解到15％(w/v)。在含50mM CAPS，pH10.5，1mM还原的谷胱甘肽的2M脲中，将溶液稀释30倍，然后在5℃搅拌72小时。首先，在25℃用醋酸将pH调到4.5，然后在用25mM醋酸钠pH4.5，平衡的SP-HP琼脂糖树脂柱上层析来从溶液中纯化OPG。用20个柱体积，以0.1柱体积/分的流速，用50mM-550mM相同缓冲液中的线性氯化钠梯度完成柱洗脱。收集仅含所需OPG形式的峰馏份，然后于5℃贮存，或将缓冲液换成磷酸缓冲的盐，通过超滤浓缩，然后于5℃贮存。用反相HPLC，SDS-PAGE、有关内毒素存在的鲎溶解物试验和N末端测序分析该物质。另外，也可以用如质谱分析、pH/温度稳定性、荧光、圆二色、差示扫描量热法和蛋白酶图谱试验等技术确定蛋白的折叠特性。
实施例11重组OPG的生物活性以组织学和组织形态学为基础，在转基因小鼠中OPG的肝过表达显著降低了破骨细胞的数量，从而明显增加了骨组织(见实施例4)。为了进一步研究产生该体外作用的潜在机制，用一破骨细胞形成的体外培养模型(破骨细胞形成试验)检测重组OPG的各种形式。该培养系统原来是由Udagawa(Udagawa等人，内分泌学，125，1805-1813(1989)，美国国家科学院进展87，7260-7264(1990))发明的，该系统使用来自骨髓细胞和来自骨髓基质细胞系之细胞的组合。已经公开了用于这些研究的对该培养系统改进的描述(Lacey等人，内分泌学136，2367-2376(1995))。在该方法中，来自小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞在用500U/ml CSF-1(菌落刺激因子1，也称为M-GSF，一种单核细胞/巨噬细胞家族谱系特异性的造血细胞生长因子)培养基(含10％热失活胎牛血清的αMEM)中过夜培养。培养后，收集非黏附细胞，经梯度纯化，然后与来自骨髓细胞系ST2的细胞共培养(1×106非黏附细胞1×105ST2细胞/ml培养基)。用地塞米松(100nM)和已知为1，25二羟维生素D3(1，25(OH)2D3，10nM)的维生素D3的生物活性代谢产物补充培养基。为了改进破骨细胞的外观，将前列腺素E2(250nM)加到某些培养物中。共培养期通常为8-10天，每3-4天更新用所有新鲜补充物补充的培养基。在不同间隔，用组织化学染色(Sigma试剂盒#387A，Sigma，St.Louis，MO)或TRAP溶液试验，评估培养物是否存在酒石酸磷酸酶(TRAP)。TRAP组织化学方法可以鉴定既是多核(＞＝3核)细胞，也是TRAP+的破骨细胞表型。所述溶液试验包括将含破骨细胞的培养物溶解在含0.1％Triton X-100的柠檬酸盐缓冲液(100mM，pH5.0)中。然后存在80mM酒石酸钠的条件下，以将对硝基苯基磷酸酯(20nM)转变成对硝基酚为基础，测量酒石酸抗性酸性磷酸酶活性，所述转变发生在于RT培养3-5分钟的过程中。通过加入NaOH至0.5M的终浓度来终止反应。测量在405nm的光密度并作图表示结果。
以前用破骨细胞形成试验的研究(Udagawa等人，出处同上)表明，这些细胞表达125I-降钙素受体(放射自显影)，并可在骨表面产生窝，当于TRAP阳性结合时，可以确定多核细胞有破骨细胞表型。在体外破骨细胞形成试验中产生的支持多核细胞的破骨细胞表型的其它证据是，通过免疫细胞化学和降钙素受体和通过原位杂交(ISH)TRAP mRNA确定细胞表达αv和β3整合素。
从CHO细胞条件培养基中纯化huOPG[22-401]-Fc融合蛋白，随后用于破骨细胞形成试验中。100ng/ml huOPG[22-401]-Fc时，破骨细胞形成基本上受到100％的抑制(图19)。存在ID50为约3ng/ml的OPG时，在微滴定板孔内溶解的培养物中测量的TRAP水平也受到抑制(图20)。溶解产物中TRAP活性的水平与通过TRAP细胞化学检测法见到的破骨细胞相对数量有关(比较图19A-19G和20)。在该模型中，还试验了纯化的人IgG1和TNFbp，发现没有抑制或刺激作用，这表明，huOPG[22-401]-Fc的抑制作用是由于所述融合蛋白的OPG部分而产生的。已经试验了其它形式的人和鼠分子，在表1中总结了累积数据。
表1不同OPG形式对体外破骨细胞形成的作用
OPG构建体 体外相对生物活性muOPG[22-401]-Fc+++muOPG[22-194]-Fc+++muOPG[22-185]-Fc++muOPG[22-180]-Fc-muOPG[22-401] +++muOPG[22-401]C195 +++muOPG[22-401]C202 +muOPG[22-401]C277 -muOPG[22-401]C319 +muOPG[22-401]C400 +muOPG[22-185] -muOPG[22-194] ++muOPG[22-200] ++muOPG[22-212] -muOPG[22-293] +++muOPG[22-355] +++huOPG[22-401]-Fc+++huOPG[22-201]-Fc+++huOPG[22-401]-Fc P26A +++huOPG[22-401]-Fc Y28F +++huOPG[22-401] +++huOPG[27-401]-Fc++huOPG[29-401]-Fc++huOPG[32-401]-Fc+/-+++，ED50＝0.4-2ng/ml++， ED50＝2-10ng/ml+， ED50＝10-100ng/ml-， ED50＞100ng/ml累积数据表明当与Fc结构域融合或不融合时，鼠和人OPG氨基酸序列22-401在体外有完全的活性。它们以剂量依赖方式抑制，而且半最大活性为2-10ng/ml。在苏氨酸残基180截短鼠C末端使所述分子失活，而在半胱氨酸残基185和以外截短则有全部活性。预计位置185的半胱氨酸残基在OPG的结构域4区形成SS3键。以前在其它TNFR相关蛋白中除去该残基表明破坏了生物活性(Yan et al.，生物化学期刊，266，12099-12104(1994))。我们发现muOPG[22-180]-Fc是无活性的，而muOPG[22-185]-Fc是有活性的，这与这些发现相符。这表明氨基酸残基22-185限定了OPG活性区。
这些发现表明，正如在破骨细胞形成测试中所试验的，与转基因表达的OPG一样，重组OPG蛋白也可以抑制破骨细胞形成。检测连续暴露于OPG的培养物中TRAP+细胞、β3+细胞、F480+细胞出现的时间过程试验表明，OPG阻断TRAP+细胞和β3+细胞的出现，但不影响F480+细胞。相反，在对照培养物中，培养确立后4天，TRAP+细胞和β3+细胞就开始出现。在OPG处理的培养物中只发现了F480+细胞，而且它们于对照培养物中的数量相同。因此OPG体外作用的机制可能包括在出现单核细胞-巨噬细胞后，但在出现表达TRAP或β3整合素之前，阻断破骨细胞分化。综合这些发现表明，OPG不影响来自骨髓的单核细胞-巨噬细胞前体的一般生长和分化，而说明OPG特异性地阻断从单核细胞-巨噬细胞前体选择性地分化破骨细胞。
为了更具体地确定OPG有抑制作用的破骨细胞分化途径，使用不同的体外培养方法。该方法(描述于Lacey等人，同上文)使用作为破骨细胞前体的骨髓巨噬细胞。通过在CSF-1/M-CSF中过夜培养，取非黏附骨髓细胞，然后于1000-2000U/ml CSF-1再培养4天，来衍生破骨细胞前体。培养4天后，称为生长期，去除非黏附细胞。然后将是骨髓巨噬细胞的黏附细胞在存在1000-2000U/mlCSF-1的条件下，进行多达2天的不同处理。将这2天的时间称为中间分化期。此后，漂洗细胞层，然后在称为后分化期的后8天加入ST-2细胞(1×105细胞/ml)、地塞米松(100nM)和1，25(OH)2D3(10nM)。在该后期也可以加入试验试剂。在该后后期需要得到破骨细胞分化的表型标记(Lacey等人，出处同上)。
通过在中间，后或同时两个分化期加入huOPG[22-401]-Fc(100ng/ml)，来试验在该模型中其对破骨细胞形成的作用。完成TRAP细胞化学和溶液检测。在图21中列出了溶液检测的结果。当同时加到中间和后分化期或仅后分化期时，huOPG[22-401]-Fc抑制TRAP活性的出现。当加到中间期然后通过漂洗从培养物中除去时，huOPG[22-401]-Fc不阻断培养溶解产物中TRAP活性的出现。细胞化学结果与溶液检测数量一致。总之，这些观察结果表明，huOPG[22-401]-Fc只需要在后分化期存在就可以发挥其对破骨细胞形成的所有抑制作用。
B.体内IL1-α和IL1-β攻击试验当皮下注射到小鼠的颅盖上时，IL1提高全身和局部的骨吸收(Boyce等人，内分泌学，125，1142-1150(1989))。通过降低高钙血的程度来评估全身作用，通过组织学评估破骨细胞介导的反应的相对强度来评估局部作用。这些试验的目的是确定当皮下注射到与IL1相同的颅盖区时，重组muOPG[22-401]-Fc是否可以改变IL1的局部和/或全身作用。
IL-1β试验将4周龄的雄性小鼠(ICR瑞士白)分成下列处理组(每组5只)对照组；IL1处理动物(接受每天一次2.5μg IL1-β的小鼠)；低剂量muOPG[22-401]-Fc处理的动物(接受每天3次1μg muOPG[22-401]-Fc的小鼠)；低剂量muOPG[22-401]-Fc和IL1-β；高剂量muOPG[22-401]-Fc处理的动物(接受每天3次10μg muOPG[22-401]-Fc的小鼠)；高剂量muOPG[22-401]-Fc和IL1-β。所有小鼠均接受注射次数总量相同的活性因子或载体(0.1％在磷酸缓冲盐中的牛血清白蛋白)。在最后一次注射后，杀死所有组的动物。在第一次注射前，第二次注射后4小时和第三次注射IL1后24小时(仅在杀死动物前)，进行称重并测量血离子钙水平。杀死后，取出颅盖并加工成石蜡切片。
IL1-α试验将4周龄的雄性小鼠(ICR瑞士白)分成下列处理组(每组5只)对照组；IL1α处理动物(接受每天一次5μg IL1-α的小鼠)；低剂量muOPG[22-401]-Fc处理的动物(接受每天3次1μg muOPG[22-401]-Fc的小鼠)；低剂量muOPG[22-401]-Fc和IL1-α(剂量同上)；高剂量muOPG[22-401]-Fc处理的动物(接受每天3次10μg muOPG[22401]-Fc的小鼠)；高剂量muOPG[22-401]-Fc和IL1-α。所有小鼠均接受注射次数总量相同的活性因子或载体(0.1％在磷酸缓冲盐中的牛血清白蛋白)。在最后一次注射后，杀死所有组的动物。在第一次注射前，第二次注射后4小时和第三次注射IL1后24小时(仅在杀死动物前)，进行称重并测量血离子钙水平。杀死后，取出颅盖并加工成石蜡切片。
组织学方法将颅盖骨样品固定在锌福尔马林中，用甲酸脱钙，通过乙醇脱水并在石蜡中固定。从与人字缝相邻的颅盖切片(5μm厚)，然后用苏木精和曙红染色或用酒石酸抗性酸性磷酸酶活性反应(Sigma试剂盒3387A)并用苏木精复染。用固定有明箱附件的显微镜，通过将组织学特征记录到数字转换器平台上，利用Osteomeasure(Osteometrics，Atlanta，GA)通过组织形态学方法评估IL1-α处理小鼠中的骨吸收。在颅盖的窄范围内确定破骨细胞数量、破骨细胞形成的表面和被浸蚀的表面。分别测量颅盖的注射和未注射侧。
结果IL1-α和IL1-β在所用的剂量产生高钙血，特别是在第二天，可能是诱导了全身性骨吸收的增加而引起的。在和IL1-β处理的小鼠中，用muOPG[22-401]-Fc阻断了高钙血反应，在IL1-α处理的小鼠中，则显著减少，在第2天，作用最明显(图22A-22B)。
组织学分析用IL1-α和β处理的小鼠颅盖表明，IL1处理在包括下列的指标方面有明显增加破骨细胞数量、破骨细胞形成的表面和被浸蚀的表面(由于破骨细胞作用而有深的扇形凹口，图23B和表2)。在应答IL1-α或IL1-β的过程中，骨吸收的增加与颅盖注射和非注射侧的相似。在IL1-α和β处理的小鼠处理的小鼠中，muOPG[22-401]-Fc注射降低了骨吸收，而在只接受载体的小鼠中，这种降低只在颅盖的muOPG[22-401]-Fc侧见到。
对这些观察最可能的解释是muOPG[22-401]-Fc抑制了骨吸收，这一结论被在与muOPG[22-401]-Fc注射位点相邻的颅盖区中，总破骨细胞数量和经历骨吸收的骨表面的百分比的下降所支持。通过组织学分析，muOPG[22-401]-Fc的局部作用最显著，但muOPG[22-401]-Fc降低了IL1诱导的高钙血的事实说明，muOPG[22-401]-Fc对全身骨吸收有更不可思议的作用。
表2. OPG对IL-1注射小鼠的骨吸收变量的影响
*与非注射侧的差异p＜0.05(通过成对P试验)
C.在生长小鼠中muOPG[22-401]-Fc的全身作用将3-4周龄，9.2-15.7g重的雄性BDF1小鼠分成每组10只的组。这些小鼠皮下注射盐或muOPG[22-401]-Fc 2.5mg/kg 14天(1mg/kg/天)。在处理前，7天和14天，给小鼠拍射线照片。在最后注射后24小时杀死小鼠。取出右股骨，用锌福尔马林固定，用甲酸脱钙，然后包埋在石蜡中。从远股骨干骺端的中区和股骨干切成切片。通过组织形态学测定6个邻近区域的骨密度，所述邻近区域从生长板的干骺端开始延伸，通过一级和二级松质，进入股骨骨干。各区为0.5×0.5mm2。
射线照片的变化在处理7天后，在OPG处理小鼠中，与对照相比，在与生长板相连的松质中，有增加的骨密度区。在远股骨干骺端和近胫骨干骺端中作用特别明显(图24A-24B)。但是，在脊椎、髂骨嵴和远胫骨中，骨密度的增加也很明显。在14天，不透明区扩大到股骨和胫骨干，尽管放射性混浊的强度减小。另外，在试验完成时，股骨长度没有差异或在试验过程中，没有长度变化，这说明OPG不改变骨长度。
组织学改变远股骨干骺端在距离生长板1.1-2.65mm区的骨密度有所增加(图25和26A-26B)。这是小鼠中破骨细胞介导的骨吸收的骨被迅速除去的区域。在这些迅速生长的幼小鼠中，用OPG处理在该区观察到的骨增加于骨吸收的抑制相符。
D.促骨生长素对大鼠中因卵巢切除诱导的骨损失的作用将12周龄的雌性Fisher大鼠进行卵巢切除(OVX)或假手术，然后在远股骨干骺端通过双X射线吸收测量法(DEXA)测量骨密度。3天的恢复期后，按照如下使动物接受14天的注射假手术动物接受载体(磷酸缓冲盐)；10只OVX动物接受OPG-Fc 5mg/kg SC；6只OVX动物接受氨羟二磷酸二钠(PAM)5mg/kg SC；6只OVX动物接受雌激素40μg/kgg/SC。处理7天和14天后，，通过DEXA测量骨密度。最后注射2天后，杀死动物，然后取右胫骨和股骨进行组织学评估。
骨密度的DEXA测量表明在卵巢切除后，骨密度降低的倾向受到OPG-Fc的抑制。其作用于已知的抗吸收剂雌激素和氨羟二磷酸二钠相似(图27)。组织形态学测量分析证实了用这些观察结果，在OVX大鼠中，OPG-Fc处理后的骨密度比未处理OVX大鼠中的骨密度显著高(图28)。这些结果确定了OPG在与卵巢切除后失去内源雌激素有关的骨损失方面的活性。
体内总结重组OPG的体内作用与在OPG转基因小鼠中所见到的变化相同。在OPG转基因小鼠中所见到的破骨细胞数量的减少，通过将重组OPG局部注射到正常小鼠和IL1-α或IL1-β处理的小鼠的颅盖上而得以再现。OPG转基因小鼠可以发育成有渐进性填充髓腔的骨硬化表型，所述填充是在第1天到出生后，从生长板延伸骨和未重塑的软骨而形成的。正常3周龄(正在生长的)小鼠中，OPG处理也会导致在软骨内骨形成区，骨和未重塑软骨的滞留，这是射线照相和确定的组织学观察到的作用。因此，重组OPG在正常动物中产生表型改变，与在转基因小鼠中见到相似，而且所述改变与OPG-诱导的骨稀释抑制作用相符。以破骨细胞形成的体外试验为基础，这样显著的抑制作用是归因于破坏了破骨细胞的形成。与该假设一致，OPG在大鼠中阻断卵巢切除诱导的骨质疏松症。在该模型中，已知骨损失是由激活的破骨细胞介导的，这说明了OPG在滞留原发性骨质疏松症中的作用。
实施例12OPG的聚乙二醇化(Pegylation)衍生物通过还原性烷基化制备N-末端PEG-OPG结合物将HuOPG met[22-194]P25A缓冲交换至25-50mM、pH4.5-4.8的NaOAc中并浓缩至2-5mg/ml。该溶液用于和单功能基的PEG醛在5-7℃进行OPG还原性烷基化反应。将直链或支链的、MW＝1-57kDa的PEG单功能基醛(可从Shearwater Polymers得到)以固体的形式加入到OPG溶液中，加入量为每摩尔OPG加2-4摩尔PEG醛。聚合物在蛋白溶液中溶解后，加入1-1.6M新制备的氰基硼氢化钠在冷去离子水中的储备液，使其在反应液混合物中的最终浓度为15至20mM。反应的进程以及OPG聚乙二醇化的程度通过在G3000SWXL柱(Toso Hass)上的筛析HPLC进行监测，用100mM NaPO4、0.5M NaCl、10％乙醇、pH6.9洗脱。反应一般进行16-18小时，然后将反应液混合物稀释6-8倍并将pH降低至3.5-4。将反应液混合物通过离子交换色谱(HP SP HiLoad 16/10，Pharmacia)进行分离，用20mM、pH4的NaOAc洗脱，在25倍柱体积内线性梯度增加NaCl至0.75M，流速为30cm/h。合并单、二或多聚乙二醇化的OPG级分并通过SEC HPLC和SDS-PAGE进行鉴定。通过N-末端序列分析，测得单PEG-OPG结合物(大多数情况下的主要反应产物)为98％N-末端PEG修饰的OPG。
该方法通常用于制备以下N-末端PEG-OPG结合物(其中的OPG为HuOPG met [22-194]P25A)5kD单PEG、10kD单支链的PEG、12kD单PEG、20kD单PEG、20kD单支链的PEG、25kD单PEG、31kD单PEG、57kD单PEG、12kD二PEG、25kD二PEG、31kD二PEG、57kD二PEG、25kD三PEG。
通过酰化制备PEG-OPG结合物将HuOPG met[22-194]P25A缓冲交换至50mM、pH8的BICINE缓冲液中并浓缩至2-3mg/ml。该溶液用于和单功能基的PEG N-羟基琥珀酰亚氨酯在室温下进行OPG酰化反应。将直链或支链的、MW＝1-57kDa的PEG N-羟基琥珀酰亚氨酯(可从Shearwater Polymers得到)以固体的形式加入到OPG溶液中，加入量为每摩尔OPG加4-8摩尔PEG N-羟基琥珀酰亚氨酯。反应的进程以及OPG聚乙二醇化的程度通过在G3000SWXL柱(Toso Hass)上的筛析HPLC进行监测，用100mM NaPO4、0.5M NaCl、10％乙醇、pH6.9洗脱。反应一般进行1小时，然后将反应液混合物稀释6-8倍并将pH降低至3.5-4。将反应液混合物通过离子交换色谱(HP SPHiLoad 16/10，Pharmacia)进行分离，用20mM、pH4的NaOAc洗脱，在25倍柱体积内线性梯度增加NaCl至0.75M，流速为30cm/h。合并单、二或多聚乙二醇化的OPG级分并通过SEC HPLC和SDS-PAGE进行鉴定。
该方法通常用于制备以下PEG-OPG结合物5kD多PEG、20kD多PEG、40kD多支链的PEG、50kD多PEG。
二聚PEG-OPG的制备在近中性pH的磷酸缓冲液中制备1-3mg/ml的用于硫醇化的HuOPGmet[22-194]P25A。加入3-倍摩尔过量的S-乙酰基巯基琥珀酸酐(AMSA)，同时维持pH在7.0并将反应液混合物在4℃下搅拌2小时。通过离子交换色谱将单硫醇化的-OPG与未修饰的及多硫醇化的OPG相分离，并通过用羟胺处理将保护的硫醇脱保护。脱保护后，通过凝胶过滤除去羟胺并将得到的单硫醇化的-OPG进行各种硫醇特异性交联化学反应。为了生成二硫化物键合的二聚体，将浓度＞1mg/ml的硫醇化的OPG通过在弱碱性磷酸缓冲液中透析进行空气氧化。将二-马来酰亚氨交联物N，N-二(3-马来酰亚氨基丙炔基)-2-羟基-1，3丙烷与浓度＞1mg/ml的硫醇化的OPG在pH6.5的磷酸缓冲液中反应制得共价硫醚，交联物与OPG的摩尔比为0.6。同样，通过将亚化学计量的二-马来酰亚氨PEG交联物与浓度＞1mg/ml的硫醇化的OPG在pH6.5的磷酸缓冲液中反应制得哑铃状PEG。任何以上二聚的结合物均可以通过离子交换色谱或筛析色谱进一步纯化。
用上述方法制得的二聚的PEG-OPG结合物(其中的OPG为HuOPGmet[22-194]P25A)包括二硫键键合的OPG二聚体、具有脂肪胺类型交联物的共价硫醚OPG二聚体、3.4kD和8kD的哑铃状PEG和一头结合的(monobell)PEG。
用在实施例11A中所述的破骨细胞成熟试验，检测PEG-OPG结合物的体外活性，通过按照实施例11C中所述测量注射到小鼠中后增加的骨密度来检测体内活性。体内活性示于下列表3。
表3聚乙二醇化OPG的体内生物活性OPG构建体 胫骨密度的增加muOPG met[22-194] -muOPG met[22-194]5k PEG +muOPG met[22-194]20k PEG+huOPG met[22-194]P25A -huOPG met[22-194]P25A 5k PEG+huOPG met[22-194]P25A 20k PEG +huOPG met[22-194]P25A 31k PEG +huOPG met[22-194]P25A 57k PEG +huOPG met[22-194]P25A 12k PEG +
huOPG met[22-194]P25A 20k Branched PEG +huOPG met[22-194]P25A 8k PEG dimer +huOPG met[22-194]P25A disulfide crosslink +尽管通过认为是优选的实施方案对本发明进行了描述，但本发明并不仅限于所公开的实施方案，相反，本发明包括所附权利要求范围内的各种修饰及等同物，所述权利要求的范围符合最宽的解释，从而包括了所有这些修饰及等同物。
序列表(1)一般资料0(I)申请人安姆根公司(ii)发明题目促骨生长素(iii)序列数168(iv)相应地址(A)收件人安姆根公司(B)街道1840 Dehavilland Drive(C)城市Thousand Oaks(D)州加利福尼亚(E)国家美国(F)邮政编码91320(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentiIn Release#1.0，#1.30版(vi)当前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类号(viii)代理/代理人资料(A)姓名Winter，Robert B.
(B)文件/文档号A-378-CIP2(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
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(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11GCCTCTAGAA AGAGCTGGGA C 21(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12CGCCGTGTTC CATTTATGAG C 21(2)SEQ ID NO13的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG 24(2)SEQ ID NO14的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GTTGCACTCC TGTTTCACGG TCTG24(2)SEQ ID NO15的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15CAAGACACCT TGAAGGGCCT GATG24(2)SEQ ID NO16的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16TAACTTTTAC AGAAGAGCAT CAGC24(2)SEQ ID NO17的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17AGCGCGGCCG CATGAACAAG TGGCTGTGCT GCG 33(2)SEQ ID NO18的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO18AGCTCTAGAG AAACAGCCCA GTGACCATTC C31(2)SEQ ID NO19的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19GTGAAGCTGT GCAAGAACCT GATG24(2)SEQ ID NO20的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG24(2)SEQ ID NO21的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO21CAGATCCTGA AGCTGCTCAG TTTG24(2)SEQ ID NO22的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO22AGCGCGGCCG CGGGGACCAC AATGAACAAG TTG 33(2)SEQ ID NO23的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO23AGCTCTAGAA TTGTGAGGAA ACAGCTCAAT GGC 33(2)SEQ ID NO24的资料(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO24ATAGCGGCCG CTGAGCCCAA ATCTTGTGAC AAAACTCAC39(2)SEQ ID NO25的资料(i)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO25TCTAGAGTCG ACTTATCATT TACCCGGAGA CAGGGAGAGG CTCTT 45(2)SEQ ID NO26的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO26CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38(2)SEQ ID NO27的资料(i)序列特征
(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO27CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTCA CGGATTGAAC CTG 43(2)SEQ ID NO28的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO28CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38(2)SEQ ID NO29的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO29TCCGTAAGAA ACAGCCCAGT GACC24(2)SEQ ID NO30的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO30CCTCTGCGGC CGCTGTTGCA TTTCCTTTCT G31(2)SEQ ID NO31的资料(i)序列特征(A)长度19氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO31Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His1 5 10 15Gln Leu Leu(2)SEQ ID NO32的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO32TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 2l(2)SEQ ID NO33的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO33CCTCTGCGGC CGCACACACG TTGTCATGTG TTGC 34(2)SEQ ID NO34的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO34TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21(2)SEQ ID NO35的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO35CCTCTGCGGC CGCCTTTTGC GTGGCTTCTC TGTT 34(2)SEQ ID NO36的资料(i)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO36CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG 37(2)SEQ ID NO37的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO37CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTTA CTGAATGG 38(2)SEQ ID NO38的资料(i)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO38CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG 37(2)SEQ ID NO39的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO39CCTCTGCGGC CGCCAGGGTA ACATCTATTC CAC 33(2)SEQ ID NO40的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO40CCGAAGCTTC CACCATGAAC AAGTGGCTGT GCTGC35(2)SEQ ID NO41的资料(i)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO41CCTCTGTCGA CTATTATAAG CAGCTTATTT TCACGGATTG 40(2)SEQ ID NO42的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO42TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21(2)SEQ ID NO43的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO43CCTCTGTCGA CTTAACACAC GTTGTCATGT GTTGC35(2)SEQ ID NO44的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO44TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 2l(2)SEQ ID NO45的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO45CCTCTGTCGA CTTACTTTTG CGTGGCTTCT CTGTT35(2)SEQ ID NO46的资料(i)序列特征
(A)长度1537个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO46GTGAAGAGCG TGAAGAGCGG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA CCCGTTTAGA 60GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT CAGCTTCCTT120TCGGGCTTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTTCC GCGGATCCTC GAGTAAGCTT CCATGGTACC180CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTCGAATTC CAACGCGTTA ACCATATGTT ATTCCTCCTT240TAATTAGTTA AAACAAATCT AGAATCAAAT CGATTAATCG ACTATAACAA ACCATTTTCT300TGCGTAAACC TGTACGATCC TACAGGTACT TATGTTAAAC AATTGTATTT CAAGCGATAT360AATAGTGTGA CAAAAATCCA ATTTATTAGA ATCAAATGTC AATCTATTAC CGTTTTAATG420ATATATAACA CGCAAAACTT GCGACAAACA ATAGGTAAGG ATAAAGAGAT GGGTATGAAA480GACATAAATG CCGACGACAC TTACAGAATA ATTAATAAAA TTAAAGCCTG TAGAAGCAAT540AATGATATTA ATCAATGCTT ATCTGATATG ACTAAAATGG TACATTGTGA ATATTATTTA600CTCGCGATCA TTTATCCTCA TTCTATGGTT AAATCTGATA TTTCAATTCT GGATAATTAC660CCTAAAAAAT GGAGGCAATA TTATGATGAC GCTAATTTAA TAAAATATGA TCCTATAGTA720GATTATTCTA ACTCCAATCA TTCACCGATT AATTGGAATA TATTTGAAAA CAATGCTGTA780AATAAAAAAT CTCCAAATGT AATTAAAGAA GCGAAATCAT CAGGTCTTAT CACTGGGTTT840AGTTTCCCTA TTCATACTGC TAATAATGGC TTCGGAATGC TTAGTTTTGC ACATTCAGAG900AAAGACAACT ATATAGATAG TTTATTTTTA CATGCGTGTA TGAACATACC ATTAATTGTT960CCTTCTCTAG TTGATAATTA TCGAAAAATA AATATAGCAA ATAATAAATC AAACAACGAT 1020TTAACCAAAA GAGAAAAAGA ATGTTTAGCG TGGGCATGCG AAGGAAAAAG CTCTTGGGAT 1080ATTTCAAAAA TATTAGGCTG TAGTAAGCGC ACGGTCACTT TCCATTTAAC CAATGCGCAA 1140ATGAAACTCA ATACAACAAA CCGCTGCCAA AGTATTTCTA AAGCAATTTT AACAGGAGCA 1200ATTGATTGCC CATACTTTAA AAGTTAAGTA CGACGTCCAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA 1260ATAAACAAAA GAGTTTGTAG AAACGCAAAA AGGCCATCCG TCAGGATGGC CTTCTGCTTA 1320ATTTGATGCC TGGCAGTTTA TGGCGGGCGT CCTGCCCGCC ACCCTCCGGG CCGTTGCTTC 1380GCAACGTTCA AATCCGCTCC CGGCGGATTT GTCCTACTCA GGAGAGCGTT CACCGACAAA 1440CAACAGATAA AACGAAAGGC CCAGTCTTTC GACTGAGCCT TTCGTTTTAT TTGATGCCTG 1500GCAGTTCCCT ACTCTCGCAT GGGGAGACCA TGCATAC1537(2)SEQ ID NO47的资料(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO47CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA48(2)SEQ ID NO48的资料(i)序列特征(A)长度55个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO48CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC55(2)SEQ ID NO49的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO49CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT49(2)SEQ ID NO50的资料(i)序列特征(A)长度1546个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO50GCGTAACGTA TGCATGGTCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA 60CGAAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGTTTTATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT120CTCCTGAGTA GGACAAATCC GCCGGGAGCG GATTTGAACG TTGCGAAGCA ACGGCCCGGA180GGGTGGCGGG CAGGACGCCC GCCATAAACT GCCAGGCATC AAATTAAGCA GAAGGCCATC240CTGACGGATG GCCTTTTTGC GTTTCTACAA ACTCTTTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC300AAATATGGAC GTCGTACTTA ACTTTTAAAG TATGGGCAAT CAATTGCTCC TGTTAAAATT360GCTTTAGAAA TACTTTGGCA GCGGTTTGTT GTATTGAGTT TCATTTGCGC ATTGGTTAAA420TGGAAAGTGA CCGTGCGCTT ACTACAGCCT AATATTTTTG AAATATCCCA AGAGCTTTTT480CCTTCGCATG CCCACGCTAA ACATTCTTTT TCTCTTTTGG TTAAATCGTT GTTTGATTTA540TTATTTGCTA TATTTATTTT TCGATAATTA TCAACTAGAG AAGGAACAAT TAATGGTATG600TTCATACACG CATGTAAAAA TAAACTATCT ATATAGTTGT CTTTCTCTGA ATGTGCAAAA660CTAAGCATTC CGAAGCCATT ATTAGCAGTA TGAATAGGGA AACTAAACCC AGTGATAAGA720CCTGATGATT TCGCTTCTTT AATTACATTT GGAGATTTTT TATTTACAGC ATTGTTTTCA780AATATATTCC AATTAATCGG TGAATGATTG GAGTTAGAAT AATCTACTAT AGGATCATAT840TTTATTAAAT TAGCGTCATC ATAATATTGC CTCCATTTTT TAGGGTAATT ATCCAGAATT900GAAATATCAG ATTTAACCAT AGAATGAGGA TAAATGATCG CGAGTAAATA ATATTCACAA960TGTACCATTT TAGTCATATC AGATAAGCAT TGATTAATAT CATTATTGCT TCTACAGGCT 1020TTAATTTTAT TAATTATTCT GTAAGTGTCG TCGGCATTTA TGTCTTTCAT ACCCATCTCT 1080TTATCCTTAC CTATTGTTTG TCGCAAGTTT TGCGTGTTAT ATATCATTAA AACGGTAATA 1140GATTGACATT TGATTCTAAT AAATTGGATT TTTGTCACAC TATTATATCG CTTGAAATAC 1200AATTGTTTAA CATAAGTACC TGTAGGATCG TACAGGTTTA CGCAAGAAAA TGGTTTGTTA 1260TAGTCGATTA ATCGATTTGA TTCTAGATTT GTTTTAACTA ATTAAAGGAG GAATAACATA 1320TGGTTAACGC GTTGGAATTC GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAGGGTACC ATGGAAGCTT1380ACTCGAGGAT CCGCGGAAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAAGC CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG1440CTGCTGCCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT AACCCCTTGG GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA1500GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACCGCTC TTCACGCTCT TCACGC 1546(2)SEQ ID NO51的资料(i)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO51TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCATGC TAGCGTTAAC GCGTTGG 47(2)SEQ ID NO52的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO52AATTCCAACG CGTTAACGCT AGCATGATGG TGATGGTGAT GATGTTTCA 49(2)SEQ ID NO53的资料(i)序列特征(A)长度141个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO53CTAATTCCGC TCTCACCTAC CAAACAATGC CCCCCTGCAA AAAATAAATT CATATAAAAA60ACATACAGAT AACCATCTGC GGTGATAAAT TATCTCTGGC GGTGTTGACA TAAATACCAC 120TGGCGGTGAT ACTGAGCACA T 141(2)SEQ ID NO54的资料(i)序列特征(A)长度147个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO54CGATGTGCTC AGTATCACCG CCAGTGGTAT TTATGTCAAC ACCGCCAGAG ATAATTTATC60ACCGCAGATG GTTATCTGTA TGTTTTTTAT ATGAATTTAT TTTTTGCAGG GGGGCATTGT 120TTGGTAGGTG AGAGCGGAAT TAGACGT 147(2)SEQ ID NO55的资料(i)序列特征(A)长度55个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO55CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55(2)SEQ ID NO56的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO56CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49(2)SEQ ID NO57的资料(i)序列特征(A)长度668个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO57GTGAAGAGCG TGAAGAGCGG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA CCCGTTTAGA60GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT CAGCTTCCTT 120TCGGGCTTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTTCC GCGGATCCTC GAGTAAGCTT CCATGGTACC 180CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTCGAATTC CAACGCGTTA ACCATATGTT ATTCCTCCTT 240TAATTAGTTA ACTCAAATCT AGAATCAAAT CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA 300TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGTCCAT 360ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAA GAGTTTGTAG AAACGCAAAA AGGCCATCCG 420TCAGGATGGC CTTCTGCTTA ATTTGATGCC TGGCAGTTTA TGGCGGGCGT CCTGCCCGCC 480ACCCTCCGGG CCGTTGCTTC GCAACGTTCA AATCCGCTCC CGGCGGATTT GTCCTACTCA 540GGAGAGCGTT CACCGACAAA CAACAGATAA AACGAAAGGC CCAGTCTTTC GACTGAGCCT 600TTCGTTTTAT TTGATGCCTG GCAGTTCCCT ACTCTCGCAT GGGGAGACCA TGCATACGTT 660ACGCACGT668(2)SEQ ID NO58的资料(i)序列特征(A)长度726个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO58GCGTAACGTA TGCATGGTCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA 60CGAAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGTTTTATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT 120CTCCTGAGTA GGACAAATCC GCCGGGAGCG GATTTGAACG TTGCGAAGCA ACGGCCCGGA 180GGGTGGCGGG CAGGACGCCC GCCATAAACT GCCAGGCATC AAATTAAGCA GAAGGGGCCT 240CCCACCGCCC GTCCTGCGGG CGGTATTTGA CGGTCCGTAG TTTAATTCGT CTTCGCCATC 300CTGACGGATG GCCTTTTTGC GTTTCTACAA ACTCTTTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC 360AAATATGGAC GTCTCATAAT TTTTAAAAAA TTCATTTGAC AAATGCTAAA ATTCTTGATT 420AATATTCTCA ATTGTGAGCG CTCACAATTT ATCGATTTGA TTCTAGATTT GTTTTAACTA 480ATTAAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GAGCTCACTA GTGTCGACCT 540GCAGGGTACC ATGGAAGCTT ACTCGAGGAT CCGCGGAAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAAGC 600CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG CTCCTGCCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT AACCCCTTGG 660GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACCGCTC TTCACGCTCT 720TCACGC726(2)SEQ ID NO59的资料(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO59TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT GGAC 44(2)SEQ ID NO60的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO60GTCCTCCTGG TACCTACCTA AAACAAC 27(2)SEQ ID NO61的资料(i)序列特征(A)长度102个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO61TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTACCCGGCG 60GACATTTATC ACACAGCAGC TGATGAGAAG TTTCTTCATC CA102(2)SEQ ID NO62的资料(i)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO62Met Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro1 5 10 15Gly Thr Tyr(2)SEQ ID NO63的资料(i)序列特征
(A)长度84个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO63TATGGAAACT TTTCCTCCAA AATATCTTCA TTATGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT 60GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC 84(2)SEQ ID NO64的资料(i)序列特征(A)长度78个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO64CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCATAA TGAAGATATT 60TTGGAGGAAA AGTTTCCA 78(2)SEQ ID NO65的资料(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO65TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTCACGGATT GAAC 44(2)SEQ ID NO66的资料(i)序列特征
(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO66GTGCTCCTGG TACCTACCTA AAACAGCACT GCACAGTG38(2)SEQ ID NO67的资料(i)序列特征(A)长度84个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO67TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA TTACGATCCG GAAACTGGTC ATCAGCTGCT 60GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC 84(2)SEQ ID NO68的资料(i)序列特征(A)长度78个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO68CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT60TTGGAGGCAG AGTTTCCA 78(2)SEQ ID NO69的资料(i)序列特征
(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO69TATGGACCCA GAAACTGGTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC54(2)SEQ ID NO70的资料(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO70CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC TGGGTCCA48(2)SEQ ID NO71的资料(i)序列特征(A)长度87个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO71TATGAAAGAA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCATTACGAT CCGGAAACTG GTCATCAGCT 60GCTGTGTGAT AAATGTGCTC CGGGTAC 87(2)SEQ ID NO72的资料(i)序列特征(A)长度81个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO72CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT60TTGGAGGCAG AGTTTCTTTC A 81(2)SEQ ID NO73的资料(i)序列特征(A)长度71个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO73GTTCTCCTCA TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCATGA AACTCTGCCT CCAAAATACC60TGCATTACGA T 71(2)SEQ ID NO74的资料(i)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO74GTTCTCCTCA TATGAAAGAA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCA 43(2)SEQ ID NO75的资料(i)序列特征(A)长度76个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO75TACGCACTGG ATCCTTAATG ATGGTGATGG TGATGATGTA AGCAGCTTAT TTTCACGGAT 60TGAACCTGAT TCCCTA 76(2)SEQ ID NO76的资料(i)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO76GTTCTCCTCA TATGAAATAC CTGCATTACG ATCCGGAAAC TGGTCAT47(2)SEQ ID NO77的资料(i)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO77GTTCTCCTAT TAATGAAATA TCTTCATTAT GATGAAGAAA CTT43(2)SEQ ID NO78的资料(i)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO78TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT 40(2)SEQ ID NO79的资料(i)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO79GTTCTCCTCA TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA 40(2)SEQ ID NO80的资料(i)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO80TACGCACTGG ATCCTTATGT TGCATTTCCT TTCTGAATTA GCA 43(2)SEQ ID NO81的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO81CCGGAAACAG ATAATGAG 18(2)SEQ ID NO82的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO82GATCCTCATT ATCTGTTT 18(2)SEQ ID NO83的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO83CCGGAAACAG AGAAGCCACG CAAAAGTAAG 30(2)SEQ ID NO84的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO84GATCCTTACT TTTGCGTGGC TTCTCTGTTT 30(2)SEQ ID NO85的资料(i)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO85TATGTTAATG AG 12(2)SEQ ID NO86的资料(i)序列特征(A)长度14个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO86GATCCTCATT AACA 14(2)SEQ ID NO87的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO87TATGTTCCGG AAACAGTTAA G 21(2)SEQ ID NO88的资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO88GATCCTTAAC TGTTTCCGGA ACA 23(2)SEQ ID NO89的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO89TATGTTCCGG AAACAGTGAA TCAACTCAAA AATAAG 36(2)SEQ ID NO90的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO90GATCCTTATT TTTGAGTTGA TTCACTGTTT CCGGAACA 38(2)SEQ ID NO91的资料(i)序列特征
(A)长度100个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO91CTAGCGACGA CGACGACAAA GAAACTCTGC CTCCAAAATA CCTGCATTAC GATCCGGAAA60CTGGTCATCA GCTGCTGTGT GATAAATGTG CTCCGGGTAC 100(2)SEQ ID NO92的资料(i)序列特征(A)长度92个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO92CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT60TTGGAGGCAG AGTTTCTTTG TCGTCGTCGT CG 92(2)SEQ ID NO93的资料(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO93ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGA 26(2)SEQ ID NO94的资料(i)序列特征
(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO94TTTGTTTTAA CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATATGAGAGG ATCGCATCAC 50(2)SEQ ID NO95的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(i)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO95CATCACCATC ACGAAACCTT CCCGCCGAAA TACCTGCACT ACGACGAAGA 50(2)SEQ ID NO96的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(i)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO96AACCTCCCAC CAGCTGCTGT GCGACAAATG CCCGCCGGGT ACCCAAACA 49(2)SEQ ID NO97的资料(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO97TGTTTGGGTA CCCGGCGGGC ATTTGT 26(2)SEQ ID NO98的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO98CGCACAGCAG CTGGTGGGAG GTTTCTTCGT CGTAGTGCAG GTATTTCGGC50(2)SEQ ID NO99的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO99GGGAAGGTTT CGTGATGGTG ATGGTGATGC GATCCTCTCA TATTTTATT 49(2)SEQ ID NO100的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO100CCTCCTTTAA TTAGTTAAAA CAAATCTAGT ATCAAATCGA TTGTGTTTGT 50(2)SEQ ID NO101的资料(i)序列特征(A)长度59个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO101ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAAATG 59(2)SEQ ID NO102的资料(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO102CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAGAAA CTTTTCCTCC AAAATATC 48(2)SEQ ID NO103的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO103TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C31(2)SEQ ID NO104的资料(i)序列特征(A)长度59个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO104ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAAATG 59(2)SEQ ID NO105的资料(i)序列特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO105CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAAAAA AAGAAACTTT TCCTCCAAAA TATC54(2)SEQ ID NO106的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO106TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C 31(2)SEQ ID NO107的资料(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO107CAGCCCGGGT AAAATGGAAA CGTTTCCTCC AAAATATCTT CATT 44(2)SEQ ID NO108的资料(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO108CGTTTCCATT TTACCCGGGC TGAGCGAGAG GCTCTTCTGC GTGT 44(2)SEQ ID NO109的资料(i)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO109CGCTCAGCCC GGGTAAAATG GAAACGTTGC CTCCAAAATA CCTGC 45(2)SEQ ID NO110的资料(i)序列特征
(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO110CCATTTTACC CGGGCTGAGC GAGAGGCTCT TCTGCGTGT39(2)SEQ ID NO111的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO111GAAAATAAGC TGCTTAGCTG CAGCTGAACC AAAATC36(2)SEQ ID NO112的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO112CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTCACGG ATTG 34(2)SEQ ID NO113的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO113AAAAATAAGC TGCTTAGCTG CAGCTGAACC AAAATC 36(2)SEQ ID NO114的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO114CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTTACTG ATTGG 35(2)SEQ ID NO115的资料(i)序列特征(A)长度102个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO115CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TGCTCCAAAA TATCTTCATT ATGATGAAGA60AACTAGTCAT CAGCTGCTGT GTGATAAATG TCCGCCGGGT AC 102(2)SEQ ID NO116的资料(i)序列特征(A)长度94个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO116CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACTAGTTTC TTCATCATAA TGAAGATATT 60TTGGAGCAAA AGTTTCCATA TGTTATTCCT CCTT 94(2)SEQ ID NO117的资料(i)序列特征(A)长度62个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO117CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TCCTGCTAAA TATCTTCATT ATGATGAAGA 60AA 62(2)SEQ ID NO118的资料(i)序列特征(A)长度62个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO118CTAGTTTCTT CATCATAATG AAGATATTTA GCAGGAAAAG TTTCCATATG TTATTCCTCC 60TT 62(2)SEQ ID NO119的资料(i)序列特征(A)长度51个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO119Tyr His Tyr Tyr Asp Gln Asn Gly Arg Met Cys Glu Glu Cys His Met1 5 10 15Cys Gln Pro Gly His Phe Leu Val Lys His Cys Lys Gln Pro Lys Arg20 25 30Asp Thr Val Cys His Lys Pro Cys Glu Pro Gly Val Thr Tyr Thr Asp35 40 45Asp Trp His50(2)SEQ ID NO120的资料(i)序列特征(A)长度2432个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置124…1326(xi)序列描述SEQ ID NO120ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTGTTGCCC AGACCTTATA TAAAACGTCA TGTTCGCCTG 60GGCAGCAGAG AAGCACCTAG CACTGGCCCA GCGGCTGCCG CCTGAGGTTT CCAGAGGACC 120ACA ATG AAC AAG TGG CTG TGC TGT GCA CTC CTG GTG TTC TTG GAC ATC168Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Phe Leu Asp Ile1 5 10 15ATT GAA TGG ACA ACC CAG GAA ACC TTT CCT CCA AAA TAC TTG CAT TAT216Ile Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr20 25 30GAC CCA GAA ACC GGA CGT CAG CTC TTG TGT GAC AAA TGT GCT CCT GGC 264Asp Pro Glu Thr Gly Arg Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly35 40 45ACC TAC CTA AAA CAG CAC TGC ACA GTC AGG AGG AAG ACA CTG TGT GTC 312Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val50 55 60CCT TGC CCT GAC TAC TCT TAT ACA GAC AGC TGG CAC ACG AGT GAT GAA 360Pro Cys Pro Asp Tyr Ser Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu65 70 75TGC GTG TAC TGC AGC CCC GTG TGC AAG GAA CTG CAG ACC GTG AAA CAG 408Cys Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Thr Val Lys Gln80 85 90 95GAG TGC AAC CGC ACC CAC AAC CGA GTG TGC GAA TGT GAG GAA GGG CGC 456Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg100 105 110TAC CTG GAG CTC GAA TTC TGC TTG AAG CAC CGG AGC TGT CCC CCA GGC 504Tyr Leu Glu Leu Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly115 120 125TTG GGT GTG CTG CAG GCT GGG ACC CCA GAG CGA AAC ACG GTT TGC AAA 552Leu Gly Val Leu Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys130 135 140AGA TGT CCG GAT GGG TTC TTC TCA GGT GAG ACG TCA TCG AAA GCA CCC 600Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro145 150 155TGT AGG AAA CAC ACC AAC TGC AGC TCA CTT GGC CTC CTG CTA ATT CAG 648Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Ser Leu Gly Leu Leu Leu Ile Gln160 165 170 175AAA GGA AAT GCA ACA CAT GAC AAT GTA TGT TCC GGA AAC AGA GAA GCA 696Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala180 185 190ACT CAA AAT TGT GGA ATA GAT GTC ACC CTG TGC GAA GAG GCA TTC TTC 744Thr Gln Asn Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe195 200 205AGG TTT GCT GTG CCT ACC AAG ATT ATA CCG AAT TGG CTG AGT GTT CTG 792Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu210 215 220GTG GAC AGT TTG CCT GGG ACC AAA GTG AAT GCA GAG AGT GTA GAG AGG 840Val Asp Ser Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg225 230 235ATA AAA CGG AGA CAC AGC TCG CAA GAG CAA ACT TTC CAG CTA CTT AAG 888Ile Lys Arg Arg His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys240 245 250 255CTG TGG AAG CAT CAA AAC AGA GAC CAG GAA ATG GTG AAG AAG ATC ATC 936Leu Trp Lys His Gln Asn Arg Asp Gln Glu Met Val Lys Lys Ile Ile260 265 270CAA GAC ATT GAC CTC TGT GAA AGC AGT GTG CAA CGG CAT ATC GGC CAC 984Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Ser Ser Val Gln Arg His Ile Gly His275 280 285GCG AAC CTC ACC ACA GAG CAG CTC CGC ATC TTG ATG GAG AGC TTG CCT 1032Ala Ash Leu Thr Thr Glu Gln Leu Arg Ile Leu Met Glu Ser Leu Pro290 295 300GGG AAG AAG ATC AGC CCA GAC GAG ATT GAG AGA ACG AGA AAG ACC TGC 1080Gly Lys Lys Ile Ser Pro Asp Glu Ile Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys305 310 315AAA CCC AGC GAG CAG CTC CTG AAG CTA CTG AGC TTG TGG AGG ATC AAA 1128Lys Pro Ser Glu Gln Leu Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys320 325 330 335AAT GGA GAC CAA GAC ACC TTG AAG GGC CTG ATG TAC GCA CTC AAG CAC 1176Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met Tyr Ala Leu Lys His340 345 350TTG AAA GCA TAC CAC TTT CCC AAA ACC GTC ACC CAC AGT CTG AGG AAG 1224Leu Lys Ala Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr His Ser Leu Arg Lys355 360 365ACC ATC AGG TTC TTG CAC AGC TTC ACC ATG TAC CGA TTG TAT CAG AAA 1272Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Arg Leu Tyr Gln Lys370 375 380CTC TTT CTA GAA ATG ATA GGG AAT CAG GTT CAA TCA GTG AAG ATA AGC 1320Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser385 390 395TGC TTA TAGTTAGGAA TGGTCACTGG GCTGTTTCTT CAGGATGGGC CAACACTGAT 1376Cys Leu400GGAGCAGATG GCTGCTTCTC CGGCTCTTGA AATGGCAGTT GATTCCTTTC TCATCAGTTG 1436GTGGGAATGA AGATCCTCCA GCCCAACACA CACACTGGGG AGTCTGAGTC AGGAGAGTGA 1496GGCAGGCTAT TTGATAATTG TGCAAAGCTG CCAGGTGTAC ACCTAGAAAG TCAAGCACCC 1556TGAGAAAGAG GATATTTTTA TAACCTCAAA CATAGGCCCT TTCCTTCCTC TCCTTATGGA1616TGAGTACTCA GAAGGCTTCT ACTATCTTCT GTGTCATCCC TAGATGAAGG CCTCTTTTAT1676TTATTTTTTT ATTCTTTTTT TCGGAGCTGG GGACCGAACC CAGGGCCTTG CGCTTGCGAG1736GCAAGTGCTC TACCACTGAG CTAAATCTCC AACCCCTGAA GGCCTCTTTC TTTCTGCCTC1796TGATAGTCTA TGACATTCTT TTTTCTACAA TTCGTATCAG GTGCACGAGC CTTATCCCAT1856TTGTAGGTTT CTAGGCAAGT TGACCGTTAG CTATTTTTCC CTCTGAAGAT TTGATTCGAG1916TTGCAGACTT GGCTAGACAA GCAGGGGTAG GTTATGGTAG TTTATTTAAC AGACTGCCAC1976CAGGAGTCCA GTGTTTCTTG TTCCTCTGTA GTTGTACCTA AGCTGACTCC AAGTACATTT2036AGTATGAAAA ATAATCAACA AATTTTATTC CTTCTATCAA CATTGGCTAG CTTTGTTTCA2096GGGCACTAAA AGAAACTACT ATATGGAGAA AGAATTGATA TTGCCCCCAA CGTTCAACAA2156CCCAATAGTT TATCCAGCTG TCATGCCTGG TTCAGTGTCT ACTGACTATG CGCCCTCTTA2216TTACTGCATG CAGTAATTCA ACTGGAAATA GTAATAATAA TAATAGAAAT AAAATCTAGA2276CTCCATTGGA TCTCTCTGAA TATGGGAATA TCTAACTTAA GAAGCTTTGA GATTTCAGTT2336GTGTTAAAGG CTTTTATTAA AAAGCTGATG CTCTTCTGTA AAAGTTACTA ATATATCTGT2396AAGACTATTA CAGTATTGCT ATTTATATCC ATCCAG 2432(2)SEQ ID NO121的资料(i)序列特征(A)长度401个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO121Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Phe Leu Asp Ile Ile1 5 10 15Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp20 25 30Pro Glu Thr Gly Arg Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr35 40 45Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val Pro50 55 60Cys Pro Asp Tyr Ser Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys65 70 75 80Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Thr Val Lys Gln Glu85 90 95Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg Tyr100 105 110Leu Glu Leu Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Leu115 120 125Gly Val Leu Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg130 135 140Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys145 150 155 160Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Ser Leu Gly Leu Leu Leu Ile Gln Lys165 170 175Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala Thr180 185 190Gln Asn Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg195 200 205Phe Ala Val Pro Thr Lys Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val210 215 220Asp Ser Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile225 230 235 240Lys Arg Arg His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu245 250 255Trp Lys His Gln Asn Arg Asp Gln Glu Met Val Lys Lys Ile Ile Gln260 265 270Asp Ile Asp Leu Cys Glu Ser Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala275 280 285Asn Leu Thr Thr Glu Gln Leu Arg Ile Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly290 295 300Lys Lys Ile Ser Pro Asp Glu Ile Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys Lys305 310 315 320Pro Ser Glu Gln Leu Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn325 330 335Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met Tyr Ala Leu Lys His Leu340 345 350Lys Ala Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr His Ser Leu Arg Lys Thr355 360 365Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Arg Leu Tyr Gln Lys Leu370 375 380Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys385 390 395 400Leu(2)SEQ ID NO122的资料(i)序列特征(A)长度1324个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置90…1292(xi)序列描述SEQ ID NO122CCTTATATAA ACGTCATGAT TGCCTGGGCT GCAGAGACGC ACCTAGCACT GACCCAGCGG 60CTGCCTCCTG AGGTTTCCCG AGGACCACA ATG AAC AAG TGG CTG TGC TGC GCA113Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala1 5CTC CTG GTG CTC CTG GAC ATC ATT GAA TGG ACA ACC CAG GAA ACC CTT161Leu Leu Val Leu Leu Asp Ile Ile Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Leu10 15 20CCT CCA AAG TAC TTG CAT TAT GAC CCA GAA ACT GGT CAT CAG CTC CTG 209Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His Gln Leu Leu25 30 35 40TGT GAC AAA TGT GCT CCT GGC ACC TAC CTA AAA CAG CAC TGC ACA GTG 257Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln 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NO136的资料(i)序列特征(A)长度191个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO136Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val1 5 10 15Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln20 25 30Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro35 40 45Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys50 55 60Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr65 70 75 80His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro85 90 95Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr100 105 110Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn115 120 125Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg130 135 140Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro145 150 155 160Pro Val Val Ser Phe Ser Pro 5er Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu165 170 175Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu180 185 190(2)SEQ ID NO137的资料(i)序列特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO137TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGGCCGG GTAC54(2)SEQ ID NO138的资料(i)序列特征(A)长度380个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO138Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His1 5 10 15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His20 25 30Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val Pro Cys Pro Asp His Ser35 40 45Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Val Tyr Cys Ser Pro50 55 60Val Cys Lys Glu Leu Gln Ser Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His65 70 75 80Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe85 90 95Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Ser Gly Val Val Gln Ala100 105 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Lys Cys Pro Asp Gly Phe115 120 125Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Ile Lys His Thr Asn130 135 140Cys Ser Thr Phe Gly Leu Leu Leu Ile Gln Lys Gly Asn Ala Thr His145 150 155 160Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala Thr Gln Lys Cys Gly Ile165 170 175Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr180 185 190Lys Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp Ser Leu Pro Gly195 200 205Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile Lys Arg Arg His Ser210 215 220Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn225 230 235 240Arg Asp Gln Glu Met Val Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys245 250 255Glu Ser Ser Val Gln Arg His Leu Gly His Ser Asn Leu Thr Thr Glu260 265 270Gln Leu Leu Ala Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Ile Ser Pro275 280 285Glu Glu Ile Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys Lys Ser Ser Glu Gln Leu290 295 300Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr305 310 315 320Leu Lys Gly Leu Met Tyr Ala Leu Lys His Leu Lys Thr Ser His Phe325 330 335Pro Lys Thr Val Thr His Ser Leu Arg Lys Thr Met Arg Phe Leu His340 345 350Ser Phe Thr Met Tyr Arg Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile355 360 365Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu370 375 380(2)SEQ ID NO139的资料(i)序列特征(A)长度380个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO139Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His1 5 10 15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His20 25 30Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr35 40 45Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro50 55 60Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His65 70 75 80Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu I1e Glu Phe85 90 95Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala100 105 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe115 120 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn130 135 140Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His145 150 155 160Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile165 170 175Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr180 185 190Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly195 200 205Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser210 215 220Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn225 230 235 240Lys Ala Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys245 250 255
Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu260 265 270Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala275 280 285Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile290 295 300Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr305 310 315 320Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe325 330 335Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His340 345 350Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile355 360 365Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu370 375 380(2)SEQ ID NO140的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO140TGGACCACCC AGAAGTACCT TCATTATGAC 30(2)SEQ ID NO141的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO141GTCATAATGA AGGTACTTCT GGGTGGTCCA 30(2)SEQ ID NO142的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B) 类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO142GGACCACCCA GCTTCATTAT GACGAAGAAA C31(2)SEQ ID NO143的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO143GTTTCTTCGT CATAATGAAG CTGGGTGGTC C 31(2)SEQ ID NO144的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO144GTGGACCACC CAGGACGAAG AAACCTCTC 29(2)SEQ ID NO145的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型CDNA(xi)序列描述SEQ ID NO145GAGAGGTTTC TTCGTCCTGG GTGGTCCAC 29(2)SEQ ID NO146的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO146CGTTTCCTCC AAAGTTCCTT CATTATGAC 29(2)SEQ ID NO147的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO147GTCATAATGA AGGAACTTTG GAGGAAACG 29(2)SEQ ID NO148的资料(i)序列特征
(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO148GGAAACGTTT CCTGCAAAGT ACCTTCATTA TG 32(2)SEQ ID NO149的资料(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO149CATAATGAAG GTACTTTGCA GGAAACGTTT CC32(2)SEQ ID NO150的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO150CACGCAAAAG TCGGGAATAG ATGTCAC 27(2)SEQ ID NO151的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO151GTGACATCTA TTCCCGACTT TTGCGTG 27(2)SEQ ID NO152的资料(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO152CACCCTGTCG GAAGAGGCCT TCTTC25(2)SEQ ID NO153的资料(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO153GAAGAAGGCC TCTTCCGACA GGGTG 25(2)SEQ ID NO154的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO154TGACCTCTCG GAAAGCAGCG TGCA 24(2)SEQ ID NO155的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO155TGCACGCTGC TTTCCGAGAG GTCA24(2)SEQ ID NO156的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO156CCTCGAAATC GAGCGAGCAG CTCC24(2)SEQ ID NO157的资料(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO157
CGATTTCGAG GTCTTTCTCG TTCTC 25(2)SEQ ID NO158的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO158CCGTGAAAAT AAGCTCGTTA TAACTAGGAA TGG 33(2)SEQ ID NO159的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO159CCATTCCTAG TTATAACGAG CTTATTTTCA CGG33(2)SEQ ID NO160的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO160CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38(2)SEQ ID NO161的资料(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO161CCTCTCTCGA GTCAGGTGAC ATCTATTCCA CACTTTTGCG TGGC 44(2)SEQ ID NO162的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO162CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG38(2)SEQ ID NO163的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO163CCTCTCTCGA GTCAAGGAAC AGCAAACCTG AAGAAGGC 38(2)SEQ ID NO164的资料(i)序列特征
(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO164CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG38(2)SEQ ID NO165的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO165CCTCTCTCGA GTCACTCTGT GGTGAGGTTC GAGTGGCC38(2)SEQ ID NO166的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO166CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38(2)SEQ ID NO167的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO167CCTCTCTCGA GTCAGGATGT TTTCAAGTGC TTGAGGGC 38(2)SEQ ID NO168的资料(i)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO168Met Lys His His His His His His His Ala Ser Val Asn Ala Leu Glu1 5 10 1权利要求
1.编码多肽的分离的核酸，所述多肽含有至少一种OPG的生物活性，其中所述核酸选自a)图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEQ ID NO122)和9C-9D(SEQ ID NO124)所示的核酸或其互补链；b)在严紧条件下，与图2B-2C(SEQ ID NO120)，9A-9B(SEQ ID NO122)和9C-9D(SEQ ID NO124)所示的多肽编码区杂交的核酸；c)在严紧条件下，与图1A中所示的核苷酸148-337杂交的核酸；和d)与(a)、(b)和(c)核酸简并的核酸。
2.权利要求1的核酸，它是cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA。
3.由权利要求1的核酸编码的多肽。
4.权利要求1的核酸，它包括对于大肠杆菌表达优选的一种或多种密码子。
5.权利要求1的核酸，它含有与其相连的可检测标记。
6.权利要求1的核酸，它含有图2B-2C(SEQ ID NO120)，图9A-9B(SEQ ID NO122)和图9C-9D(SEQ ID NO124)的多肽编码区。
7.权利要求6的核酸，它具有图9C-9D(SEQ ID NO124)中所示的核苷酸158-1297的序列。
8.含有权利要求1的核酸的表达载体。
9.权利要求8的表达载体，其中所述核酸含有图9C-9D(SEQ IDNO124)所示的多肽编码区。
10.用权利要求8的表达载体转化或转染的宿主细胞。
11.权利要求10的宿主细胞，它是真核细胞。
12.权利要求11的宿主细胞，它选自CHO、COS、293、3T3、CV-1和BHK细胞。
13.权利要求10的宿主细胞，它是原核细胞。
14.权利要求13的宿主细胞，它是大肠杆菌。
15.含有权利要求8的表达载体的转基因哺乳动物。
16.权利要求15的转基因哺乳动物，它是啮齿类动物。
17.权利要求16的转基因哺乳动物，它是小鼠。
18.一种生产OPG的方法，它包括在适宜的营养条件下，使以权利要求1的核酸转化或转染的宿主细胞生长；和分离核酸表达的多肽产物。
19.含OPG的纯化并分离的多肽。
20.权利要求19的多肽，它是哺乳动物OPG。
21.权利要求20的多肽，它是人OPG。
22.权利要求19的多肽，它基本上不含其它人蛋白。
23权利要求21的多肽，它具有图2B-2C(SEQ ID NO121)，图9A-9B(SEQ ID NO123)或图9C-9D(SEQ ID NO125)所示的氨基酸序列或其衍生物。
24.权利要求23的多肽，它具有图9C-9D(SEQ ID NO125)所示的残基22-401的氨基酸序列。
25.权利要求23的多肽，它具有图9C-9D(SEQ ID NO125)所示的残基32-401的氨基酸序列。
26.权利要求19的多肽，其特征在于它是外源DNA序列表达的产物。
27.权利要求26的多肽，其中所述DNA是cDNA、基因组DNA或合成DNA。
28.权利要求19的多肽，所述多肽已经用水溶性聚合物修饰过。
29.权利要求28的多肽，其中水溶性聚合物是聚乙二醇。
30.一种多肽，它包含含有4个半胱氨酸富集结构域的至少约164个氨基酸的氨基酸序列，所述半胱氨酸富集结构域代表肿瘤坏死因子受体细胞外区的半胱氨酸富集结构域；和提高骨密度活性。
31.含有图2B-2C(SEQ ID NO121)，图9A-9B(SEQ ID NO123)或图9C-9D(SEQ ID NO125)所示氨基酸序列的，在残基22有氨基末端的多肽，其中从羧基末端缺失了1-216个氨基酸。
32.权利要求31的多肽，它含有残基22-185、22-189、22-194或22-201的氨基酸序列。
33.权利要求32的多肽，它还含有从羧基末端延伸的人IgG1的Fc区。
34.含有图2B-2C(SEQ ID NO121)，图9A-9B(SEQ ID NO123)或图9C-9D(SEQ ID NO125)所示氨基酸序列的，在残基22有氨基末端的多肽，其中从氨基末端缺失了1-10个氨基酸，而且，可选地从羧基末端缺失了1-216个氨基酸。
35.权利要求34的多肽，它含有残基27-185、27-189、27-194、27-401或32-401的氨基酸序列。
36.权利要求35的多肽，它还含有从羧基末端延伸的人IgG1的Fc区。
37.一种多肽，它选自huOPG[22-201]-FchuOPG[22-401]-FchuOPG[22-180]-FchuOPG met[22-401]-FchuOPG Fc-met[22-401]huOPG met[22-185]huOPG met[22-189]huOPG met[22-194]huOPG met[27-185]huOPG met[27-189]huOPG met[27-194]huOPG met[32-401]huOPG met-lys[22-401]huOPG met[22-401]huOPG met[22-401]-Fc(P25A)huOPG met[22-401](P25A)huOPG met[22-401](P26A)huOPG met[22-401](P26D)huOPG met[22-194](P25A)huOPG met[22-194](P26A)huOPG met met-(lys)3[22-401]huOPG met met-arg-gly-ser-(his)6[22-401]
38.编码权利要求37的多肽的核酸。
39.特异性结合OPG的抗体或其片段。
40.权利要求39的抗体，它是单克隆抗体。
41.一种用于检测生物样品中是否存在OPG的方法，它包括在使抗体与OPG结合的条件下，将所述样品与权利要求39的抗体一起保温；和检测结合的抗体。
42.一种评估候选物质结合OPG的能力的方法，它包括将OPG与候选物质在允许结合的条件下保温；和测量结合的物质。
43.一种调节动物中OPG水平的方法，它包括用编码OPG的核酸修饰该动物。
44.权利要求43的方法，其中所述核酸促进组织中OPG水平的提高。
45.权利要求44的方法，其中所述动物是人。
46.一种药物组合物，它含有在药用载体、辅药、增溶剂、稳定剂和/或抗氧化剂中的治疗有效量的OPG。
47.权利要求46的组合物，其中所述OPG是人OPG。
48.权利要求47的组合物，其中所述OPG具有图9B所示的氨基酸序列。
49.一种治疗骨疾病的方法，它包括施用治疗有效量的权利要求19的多肽。
50.权利要求49的方法，其中所述多肽是人OPG。
51.权利要求49的方法，其中所述骨疾病是过量骨损失。
52.权利要求51的方法，其中所述骨疾病选自骨质疏松症，变形性骨炎，高血钙，甲状旁腺机能亢进，类固醇诱发的骨缺乏，由类风湿关节炎引起的骨损失，由骨髓炎引起的骨损失，溶骨转移和牙周骨损失。
53.权利要求49的方法，它还包括施用治疗有效量的选自下列的物质骨成形蛋白BMP-1到BMP-12、TGF-β家族成员、IL-1抑制剂、TNFα抑制剂、甲状旁腺激素和其类似物，甲状旁腺激素相关蛋白和其类似物，E系列前列腺素，二磷酸盐和骨增强矿物质。
54.由促骨生长素单体组成的促骨生长素多聚体。
55.权利要求54的多聚体，它是二聚体。
56.权利要求54的多聚体，它是通过链间二硫键形成的。
57.权利要求54的多聚体，它是通过联合衍生于人IgG1的Fc区而形成的。
58.权利要求54的多聚体，它基本上不含促骨生长素单体和无活性多聚体。
59.权利要求54的多聚体，其中所述单体含有图9C-9D(SEQ IDNO125)所示残基22-401的氨基酸序列或其衍生物。
60.权利要求54的多聚体，其中所述单体含有图9C-9D(SEQ IDNO125)所示残基22-194的氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种新的分泌型多肽,称为促骨生长素,它是肿瘤坏死因子受体超家族的成员,而且与骨代谢的调节有关。还公开了编码促骨生长素的核酸,多肽,重组载体和用于表达的宿主细胞,结合OPG的抗体和药物组合物。所述多肽被用于治疗以骨吸收增加为特征的骨疾病,如骨质疏松症。
文档编号C12N5/10GK1182452SQ96193441
公开日1998年5月20日 申请日期1996年12月20日 优先权日1995年12月22日
发明者W·J·博伊尔, D·L·莱凯, F·J·卡尔佐尼, M·张 申请人:安姆根有限公司