生物分子的检测方法

专利名称：：生物分子的检测方法
技术领域：
：本发明涉及用于检测介质中催化活性的核酶存在的方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒在方法和试剂盒用于检测在试验样品中特异性生物分子的存在的范围之内是有用的。
背景技术：
：检测特异性生物分子(如DNA或RNA序列、蛋白质、抗原、抗体等)在样品中存在是各种实验、诊断的和治疗用途的需要。许多测定可用于检测蛋白质生物分子，如凝胶电泳图、HPLC、亲和色谱法以及其它基于使用适当的标记探针进行的测定。在这样的测定在其中要检测的蛋白质生物分子存在足够大的数量时是令人满意的同时，它们也时常不够灵敏到足以使得可以进行少量生物分子的检测。DNA或RNA序列可通过使用标记的探针检测。在检测的DNA或RNA序列仅以十分小的量存在时，它们必须通过一些方法如LCR(连接酶链反应)，SSR(自动维持序列扩增)或PCR(聚合酶链反应)扩增。虽然扩增方法如PCR对基础研究具有极大的影响，它们在过渡到临床设备却是缓慢的。这一点的首要原因是与样品的临床环境结合的自动化的需要产生了复杂、缓慢而昂贵的处理。对环境因素高度敏感性的蛋白质酶的需要使精确控制的环境成为必要(在其中操作这些酶)。典型地，临床样品包含许多组分，它们可干扰酶进行其催化活性的能力。此外，用于样品制备以释放核酸的标准方法(如胍硫氰酸或酚抽取)不适用于以蛋白质为基础的酶促活性，因而必须从样品制剂中除去靶核酸。核酶典型地是具有类酶促催化活性的RNA分子，这种活性通常是核酸序列的裂接、剪接和连接。尽管曾有证明核酶可作用于DNA分子和蛋白质，核酶的已知底物是RNA分子。参与胞内反应的天然核酶以顺式起作用，仅催化单一的转换，在反应期间通常进行自身修饰。然而，可以对核酶工程操作以使其按真正的催化方式以反式作用，转换大于一而不进行自身修饰。在核酶中可鉴别出两个明显的区结合区(使核酶具有和特异性核酸序列(也可能是特异性蛋白质)杂交的特异性)和催化区(使核酶具有裂解、连接或剪接活性)。每组核酶使用不同的作用机制裂解不同的核苷酸序列。每组可按对其催化活性是必须的核苷酸碱基的数目以及核酶和靶序列的特异性程度进一步区分(RobertH.Simons，生物化学年评，61，641-671，(1992))。为了治疗疾病或遗传失常，最近提出了使用核酶裂解靶RNA，如病毒RNA或从从应关闭的基因转录的信使RNA。这种方法作为通过使用反义序列以封闭RNA转录的替代方法提出。由于核酶的催化性质，单一的核酶分子可裂解许多靶RNA分子，因此可以以比反义治疗所需的浓度相对更低的浓度达到治疗活性(WO96/23569)。很少有提及核酶用于诊断目的的用途。WO94/13833描述了一种检测溶液中核酸分子的方法，这种方法通过制作(tailoring)具有两个区的特异性核酶分子，其中一个和待检测的核酸序列互补，另一个和带有可检测的标记的共靶分子互补。核酶可特异性地并反向结合选择的靶核酸序列和和标记的共靶。靶和共靶均结合时，核酶进行构型改变，这使其具有活性并可把标记从共靶裂解掉，然后检测游离的标记。通过共靶的裂解，核酶可与另外的共靶再结合，裂解更多的标记并产生更多的可检测信号。尽管WO94/13833的发明人称它们的发明“信号的扩增”，实际上产生的核酶数目无扩增，而反应是纯粹的酶促反应，其中催化物质(在核酶的情况下)裂解底物(在共靶的情况下)，然后解离并裂解另一种底物。没有发生参与反应的活性核酶的数量的真正扩增。术语表下面是用于下列说明书和权利要求书的术语表。然而，这个术语表不应分离地考虑，要完全理解各种术语和这些术语在本发明上下文中的意义，术语表应结合本说明书的其余部分阅读。核酶-具有类酶促催化活性的核酸分子。尽管通常在本发明的上下文中该术语用于指催化活性的(类酶的)寡核苷酸，在本领域中所使用的术语“核酶”指具有作为催化活性的RNA分子。这样，本发明的核酶可以是RNA分子，可以是包含dNTPs或完全由dNTPs组成的寡核苷酸，也可以包括各种非天然产生的核苷酸，如IsoG或IsoC5′-O-(1-硫代-鸟苷三磷酸)核苷酸和5-O-甲基核苷酸。可按照本发明使用的核酶可如上所述专一由核酸组成，或其催化活性需要辅因子。核酶可以具有寡核苷酸序列的裂解、连接、剪接或剪除(splicingout)(除去)、向寡核苷酸序列添加基团、核酸序列的重排等催化活性。测定的生物分子-在待检测的试验样品中存在的分子。它可以是寡核苷酸或识别对的成员，如受体/配体、抗体/抗原、外源凝集素/糖蛋白等。起始核酶-在较多核酶产生的地方起始反应的核酶，最终导致可检测的标记产生。在本发明的方法用于检测生物分子时，起始核酶是检测系统(见下)的一部分并作为待测的生物分子的存在的报道分子，因为只有所说的待测生物分子存在，起始核酶才产生或变为催化活性的。活性起始核酶的存在活化了催化系统(见下)。检测系统-使催化活性的起始核酶产生或活化的分子和试剂的组合，这作为在试验样品中的待测生物分子存在的报道分子。换句话说，在待测的生物分子存在时，在反应或反应级联之后，最终产生催化活性的起始核酶。在起始核酶以扩增方式产生更多的活性核酶的地方，在催化系统中检验起始核酶的存在(见下)(核酶自身或其催化活性的产物，如在测定的最终阶段检测游离标记)。失活核酶-潜在的催化活性核酶，它直到被修饰或直到修正介质的条件使其在其中变为活性后才能发挥其催化活性(裂解、剪接、连接等)。活化-通过某种催化作用(裂解、剪接、连接、添加基团、重排)或外部条件的改变(如添加镁离子)使失活的核酶变为催化活性的。抑制部分-时常存在于第二复合体分子(见下)中而且在存在时使起始核酶失活的部分。抑制部分的抑制作用可以通过修饰它或从复合分子中除去终止。复合分子-形成按照在本文中称作“活化实施方案”的本发明实施方案的检测系统一部分的分子。在实行活化实施方案的一种方式中，使用了“第一复合分子”，它包括作为推定的(apriori)、催化失活的起始核酶(例如，由于在介质中缺乏镁离子)和能被活性起始核酶裂解并包含识别生物分子(见下)的序列连接。在另一种实行活化实施方案的方式中，使用了“第二复合分子”，它包括作为推定的、催化失活的起始核酶和能被活性起始核酶裂解并包含识别生物分子(见下)的序列连接。第二复合分子还包含抑制部分。识别生物分子-能特异性地识别或结合到待测的生物分子上的分子。在待测的生物分子是寡核苷酸序列时，识别生物分子是互补序列。在待测的生物分子是识别对的成员(如抗原-抗体)时，识别生物分子是此识别对的另一个成员。第一寡核苷酸-一种寡核苷酸，典型地是DNA分子，从3′→5′包括双链功能启动子、编码与起始核酶序列互补序列的单链序列、和能被催化活性起始核酶裂解的RNA序列等同的(具有必要的U-T替换)单链序列以及和要检测的寡核苷酸序列的5′-部分互补的单链序列。第二寡核苷酸-一种寡核苷酸，典型地是DNA分子，从3′→5′包括3′-部分和要检测的寡核苷酸序列互补的单链序列以及触发寡核苷酸模板(见下)。触发寡核苷酸模板-是第二寡核苷酸一部分的寡核苷酸序列，其转录产物能和反向(back)启动子构建体(见下)杂交。触发寡核苷酸序列-触发寡核苷酸模板的转录产物，能和反向启动子构建体(见下)杂交，在反向启动子之后完成，可引起其连接的寡核苷酸序列转录。非模板链寡核苷酸-通过待测的核酸序列(第一寡核苷酸和第二寡核苷酸)杂交获得的寡核苷酸杂合体的转录产物，从3′到5′包括触发寡核苷酸序列、和待测的生物分子互补的序列、和可被起始核酶裂解的序列互补的序列以及和起始核酶互补的序列。反向启动子构建体-与能和触发寡核苷酸序列杂交的单链序列结合的单链启动子序列。在与触发寡核苷酸序列杂交之后，通过适合的DNA聚合酶作用，可以产生功能性的双链启动子，在转录系统(见下)存在下，这种启动子能产生最终的寡核苷酸转录物(见下)。最终的寡核苷酸转录物-在反向启动子构建体和非模板链寡核苷酸杂交之后获得的寡核苷酸杂合体的转录产物(在启动子由适合的DNA聚合酶完成为双链功能性启动子之后)，同时从5′-3′包含起始核酶序列、能被所说的起始核酶裂解的序列、编码待测的生物分子上的检测序列的互补序列的序列以及编码触发寡核苷酸模板的互补序列的序列。在所说的最终寡核苷酸转录物的起始核酶可裂解其邻近的序列，这样就释放了游离的、全活性的起始核酶。第三寡核苷酸序列-和待测的生物分子中的要检测的序列的5′-部分互补的核酸序列。第三组合物分子-用于本发明的“装配实施方案”的分子，该分子包含和起始核酶的一部分连接的第三寡核苷酸序列。它也可有可无地包含由活性起始核酶裂解的序列。第四寡核苷酸序列-和待测的生物分子中要检测的序列的3′-部分互补的核苷酸序列。第四组合物分子-用于本发明的“装配实施方案”的分子，该分子包含和起始核酶的一部分连接的第四寡核苷酸序列，其中核酶需要完成存在于第三组合物的部分以获得完全的催化活性核酶。它也可有可无地包含由活性起始核酶裂解的序列。催化系统-分子和反应混合物的集合体，在催化活性起始核酶存在下，该集合体产生可检测的信号。该分子集合体包含含有是推定的失活核酶的组合物分子的组合。在一个实施方案中，催化系统包括试剂和分别包含第一和第二核酶(失活)的第一组合物分子与第二组合物分子(见下)的组合。第一和第二核酶是推定的失活的，其中之一或两者可被催化活性起始核酶活化。活性的第一核酶可活化失活的第二核酶分子，活性的第二核酶可以活化失活的第一核酶以以正反馈方式造成活性核酶的数量的扩增。另外，第一和第二核酶可以是固定或在空间上相互分离，通过起始核酶裂解其中之一或两者会引起它们释放至介质中。释放的游离核酶可使固定的第二核酶游离化(例如通过裂解)，反过来，游离第二核酶释放并使第一核酶游离化，这样就引起了自扩增反应级联，它以正反馈方式迅速产生活性核酶的数量扩增。按照另一个实施方案，催化系统也可以仅包括一种组合物分子，这种组合物分子是固定的或在反应容器中相互分离，或者，这种组合物分子是推定的失活的。起始核酶活化失活核酶或从组合物分子释放核酶，然后活性的或释放的核酶分别活化失活的或游离固定化的其它核酶，然后就引起了自扩增反应级联，它以正反馈方式迅速产生活性核酶的数量扩增。由于核酶的活化或释放，产生了可检测的信号，信号指示起始核酶在介质中的存在。第一组合物分子-包括第一核酶(见下)，可有可无地标记并和第二核酸序列(见下)连接。第二组合物分子-包括第二核酶(见下)，可有可无地标记并和第一核酸序列(见下)连接。第一核酸序列-一种寡核苷酸序列，它是第二组合物分子的一部分，而且是第一核酶(见下)的催化活性靶。在第一核酸序列上的第一核酶催化活性之后，第二核酶(见下)被释放进介质或变为催化活性的。第二核酸序列-一种寡核苷酸序列，它是第一组合物分子的一部分，而且是第二核酶(见下)的催化活性靶。在第二核酸序列上的第二核酶催化活性之后，第一核酶(见下)被释放进介质或变为催化活性的。第一核酶-第一组合物分子的一部分-能裂解第一核酸序列，而且其催化活性和起始核酶等同。它可有可无地被标记。第二核酶-第二组合物分子的一部分-能裂解第一核酸序列并可有可无地被标记。第三核酶-按照另一个实施方案可形成催化系统的一部分的核酶。第三核酶最初是失活的。起始核酶通过在第三核酶上发挥其催化活性(以在下面将要解释的方式)起作用以活化第三核酶，然后活化的核酶可以起作用以活化催化系统中的其它第三核酶。转录系统-寡核苷酸、核苷酸、RNA聚合酶和试剂的集合体，在寡核苷酸模板存在时使寡核苷酸转录物转录。第四核酶-按照其实施方案是催化系统一部分的核酶，这种核酶只要是催化活性的就可结合第五核酶(见下)的两部分以发挥催化活性的第五核酶。第四核酶由至少两部分组成，它们最初是分离的并通过第五核酶(当是催化活性时)连接在一起。在连接之后，第四核酶变为催化活性的。第五核酶-是包含第四核酶的催化系统的一部分的核酶，这种核酶只要是催化活性的就可结合第四核酶的两部分以发挥催化活性的第四核酶。第五核酶由至少两部分组成，它们最初是分离的并通过第四核酶连接在一起。在连接之后，第五核酶变为催化活性的。第六核酶-第三核酶的特异性例子，其中所说的失活核酶携带另外的核酸序列并通过这种序列的裂解或剪除(即除去)活化。第七核酶-其中所说的待测核酸序列完成(complete)对其催化活性必要的缺失部分的核酶，这样它一旦与待测序列结合就成为催化活性的。发明概述本发明提供了一种基于核酶的信号扩增方法，这种方法操作比较简单，而且快速廉价。不同于迄今为止可供使用的检测-扩增方法，本发明的方法也适于point-of-care(POC)试验。本发明的方法的一个优点是在其中核酶在临床环境发现的条件下(如在生物体液中)是活性的。进而，如在下面进一步显示的，为了确保特异性，按照本发明的信号-扩增方法不需要遵守特定的条件(在现有技术的信号-扩增方法中必须严格遵守条件)。另外，在各种样品制剂混合物(例如1M硫氰酸胍以及在饱和的酚制剂中)核酶是功能性的，所说的制剂混合物通常抑制其它检测-扩增系统的功能。核酶由核酸序列组成，这样可把测定和探针序列包括在核酶分子中。而且，通过工程操作核酶增加扩增方法的特异性是可能的，这样待测序列自身的部分需要核酶发挥其催化活性。在本领域中术语作为“体外进化”的一种有效的技术可成功地运用于核酶以产生具有各种催化活性和特性的核酶。通过这种技术，可用活性筛选许多潜在的核酶。纯化那些表现出活性的核酶以用于进一步选择，在重复几次之后，只留下最高效的候选者。在传统的扩增技术中，在酶选择之后，必须修饰酶操作的环境(即包含药品的介质)以使得酶具有适当的活性。在核酶的情况下，在体外进化中，通过在其组合物和临床样品相同的选择介质中进行体外进化选择在所需的临床(生物)介质中是高度活性的核酶是可能的。本发明提供了一种用于检测在介质中的催化活性核酶(本文所指的“起始核酶”)的灵敏方法。虽然通常催化活性起始核酶作为试验样品中其它生物分子存在的报道分子，催化活性起始核酶存在的检测自身是一个目的。一旦把包含催化活性起始核酶的介质导入按照本发明的催化系统，就导致催化反应级联，由此引起活性核酶数量的指数扩增。催化系统包括失活的或空间上相互分离的核酶以使它们不能发挥其催化活性；起始核酶释放或活化催化系统的核酶，这些核酶反过来分别释放或活化系统的其它核酶。携带可检测的标记或催化活性的核酶导致产生可检测的标记，然后这种标记作为发生于系统之中的催化级联指示。按照其中核酶是最初固定的本发明实施方案，在反应介质中游离核酶的存在自身可作为可检测的信号。按照另一个实施方案，使各活性的核酶携带或产生可检测的标记，然后这些可检测的标记可检测的信号。按照本发明的方法有非常小的假阳性信号，即低噪音水平，而且，本发明的方法可使在单一测定系统中检测几个生物分子成为可能。这样，本发明提供了一种用于检测在介质中催化活性起始核酶存在的方法，该方法包含以下步骤(a)提供催化系统，该催化系统包含(aa)推定的催化失活的或空间上受限制的使得它们不能对靶发挥其催化活性的核酶；所述核酶的靶是催化系统的其它核酶，它们对其它核酶的催化活性引起以下两者之一(i)活化失活的核酶，(ii)释放空间上受限制的核酶以使其可接触它们的靶；至少催化系统的某些核酶是起始核酶催化活性的靶，起始核酶对所说的某些核酶的催化活性是上述(i)或(ii)；(ab)具有可检测的性质的可检测标记以使核酶的催化活性引起可检测性质的变化；(b)把介质与所说的催化系统相接触；(c)提供使所说的催化系统的催化活性起始核酶和催化活性核酶发挥其催化活性的条件，由此，存在的催化活性起始核酶引起反应级联，其中催化系统的核酶被活化或释放进介质中；(d)检测所说的可检测性质，所说的性质的变化是活性起始核酶在所说的介质中存在的指示。本发明的核酶检测方法的主要效用在设计用于检测生物分子存在的测定的范围之内，这些生物分子如在生物样品中的特异性核酸序列、结合偶联的成员如抗体-抗原、糖-外源凝集素等。概念上可以认为这样的测定包含两个有区别的组分(尽管这些组分可实际上一起包括在一个反应容器中)检测系统和催化系统。在这样的测定中，待测生物分子的存在导致在介质中催化活性起始核酶按照以下将要进一步描述的方式产生。然后催化活性起始核酶作为催化系统的报道分子，在扩增活性核酶数量的反应级联之后如通常所述在反应介质中产生可检测的标记。这样，在催化系统的介质中出现可检测的标记表明待测生物分子在初始待测生物样品中的存在。发明详述按照本发明使核酶具有了新的用途。在最广的意义上，包含核酶的催化系统用于检测在待测介质中催化活性起始核酶的存在。在待测介质中催化活性起始核酶存在的检测自身是一个目的，例如，在通过体外进化制备核酶的方法中。此外，按照本发明的一个优选的实施方案，催化活性起始核酶作为在待测生物样品中待测生物分子(而非起始核酶)存在的报道分子。按照本发明所用的核酶可完全由RNA组成。有时在RNA中用某些脱氧核苷酸(“dNTPs”)或某些其它天然或非天然产生的核苷酸(如IsoG或IsoC5-O-(1-硫代三磷酸)核苷酸和5-O-甲基核苷酸)取代某些核苷酸(“rNTPs”)也是可能的。有时这样的取代是合乎需要的，例如，提高核酶对几乎在所有的生物样品中都存在的核糖核酸酶的稳定性。除非特别指出，术语“核酶”可以理解为是指完全由rNPS组成的催化核苷酸或其中某些rNTPs由dNTPs或其它核苷酸取代的催化核苷酸。核酶也可以完全由DNA组成(Breaker等，化学和生物学，1(4)223-9，1994)。本发明的核酶可由以上所述由非核酸分子复合形成的核酸序列组成，其中非核酸分子如蛋白质、多肽、脂肪酸、染料、抗生素或碳水化合物。与核酶复合的非核酸部分可作为核酶催化活性的辅因子。在下面使用了术语“寡核苷酸”。取决于上下文，寡核苷酸可以是DNA寡核苷酸(完全由dNTPs组成)或RNA寡核苷酸(完全由rNTPs组成)。然而，特别在RNA寡核苷酸的情况下，有时以dNTPs或其它天然和非天然产生的核苷酸取代某些或所有rNTPs是合乎需要的。本发明在广义上提供了用于检测在试验介质中催化活性起始核酶存在的方法。“催化活性”指能进行催化反应(如裂解、剪接、连接、把特异性基团(如磷酸盐)添加至分子中、核酸序列的重排等)的核酶。按照进行本发明的实施方案的催化系统包括两种核酶，它们是推定的失活的，但作为催化活性发挥的效果变为催化活性的。例如，每种核酶在其活性必须部分有缺口或断口。这样在缺口或断口连接之前需要将其活化。在这种情况下，催化系统包括两种核酶，每种推定的断为两组分，这样最初是失活的。一种的活性核酶连接第二种核酶的两个组分，这样使其具有活性，第二种活性核酶可连接第一种核酶的两个组分，由此使其具有活性。然后通过以正反馈放大方式交叉连接进行活化。一种第一催化核酶可通过作为检测系统产物的起始核酶以两条路线之一产生。按照第一条路线，第一种的某些核酶推定的是完全装配的但不能连接第二核酶的部分，因为它们在空间上是分离的，例如，作为通过多孔膜被固定的结果等。起始核酶裂解固定化的完全装配的第一种核酶分子，然后游离第一种核酶连接第二种核酶，后者又反过来连接第一种核酶的成员(这些成员推定的不是装配的等)。按照第二条路线，起始核酶是自身是连接其部分(催化系统的两种核酶中的至少一种)的连接核酶，这样开始交叉连接级联。在这种情况下，不需要从空间上分离催化系统的各种成员，因为直到起始核酶导入反应混合物才开始催化过程。另一个例子是具有丰余序列的核酶，这种丰余序列使核酶失活，这样裂解剪除以使核酶活化。另一个例子是需要序列重排或添加特异性基团以使其具有活性的核酶。另一个例子是需要逆外显子剪接(即添加对核酶是内部的序列)的核酶。一种核酶在活性形式时，因为它具有需要修饰从失活至活性形式的其它核酶的催化性质(连接、裂解、剪接、重排等)可以活化第二种的失活核酶，反之亦然。两种核酶可潜在地具有相同类型的催化活性(例如，两种都是连接核酶或两者都是裂解核酶等)或可以具有不同类型的催化活性。一种或两种推定的失活核酶可通过催化活性起始核酶活化。在向介质导入起始核酶之前，催化系统根本上是不起作用的，因为没有发生催化活性。在这样的起始核酶存在下，开始核酶扩增级联，因为每种活性核酶以正反馈方式反过来产生更多的活性核酶。活性核酶产生可以下述方式产生的检测信号，这样的信号指示了介质中催化活性起始核酶的存在。按照另一个用于实施本发明的实施方案的催化系统包含两种组合分子(compositemolecules)，每种包含与一种可裂解的核酸序列连接的核酶。在一种组合分子中的核酶可裂解其它种组合分子中的核酸序列以便两种组合分子之间的交叉裂解在原则上是可能的，同时也避免了自裂解。然而，在起始核酶导入介质之前不导致交叉裂解，因为构建两种组合分子它们之间的相互作用，同时裂解的核酶可和试验容器中的其它组合分子相互作用并以正反馈方式向介质中释放核酶。可以通过各种方法阻止相互作用，例如，通过把每种组合分子固定到试验容器的不同侧面上；通过把每种组合分子与具有阻止吸附到一个颗粒上的分子和吸附到另一个颗粒上的分子之间的相互作用的性质(例如大小或其它性质，例如相同的电荷(使小珠相互排斥))的不同小殊或不同胶体颗粒相连接；通过把组合分子与具有相同电荷的部分相连接以使所说的分子之间的电荷排斥阻止任何两种组合分子之间的相互作用；通过把每种组合分子放置在多孔膜的相对一侧(多孔膜不允许全组合分子通过其渗透，但允许裂解的核酶自由通过)。存在于推定的试验介质中或作为在生物样品中存在的另一个生物分子(如在这种情况下的核酶)(推定的报道分子)产生的催化活性起始核酶可裂解存在于一种或两种组合分子中的特异性核酸序列，由此释放催化系统的核酶。裂解的核酶在反应容器中可与其它组合分子的核酶自由自由地相互作用，反过来，这又可裂解第一种组合分子的核酶，由此产生了核酶“乒乓球式的”交叉裂解。核酶的这样的交叉裂解以正反馈方式作用，引起反应的实质上的扩增。其中之一或两种核酶典型地具有可检测的标记。裂解的标记的检测表明在反应混合物中的存在催化活性起始核酶。在起始核酶是报道核酶时，游离标记的检测表明在反应混合物中存在待测的生物分子。按照其它实施方案，催化系统可以仅包括一种失活核酶或一种包含核酶和当转化成游离或活性形式时被核酶裂解的核酸序列的组合分子。按照和以上的实施方案所描述的方式类似的方式，核酶的每一种分子直到催化活性起始核酶导入介质之前是失活的例如，每种失活的分子是封闭的环形式，这种环可通过催化活性起始核酶裂解或剪除核苷酸链打开。然后活化的(打开的)核酶打开并活化催化系统中的其它这样的封闭的环形分子。以和第二实施方案所描述的方式类似的方式，每种组合分子可包括定向定位的核酶，这种核酶阻止邻近的可裂解核酸序列的自裂解(例如，通过把序列放置到和核酶紧邻的位置)。在核酶和可裂解的序列之间没有间插序列的事实stcarically抑制了顺式裂解(可裂解的序列也可以具有逆方向，这样顺式裂解就是不可能的)。然而，释放的核酶可以以正确的方向接近并裂解核酸序列，进而向介质中释放更多的核酶。为了防止非释放的核酶的自发顺式裂解，确保如上所述的空间分离是可能的。在催化系统中活化核酶存在的检测取决于核酶催化活性的类型可采取各种形式。例如，在活性裂解或剪除的地方，标记可以连接到被裂解或剪除的部分，然后这样释放的标记的检测是催化活性起始核酶在介质中存在的指示。在某些情况下，核酶的活化使核酶的两个区之间的距离发生改变，如在两个有距离的区通过连接或重排、剪除间插区到一起的地方，或其中两个最初邻近的区通过如封闭环的打开分离的地方。在这种情况下，有可能在核酶的一个区和部分上吸附荧光标记，如淬灭核酶另一个区上荧光标记的光激发的Rodamine。当两者是邻近的时Rodamine对荧光标记的光激发有淬火作用，而两者分开时则没有这种作用。通过监控荧光标记的光激发改变，有可能确定两个区是否是邻近的(如在封闭的环失活核酶的情况下)或分离的(当核酶被打开并活化的情况下)。标记也可以是在不和核酶结合而且在其上催化活性核酶可以发挥其催化活性的底物上进行。例如，标记可以在作为核酶活性的结果被裂解或剪除的核酸序列上进行，由此把标记释放至介质。在这种情况下检测是通过介质中游离标记的存在。“乒乓球式的”的交叉活化(是否通过交叉裂解、交叉连接、交叉剪接、交叉重排或各种催化作用的替代循环)实质上扩大了反应，形成在短时间内表明起始催化活性核酶在介质中是否存在的指示。在现有技术扩增检测方法如PCR或LCR完成需要几个小时的同时，本发明的扩增检测方法在短得多的时间内完成。在催化活性起始核酶作为其它生物分子存在的报道核酶的地方，需要这样的检测系统，其中催化活性起始核酶仅在待测的生物分子存在下产生。这可以在下列实施方案之一中进行，在本文中作为“活化实施方案”、“转录实施方案”、“装配实施方案”和“完成实施方案”。按照活化实施方案，起始(报道分子)核酶推定是失活的。这种失活可以是介质中缺乏镁离子的结果，而镁离子对核酶的催化活性是需要的；这也可以是在介质中存在抑制部分的结果；这也可以是在介质中存在寡核苷酸的结果(这种寡核苷酸和被裂解以活化或把核酶释放进系统的杂交序列，其中只要序列是双链的裂解就不可能进行)等等。按照该实施方案，核酶与可特异性地和样品中待测的生物分子识别和结合的识别生物分子连接。例如，在待测的生物分子是寡核苷酸序列的地方，识别生物分子是互补序列；在待测的生物分子是酶的地方，识别生物分子可以是底物；在待测的生物分子是抗原的地方，识别生物分子可以是特异性地和抗原相互作用的抗体等。然后使和识别分子连接的核酶与待测生物分子相互作用，接着分离并洗去未结合的核酶。这样的分离可以通过结合核酶和待测生物分子的复合物与游离核酶的复合物之间的大小区别通过推定的固定待测的生物分子然后洗去游离核酶分子等进行。在所说的分离之后，改变条件以活化核酶，例如，添加缺乏的镁离子；通过修饰或除去抑制部分以停止其抑制活性；通过把双链非裂解序列解链为可单链可裂解的序列等。仅当待测的生物分子存在时，保留了结合的核酶，仅这些保留的核酶通过适当的条件改变活化。本发明的转录实施方案可在待测生物分子是核酸序列的地方使用。该实施方案的检测阶段通常可以如以色列专利申请105894和111857(其对应PCT申请WO94/29481和____)所述的进行，其中“触发寡核苷酸”是所说的起始核酶。该实施方案的检测系统包含两种寡核苷酸分子第一种包含和待测的核酸序列的5-部分互补的序列，第二种包含和待测的核酸序列的3-部分互补的序列。第一种寡核苷酸分子包含和待测的生物分子互补的序列的上游、功能启动子、编码起始核酶的序列以及能被所说的检测核酶裂解的序列(根本上是DNA序列)。第二个寡核苷酸分子包含和待测的序列3-互补的序列的下游、触发寡核苷酸模板、转录产物(能触发起始核酶序列的转录，将在下文中详尽解释)。如果在试验样品中不存在待测生物分子，就不转录触发寡核苷酸序列，因为只有待测生物分子的存在才能使需要产生所说的触发寡核苷酸的适当模板的两种分子接触即携带功能启动子的第一寡核苷酸分子和携带触发寡核苷酸模板的第二寡核苷酸分子。如果待测的生物分子存在，在转录系统存在时产生触发序列，反过来能产生包含和可被裂解的序列连接的起始核酶的转录物。在自裂解之后，这些转录物释放至催化活性起始核酶的介质中。按照本发明的装配实施方案，在待测生物分子是核酸序列的地方也是适用的，检测系统包含第三寡核苷酸(包含和待测核酸序列的5-分互补的序列)和第四寡核苷酸序列(包含与待测的核酸序列其余部分(3-部分)互补的序列)。每种这样的寡核苷酸也包括核酶的一部分(例如，一半)，两部分共同构成全长的、功能性的活性核酶。按照该实施方案，待测核酸序列的功能是使这两种寡核苷酸接触，这样产生功能性活性起始核酶。这样，在样品中存在待测核酸序列时，就产生功能起始核酶，后者可在本发明的催化系统中检测。按照本发明的完成实施方案，检测系统包括第七寡核苷酸、待测序列、生产催化活性起始核酶的与第七寡核苷酸的复合物。例如，待测序列可形成核酶催化核心的一部分。这样，按照该实施方案，推定核酶是不完全的，仅在待测序列的存在下，它才变成了完全的、催化活性核酶，后者可在催化系统中检测。待测序列也可以通过在其3-端与核酶缺失部分的一边杂交并通过其5-端与核酶缺失部分的另一边杂交完成核酶，这样就桥接了缺失部分以产生功能性起始核酶。待测序列也可以通过“逆外显子剪接”完成核酶的缺失部分，其中把所说的待测序列通过适当的裂解和连接反应插入到核酶中。所说的“逆外显子剪接”可通过存在于介质中的其它核酶进行。为了降低本发明的方法的“噪音”水平并减少假阳性结果，结合本发明的两种或两种以上的实施方案以双重保证在无待测生物分子存在的情况下不产生催化活性起始核酶是可能的。例如，把本发明的装配和活化实施方案结合的可能的，但催化活性核酶仅作为两种累积条件的结果产生在镁较少的混合物中全核酶从其两部分的装配，在洗去游离不完全核酶之后，全核酶通过添加镁离子活化。在本发明的检测系统的大多数实施方案中所用的核酶在大多数情况下是通用的，即相同的核酶可用于检测不同的待测生物分子，因为通过吸附的识别生物分子(在活化实施方案中)，或通过第一和第二寡核苷酸分子(在转录实施方案中)或通过第三和第四寡核苷酸序列(在装配实施方案中)需要特异性。在本发明的完成实施方案的情况下，必须制作第五寡核苷酸以适合待测的每种特异性核酸，因为识别待测序列的序列是核酶自身的一部分。本发明也提供了进行上述方法所需的试剂以及包含所说的试剂的试剂盒。下面参考某些非限制附图和实施例描述本发明在附图中使用了各种符号，它们在本发明的上下文中有下列意义直线(______)-DNA链波状线(￣￣)-RNA链A，B，C，等…-在DNA编码链中的序列A，B，C，等…-在互补的非编码DNA链中的序列a，b，c，等…-RNA序列a，b，c，等-和a，b，c互补的RNA序列固定在固相支持体上*可检测的标记抑制部分。附图简要描述图1显示了本发明的包含两种通过交叉裂解活化的组合分子的催化系统实施方案；图2(a)和2(b)显示了按照本发明的实施方案的催化系统，该系统包含一种通过交叉裂解或交叉剪接活化的组合分子其中所说的核酶是封闭环状形式(图2(a))；其中所说的核酶需要剪接才成为活性的(图2(b))；图3显示了组合分子可相互分离的各种方式通过固定到反应容器的明显位点(3A)；通过和大珠连接(3B)；通过和荷电的部分连接(3C)；通过把每种组合分子放置在多孔膜相对一侧；图4显示了按照本发明的活化实施方案的检测系统的例子，其中所说的核酶通过添加镁离子活化；图5显示了了按照本发明的活化实施方案的检测系统的另一个例子，其中所说的核酶通过抑制部分的修饰活化；图6显示了按照本发明的转录实施方案的检测系统；图7(a)和7(b)显示了按照本发明的装配实施方案的检测系统；其中核酶的识别序列和待测核酸序列杂交(图7(a))；或其中核酶的打开的stemp-II的待测序列杂交(图(b))；图8显示了本发明的包含两种通过交叉连接活化的核酶的催化系统的例子；图9显示了按照本发明的活化实施方案的检测系统的另一个例子，其中所说的核酶通过提供可裂解单链序列活化。图10显示了包含图7(b)的stem-II打开核酶的检测系统的裂解结果；图11显示了包含图2(b)的封闭环组合分子的催化系统的裂解结果；图12显示了核酶在未处理的血液和变性剂存在下的裂解结果。特定实施方案的描述催化系统首先参照显示构建本发明的催化系统的方式的图1。催化系统包括两种组合分子10和11。组合分子10包含一类和定名为b(13)的RNA序列连接的标记核酶(该核酶定名为核酶A(12))。组合分子11包含另一种定名为B(14)的标记核酶和RNA序列a(15)。在分子11中的核酶B能裂解在分子10中的序列b，在分子10中的核酶A能裂解在分子11中的序列a。最初分子10和11不能相互作用，因为每一种都固定在反应容器的不同位点。起始核酶16也能裂解分子10中的序列b。如果起始核酶存在于反应混合物中，序列b被裂解，向反应混合物释放游离核酶A(12)。游离核酶A(12)能在反应容器内分散以裂解分子11，这样向反应混合物释放游离核酶B(14)。游离核酶B(14)也能通过反应容器迁移以裂解分子10，再次释放游离核酶A(12)，循环以正反馈方式一次次地重复。因为核酶A和B都被标记，在上清液中其中之一或两者的检测表明在反应混合物中存在起始核酶16。下面是包含和序列13连接的锤头类型的核酶12的分子10的例子，然后在3′-端用生物素标记序列13(大写字母2′-O-甲基化的；小写字母RNA)5′CCAcugaugagGCCGAAAGGCcgaaacGUgucCGUAAA-下面是包含能裂解分子10中的序列13的另一种锤头类型的核酶14的分子11的例子。核酶14和能被核酶12裂解的序列15连接，然后核酶12的分子在其3′-端用生物素标记(大写字母2′-O-甲基化的；小写字母RNA)5′-GAGACGcugaugagGCCGAAAGGCcgaaacACgucUGGAAA尽管核酶A和B作为不同的核酶，序列a和b作为不同的序列，两种核酶和序列实际上是等同的。在这种情况下，在分子10或11每一种中的自裂解可通过把核酶与它所吸附的序列以相当近以致不能以顺式方式裂解的距离相连接避免，而游离核酶可以反式裂解组合分子。这可以通过把核酶与其潜在地可裂解的序列紧接着连接完成。这是因为核酶应与其潜在地可裂解的序列通过几个核苷酸隔开以产生有效的裂解。因此，当在组合分子中的核酶紧接着与可裂解的序列直接连接时，在仅能以反式裂解时，不可能以顺式裂解，序列仅可通过反式裂解。现在参照显示在反应容器中仅存在一种组合分子的地方的另一种选择的图2(a)。催化系统包括一种分子17′，每种包含核酶C′(18′)和可裂解的序列C′(19′)。分子17以封闭的环状的形式，这样的核酶最初是失活的。如果催化活性起始核酶16″存在于介质中，它可裂解序列c′并打开核酶使其成为活性的。打开核酶18反过来又可通过裂解打开另外的组合分子17并使它们变为活性的。检测可通过使用荧光标记(F)和Rodamine(Rd)进行。当两者在封闭的环中是相邻的时，就淬灭了荧光标记的光激发，当它们在打开的分子序列中是分离的时，荧光标记的光激发变得较强。现在参考显示包含仅一种组合分子的催化系统的另一个选择的图2(b)。核酶17″在其核心区中具有额外的核苷酸序列18″，它使核酶失活。在额外的序列的末端是封闭基团19，它使打开的末端不能自发连接。具有剪接催化活性的起始核酶16可裂解额外的序列18并封闭基团19，然后可连接游离末端以产生功能核酶。然后，功能核酶可剪接反应介质中的其它核酶，并引起反应的扩增。按照一种选择(选择1)的检测基本如图1(a)所示进行。但是在这种情况下，最初把在荧光基团(F)中的Rodamine(Rd)分开，仅通过核酶的活化使它们变得邻近，以便活性核酶可通过光激发的淬灭检测。按照检测的第二种方式(选择2)，包含游离额外序列18和封闭基团19的剪除基团携带可检测的标记。图2(b)的方式的优点是十分低的“噪音”水平，因为为了失活核酶自发变为活性的(在起始核酶的存在下不变为活性)，两个自发的事件(occurrences)必须发生自发的裂解(于生理ph和37℃的温度下在10mMMgCl中以10-6/分钟的概率)并自发连接(以107/分钟的概率)产生非常低的概率的自发活化(1013/分钟)。吸附到核酶A，B或C其中之一或两种的标记(图1)可以是本领域已知的任何可检测的标记，如放射性同位素、荧光标记、在底物存在下能产生显色反应的酶等。图3显示了各种方式，其中放置了所说的第一实施方案的两种组合分子10和11以避免相互作用，但允许游离核酶12和14与组合分子之间相互作用。可以理解相同的原则可适用于其它方式以构建本发明的催化系统，即在图2中阐述的在一种组合分子存在的地方。在图3(A)中分子10和11固定在反应容器的不同的和分离的位点上，而同时核酶12和14游离地分散在反应混合物中。图3(B)显示了固定在小珠19上的分子10和11，小珠的大小阻止了所说的分子之间的相互作用。然而，游离核酶12和14可游离地分散在反应混合物中并与组合固定分子相互作用。图3(C)显示了分离的组合分子的另一个例子，其中组合分子10和11吸附在具有相同电荷37的荷电部分上。所吸附部分之间的电排斥消除了分子10和11之间相互作用的可能性。然而，基本上不荷电的游离核酶12和14可与组合分子相互作用。图3(D)显示了通过把组合分子10和11放置在作为分子筛的多孔膜34的相对端并阻断大分子10和11的通过而同时允许较小的游离核酶12和14通过以分开它们的另一个例子。确保两种组合分子10和11不相互作用的另一个方式是通过使用封阻剂分子，封阻剂分子和特定的序列互补使其成为双链。按照这种方式，组合分子10包含封阻剂分子，它使可裂解的序列B和核酶A的催化区的一部分变为双链。在部分双链的组合分子10中，由于核酶催化区是双链的事实，它不是活性的。以类似的方式封闭组合分子11。如果起始核酶存在于反应混合物中，它显示出存在于组合分子10中的封阻剂的一部分，然后起始分子可裂解序列b。一旦分子b被裂解后，核酶也就具有了活性，因为部分替换封阻剂分子完全降低了组合分子10的活性，使其催化区变为单链和活性的。然后活性核酶以与上所述的相同的方式替换组合分子11的封阻剂分子，裂解可裂解的序列a并把核酶b转变为单链和活性的。然后核酶b以与以上所述的起始核酶活化类似的方式活化组合分子10，接着就可以进行两种组合分子的交叉活化。现在参照显示构建本发明的催化系统的另一个选择的图8。催化系统包括两种核酶80和81，它们当完全装配后是活性的，但当分别被分离成其部分80a、80b和81a、81b是失活的。全核酶81能连接核酶部分81a和81b以产生全长的和活性的核酶。全核酶81能连接核酶部分80a和80b以产生全长的和活性的核酶80，以便可通过交叉连接进行交叉活化。起始核酶86或86可通过从位点裂解全长的但固定的核酶(其中它和核酶部分81a和81b是部分分离的，例如，以在图3中指定的方式之一(图8上左部))或通过能连接部分80a和80b以形成全长的和活性的核酶80(图8上右部)产生全长的和活性的核酶80。检测系统在本发明的方法用于帮助检测非核酶的生物分子的地方，本发明也包括一种仅在待测分子存在时能产生催化活性起始核酶的检测系统。图4显示了本发明的活化实施方案的一个例子。在这个例子中，待测生物分子是固定的核酸序列A(41)，例如，DNA序列。固定可用本领域已知的任何方法进行，例如，在交叉连接剂的帮助下或通过在使小分子通过的两个多孔膜之间捕获待测的核酸分子。在待测的生物分子是蛋白质的地方，可以把它固定到携带适当的捕获剂(如指导抗不需检测的区域等的适当的固定的抗体等)的小珠上。另外，待测的生物分子可固定在硝酸纤维素膜上，为了饱和膜上的所有空位置并避免在下一步的非特异性吸收，另一种蛋白质(如白蛋白)应施用到硝酸纤维素膜上。检测系统也包含含有连接到可裂解的序列c(44)能被活性核酶裂解的核酶43的第一复合分子42，还包含和待测序列A(41)互补的序列a(45)。核酶43不自裂解，因为分子42保持在消除核酶催化活性的镁较少的反应混合物中。这可以通过，例如，把复合分子42保持在镁较少的含EDTA的反应混合物中进行。核酶43的一个例子和锤头状的裂解序列c(44)连接(大写字母2-O-甲基化的；小写字母RNA；强调并有下划线的DNA)5-GCAACAGTGGAGGAAAGCCUACgucUGGUACGUCCAcugaugagGCCGAAAGGCcgaaacGUAGUAAA使分子41和42杂交以产生固定的杂合体46。洗去游离分子42，向固定的杂合体46添加浓度足以活化核酶的镁离子。在这样的浓度的镁离子存在下，核酶43可裂解序列c，这样把它自己释放到反应混合物中而留下固定的裂解杂合体47。在催化系统中，游离和催化活性的核酶43可作为起始核酶。图5显示了本发明的活化实施方案的另一个例子。把包含核酸序列A(例如DNA序列)的待测生物分子51如上所述固定。检测系统包含含有连接到序列c(54)的核酶53的第二复合分子52，其中序列c可被催化活性核酶和在待测的生物分子中的序列a互补是序列a(55)裂解。复合分子也包括抑制部分58，它以其未修饰的形式存在时抑制核酶53的催化活性。抑制分子的例子是和核酶的一部分互补的核酸序列。在这样的序列存在下，核酶折叠成失活的三维形式。使分子51和52杂交以产生固定的杂合体56。洗去游离分子52。向分离的杂合体56添加修饰物质，该修饰物质可与抑制部分58相互作用并将其修饰成非抑制形式。例如，在抑制部分是可引起核酶折叠的的核酸序列的地方，修饰物质可以是和抑制部分互补的序列，它与抑制部分杂交并阻断抑制部分，这样使得重折叠成其活性形式。另外，修饰物质可以是能除去或裂解抑制部分以终止其抑制作用的物质。然后活性核酶了裂解序列c，这样将自身从固定化的裂解杂合体57释放。然后催化活性游离核酶53作为催化系统的起始核酶。现在参照显示本发明的活化实施方案的另一个例子的图9。分子91包含起始核酶90的序列，该序列吸附到可被核酶裂解的序列c和能与待测的生物分子杂交(例如是分子94的待测DNA序列)序列a和b上。分子91还包含含有序列B和C的封阻剂DNA序列92，序列B和C能分别和分子91的序列b和c杂交以产生双链结构。封阻剂DNA序列92经由接头序列93连接。核酶90不能裂解序列c，因为它的序列区是双链的(通过和封阻剂序列92杂交)。然后把待测分子94导入反应混合物中。如果待测生物分子和分子91的a和b序列互补，然后封阻剂分子92被待测分子94替换以产生杂合体分子95。在杂合体分子95中，裂解序列c是单链，它使核酶能裂解它，这样作为催化活性核酶96被释放到反应混合物中，这种核酶96在催化系统中作为起始核酶。按照该实施方案的条件如温度，双链的识别生物分子b的一部分的长度等必须注意选择以使基本上仅当待测生物分子序列A和B优选地和识别序列a和b相匹配时，待测分子能置换封阻剂分子92。现在参照显示适用于生物分子是核酸序列的本发明的检测系统的转录实施方案的图6。按照这个特定的实施方案，最终使起始核酶转录的正确DNA模板仅在待测核酸序列存在下从其部分装配。检测系统包含根本上是DNA的第一寡核苷酸分子61，它从3′→5′包含；双链启动子、编码起始核酶互补序列的序列R、编码可被催化活性核酶裂解的序列的序列C、和待测的核酸序列的5′部分互补的序列D1。检测系统还包括根本上是DNA的第一寡核苷酸分子61，它从3′→5′包含和待测的核酸序列的3′部分互补的序列D2以及触发寡核苷酸模板(TRIG)。如果待测核酸序列63存在，在适当的杂交条件下，分子61的序列D1和分子62的序列D2分别和待测核酸序列的序列D1′和D2′杂交以产生杂合体64。在转录系统存在下，产生非模板链寡核苷酸，它从3′→5′包含触发寡核苷酸序列trig、d2′和d1′序列、分别和可裂解的核酸序列和起始核酶互补的序列c′r′。向反应混合物中添加回复启动子构建体66的分子，该分子包含与可和寡核苷酸触发序列TRIG杂交的序列连接的单链DNA启动子。在适当的条件下，回复启动子构建体66和分子65杂交以产生杂合体67。在DNA聚合酶存在下，完全合成(complete)单链启动子以在杂合体68中产生功能性的双链启动子。在转录试剂的存在下，杂合体68可作为最终寡核苷酸转录产物69的模板，它从其5′端包含起始核酶序列r和能被所说的核酶裂解的可裂解的序列c。核酶r裂解可裂解的序列c，这样将其自身以游离核酶的形式释放环境介质中。游离核酶70可在催化系统中作为催化活性起始核酶。本发明的装配实施方案的一种方式在图7(a)中显示。检测系统包含含有核酸序列A1A2的待测生物分子71。此外，检测系统包含核酶72的一部分(包含和序列A1互补的寡核苷酸序列a′1)和另外的核酶73的一部分(包含和序列A2互补的寡核苷酸序列a2′)。核酶72和73的部分如果装配共同构成全核酶。如果待测分子71存在于介质中，它可以和核酶的部分a1-72和核酶的a2-部分杂交使两部分共同形成功能核酶-待测序列杂合体76，它可在催化系统中作为起始核酶(例如，通过裂解分子77)，其中裂解在催化系统中可能需要起始扩增级联。本发明的装配实施方案的另一种方式在图7(b)中显示。构建锤头型的核酶79，其中stem-II被缩短以仅具有一种互补核苷酸(在图2b中通过一条线代表)和stem的剩余部分(被打开以产生臂a和b)。核酶79能和序列70杂交以形成stemI和III，然后完成催化活性(例如，序列70的裂解)。然而，推定的核酶79不能裂解可裂解的序列70，因为其stem-II是开放的和失活的。构建了和待测序列的序列A和B(如DNA序列80)互补的开放的核心的臂a和b。在待测DNA序列80存在下，stem-II核酶79的臂a和b和待测序列的杂交以产生全双链stem-II，这样核酶就成为催化活性的并作为催化系统中的起始核酶，例如，可裂解的序列70是在需要裂解以达到其活性的催化系统中的酶的一部分。实施例实施例1使用具有开放stem-II的核酶检测待测的核酸序列把核酶HH8在stemp-II的环中切割成两部分。HH8的两种核酶(HH8-3和HH85)一半的每部分具有和LAMTAR0DNA靶分子互补的不同的附加的17个碱基尾序列。在靶存在时，把两合在一起以形成活性核酶。在LAMTAR0靶中，和核酶的两半互补的两种序列是连续的。在其它的LAMTAR分子(LAMTAR1到LAMTAR4)，两种序列分别由1至4个非互补的碱基分离。核酶底物是包含通过HH8识别的序列的SB8-24。(a)方法1.序列在应用生物系统381ADNA合成仪上按照制造厂商推荐的方案合成寡脱氧核苷酸。使用Ampliscribe试剂盒(EpicenterTechnologies)用于所有的RNA合成，[α32P]UTP[3000Ci/mmol]从Rotem工业有限公司(以色列)购买。DNA靶LAMTAR05′GCTCCGAGTCCACCTGCACGCCGACCAGTGCCGTGTTCGGGA3′LAMTAR15′GCTCCGAGTCCACCTGCACGCTCGACCAGTGCCGTGTTCGGGA3′LAMTAR25′GCTCCGAGTCCACCTGCACGCTTCGACCAGTGCCGTGTTCGGGA3′LAMTAR35′GCTCCGAGTCCACCTGCACGCTATCGACCAGTGCCGTGTTCGGGA3′LAMTAR45′GCTCCGAGTCCACCTGCACGCTATAACGACCAGTGCCGTGTTCGGGA3′下划线-和核酶一半互补的序列；黑体-互补的另外的序列。RNA转录物SB-24(HH8的底物)5′GGUCACAAUGUCGGUCGAGUUCCA3′HH8-3(核酶一半)5′GGCGACCCUGAUGAGGCCGCGUGCAGGUGGACUCG3′HH8-5(核酶一半)5′GGAACACGGCACUGGUCGGGCCGAAACAUUAA3′下划线-和靶互补的序列。2.RNA的制备按照上述(1)合成DNA寡核苷酸。通过在15％聚丙烯酰胺7M尿素凝胶上电泳、UV-shadowed并在0.5MTris-Cl、0.1％SDS和0.1mMEDTA中于室温下洗脱过夜纯化上述寡核苷酸。用0.1体积的3M醋酸钠和3体积的乙醇沉淀洗脱的DNA，并使之重新悬浮在1mMTris-Cl(pH-7.0)和0.1mMEDTA中，在-20℃保存直到使用。通过在95℃温育15秒并在70℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃和37℃每种温度下温育5分钟使纯化的寡核苷酸退火为20mM互补的非模板T7RNA聚合酶启动子寡核苷酸(TAATACGACTCACTATAGG)。转录反应混合物(50ml)包含2mg退火的DNA、1×反应缓冲液、10mM二硫苏糖醇、2mMATP、CTP和GTP、1mMUTP、25mCi[a32P]UTP和1.1mMMgCl2。混合物在37℃下温育1小时并在80℃下温育5分钟以去活化酶。RNA如所述的沉淀。转录物通过在15％聚丙烯酰胺7M尿素凝胶上电泳纯化。RNA通过放射自显影定位并如所述的洗脱。洗脱的RNA如所述的沉淀，重新悬浮在0.1×TE中并在闪烁板(LumaLSC)中计数。3.裂解反应反应(10ml)通常在0.5pmol核酶、50mMTris-Cl(pH-7.5)、1mMEDTA(pH-7.5)、0.05％SDS和30mMMgCl2存在下进行。为了消除另外的RNA构象(它可在-20℃保存期间形成)，反应在95℃下预温育1分钟。反应在37℃下温育1分钟并通过添加包含10M尿素和10mMEDTA的染色溶液并置于冰上停止。样品在80℃下变性5分钟并在15％聚丙烯酰胺7M尿素凝胶上电泳。(b)结果聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果如图10所示。无靶的核酶没有产生可看到的裂解。添加靶后导致了增多的裂解。增多的量在所试验的LAMTAR4核酶中最大。实施例2包含封闭环组合分子的催化系统SLS-前体核酶(Rz)是具有11bp的长stemp-II的环形Rz。两个识别臂一前一后地与额外的裂解碱基连接以分离它们。因此该核酶无活性，但作为活性核酶的模板。一旦被裂解后，“开放”核酶变为活性的(如图2(b)图解显示)。为了起始催化系统必须存在起始核酶。在37℃下30mMMgCl2中RNA的自发裂解以每分钟每106个分子的速率发生。在裂解位点自发裂解的环形核酶变为活性的并可作为引发剂。(a)方法1.序列在应用生物系统381ADNA合成仪上按照制造厂商推荐的方案合成寡脱氧核苷酸。使用Ampliscribe试剂盒(EpicenterTechnologies)用于所有的RNA合成，[α32P]UTP[3000Ci/mmol]从Rotem工业有限公司(以色列)购买。RNA前体(SLS′s)序列是5′GGUCAGCAGUCGAA[识别臂I]X[识别臂III]CUGAUGAGACUGCUGACCA3′。</tables>2.RNA的制备RNA的制备如上述实施例1所述进行。3.自发裂解反应反应(10ml)通常在0.5pmol核酶、50mMTris-Cl(pH-7.5)、1mMEDTA(pH-7.5)、0.05％SDS和30mMMgCl2存在进行。为了消除另外的RNA构象(它可在-20℃保存期间形成)，反应在95℃下预温育1分钟。反应在37℃下温育1分钟并通过添加包含10M尿素和10mMEDTA的染色溶液并置于冰上停止。样品在80℃下变性5分钟并在15％聚丙烯酰胺7M尿素凝胶上电泳。(b)结果聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果如图11所示。检测一组8种不同的环形核酶的级联活性。级联通过上述的自发裂解起始。如图1所示，一种核酶(#313)显示出导致以正反馈方式扩增的起作用的催化级联。实施例III通过用于DNA制剂的血液和各种材料抑制核酶所有扩增技术需要样品制备步骤以释放核酸并通过血液组分消除反应抑制。在这些制剂使用了几种材料，如SDS、酚和胍盐(guanidinium)。进行了不需样品制备步骤的扩增反应。试验了在血液存在下、有或没有核酸释放剂的核酶活性。检测了仅两种RNA和被修饰的核酶。(a)方法1.寡核苷酸寡脱氧核苷酸从Haddassa医院(MountScopus，耶路撒冷)的分子生物学单位购买。修饰的核酶由RPI，Boulder公司合成。AmpliscribeT7转录试剂盒(EpicenterTechnologies)用于所有的RNA合成。[γ32P]ATP[6000ci/mmol]和[α32P]UTP[3000Ci/mmol]从Rotem工业有限公司(以色列)购买。T4多核苷酸激酶从NEB，Beverly，Ma购买。2.核酶DS-LS-RzA3-65′GCAACAGTGGAGGAAAGCCUACgucUGGUACGUCCAcugaugagGCCGAAAGGCcgaaacGUAGUAAA3′小写字母-核糖核苷酸；大写字母-2′-O-甲基修饰；下划线大写字母-脱氧核糖核苷酸。HH8(RNA转录物)5′GGCGACCCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACAUUAA3′3.修饰核酶的标记将50pmol核酶、10单位的T4多核苷酸激酶和20μCi[γ32p]ATP25℃下以10μl的总体积在1X反应缓冲液中温育1小时。反应通过在60℃下温育10分钟终止。4.RNA的制备通过在15％聚丙烯酰胺7M尿素凝胶上电泳、UV-shadowed并在0.5MTris-Cl、0.1％SDS和0.1mMEDTA中于室温下洗脱过夜纯化HH8模板DNA寡核苷酸。用0.1体积的3M醋酸钠和3体积的乙醇沉淀洗脱的DNA，并使之重新悬浮在0.1XTE(1mMTris-ClpH-7.0和0.1mMEDTA)中，在-20℃保存直到使用。通过在95℃温育15秒并在70℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃和37℃每种温度下温育5分钟使纯化的寡核苷酸退火为20μM的互补非模板T7RNA聚合酶启动子寡核苷酸(TAATACGACTCACTATAGG)。转录反应混合物(50μl)包含2mg退火的DNA、1×反应缓冲液、10mM二硫苏糖醇、2mMATP、CTP和GTP、1mMUTP、25mCi[a32P]UTP和1.1mMMgCl2。混合物在37℃下温育1小时并在80℃下温育5分钟以使酶去活化。RNA如所述的沉淀。转录物通过在15％聚丙烯酰胺7M尿素凝胶上电泳纯化。RNA通过放射自显影定位并如所述的洗脱。洗脱的RNA如所述的沉淀，重新悬浮在0.1×TE中并在闪烁flour(LumaLSC)中计数。5.裂解反应反应(10μl)通常在0.5pmol修饰的核酶或HH8、50mMTris-Cl(pH-7.5)、1mDEDTA(pH-7.5)、0.05％SDS和30mMMgCl2存在下进行。添加1μl的全血或0.2μl的全血以及其它的组分(参见图1)。反应在37℃下温育1分钟并通过添加包含10M尿素和10mMEDTA的染色溶液并置于冰上停止。样品在80℃下变性5分钟并在15％聚丙烯酰胺7M尿素凝胶上电泳。(b)结果结果如图12所示，其中0.5pmol或核酶存在于每种样品中，把1μl的血液和10％SDS4M硫氰酸胍或酚三氯甲烷1∶1混合，把1μl的每种处理的血样或试剂分别添加到反应试验中。不论血液是否存在，核酶活性的结果不受1％SDS、0.35M胍或被酚三氯甲烷抑制。未处理血液降解了核酶的RNA部分。这些结果表明本发明的以核酶为基础的检测方法的一个优点是，在制备催化样品使用的变性剂不阻碍核酶的催化活性。权利要求1.一种用于检测在介质中催化活性起始核酶存在的方法，该方法包含以下步骤(a)提供催化系统，该催化系统包含(aa)推定的催化失活的或空间上受限制的使得它们不能对靶发挥其催化活性的核酶；所述核酶的靶是催化系统的其它核酶，它们对其它核酶的催化活性引起以下两者之一(i)活化失活的核酶，(ii)释放空间上受限制的核酶以使其可接触它们的靶；至少催化系统的某些核酶是起始核酶催化活性的靶，起始核酶对所说的某些核酶的催化活性是上述(i)或(ii)；(ab)具有可检测的性质的可检测标记以使核酶的催化活性引起可检测性质的变化；(b)把介质与所说的催化系统相接触；(c)提供使所说的催化系统的催化活性起始核酶和催化活性核酶发挥其催化活性的条件，由此，存在的催化活性起始核酶引起反应级联，其中催化系统的核酶被活化或释放进介质中；(d)检测所说的可检测性质，所说的性质的变化是活性起始核酶在所说的介质中存在的指示。2.按照权利要求1的方法，该方法包括以下步骤(a)把介质与催化系统相接触，该催化系统包含-第一和第二核酶，它们都是推定的催化失活的；-所说的第一核酶基于所说的第二核酶的催化活性变为催化活性的，所说的第二核酶基于所说的第一核酶的催化活性变为催化活性的；-所说的第一或所说的第二核酶的至少一种基于所说的起始核酶的催化活性变为催化活性的；-所说的第一或第二核酶的至少一种携带标记，以便基于其它核酶的催化活性出现所说标记的可检测性质的改变；(b)提供所说的起始核酶和所说的第一和所说的第二核酶可以发挥它们的催化活性的条件；和(c)检测所说的可检测性质，所说的性质改变是在所说的介质中存在活性起始核酶的指示。3.按照权利要求1的方法，该方法包括(a)把介质与催化系统相接触，该催化系统包含-第一组合核酸分子，该分子包含一种能裂解第一可裂解的核酸序列的第一核酶，其连接到第二可裂解的核酸序列上，所说的第二序列的裂解从所说的第一组合分子释放所说的第一核酶；-第二组合核酸分子，该分子包含一种能裂解所说的第二可裂解的核酸序列的第二核酶，其连接到第一可裂解的核酸序列上，所说的第一序列的裂解从所说的第二组合分子释放所说的第二核酶；-所说的第一或第二可裂解的序列的至少一种可被所说的起始核酶裂解；-所说的第一组合和所说的第二组合核酸分子相互分离以避免两个组合分子之间接触；-所说的第一和所说的第二组合分子的至少一种携带可检测的标记，所说的标记被包含在其它组合分子中的核酶裂解后释放至反应介质中；(b)提供使核酶可以裂解并使得裂解的核酶可在所说的第一和所说的第二组合核酸分子之间迁移的条件；(c)检测所释放的标记的存在，在介质中存在所释放的标记表明在介质中存在催化活性核酶。4.按照权利要求1的方法，该方法包括以下步骤(a)把介质与催化系统相接触，该催化系统包含推定是催化失活的第三核酶；-所说的推定的催化失活的第三核酶的每种分子基于催化活性的第三核酶的其它分子的催化活性变为活性的；-所说的推定的催化失活的第三核酶也基于所说的起始核酶的催化活性变为活性的；-所说的第三核酶携带标记以便基于其它第三核酶分子的催化活性使所说的标记的可检测的性质发生改变；(b)提供适合于所说的第三核酶和所说的起始核酶发挥其催化活性的条件；(c)检测所说的可检测性质，所说的性质的改变是在所说的介质中存在活性起始核酶的指示；5.按照权利要求1的方法，该方法包括以下步骤(a)把介质与催化系统相接触，该催化系统包含-一种组合核酸分子，该分子包括连接到可裂解的核酸序列上的标记核酶，连接以阻止所说的核酸序列被所说的核酶裂解而存在于组合分子中的方向和位置进行，所说的核酸序列当以游离形式存在时可被所说的核酶裂解，由此从所说的组合分子中释放所说的标记核酶；-所说的可裂解的核酸序列也可被所说的起始核酶裂解；-所说的组合分子相互分离以避免它们在其中接触。(b)提供能够裂解核酶并允许裂解的核酶在所说的组合分子之间迁移的条件；(c)检测所释放的标记的存在，在介质中存在所释放的标记表明在介质中存在催化活性核酶。6.按照权利要求4的方法，该方法检测介质中具有裂解催化活性的催化活性核酶的存在，该方法包括(a)把介质和催化系统相接触，该催化系统包含-一种组合核酸分子，该分子包含具有可裂解的核酸序列的核酶，所说的组合分子是封闭环的形式，所说可裂解的核酸序列可被开放形式的组合分子裂解；-所说的可裂解的核酸序列也可被起始核酶裂解；-所说的组合分子携带可检测的标记，该标记基于封闭的组合分子的打开改变其可检测的性质；(b)提供可使核酶裂解和迁移的条件；(c)检测所说的性质中的所说的可检测的性质的改变，其是在介质中存在催化活性核酶的指示。7.按照权利要求4的方法，该方法检测介质中具有剪接催化活性的催化活性起始核酶的存在，该方法包括(a)把介质与催化系统相接触，该催化系统包含-在其催化活性必要区中具有额外的核酸序列的第六核酶，所说的核酸序列使核酶失活；-剪接所说的额外核酸序列使第六核酶变为活性的；-所说的额外核酸序列可以通过所说的第六催化活性核酶从组合分子中剪接；-所说的额外核酸序列也可以通过催化活性可检测的标记剪接；-所说的第六核酶携带可检测的标记，该可检测的标记基于额外核酸序列的剪接改变其可检测的性质。(b)提供使核酶剪接的条件；(c)检测在所说的性质中所说的可检测性质的改变，其是在介质中存在催化活性核酶的指示。8.按照权利要求3的方法，其中所说的第一和第二组合核酸分子定位于多孔膜的相对一侧，这封闭能使第一和第二游离核酶通过的通道。9.按照权利要求3的方法，其中所说的第一和第二组合核酸分子固定在底物上。10.按照权利要求5的方法，其中每种组合分子固定在一种底物上。11.按照权利要求9或10的方法，其中所说的底物是小珠。12.按照权利要求3的方法，其中所说的第一和第二组合核酸分子连接到具有相同电荷的部分上。13.按照权利要求5的方法，其中每种组合分子连接到荷电部分上，在反应混合物中的所有部分具有相同的电荷。14.一种检测待测的生物分子在试验样品中存在的方法，该方法包括以下步骤(a)使样品与检测系统在仅当待测的生物分子存在于样品中基本上能使催化活性起始核酶产生的条件下接触；(b)按照权利要求1-5任一之方法检测催化活性起始核酶的存在，其存在表明在样品中存在待测生物分子。15.按照权利要求14的方法，该方法包括(a)提供第一复合分子，该分子包含核酶是催化失活条件下的起始核酶和能特异性地识别和结合所说的待测生物分子的识别生物分子；(b)把所说的第一复合分子与试验样品相接触，接触的条件是使得所说的识别生物分子和所说待测生物分子之间可以结合而同时可以保持使核酶催化失活的条件；(c)除去未结合的第一复合分子；(d)提供不同的条件，其中可以使起始核酶变为活性的；(e)按照权利要求1-5任一之方法检测催化活性起始核酶的存在，其存在表明在样品中存在待测生物分子。16.按照权利要求15的方法，该方法包括(a)提供第一复合分子，该分子包含核酶是催化失活条件下的起始核酶和能特异性地识别和结合所说的待测生物分子的识别生物分子；所说的核酶连接到能被催化活化的起始核酶裂解的可裂解的核酸序列上，其中所说的可裂解序列的裂解把催化活性起始核酶释放到环境介质中；(b)把所说的第一复合分子与试验样品相接触，接触的条件是使得所说的识别生物分子和所说待测生物分子之间可以结合而同时可以保持使核酶催化失活的条件；(c)除去未结合的第一复合分子；(d)提供不同的条件，其中可以使所说的起始核酶变为催化活性的以引起所说的可裂解序列的裂解，这样把活性起始核酶释放到环境介质中；(e)按照权利要求1-5任一之方法检测催化活性起始核酶的存在，其存在表明在样品中存在待测生物分子。17.按照权利要求15的方法，该方法包括(a)提供杂合体分子，该分子包含和可裂解的核酸序列连接的起始核酶，其中的核酸序列当是单链时能被起始核酶裂解，所说的可裂解序列的裂解把催化活性起始核酶释放到环境介质中，杂合体分子还包含能特异性地识别和结合所说的待测生物分子的识别生物分子，所说的可裂解序列和所说的识别生物分子的一部分推定是双链的；(b)把所说的杂合体分子与试验样品相接触，接触的条件是通过基本上完全匹配的待测生物分子使得识别生物分子和可裂解的核酸序列的双链部分的一条链的置换可以进行；(c)提供这样的条件，该条件使得可以通过催化活性核酶裂解以引起单链可裂解的序列的裂解，由此把催化活性起始核酶释放进环境介质中；(d)按照权利要求1-5任一之方法检测催化活性起始核酶的存在，其存在表明在样品中存在待测生物分子。18.按照权利要求15的方法，该方法包括(a)提供第二复合分子，该分子包含能特异性地识别和结合所说的待测生物分子的起始核酶和识别生物分子，所说的核酶和能被催化活性起始核酶裂解的可裂解核酸序列连接，所说的可裂解序列的裂解把催化活性起始核酶释放到环境介质中，所说的第二复合分子也包含能抑制所说的起始核酶的催化活性的抑制部分；(b)把所说的第二复合分子与试验样品相接触，接触的条件是使得所说的识别生物分子和所说待测生物分子之间可以结合而同时可以使抑制部分保持其抑制形式的条件；(c)除去未结合的第二复合分子；(d)修饰所说的结合的第二复合分子的抑制部分以除去其抑制作用，由此引起所说的可裂解序列的裂解并把起始核酶释放进环境介质中；(e)按照权利要求1-5任一之方法检测催化活性起始核酶的存在，其存在表明在样品中存在待测生物分子。19.按照权利要求15的方法，其中在(a)中的条件是基本上无镁离子，步骤(d)包括以足以使所说的起始核酶变为催化活性的浓度向反应介质中添加镁离子。20.按照权利要求14的方法，其中所说的待测生物分子是核酸序列，所说的方法包括以下步骤(a)把样品与检测系统相接触，该检测系统包括-第一寡核苷酸分子，该分子具有双链启动子、单链寡核苷酸序列(本质上是DNA，它基本上和起始核酶序列相同)；本质上是DNA(基本上和能被催化活性起始核酶裂解的可裂解序列相同)的单链序列以及和待测核酸序列的5′-部分互补的单链序列；-第二寡核苷酸分子，该分子具有和待测核酸序列的3′-部分互补的单链序列，还包含可被转录以产生触发寡核苷酸序列的单链触发寡核苷酸模板，所说的触发寡核苷酸序列在回复启动子构建体和DNA聚合酶存在下可在转录系统中触发反应，其中转录它所吸附的序列；(b)提供使所说的第一和所说的第二寡核苷酸分子和待测核酸序列杂交的条件；(c)在使得转录可以进行的条件下添加转录系统，由此转录触发寡核苷酸序列，所说的触发寡核苷酸序列在回复启动子、DNA聚合酶和转录系统存在下以及可以进行杂交的条件下，DNA聚合和转录使最终寡核苷酸转录物转录，该转录物包含和能被催化活性起始核酶裂解的可裂解序列连接的起始核酶；(d)提供使得基于所说的催化活性核酶裂解所说的可裂解序列的条件，以引起所说的可裂解序列裂解并将其自身释放进环境介质中；(e)按照权利要求1-5任一之方法检测催化活性起始核酶的存在，其存在表明在样品中存在待测生物分子。21.按照权利要求14的方法，其中所说的待测生物分子是核酸序列，该方法包括以下步骤(a)把试验样品和检测系统温育，该检测系统包含-第三组合分子，该分子包含和待测核酸序列的5′-部分互补的第三单链寡核苷酸序列，所说的第三寡核苷酸序列和起始核酶的一部分连接；-第四组合分子，该分子包含和待测核酸序列的其余3′-部分互补的第四单链寡核苷酸序列，所说的第四寡核苷酸序列和起始核酶的一部分(需要使和第三寡核苷酸序列连接的核酶完全)和连接以产生完全起始核酶；(b)提供使所说的第三和第四寡核苷酸序列与待测核酸序列杂交并能使全起始核酶从其部分装配的条件；(c)按照权利要求1-5任一之方法检测催化活性起始核酶的存在，其存在表明在样品中存在待测生物分子。22.按照权利要求14的方法，其中所说的待测生物分子是核酸序列，该方法包括以下步骤(a)把试验样品和检测系统温育，该检测系统包含-锤头类型的核酶，其中stem-II的某些双链部分被减短，其中所说的剩余双链stem-II吸附到两种单链序列上，一种和待测核酸序列的5′-端互补，另一种和待测核酸序列的3′-端互补；-所说的核酶推定是失活的；-所说的两种单链序列和互补序列的杂交使核酶变为催化活性的；(b)提供使所说的核酶和所说的待测核酸序列杂交的条件；(c)按照权利要求1-5任一之方法检测催化活性起始核酶的存在，其存在表明在样品中存在待测生物分子。23.按照权利要求1的方法，该方法用于检测介质中具有裂解活性的催化活性起始核酶的存在，该方法包括(a)把介质与催化系统相接触，该催化系统包含-一种能连接第五核酶部分的第四核酶，它和可被起始核酶裂解的核酸序列连接，所说的核酸序列的裂解把催化活性的第四核酶释放到环境介质中；-第五核酶的两部分，它们能被第四核酶连接给出催化活性的第五核酶，所说的第五核酶是一种能连接第四核酶的部分的核酶；-第四核酶的两部分，它们能被第五核酶连接给出催化活性的第四核酶；-所说的第四核酶推定地是和第五核酶的两部分分离以避免相互接触；-所说的第四或所说的第五核酶的至少一种携带基于连接改变其可检测性质的标记；(b)提供使核酶裂解并使得可以进行裂解的全长第四分子对第五核酶的两部分迁移的条件。(c)提供或保持使得核酶连接的条件；(d)检测所说的可检测性质，在所说的性质的改变是在所说的介质中存在所说的起始核酶的指示。24.按照权利要求1的方法，该方法检测在介质中具有连接活性的催化活性起始核酶的存在，该方法包括(a)把介质与催化系统相接触，该催化系统包含-第五核酶的两部分，它们能被第四核酶连接以产生催化活性的第五核酶，所说的第五核酶是一种能连接第四核酶的部分的核酶；-第四核酶的两部分，它们能被第五核酶连接以产生催化活性的第四核酶，所说的第四核酶是一种能连接第五核酶的部分的核酶；-所说的第五核酶的两部分或所说的第四核酶的两部分能被催化活性起始核酶连接；-所说的第四或所说的第五核酶中的至少一种携带可基于连接改变其可检测性质的标记；(b)提供使得核酶可以连接的条件；(c)检测所说的可检测性质，在所说的性质的改变是在所说的介质中存在所说的起始核酶的指示。25.用于权利要求1至24任一之方法的试剂盒。全文摘要本发明涉及用于检测介质中催化活性的核酶存在的方法。催化活性的核酶的检测自身可以是一个目标,或者所述核酶可以用作其它生物分子在测定的样品中存在的报道分子。检测在催化系统中进行,其中所述活性核酶的存在用于以正反馈放大方式产生其它活性核酶。文档编号C12Q1/68GK1183812SQ96192947公开日1998年6月3日申请日期1996年2月27日优先权日1995年2月27日发明者N·阿施,Y·提谷施斯基,G·克路普,J·格里伯格,A·菲里德马恩申请人:音坦里吉有限公司