专利名称：gC1q受体,与其结合的HIV－1gp120区以及相关肽和靶向抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及(1)与HIV-1gp120结合并基于gC1q受体(gC1q-R)的肽，以及针对这些肽的抗体；(2)与gC1q-R结合的HIV-1gp120相关肽，以及针对这些肽的抗体。
背景技术：
C1q是补体经典途径的C1复合物的一个组分(R.B.Sim and K.B.M.Reid，今日免疫学1991；12307-311)，C1q的生物学功能多种多样，包括起始补体级联系统进行调理和细胞溶解，以及根据表达C1q受体的细胞类型而介导几种不同的功能。C1q在单核细胞/巨噬细胞中增强FcR和CR1介导的吞噬作用(D.A.Bobak等，欧洲免疫学杂志，1988；182001-2007；D.A.Bobak等，免疫学杂志1987；1381150-1156)，刺激B细胞产生免疫球蛋白(K.R.Young等，免疫学杂志1991；1463356-3364)，激活血小板以表达αIIb/β3整联蛋白、P-选择蛋白和前促凝剂(procoagulant)(E.I.B.Peerschke等，实验医学杂志1993；178579-587；E.I.B.Peerschke等，免疫学杂志1994；1525896-5901)，激活巨噬细胞的肿瘤毒性(R.W.Leu等，免疫学杂志1990；1442281-2286)，以及发挥对T细胞生长的抗增殖性作用(A.Chen等，免疫学杂志1994；1531430-1440)。
最近已鉴别、克隆并测序了一种称为gC1q-R的33千道尔顿(kD)受体，其与C1q分子的球状头部结合(B.Ghebrehiwet等，实验医学杂志1994；1791809-1821；E.I.B.Peerschke等，免疫学杂志1994；1525896-5901；A.Chen等，免疫学杂志1994；1531430-1440)。另一种称为cC1q-R的60kD受体与C1q的氨基端胶原样(collagen-like)区域结合(B.Ghebrehiwet等，Behring Inst.Mitt.1989；84204-215；A.Chen等，免疫学杂志1994；1531430-1440)。基于经聚合酶链反应(PCR)扩增检测gC1q-R mRNA以及经免疫化学方法检测gC1q-R蛋白的表达，发现这一受体在许多不同细胞类型中存在，例如，B细胞、T细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜伊红性粒细胞、成纤维细胞、血小板、内皮细胞、肝细胞、神经细胞和平滑肌细胞。然而，尚不知gC1q-R结合HIV-1gp120并中和HIV-1的感染性。
已经公知主要在辅助/诱导T细胞表面表达的CD4抗原是HIV-1gp120的主要受体(P.J.Maddon等，细胞1986；47333-385；J.S.McDougal等，科学1986；231382-385)，除了CD4+T细胞，HIV-1还可以结合并感染其它一些细胞类型，如单核细胞/巨噬细胞、B细胞、结肠上皮细胞和神经胶质细胞，这些细胞表达检测不到的或最低水平的细胞表面CD4。已经提示有几种其它受体与HIV-1感染靶细胞相关，例如在人结肠上皮细胞、施旺细胞和少突胶质细胞表面的半乳糖神经酰胺(Gal-Cer)(N.Yahl等，病毒学1994；204550-557；J.M.Harouse等，科学1991；253320-323)，在B细胞上的IgM同种型的人免疫球蛋白VH3基因产物(分子量950kD)(L.Berberian等，科学1993；2611588-1591)，在活化的T和B细胞上的CD26(分子量110kD)(C.Callebaut等，科学1993；2622045-2050)，以及主要在巨噬细胞上的膜结合C型凝集素(分子量46kD)(B.M.Curtis等，美国国家科学进展1992；898356-8360)。
本发明是在意在发现非CD4表达细胞上的针对HIV-1gp120的细胞结合蛋白或受体的研究中完成。为此目的，将得自P.J.Nara(AIDS Res.Hum.Retroviruses1987；3283-302)的CEM-SS细胞(其是表达高水平细胞表面CD4的T细胞)的裂解物以及得自美国典型培养物保藏中心(Rockville，Maryland)的DAKIKI细胞(其是CD4阴性B细胞)的裂解物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并将分开的蛋白质转印到硝基纤维素膜上进行Western免疫印迹分析，发现重组gp120或HIV-1感染细胞衍生的gp120与CEM-SS和DAKIKI细胞裂解物中的一条32-33kD蛋白带反应，该蛋白带与和抗人CD4单克隆抗体反应的55kD蛋白带截然分开。
为了纯化这一新的gp120结合蛋白以用于N-末端氨基酸测序鉴定，制备大量DAKIKI细胞裂解物，用Prep Cell Model 491(Bio-Rad实验室公司，Hercules，加利福尼亚)经制备电泳部分纯化这一gp120结合蛋白。然后将样品进行二维凝胶电泳并印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上进行Western免疫印迹分析以鉴别gp120反应性蛋白斑点并进行N-末端氨基酸测序。已证明gp120反应性蛋白的N-末端头15个氨基酸的序列与以前已鉴定为p32的蛋白(分子量32kD)的N-末端头15个氨基酸的序列相同，p32是由A.R.Krainer等(细胞1991；66383-394)和B.Honore等(基因1993；134282-287)报道与人前mRNA剪接因子共纯化的。进一步的实验揭示DAKIKI细胞可以被兔抗p32免疫球蛋白染色，表明p32存在于DAKIKI细胞的表面，兔抗p32免疫球蛋白是通过使用大肠杆菌表达的纯p32而产生。DAKIKI细胞还显示能结合重组HIV-1gp120，虽然该细胞在其表面不表达能用免疫荧光方法检测到的CD4。总之，这些发现证明p32是另一种HIV-1gp120的细胞表面结合蛋白，随后证明p32具有与gC1q-R(SEQ ID NO1)的相同的序列(B.B.Ghebrehiwet等，实验医学杂志1994；1791809-1821)。
gC1q-R的前体或前蛋白原含有282个氨基酸(a.a.)，功能性成熟蛋白含有209个氨基酸，这一成熟蛋白含有SEQ ID NO1的74位氨基酸(亮氨酸)至282位氨基酸(谷氨酰胺)的肽部分。成熟gC1q-R是高荷电的并是酸性的，其在114、136和223位氨基酸处具有3个潜在的N-糖基化位点，因此，在SDS-PAGE中gC1q-R的表观分子量为32kD，而不是由氨基酸组成计算得到的24.3kD。由于成熟蛋白仅在186位具有一个半胱氨酸，因此蛋白内没有链内二硫键。gC1q-R在许多细胞类型中发现，如B细胞、T细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜伊红性粒细胞、嗜中性白细胞、血小板、内皮细胞、成纤维细胞和肝细胞。
由于gC1q-R与多种免疫学和生理学功能相关，所以gC1q-R和HIV-1gp120之间的相互作用可能导致HIV-1感染个体表现出的一些免疫学和生理学功能异常。其还可能导致已知的HIV-1的感染不同组织和器官中的各种非CD4表达人细胞的能力。对gC1q-R和HIV-1gp120之间的相互作用的人工干预代表了抵抗HIV-1疾病的新策略，基于这种人工干预的几个发明将在下面讨论。
发明概述本发明包括基于针对HIV-1gp120的gC1q-R的结合位点的免疫原和肽，以及基于针对gC1q-R的HIV-1gp120的结合位点的免疫原和肽。针对gp120的gC1q-R结合位点的序列如SEQ ID NO2所示，针对gC1q-R的HIV-1gp120结合位点的序列如SEQ ID NO3所示。本发明还包括针对所有这些免疫原和肽的抗体和结合分子以及诱导这种抗体的内源性产生。本发明的其它方面和实施方案进一步如下所述。
附图的简要描述
图1是用于在大肠杆菌中表达全长成熟型gC1q-R(1-209a.a.)及其3个截短形式的载体pT7-7的限制图谱，gC1q-R(δ1-57)代表gC1q-R(58-209a.a.)，gC1q-R(C)代表gC1q-R(95-209a.a.)，gC1q-R(N)代表(1-94a.a.)。
图2示出由ELISA测定的HIV-1gp120对gC1q-R的结合，Y轴代表以450nm处OD表示的HIV-1gp120与gC1q-R的反应性，X轴是溶液中HIV-1gp120的浓度。
图3A示出在CEM-SS细胞中gC1q-R对HIV-1IIIB的感染性的中和作用；其中Vn是在双份测试孔中的合胞体的平均数，Vo是在双份对照孔中的合胞体的平均数。
图3B示出在CEM-SS细胞中gC1q-R对HIV-1MN的感染性的中和作用；其中Vn是在双份测试孔中的合胞体的平均数，Vo是在双份对照孔中的合胞体的平均数。
图3C示出在CEM-SS细胞中gC1q-R对HIV-1RF的感染性的中和作用；其中Vn是在双份测试孔中的合胞体的平均数，Vo是在双份对照孔中的合胞体的平均数。
图4示出gC1q-R对HIV-1IIIB感染的H9细胞与CD4+-Hela细胞的融合的抑制作用。
图5示出由流式细胞术测定的大肠杆菌表达的纯化的gC1q-R与HIV-1IIIB感染的H9细胞的结合。
图6示出在ELISA中C1q对HIV-1gp120与gC1q-R结合的作用，用实心圆绘制的线代表C1q，用实心方块绘制的线代表gC1q-R，Y轴代表以450nm处OD表示的gp120与gC1q-R的反应性，X轴是溶液中C1q和gC1q-R的浓度。
图7示出HIV-1gp120作为ELISA中的固相抗原与各种形式的大肠杆菌表达的gC1q-R的反应性，用实心方块绘制的线代表gC1q-R的全长成熟形式(1-209a.a.)；用实心圆绘制的线代表截短的gC1q-R(58-209a.a.)，即缺失N-末端57个氨基酸的gC1q-R；用实心三角形绘制的线代表N-末端构建物，gC1q-R(1-94a.a.)；用实心倒三角形绘制的线代表C-末端构建物，gC1q-R(95-209a.a.)。Y轴代表以450nm处OD表示的HIV-1gp120与各种形式的gC1q-R的反应性，X轴是溶液中gp120的浓度。
图8示出抗体99-12-1对gC1q-R肽LM12DN的结合，用实心方块绘制的线代表肽LM12DN，用实心圆绘制的线代表肽TD18EE，Y轴代表以450nm处OD表示的99-12-1与肽的反应性，X轴代表溶液中99-12-1的浓度。
图9示出抗gC1q-R单克隆抗体99-12-1对gC1q-R结合HIV-1gp120的竞争。
图10示出抗HIV-1gp120抗体G3-299和6205对HIV-1gp120结合gC1q-R的竞争。用实心圆绘制的线代表抗HIV-1gp120 C4区G3-299；用实心方块绘制的线代表多克隆绵羊抗体6205，其特异性抗HIV-1gp120 C5区肽(HXB2R的氨基酸残基数497-511，SEQ ID NO10)；用实心三角形绘制的线代表重组可溶性CD4(rsCD4)。
图11示出gC1q-R与HIV-1gp120 C4区肽RC12LT，TG12NN和RC16GG的反应性。用实心三角形绘制的线代表RC16GG；用实心圆绘制的线代表TG12NN；用实心方块绘制的线代表RC12LT。Y轴代表以450nm处OD表示的gC1q-R与肽的反应性，X轴代表溶液中gC1q-R的浓度。
完成和使用本发明A.gC1q-R肽gC1q-R的完整核苷酸序列和推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO1，在大肠杆菌中表达并用于免疫和下述其它实施例的重组gC1q-R是起自SEQ ID NO1中74位氨基酸残基亮氨酸的完整C-末端区段，这一区段代表已鉴定的gC1q-R的可溶性成熟蛋白。N-末端区段可能代表前蛋白原中的疏水性膜锚。
包括SEQ ID NO1的氨基酸残基239-250的肽区段被鉴别为结合gp120的活性结合位点，其是基于下述实施例10中讨论的抗gC1q-R单克隆抗体99-12-1(其结合SEQ ID NO2的肽)对gp120结合gC1q-R的竞争抑制而得出的结论。
gC1q-R结合gp120的活性结合位点可以表达为独立的肽(以下称为“gp120结合位点”)，或者表达为包括gp120结合位点的任何较长的肽(如代表完整gC1q-R序列的肽)(见下述实施例1)，或者gp120结合位点或这种较长的肽可以与另一种载体蛋白如匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)或另一种增强其免疫原性的载体分子连接，或者gp120结合位点可以与能产生免疫原性构型的肽或分子结合以增强其免疫原性，或者一种与gp120结合位点结构上或免疫学上等价的肽也可用于同样目的(所有这种肽以下均称为“gp120结合位点肽”)。
gp120结合位点肽可用在诊断分析中以检测或定量HIV-1gp120，HIV-1病毒颗粒或者HIV-1感染的细胞，这种诊断分析可以使用标准的分析程序，如酶联免疫吸附测定(ELISA)。在ELISA中，gp120结合位点肽可以固定于惰性固相基质或磁珠上，这种固定可以直接进行或通过交联剂或特异结合试剂间接固定。然后将生物学体液试样与包被的基质温育，与gp120结合位点肽反应的游离的HIV-1gp120分子或携带gp120分子的HIV-1病毒颗粒将结合到基质上，随后可用单克隆或多克隆抗HIV-1抗体检测结合的HIV-1gp120分子或HIV-1病毒颗粒，然后该单克隆或多克隆抗HIV-1抗体可与酶联二级检测抗体反应以用于基于颜色反应定量。或者，捕获的gp120或病毒颗粒可以用其它手段例如荧光、化学发光、放射性计数或PCR检测。
gp120结合位点肽还可用于通过直接或间接免疫化学程序检测和定量患者血样或其它样品中的HIV-1感染的细胞。例如，在一种这样的检测中，将感染细胞与gp120结合位点肽接触，然后用与其结合的抗体标记，这些检测抗体可以直接或间接与一荧光探针缀合，然后通过在荧光显微镜下观察细胞或通过流式细胞计量方法检测免疫荧光。或者，gp120结合位点肽可直接用酶、放射性核素、荧光探针或生物素标记，与细胞结合的标记肽可随后用相应的熟知方法检测。
gp120结合位点肽或任何衍生产物如与毒素(例如，蓖麻毒蛋白A、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素A、商陆抗病毒蛋白)，高能放射核素(例如碘-131、铟-111和钇-90)，细胞毒药物(如阿霉素)，细胞膜活性分子(例如磷脂酶、补体和皂苷)的缀合物，或者作为微载体(如脂质体)均可用于治疗HIV-1疾病或防止HIV-1感染。已证明对应于gC1q-R成熟蛋白的完整序列的肽可中和HIV-1几种趋异进化毒株的体外感染性并抑制CD4阳性细胞和被HIV-1IIIB感染的细胞之间形成合胞体。见下述实施例5和6。给予gp120结合位点肽预计能结合gp120并中和HIV-1，以及能防止HIV-1通过细胞-细胞融合(合胞体形成)感染其它细胞。这种给药可以作为HIV-1疾病的治疗方法或者可以在接触HIV-1之前或接触之后立即预防性给药以防止或抑制HIV-1感染。在预防应用中，其可以作为预防措施给予高危人群，如静脉药物使用者以及护理工人。或者，其可在针刺损伤后使用以防止感染，或者在即将出生前或出生后立即应用以防止母婴HIV-1传播。
gp120结合位点肽可以与固相基质缀合，这一修饰的基质可以体外(extracorporeally)应用以除去游离HIV-1病毒颗粒或者从HIV-1感染个体除去HIV-1感染细胞以降低病毒负载(load)。B.针对gC1q-R肽的抗体可以使用下述实施例2中描述的公知技术容易地制备抗gC1q-R的单克隆或多克隆抗体，这种单克隆抗体可以使用单价或多价gC1q-R或gp120结合位点肽作为免疫原产生。gC1q-R肽(gp120结合位点肽)还可用于在免疫接种和融合后筛选杂交瘤。另一种方法是使用gp120结合位点肽或能结合gp120 C4区的相关部分的等价肽与一或多种蛋白载体结合制备免疫原，优选的蛋白载体是KLH、破伤风类毒素或卡介苗(BCG)，也可使用重组蛋白抗原如来自痘苗病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒或流感病毒的那些。这些载体可以与gp120结合位点肽化学缀合，或者完整的载体-肽可以由重组宿主细胞表达。多克隆抗体可以用gp120结合位点肽或等价肽作为免疫原从动物(例如啮齿类动物、绵羊、山羊、豚鼠、兔和非人灵长类动物)中产生(见下述实施例3)。
特异于gC1q-R的gp120结合位点的单克隆或多克隆抗体还可以用DNA免疫原如编码gp120结合位点肽的脱氧寡核苷酸免疫动物而产生(J.J.Donnelly等，免疫学方法杂志1994；176145-152)。编码gC1q-R的特异寡核苷酸可以与其它表达载体(例如痘苗病毒、乙型肝炎病毒、细胞肥大病毒、反转录病毒或腺病毒)构建在一起以用于增强表达和基因寻靶(targeting)。或者，可以采用直接肌肉内注射、机械程序如包被有DNA的高速金微粒转染表皮或者通过化学(例如磷酸钙)或电学方法来自体内(ex vivo)转染以将寡核苷酸插入宿主细胞用于表达抗原诱导特异抗体应答。
这种单克隆抗体或多克隆抗体有许多用途，通过使用上述免疫荧光测定或其它方法，它们可以用来检测表达gC1q-R受体的细胞，如B细胞、T细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜伊红性粒细胞、成纤维细胞、血小板以及内皮和平滑肌细胞。已证明与gC1q-R反应的单克隆抗体99-12-1与gp120竞争结合gC1q-R(见下述实施例11描述的实验)，因此，它们还可用作HIV-1疾病的疗法，或者如果在接触HIV-1之前或之后立即预防给药的话，可以防止或抑制HIV-1感染。
如果用于治疗HIV-1疾病或防止人类感染，它们优选以嵌合抗体、人源化抗体或人抗体形式应用。嵌合抗体采用本领域公知的重组方法生产，其具有动物可变区和人恒定区。人源化抗体比嵌合抗体具有更高程度的人肽序列，在人源化抗体中，只有负责抗原结合和特异性的互补决定区(CDR)来源于动物并具有相应于动物抗体的氨基酸序列，抗体分子的几乎所有其余部分均来源于人并对应于人抗体的氨基酸序列，见L.Riechmann等，自然1988；332323-327；G.Winter，美国专利5,225,539；C.Queen等，国际专利WO90/07861。
人抗体可通过几种不同途径制备，包括使用人免疫球蛋白表达文库(StratagenCorp.，La Jolla，California)生产人抗体的片段(VH、VL、FV、Fd、Fab、或F(ab’)2)，并使用类似于生产嵌合抗体的技术将这些片段构建成完整人抗体。人抗体还可以在携带人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠中生产，该转基因小鼠由GenPharm Internatioanal(Mountain View，California)生产。将动物用gp120结合位点肽免疫接种，可以在接受该免疫原的免疫接种者体内发现抗gp120结合位点肽的人抗体。可以从供体的B细胞开发杂交瘤或EBV转化的B细胞系。人抗体还可通过联合文库(combinatorial library)方法(T.A.Collet等，美国国家科学进展1992；8910026-10030)使用编码抗gp120结合位点肽抗体的重链和轻链的mRNA产生。
或者，还可制备一种单肽链结合分子，该分子中重链和轻链Fv区连接在一起(J.S.Huston等，美国国家科学进展1983；855879-5883)。所有的完整或部分人抗体的免疫原性均比完整鼠单克隆抗体的免疫原性低，片段或单链抗体也是低免疫原性的，因此，所有这些类型的抗体不容易激发免疫或过敏应答。所以，它们比完整动物抗体更适合在人类中体内给药，特别是当需要重复或长期给药时。
抗gp120结合位点肽的抗体可以注射进动物(例如小鼠)以产生抗独特型单克隆抗体，这些抗独特型抗体可以模拟原始抗原并因此可用作免疫原以产生针对gp120结合位点肽的抗体，或者作为gC1q-R阻断HIV-1感染。C.HIV-1gp120肽与gC1q-R结合通过下述实施例13的方法证明了一种具有HXB2R株的HIV-1gp120氨基酸残基444-459的序列(SEQ ID NO3所示)的重组肽能结合gC1q-R，这一肽区段位于gp120中称为C4的区域内(C.K.Leonard等，生物化学杂志1990；26510373-10382)，这一肽以下称为“gC1q-R结合位点肽”。这种肽或者含有这种肽的较长肽或具有结合gC1q-R能力的等价肽可以用作免疫原以产生靶向这一gp120区域的单克隆或多克隆抗体。
如上所述，具有SEQ ID NO3所示序列的重组肽或者含有这种肽的较长肽或具有结合gC1q-R能力的等价肽，或者其它基于这种肽的其它免疫原(例如，通过将这些肽与优选的载体蛋白如KLH、破伤风类毒素或BCG缀合制备的免疫原，或者将这些肽作为免疫原结构如缺陷型或减毒型乙型肝炎病毒、腺病毒或流感病毒的一部分而制备的免疫原)可以用作抗HIV-1的疫苗。这些载体可以与gp120结合位点肽化学缀合，或者完整的载体-肽可以从重组宿主细胞表达。当用作疫苗时，它们将内源产生抗体，产生的抗体将结合gp120的gC1q-R结合位点并中和HIV-1，或者它们将与HIV-1感染的细胞结合以抑制通过细胞-细胞融合而进行的病毒传播或者通过依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞溶解(CMC)杀死感染的细胞。
特异于gp120结合gC1q-R的结合位点的单克隆或多克隆抗体还可通过用编码gC1q-R结合位点肽的脱氧寡核苷酸作为DNA免疫原免疫动物而产生(J.J.Donnelly等，免疫学方法杂志1994；176145-152)。编码gp120这一部分的特异性寡核苷酸可以与其它表达载体(如痘苗病毒、乙型肝炎病毒、细胞肥大病毒、反转录病毒或腺病毒)构建在一起以增强表达和基因寻靶。或者，可以采用直接肌肉内注射、机械程序如包被有DNA的高速金微粒转染表皮或者通过化学(例如磷酸钙)或电学方法来自体内(ex vivo)转染以将寡核苷酸插入宿主细胞用于表达抗原诱导特异抗体应答。D.HIV-1gp120肽的抗体SEQ ID NO3代表的gC1q-R结合位点肽的单克隆抗体可以用常规技术产生，方法是用gp120或这种肽或上述免疫原免疫动物(如啮齿类或非人灵长类)。也可以如上所述用公知的技术产生多克隆抗体。
gC1q-R结合位点肽(在gp120的C4区)的单克隆抗体或多克隆抗体也可以如上所述用编码这一区或较长区域的寡核苷酸作为DNA免疫原或疫苗在动物或人中产生。
这些单克隆抗体或多克隆抗体可以用于在一诊断分析中检测或定量HIV-1gp120、HIV-1病毒颗粒或HIV-1感染的细胞，这种诊断分析可以采用标准的分析如ELISA。ELISA如上述用于gp120结合位点肽的类似方式进行，只是将抗HIV-1gp120抗体而不是这些肽固定在惰性固相基质或磁珠上。然后将生物学体液样品与这些包被的基质一起温育，与抗体反应的HIV-1gp120或携带gp120分子的HIV-1病毒颗粒将结合到基质上。随后用其它的单克隆或多克隆抗HIV-1抗体检测结合的病毒颗粒或gp120，而所用的抗体随后可与酶联二级检测抗体反应以基于颜色反应定量。或者，捕获的gp120或HIV-1病毒颗粒可以用其它方法检测，如荧光法、化学发光法或PCR。
这些抗体还可用于通过直接或间接免疫荧光程序检测和定量或者血样中的HIV-1感染的细胞，如上述用于检测gp120结合位点肽的程序。这些抗体还可直接用酶、放射核素、荧光探针或生物素标记，随后可用已知方法检测与细胞结合的标记抗体。
针对HIV-1gp120区的C4区的这一gC1q-R结合位点的抗体还可以潜在地用于治疗HIV-1疾病或防止HIV-1感染。它们可以单独应用或与其它抗HIV-1中和抗体、重组可溶性CD4、抗反转录病毒药物或细胞因子联合应用。这些抗体预计是中和性的，因为一旦与gp120结合后，它们将抑制gp120与gC1q-R结合从而防止对靶细胞的后续感染。当用于治疗或防止HIV-1感染时，这些抗体可以是嵌合的、人源化的或人抗体形式，产生这些形式抗体的方法如上所述。另外，可以用gC1q-R结合位点肽免疫带有人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠以生产人抗体，或者可以在HIV-1感染的个体或接种含gC1q-R结合位点肽的接种者体内发现抗gp120 C4区的人抗体。可以从这些供体的B细胞开发杂交瘤或EBV转化的B细胞系。人抗体还可通过联合文库(combinatorial library)方法(T.A.Collet等，美国国家科学进展1992；8910026-10030)使用编码抗C4抗体的重链和轻链的mRNA产生，这些mRNA可以从HIV-1感染的个体或如上所述的疫苗接种者的B细胞得到。
单克隆抗体或多克隆抗体可以以缀合物或微载体(如脂质体)的形式用于制导细胞毒性因子以杀死感染细胞，缀合的因子可以是例如毒素、细胞毒药物、膜活化酶或化学品以及高能放射核素。
针对gp120上的gC1q-R结合位点的抗体可以与固相基质缀合，这些修饰后的基质可以体外应用除去游离HIV-1病毒颗粒或从HIV-1感染个体中除去HIV-1感染细胞以降低病毒负载。
针对gp120上的gC1q-R结合位点的抗体可以通过与带有不同特异性(例如针对细胞表面标记或HIV-1抗原)的另一种抗体结合而修饰，这种双特异性抗体可以通过化学缀合(S.A.Kostelny等，免疫学杂志1992；1481547-1553；A.Mabondzo等，感染疾病杂志1992；16693-99)或两个杂交瘤的融合(S.M.Chamow等，免疫学杂志1994；1534268-4280)而产生。
gC1q-R结合位点肽的抗体可以注射给动物(例如小鼠)以产生抗独特型单克隆抗体，抗独特型单克隆抗体可以模拟用于产生靶抗体的原始抗原，并因此可用作免疫原以产生针对gC1q-R结合位点的抗体。
以下描述本发明的实施例以及其应用性的例证。
实施例1 在大肠杆菌中表达gC1q-R蛋白A.分离RNA和制备cDNA根据厂商建议(Biotecx，Houston，Texas)通过RNA-ZOL抽提法从5×106个DAKIKI细胞中分离总RNA。在一含有50mMTris-HCl(pH8.3)和20单位RNASIN(Promega，Madison，Wisconsin)，0.5mM每种dATP，dTTP，dCTP，dGTP，10μM寡dT和2单位AMV反转录酶(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland)的反转录反应混合物中将10微克RNA用作模板制备cDNA的第一链。反应在42℃进行1小时。
B.PCR扩增编码成熟全长gC1q-R蛋白(SEQ ID NO1的74位亮氨酸至282位谷氨酰胺)的gC1q-R cDNA用于PCR的两个引物的序列来自gC1q-R cDNA基因(A.R.Krainer等，细胞1991；66383-394)，引物1加有一NdeI限制位点，引物2加有一PstI限制位点(引物1，SEQ ID NO4 TACATATGCTGCACACCGACGGAGAC；引物2，SEQ ID NO5 GCCCTGCAGCATCTGTCTGCTCTA)。在50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.01％明胶，0.2mM每种dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.5mM每种引物，2μl反转录反应混合物和1单位Taq DNA聚合酶(美国生物化学品公司，Cleveland，Ohio)中进行PCR，PCR在GeneAmp9600(Perkin Elmer，Norwalk，Connecticut)上于94℃(1分钟)、55℃(2分钟)和72℃(2分钟)进行40个循环。
C.构建gC1q-R表达载体并在大肠杆菌中表达全长成熟重组蛋白通过NdeI和PstI双酶切消化将gC1q-R cDNA片段克隆到pT7-7载体(美国生物化学品公司)中(图1)，宿主大肠杆菌是BL21。克隆的基因在强T7启动子的控制之下并由1mM IPTG诱导表达。
D.表达截短的gC1q-R重组蛋白如图1所示产生带有截短的N-末端部分的重组gC1q-R，称为gC1q-R(C)。通过EcoRI和BstXI限制酶消化从pT7-7/gC1q-R表达载体除去编码N-末端部分的基因片段。gC1q-R(C)含有SEQ ID NO1的168位苯丙氨酸至282位谷氨酰胺之间的肽片段。载体的末端用T4 DNA聚合酶补平并用T4 DNA连接酶重新连接。肽gC1q-R(C)在BL21细胞中以与全长gC1q-R相同的方式表达。
如图1所示产生带有截短的C-末端部分的重组gC1q-R，称为gC1q-R(N。gC1q-R(N)含有SEQ ID NO1的74位亮氨酸至167位天冬氨酸之间的肽片段。通过BstXI和PstI限制酶消化从pT7-7/gC1q-R表达载体除去编码C-末端部分的基因片段。载体的末端用T4 DNA聚合酶补平并用T4 DNA连接酶重新连接。肽gC1q-R(N)在BL21细胞中以与全长gC1q-R相同的方式表达。
如图1所示产生带有N-末端57个氨基酸被截短的重组gC1q-R，称为gC1q-R(δ1-57)。gC1q-R(δ1-57)含有SEQ ID NO1的131位缬氨酸至282位谷氨酰胺之间的肽片段。该基因片段首先用PCR合成，在PCR中使用全长gC1q-R cDNA作模板，两个引物为引物2，SEQ ID NO5和序列为AAGAATTCCGGTCACTTTCAACATT的引物3(SEQ ID NO6)，PCR的反应条件与上述相同，只是扩增循环减少至25个。将PCR扩增的DNA片段克隆到pT7-7载体的EcoRI和PstI位点。肽gC1q-R(δ1-57)在BL21细胞中以与全长gC1q-R相同的方式表达。
E.从大肠杆菌中生产和纯化gC1q-R培养表达gC1q-R的大肠杆菌并收获，在Tris缓冲液中超声处理，离心裂解物并将上清对含20mM HEPES，0.1M KCl，0.5％甘油，0.2mM EDTA和1mM二硫苏糖醇pH8.0的缓冲液透析。将透析的样品上样到预平衡的Fast Q离子交换柱(Pharmacia Biotechnology，Piscataway，New Jersey)。用含20mM HEPES和1MKCl pH8.0的缓冲液洗脱结合的蛋白。收集经SDS-PAGE和经测定与重组gp120的反应性的Western免疫印迹分析测试呈gC1q-R阳性的组分。合并的组分进一步在Sephracryl 200凝胶过滤柱(Pharmacia Biotechnology)上纯化。最终物质的纯度经SDS-PAGE测定，其与gp120的结合活性经ELISA测定(见下述实施例4)。实施例2 制备抗gC1q-R肽的单克隆抗体用在200μl PBS中的100μg在弗氏完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)中的大肠杆菌表达的纯gC1q-R皮下注射12周龄的雄性BALB/cJ小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine)。一个月后，用100μg在弗氏不完全佐剂中的gC1q-R皮下注射小鼠。一个月后再次用100μg在弗氏不完全佐剂中的相同抗原皮下注射小鼠，三天后处死。对每一融合，从免疫小鼠的脾制备单细胞悬液并用于与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。将5×108个Sp2/0细胞与5×108个脾细胞在含50％聚乙二醇(分子量1450)(Kodak，Rochester，New York)和5％二甲亚砜(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)的培养基中融合。然后在补加10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基喋呤和16μM胸腺嘧啶的Iscove培养基(Gibco，Grand Island，NewYork)中将细胞调整至每200μl悬液含1.5×105个脾细胞。将200微升细胞悬液加到约20个96孔微培养板的每个孔中。培养约10天后，取上清在每孔用50×103个DAKIKI细胞预包被的Immulon 1微测试板(Dynatech Laboratories，Alexandria，Virginia)上经ELISA筛选。DAKIKI细胞经测定在表面丰富表达gC1q-R。简而言之，向用于DAKIKI细胞包被的微测试板的孔中加入200μl在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％BLOTTO(脱脂奶粉)以封闭非特异性位点。1小时后用缓冲液PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗孔。从每一融合孔中收集50微升培养物上清并与50μl BLOTTO混合然后加入到微测试板的各个孔中。温育1小时后用PBST洗孔。然后通过与在BLOTTO中以1∶1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，Pennsylvania)反应而检测与细胞结合的鼠抗体。向孔中加入含1.1％3’，3’，5’，5’四甲基联苯胺(Sigma)和0.0003％过氧化氢的过氧化物酶底物溶液以显色。每孔加入50μl 2M H2SO4而终止反应。反应混合物在450nm的光密度(OD)用BioTek ELISA阅读仪(BioTek Instruments，Winooski，Vermont)读出。
在ELISA中还测试了那些阳性孔中的培养物上清与重组gC1q-R的反应性。简而言之，向Immulon 2(Dynatech Laboratories)微测试板的孔中加入50μl浓度为1μg/ml的大肠杆菌表达的gC1q-R，室温过夜。在轻弹板除去包被溶液后，向每孔中加入200μl BLOTTO保温1时以封闭非特异性位点。然后用PBST洗孔，如上所述检测结合的鼠抗体。通过有限稀释克隆那些阳性孔中的细胞，并再次测试这些克隆在ELISA中与gC1q-R的反应性。选定的杂交瘤在旋动瓶中培养并收集培养物上清通过蛋白A亲和层析纯化抗体。测试一种如此产生的针对gC1q-R的单克隆抗体99-12-1以确定其是否与HIV-1gp120竞争结合gC1q-R(见下述实施例11)。实施例3 制备抗gC1q-R的多克隆抗体用100μg在弗氏完全佐剂中的大肠杆菌表达的纯gC1q-R(DifcoLaboratories)皮下免疫接种约15周龄的两只雄性新西兰白兔。两周后用同样量的在弗氏不完全佐剂中的抗原对它们再次注射。两周后再次重复同样的免疫接种。从免疫动物收集血清并如上所述在ELISA中测试其与gC1q-R的反应性，只是使用在BLOTTO中以1∶2000稀释的HRP缀合的驴抗兔IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，)检测结合的抗体。使用有较高血清学应答的动物收集血清。通过使用gC1q-R偶联的Affigel 102(BioRad Laboratories)的亲和柱纯化多克隆兔抗gC1q-R免疫球蛋白。实施例4 在ELISA中HIV-1IIIB gp120与大肠杆菌表达的gC1q-R的结合用100μl大肠杆菌表达的gC1q-R(5μg/ml于0.1M乙酸钠缓冲液pH6中)包被Immulon 2板的孔并在室温温育过夜。在室温用封闭缓冲液PBSTB(含2％牛血清白蛋白的PBST)处理孔1小时并用PBST洗后，以双份向相应孔中加入100μl系列稀释的杆状病毒表达的HIV-1IIIB gp120(美国生物技术公司，坎布里奇，马萨诸塞州)(从2μg/ml至0.016μg/ml)并于室温反应1小时，然后如前所述洗孔。用以1∶2000稀释的与HRP缀合的抗HIV-1gp120 V3功能域小鼠单克隆抗体BAT123检测结合的gp120。经测试该抗体与SEQ ID NO7所示的gp120中的肽片段(HXB2R毒株的氨基酸残基号308-322)反应，并且不干扰gC1q-R和gp120之间的结合。向每孔中加入100微升稀释的缀合物并于室温反应1小时，然后洗孔并向每孔中加入200μl过氧化物酶底物溶液以显色30分钟。通过加入50μl 2M H2SO4终止反应，并用BioTek ELISA阅读仪在450nm测定OD。通过将加入gp120的测试孔的OD减去未加gp120的对照孔的OD得出特异性反应性。
结果示于图2，其中可看出当gp120浓度增加时，gp120与恒定量的固定化重组gC1q-R的结合以S型方式增加，这显示出gp120与gC1q-R的剂量依赖性结合。因为抗gp120 V3区抗体BAT123仍能和与gC1q-R结合的gp120反应，其证明gC1q-R与gp120的结合不涉及如SEQ ID NO7所示的gp120的V3区。实施例5 HIV-1中和分析为测试gC1q-R对HIV-1感染性的抑制活性，如P.L.Nara等所述(AIDS研究，人类反转录病毒1987；3283-302)用CEM-SS细胞作为靶细胞进行合胞体形成微量分析。简而言之，将50μl稀释的大肠杆菌表达的gC1q-R与50μl含有200个HIV-1IIIB、HIV-1MN或HIV-1RF合胞体形成单位(SFU)的病毒培养物上清混合，并在室温温育1小时。将混合物加入到含5×104个DEAE-葡聚糖处理的CEM-SS细胞的微培养孔中，将该细胞培养物在5％CO2中于37℃保持3-4天。在倒置显微镜下计数合胞体。中和活性以IC50表示，其定义是达到50％感染抑制时所需的浓度(即Vn/Vo＝50％)，其中Vn是在测试孔中的SFU，Vo是在不加测试抗体的对照孔中的SFU。
结果示于图3A、3B和3C，可以看出gC1q-R中和HIV-1IIIB、MN和RF的IC50分别是4.3，13.5和1.65μg/ml。这些中和资料提示gC1q-R可以宽范围地抑制各种不同HIV-1提取物的感染性。实施例6 分析对合胞体形成的抑制活性用HIV-1感染的H9细胞和表达CD4的HeLa细胞研究gC1q-R对通过细胞-细胞融合的HIV-1传播的作用，这两种细胞接触后融合并在培养物中形成合胞体。HeLa是人癌细胞系，HeLa-CD4+在其基因组内含有由转染而导入的CD4 DNA，它在其细胞表面表达CD4抗原。在本研究中使用的程序与P.J.Madden等，细胞1986；47333-348中所述的类似。简要地说，将HeLa-CD4+细胞以1×105个细胞/孔在24孔微培养板上铺板，温育板36小时，此时单层上皮细胞几乎铺满。当向亚铺满的HeLa-CD4+细胞中加入1×104个感染的H9细胞时，细胞形成接触并融合，8小时后形成多核巨细胞(合胞体)。带有多于5个核的那些合胞体很容易识别并计数，提供了合胞体形成的定量检测。当研究大肠杆菌表达的纯gC1q-R对合胞体形成的作用时，将不同浓度的gC1q-R与感染的H9细胞混合并加到HeLa-CD4+细胞中。每孔中的最终培养基体积为1ml。在37℃于5％CO2中温育8小时后，用RPMI-1640培养基洗孔，用甲醇固定，空气干燥并用在甲醇中的0.1％亚甲蓝染色。在100倍放大倍数下检查细胞，以在4个随机选择的区域上的平均值确定合胞体(含有多于5个核)的数目。合胞体形成的抑制百分率以与对照相比在加入gC1q-R的孔中的合胞体数的减少而计算。
图4所示的结果证实重组gC1q-R抑制HIV-1IIIB感染的H9细胞和CD4+-HeLa细胞之间的融合，其IC50为21μg/ml。实施例7 由流式细胞计量术测量的gC1q-R与HIV-1IIIB感染的H9细胞的结合通过间接免疫荧光流式细胞计量术分析大肠杆菌表达的纯gC1q-R与HIV-1IIIB感染的H9细胞表面表达的gp120之间的结合。将50微升感染的细胞(10×106个细胞/ml PBSB(含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水pH7.4))与系列浓度的大肠杆菌表达的纯gC1q-R在冰上混合30分钟。然后在相同缓冲液中洗细胞1次，300×g离心5分钟，将细胞沉淀重悬于50μl相同缓冲液中并加入50μl浓度为5μg/ml的亲和纯化的兔抗gC1q-R在冰上反应30分钟。然后如前所述洗细胞并加入50μl 1∶40稀释的荧光素缀合的驴抗兔IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories)，并置于冰上30分钟。随后洗细胞，在1％低聚醛中固定并用Coulter EPIC细胞分析仪(Coulter Electronics，Hialeah，Florida)分析。在对照中，只使用兔抗gC1q-R和/或荧光素缀合的驴抗兔IgG。特异细胞染色的计算是将试验的细胞结合百分率减去对照的细胞结合百分率，后者设定为10％。还测试了未感染的H9细胞作为结合研究的阴性对照。
结果显示重组gC1q-R以剂量依赖形式与HIV-1IIIB感染的H9细胞结合(图5)，但不与未感染的H9细胞结合。实施例8 C1q对ELISA中HIV-1gp120与gC1q-R结合的影响为测试天然配体C1q是否与gp120共有结合gC1q-R的结合位点，通过ELISA研究C1q对HIV-1gp120与gC1q-R结合的影响。用50μl在0.1M乙酸钠缓冲液中的浓度为5μg/ml的大肠杆菌表达的纯gC1q-R包被Immulon 2的孔并在室温温育过夜，然后用200μl封闭/稀释缓冲液PBSTB在室温封闭孔1小时。用PBST洗孔后，在用封闭/稀释缓冲液系列稀释的大肠杆菌表达的gC1q-R或从人血清纯化的C1q(Quidel，San Diego，California)的存在和不存在下，向每孔中加入50μl浓度为0.2μg/ml的杆状病毒表达的HIV-1IIIB gp120，在室温温育孔1小时后洗孔。向每孔中加入50μl在封闭/稀释缓冲液中1∶2000稀释的HRP缀合的单克隆抗体BAT123，并在室温温育1小时，然后洗板，如上所述加入过氧化物酶底物溶液显色。通过将加gp120的测试孔的OD减去不加gp120的对照孔的OD得到特异反应性。
结果如图6所示，其中实心圆划线代表C1q，实心方块划线代表gC1q-R。C1q不与gp120竞争结合gC1q-R，而gC1q-R如所预期的竞争。结果显示gp120在gC1q-R上的结合位点不同于C1q在gC1q-R上的结合位点，它们互不干扰。这是一个非常重要的发现，因为当将gC1q-R给予HIV-1感染的个体时或给予接触过HIV-1的人时，在血中存在的大量的C1q不会干扰gC1q-R与病毒颗粒上或感染细胞上的HIV-1gp120的结合。另外，gC1q-R同时结合C1q和gp120的能力是显著而有益的，因为gC1q-R可能可以介导激活补体经典途径以裂解HIV-1病毒颗粒和HIV-1感染的细胞。实施例9 HIV-1gp120与gC1q-R的不同重组构建物的反应性为定位gC1q-R上供HIV-1gp120结合的位点，制备各种长度的gC1q-R重组构建物用于ELISA。用100μl在0.1M乙酸钠缓冲液(pH6)中的浓度为5μg/ml的大肠杆菌表达的纯全长gC1q-R(1-209a.a.)、gC1q-R(58-209a.a.)、gC1q-R(1-94a.a.)或gC1q-R(95-209a.a.)包被Immulon 2的孔并在室温温育过夜，用封闭/稀释缓冲液PBSTB在室温处理孔1小时并用PBST洗后，以双份向相应的孔中加入100μl系列稀释的杆状病毒病毒的HIV-1IIIB gp120(美国生物技术公司)(从2μg/ml至0.016μg/ml)，在室温反应1小时，然后如前所述洗孔。通过加入100μl 1∶2000稀释的HRP缀合的单克隆抗体BAT123在室温保温1小时而检测结合的gp120，然后洗孔，并向每孔中加入200μl过氧化物酶底物溶液显色30分钟。加入50μl 2M H2SO4终止反应，并用BioTek ELISA阅读仪在450nm测量OD。通过将加gp120的测试孔的OD减去不加gp120的对照孔的OD得到特异反应性。
结果如图7所示，其中实心方块划线代表全长gC1q-R(1-209a.a.)，实心圆划线代表gC1q-R(58-209a.a.)，实心三角代表gC1q-R(1-94a.a.)，实心倒三角代表gC1q-R(95-209a.a.)。gp120与gC1q-R(1-209a.a.)、gC1q-R(58-209a.a.)和gC1q-R(95-209a.a.)结合，而不与gC1q-R(1-94a.a.)结合。因此，结果提示gC1q-R上与gp120结合的位点位于其C-末端部分，这一观察与图6所示的结果一致，即gp120结合位点与C1q结合位点截然分开，C1q结合位点位于gC1q-R的N-末端肽片段，如SEQ ID NO8所示(B.Ghebrehiwet等，实验医学杂志1994；1791809-1821)。这一肽片段等价于SEQ ID NO1的氨基酸残基76-93。实施例10 肽作图定位gC1q-R上用于结合99-12-1的功能域为定位gC1q-R上结合99-12-1的表位，使用多针肽合成(MultipinPeptide Synthesis)技术(H.M.Geysen等，科学1987；2351184-1190)。在一96孔微测试板矩阵的塑料针上以系列方式独立合成41个12聚体肽，该41个肽包括了完整的gC1q-R序列(相邻的肽以7个氨基酸互相重叠)。该套肽由Chiron Mimotopes PTY.LTD.，Clayton，Victoria，澳大利亚商业合成。
使用这一多针肽系统定位表位的程序类似于厂商说明书。简而言之，首先用含有在PBS中的2％牛血清白蛋白和0.1％Tween 20的预包被缓冲液在室温处理针1小时，然后将针插入含有在预包被缓冲液中的浓度为2μg/ml的抗体99-12-1的96孔微测试板的孔中，在室温进行1小时温育。在PBST中洗针(洗3次，每次10分钟)，然后在含有1∶4000稀释的100μl HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)的96孔微测试板的孔中室温温育1小时。如前所述洗针后，将针放入含有2，2’-连氮-双[3-乙基苯并噻唑啉-b-磺酸]二铵(ABTS)和H2O2的过氧化物酶底物溶液(Kirkegaard & PerryLaboratories Inc.，Gaithersburg，Maryland)的孔中室温保温30分钟以显色。通过BioTek ELISA读板仪在405nm读板，对比492nm波长处的背景吸收。显色的孔指示在这些孔中gC1q-R衍生的肽与99-12-1的反应性。
表位定位的结果显示99-12-1与SEQ ID NO2的肽结合。
为证实99-12-1的结合表位，在ELISA中测试SEQ ID NO2的肽LM12DN结合99-12-1的能力。使用以前确定的是结合C1q的位点的SEQ IDNO8的肽(肽TD18EE)作为阴性对照。使用厂商建议的9-芴甲氧羰基合成程序通过自动肽合成仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，California)合成肽LM12DN和TD18EE。在肽ELISA中，用50μl 1μg/ml的肽LM12DN或TD18EE包被Immulon 2微测试板的孔，于室温过夜包被。通过轻振板除去包被溶液后，向每孔中加入200μl PBSTB以在室温饱和非特异性位点1小时，然后用PBST洗孔。以双份向孔中加入50微升在PBSTB中系列稀释的99-12-1，室温保温1小时，之后再次洗板。向每孔中加入1∶2000稀释的50μl HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，室温保温1小时。之后洗孔，如上所述加入过氧化物酶底物显色。用ELISA阅读仪在450nm读板，将加入99-12-1的测试孔的OD减去对照孔的OD得到特异反应性。
结果示于图8，其中实心方块划线代表肽LM12DN，实心圆划线代表肽TD18EE。99-12-1与肽LM12DN(SEQ ID NO2)以剂量依赖方式结合，但99-12-1不与肽TD18EE(SEQ ID NO8)结合。实施例11 在ELISA中抗gC1q-R单克隆抗体99-12-1对HIV-1gp120与gC1q-R结合的竞争用50μl在0.1M乙酸钠缓冲液(pH6)中的5μg/ml大肠杆菌表达的纯gC1q-R于室温过夜包被Immulon 2微测试板的孔，然后用200μl封闭/稀释缓冲液PBSTB在室温封闭孔1小时，之后用PBST洗。在用封闭/稀释缓冲液系列稀释的99-12-1的存在和不存在下，向每孔中加入50μl浓度为0.2μg/ml的杆状病毒表达的HIV-1IIIB gp120，在室温温育孔1小时后洗孔。向每孔中加入50μl在封闭/稀释缓冲液中1∶2000稀释的HRP缀合的单克隆抗体BAT123，并在室温温育1小时，然后洗板，如上所述加入过氧化物酶底物溶液显色。通过以加gp120和不加gp120的孔的OD之差计算99-12-1对gp120与gC1q-R结合的抑制。
图9显示99-12-1以剂量依赖的方式抑制gp120与gC1q-R的结合，提示99-12-1结合到gC1q-R上与gp120相互作用关键的位点上。这一位点如实施例10所述定位于SEQ ID NO2。实施例12 在ELISA中抗体G3-299和6205对HIV-1gp120与gC1q-R结合的竞争为有助于鉴别HIV-1gp120上的gC1q-R结合位点，设计一竞争ELISA以检查各种抗HIV-1gp120抗体和重组可溶性CD4(rsCD4)对gp120p120与gC1q-R结合的作用。
用50μl在0.1M乙酸钠缓冲液(pH6)中的5μg/ml大肠杆菌表达的纯gC1q-R于室温过夜包被Immulon 2微测试板的孔，然后用200μl封闭/稀释缓冲液PBSTB在室温封闭孔1小时。在用封闭/稀释缓冲液系列稀释的抗HIV-1 gp120抗体和rsCD4(Biogen，Boston，Massachusetts)的存在和不存在下，向每孔中加入50μl浓度为0.2μg/ml的杆状病毒表达的HIV-1IIIB gp120，在室温温育孔1小时。所测的抗HIV-1 gp120抗体包括小鼠单克隆抗体G3-299(结合C4区(HXB2R毒株的氨基酸残基号423-437)，如SEQ ID NO9所示)，绵羊抗HIV-1gp120 C5区抗体，6205(结合HXB2R毒株的氨基酸残基号497-511的序列，如SEQ ID NO10所示)，和BAT085(结合HXB2R毒株的氨基酸残基号169-183的V2区，如SEQ ID NO11所示)。G3-299和BAT085的性质以前已有描述(N.C.Sun等，病毒学杂志1989；633579-3585；M.S.C.Fung等，病毒学杂志1992；66848-856)。抗体6205购自International Enzymes，Fallbrook，California。洗板后，向每孔中加入50μl在封闭/稀释缓冲液中1∶2000稀释的HRP缀合的单克隆抗体BAT123，并在室温温育1小时，然后洗板，如上所述加入过氧化物酶底物溶液显色。通过以加和不加竞争剂的孔的OD之差计算抗HIV-1gp120抗体或4sCD4对gp120与gC1q-R结合的抑制。
结果如图10所示，其中实心圆划线代表抗gp120 C4区G3-299，实心方块划线代表多克隆绵羊抗gp120 C5区，6205，实心三角划线代表rsCD4。可以看出G3-299非常有效地竞争gp120与gC1q-R的结合，6205中度竞争，而rsCD4不是这样。抗V2区的抗体BAT085也不抑制结合。总之，实施例4和实施例12的结果提示gC1q-R结合位点位于C4和C5区的附近，其与CD4结合位点截然分开。这一重要的发现提示gC1q-R和rsCD4可以联合应用治疗HIV-1感染，这样可以扩大防止CD4阳性靶细胞和CD4阴性靶细胞感染的有效性。实施例13 肽作图定位HIV-1gp120上结合gC1q-R的功能域为确定HIV-1gp120上结合gC1q-R功能域的肽表位，再次使用如上所述的多针肽合成技术。通过Chiron Mimotopes肽系统在一96孔微测试板矩阵的塑料针上合成94个12聚体肽，该94个肽包括了完整的HIV-1MN gp120序列(相邻的肽以7个氨基酸互相重叠)，HIV-1MN gp120的氨基酸序列基于LosAlamos国立实验室数据库(G.Myers等，人反转录病毒和AIDS，1992)。定位表位的程序类似于上述实施例10所述。
用5μg/ml大肠杆菌表达的纯gC1q-R与塑料针上的肽反应。洗针后，通过在室温与亲和纯化的兔抗gC1q-R免疫球蛋白反应1小时检测结合的gC1q-R。如前所述洗针，并与HRP缀合的驴抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)反应。显色反应程序如前所述。
用覆盖结合区的重叠合成肽作为ELISA中的包被抗原证实HIV-1gp120上的gC1q-R结合表位。HIV-1 HXB2R gp120重叠肽RC16GG(氨基酸残基号444-459，如SEQ ID NO3所示)，RC12LT(氨基酸残基号444-455，如SEQ ID NO12所示)，以及TG12NN(氨基酸残基号450-461，如SEQID NO13所示)购自美国生物技术公司。用100μl 2μg/ml的相应肽在室温过夜包被Immulon 2微测试板的孔，然后用200μl封闭/稀释缓冲液PBSTB在室温处理孔1小时，之后用PBST洗孔。以双份向孔中加入不同浓度的大肠杆菌表达的纯gC1q-R，在室温反应1小时，然后如前所述洗板。向每孔中加入100微升2μg/ml的亲和纯化的兔抗gC1q-R免疫球蛋白，在室温反应1小时，然后洗板。加入100微升稀释的HRP缀合的驴抗兔IgG，室温反应1小时，洗板。如前所述加入过氧化物酶底物溶液进行显色反应。
结果如图11所示，其中实心方块划线代表RC12LT，实心圆划线代表TG12NN，实心三角划线代表RC16GG。可以看出只有RC16GG与gC1q-R反应，这一结果与下列事实一致，即gp120上的gC1q-R结合位点位于SEQ ID NO3所示的肽片段中，即位于gp120的C4区。如实施例12所示，抗体G3-299可以有效地竞争gp120与gC1q-R的结合，可能是因为G3-299的结合位点(SEQIN NO9)与gC1q-R的结合位点(SEQ IN NO3)紧密相邻。
应理解的是本文所述的术语、表达法和实施例仅仅是举例性而非限制性的，本发明的范围仅由权利要求书限定并包括所有等价物。
序列表(1)一般信息(i)申请人迈克尔·S·C·冯，比尔·N·C·孙，塞西莉·R·Y·孙，金泳宇，余立明(ii)发明名称gC1q受体，与其结合的HIV-1gp120区以及相关肽和靶向抗体(iii)序列数13(iv)通讯地址(A)收信人Tanox Biosystems，Inc.
(B)街道10301 Stella Link Rd.
(C)城市休斯敦(D)州德克萨斯州(E)国家美国(F)邮码77025(v)计算机可读形式(A)媒介类型3.5英寸软盘(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统DOS 3.30(D)软件Wordperfect 5.1(vi)当前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号08/410,360(B)申请日24/03/1995(viii)律师/代理人信息(A)姓名Mirabel，Eric P.
(B)注册号31,211(C)案号/文档号TNX95-1-PCT(ix)电讯信息(A)电话(713)664-2288(B)传真(713)664-8914(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征；(A)长度1138个核苷酸(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO1CCGGCGGCGC CTCAGGTCGC GGGGCGCCTA GGCCTGGGTT 40GTCCTTTGCA TCTGCACGTG TTCGCAGTCG TTTCCGCG78ATG CTG CCT CTG CTG CGC TGC GTG CCC CGT GTG CTG GGC TCC TCC 123Met Leu Pro Leu Leu Arg Cys Val Pro Arg Val Leu Gly Ser Ser5 10 15GTC GCC GGC CTC CGC GCT GCC GCG CCC GCC TCG CCT TTC CGG CAG 168Val Ala Gly Leu Arg Ala Ala Ala Pro Ala Ser Pro Phe Arg Gln20 25 30CTC CTG CAG CCG GCA CCC CGG CTG TGC ACC CGG CCC TTC GGG CTG 213Leu Leu Gln Pro Ala Pro Arg Leu Cys Thr Arg Pro Phe Gly Leu35 40 45CTC AGC GTG CGC GCA GGT TCC GAG CGG CGG CCG GGC CTC CTG CGG 258Leu Ser Val Arg Ala Gly Ser Glu Arg Arg Pro Gly Leu Leu Arg50 55 60CCT CGC GGA CCC TGC GCC TGT GGC TGT GGC TGC GGC TCG CTG CAC 303Pro Arg Gly Pro Cys Ala Cys Gly Cys Gly Cys Gly Ser Leu His65 70 75ACC GAC GGA GAC AAA GCT TTT GTT GAT TTC CTG AGT GAT GAA ATT 348Thr Asp Gly Asp Lys Ala Phe Val Asp Phe Leu Ser Asp Glu Ile80 85 90AAG GAG GAA AGA AAA ATT CAG AAG CAT AAA ACC CTC CCT AAG ATG 393Lys Glu Glu Arg Lys Ile Gln Lys His Lys Thr Leu Pro Lys Met95 100 105TCT GGA GGT TGG GAG CTG GAA CTG AAT GGG ACA GAA GCG AAA TTA 438Ser Gly Gly Trp Glu Leu Glu Leu Asn Gly Thr Glu Ala Lys Leu110 115 120GTG CGG AAA GTT GCC GGG GAA AAA ATC ACG GTC ACT TTC AAC ATT 483Val Arg Lys Val Ala Gly Glu Lys Ile Thr Val Thr Phe Asn Ile125 130 135AAC AAC AGC ATC CCA CCA ACA TTT GAT GGT GAG GAG GAA CCC TCG 528Asn Asn Ser Ile Pro Pro Thr Phe Asp Gly Glu Glu Glu Pro Ser140 145 150CAA GGG CAG AAG GTT GAA GAA CAG GAG CCT GAA CTG ACA TCA ACT 573Gln Gly Gln Lys Val Glu Glu Gln Glu Pro Glu Leu Thr Ser Thr155 160 165CCC AAT TTC GTG GTT GAA GTT ATA AAG AAT GAT GAT GGC AAG AAG 618Pro Asn Phe Val Val Glu Val Ile Lys Asn Asp Asp Gly Lys Lys170 175 180GCC CTT GTG TTG GAC TGT CAT TAT CCA GAG GAT GAG GTT GGA CAA 663Ala Leu Val Leu Asp Cys His Tyr Pro Glu Asp Glu Val Gly Gln185 190 195GAA GAC GAG GCT GAG AGT GAC ATC TTC TCT ATC AGG GAA GTT AGC 708Glu Asp Glu Ala Glu Ser Asp Ile Phe Ser Ile Arg Glu Val Ser200 205 210TTT CAG TCC ACT GGC GAG TCT GAA TGG AAG GAT ACT AAT TAT ACA 753Phe Gln Ser Thr Gly Glu Ser Glu Trp Lys Asp Thr Asn Tyr Thr215 220 225CTC AAC ACA GAT TCC TTG GAC TGG GCC TTA TAT GAC CAC CTA ATG 798Leu Asn Thr Asp Ser Leu Asp Trp Ala Leu Tyr Asp His Leu Met230 235 240GAT TTC CTT GCC GAC CGA GGG GTG GAC AAC ACT TTT GCA GAT GAG 843Asp Phe Leu Ala Asp Arg Gly Val Asp Asn Thr Phe Ala Asp Glu245 250 255CTG GTG GAG CTC AGC ACA GCC CTG GAG CAC CAG GAG TAC ATT ACT 888Leu Val Glu Leu Ser Thr Ala Leu Glu His Gln Glu Tyr Ile Thr260 265 270TTT CTT GAA GAC CTC AAG AGT TTT GTC AAG AGC CAG 924Phe Leu Glu Asp Leu Lys Ser Phe Val Lys Ser Gln275 280TAGAGCAGAC AGATGCTGAA AGCCATAGTT TCATGGCAGG 964CTTTGGCCAG TGAACAAATC CTACTCTGAA GCTAGACATG 1004TGCTTTGAAA TGATTATCAT CCTAATATCA TGGGGGAAAA 1044AATACCAAAT TTAAATTATA TGTTTTGTGT TCTCATTTAT 1084TATCATTTTT TTCTGTACAA TCTATTATTT CTAGATTTTT 1124GTATAACATG ATAG 1138(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征；(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO2Leu Met Asp Phe Leu Ala Asp Arg Gly Val Asp Asn5 10(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征；(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO3Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly5 10 15(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征；(A)长度26个核苷酸(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO4TACATATGCT GCACACCGAC GGAGAC 26(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征；(A)长度24个核苷酸(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO5GCCCTGCAGC ATCTGTCTGC TCTA 24(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征；(A)长度25个核苷酸(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性
(ix)序列描述SEQ ID NO6AAGAATTCCG GTCACTTTCA ACATT 25(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征；(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO7Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys5 10 15(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征；(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO8Thr Asp Gly Asp Lys Ala Phe Val Asp Phe Leu Ser Asp Glu Ile LysGlu Glu5 10 15(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征；(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO9Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro5 10 15(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征；(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO10Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg5 10 15(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征；
(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO11Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe Tyr Lys Leu Asp Ile Ile Pro5 10 15(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征；(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO12Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr5 10(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征；(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)序列描述SEQ ID NO13Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Asn5 10
权利要求
1.一种具有SEQ ID NO2的序列的肽。
2.权利要求1的肽，其与增强其免疫原性的一种载体缀合。
3.权利要求2的肽，其中所述的载体是KLH。
4.编码SEQ ID NO2的肽的寡核苷酸。
5.权利要求4的寡核苷酸，其是脱氧寡核苷酸。
6.靶向权利要求1的肽的结合分子或抗体。
7.权利要求6所述的结合分子或抗体，其是单克隆抗体。
8.单克隆抗体99-12-1。
9.生产单克隆抗体99-12-1的细胞系。
10.一种具有SEQ ID NO3的序列的肽。
11.权利要求10的肽，其与增强其免疫原性的一种载体缀合。
12.权利要求10的肽，其中所述的载体是KLH。
13.编码SEQ ID NO3的肽的寡核苷酸。
14.权利要求13的寡核苷酸，其是脱氧寡核苷酸。
全文摘要
本发明公开了基于gC1q－R上结合HIV－1gp120的结合位点的免疫原和肽,以及基于HIV－1gp120上结合gC1q－R的结合位点的免疫原和肽。gC1q－R上的结合gp120的结合位点的序列如SEQIDNO:2所示,HIV－1gp120上结合gC1q－R的结合位点的序列如SEQIDNO:3所示。还公开了针对所有这些免疫原和肽的抗体和结合分子,以及诱导这种抗体的内源生产。
文档编号C12R1/19GK1179163SQ9619278
公开日1998年4月15日 申请日期1996年3月22日 优先权日1995年3月24日
发明者迈克尔·S·C·冯, 比尔·N·C·孙, 塞西莉·R·Y·孙, 金永瑀, 於利敏 申请人:泰诺克斯生物系统公司