专利名称：制备β－内酰胺类抗菌素的方法
技术领域：
本发明涉及利用以酰化试剂对β-内酰胺环实施酶催化酰化制备β-内酰胺类抗菌素的方法。
这样一种方法例如公开在WO-A-9201061中。在该公开所描述的方法中，使用了大大超过β-内酰胺环数量的酰化试剂。其pH值被调整到某一较低的水平并保持恒定。如果在该方法中酶要重复多次使用，则酶的活性表现出明显下降。
然而在实践中，要获得一种商业上具有吸引力的方法，加入的酶就应当适合重复使用许多次(例如50次以上，尤其是100次以上)而不会显著丧失活性。
本发明的目的就是要获得一种消除了所述缺点的β-内酰胺环的酶催化酰化方法。
按照本发明，该目的是在一种通过以酰化试剂对β-内酰胺环进行酶催化化酰化来制备β-内酰胺类抗菌素的方法实现的，其中β-内酰胺环与酰化试剂之间的摩尔比为0.5∶1～2∶1，反应混合物中无机盐的浓度低于1000∶n mM，n代表阴离子的化合价，且β-内酰胺类抗菌素与β-内酰胺环浓度之和为200～800mM。
事实是本申请人已发现，在连续使用的多个周期中，酶的活性对酶催化 酰化反应期间反应混合物中无机盐的浓度，以及对β-内酰胺类抗菌素与β-内酰胺环的浓度之和存在依赖关系。
可用于本发明方法中的β-内酰胺环的合适例子是青霉烷酸衍生物，例如6-氨基青霉烷酸(6-APA)，以及头孢烷酸衍生物，例如7-氨基头孢烷酸(7-ACA)、7-氨基去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)及7-氨基-3-氯代头孢烷酸(7-ACCA)。
可用于本发明方法中的合适酰化试剂例如是α-氨基酸衍生物，特别是苯基甘氨酸、对羟苯基甘氨酸以及二氢苯基甘氨酸的酰胺及酯。
原则上，任何适合作为偶合反应催化剂的酶皆可使用。例如，这些酶是一般统称为“青霉素酰胺酶”及“青霉素酰基转移酶”的酶。合适的酶的例子是那些由下列物质衍生的酶醋酸杆菌、气单孢菌、产碱菌、Aphanocladium、芽孢杆菌sp.、假头状孢子头(Cephalosporium)、埃希氏菌、黄色杆菌、克氏梭菌(Kluyvera)、枝动杆菌、精朊杆菌、假单孢菌及黄单孢菌，特别是巴氏醋杆菌、粪产碱菌、巨大芽孢杆菌、大肠埃希氏菌及柑橘黄单胞菌。
优选的是使用固相酶，因为这种酶易于重复使用。固相酶本身是已知的且有商品供应。特别合适的酶是Boehringer Mannheim公司生产的商品名为Enzygel的大肠埃希氏菌酶、Recordati公司生产的固相青霉素G酰基转移酶、Hannover药物生物技术公司生产的固相青霉素G酰基转移酶以及按WO-A-92/12782所述提取并按EP-A-222462予以固定的大肠埃希氏菌青霉素酰基转移酶。
该酶催化酰化反应大多在-5～35℃之间进行，特别是在5～35℃之间，优选地在0～28℃之间，最优选在15～28℃之间进行。
实施酰化反应的pH值大多在6～8.5之间。在决定最佳pH值的诸多因素当中特别要注意的是抗菌素，因为β-内酰胺类抗菌素及β-内酰胺环的稳定性及溶解度均与pH值有关。如果使用苯基甘氨酸衍生物作为酰化试剂，pH值优选地为6.2～8.5，最优选为7～8；如果使用对羟苯基甘氨酸衍生物作为酰化试剂，pH值优选地为6～7.5，最优选为6～7。此外，酶的活性也与pH值有关。
在实施过程中，酰化反应大多在水中进行。任选地，反应混合物也可含有有机溶剂或有机溶剂的混合物，优选地其含量少于30％(体积)。可使用的有机溶剂的例子是含有1～7个碳原子的醇，例如一元醇，特别是甲醇或乙醇；二元醇，特别是乙二醇或三元醇，特别是甘油。
应选择β-内酰胺类抗菌素的浓度及β-内酰胺环的浓度，使得两种浓度之和为200～800mM。优选的是，选择该浓度，使得两种浓度之和为300～700mM，最优选300～600mM。
酰化试剂与β-内酰胺环之间的摩尔比为0.5∶1～2∶1。优选地为0.7∶1～1.3∶1，最优选0.8∶1～1.2∶1。优选的是，选择酰化试剂与β-内酰胺环之间的摩尔比，使得整个酰化反应期间反应混合物的pH值在不滴加酸的情况下不超过上述极限。
事实是本申请人已发现，如果在上述过程中用滴加强酸来维持pH值恒定，酶的稳定性受到的损害会因向反应混合物中直接加入酸，从而出现所谓的“热点”(低pH点)而加剧。另外，这种现象的出现还因滴加酸而造成盐浓度增加所产生的效应所致。而且发现，这两种影响互为加强。
由于当使用酰胺作为酰化试剂时酰化反应过程中释放出氨气，在诸如Cl-、SO42-、PO43-、NO3-之类的阴离子存在下的反应混合物中将发生无机盐的积累。已发现，如果无机盐浓度变得过高，例如高于1000∶n mM，其中n是阴离子的化合价，则酶的活性在使用若干周期之后会显著降低。因此本发明方法中的无机盐浓度应维持在低于1000∶n mM，优选地低于700∶nmM的水平，其中n的定义如前文，就是说对于氯化物及硝酸盐而言，n是1，对硫酸盐而言n是2。
为了保持低无机盐浓度，优选的是，确保酶催化酰化反应期间生成的那部分无机盐限制在最少程度。
在制备已知的β-内酰胺类抗菌素，例如头孢氨苄、阿莫西林、氨苄西林、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄以及头孢噻肟等的过程中，经常使用的酰化试剂是苯基甘氨酸及对羟苯基甘氨酸衍生物，例如它们的酰胺或酯。在已知的方法中，它们经常以强酸盐的形式使用，例如苯基甘氨酰胺·HCl、苯基甘氨酰胺·H2SO4、苯基甘氨酸甲酯.HCl或二氢苯基甘氨酸甲酯.HCl。在本发明的方法中，优选使用游离酰胺或游离酯，以防止由于酰化试剂的盐中和而生成附加的无机盐。固体形式的游离酰胺尤其适合于这一目的。
已知D-苯基甘氨酸的游离酰胺(D-PGA)难于以固体形式回收。现已发现，游离D-苯基甘氨酰胺可以这样简单地制取通过以碱，优选用氨，将强酸盐形式的D-苯基甘氨酰胺水溶液中和，继而在冷却后回收到固体形式的游离D-苯基甘氨酰胺。D-苯基甘氨酰胺的硫酸盐的浓度优选地为0.5M～4M，特别是1～3M。冷却后的温度大多为-5～25℃，优选地为0～15℃。
生成的β-内酰胺类抗菌素可以用已知的方法从反应混合物中回收，例如借助配位反应或结晶。
下面，将借助实例进一步说明本发明，然而本发明并不限于这些实例。
酶循环实验的一般描述在下面实例中的每一例中，描述了酶循环实验I～X，即在一个实验中让一定量的酶多次经受同样的反应条件。
这是在一个双层壁、搅拌反应釜中进行实验来到达的，该反应釜的底部由G-3玻璃过滤器构成。每一次反应的终点，反应混合物借助抽滤取出；而留下的酶经过洗涤，然后直接用于下一次反应。
在实例I～X中的每一例中，使用的是Recordati公司(米兰)生产的青霉素G酰基转移酶。这种酶的供应形式为一种水与甘油的混合物(湿酶)；每次加入之前用水洗涤3遍。每个实验中的温度均为25℃。
在每个实例的标题及说明中，指明了起始反应混合物(或进料)中酰化试剂及β-内酰胺环的浓度，以及该酰化试剂以何种形式加入的(以一种酸的盐或以游离形式)、反应的pH值如何变化以及是否滴加酸，如果滴加，则使用何种酸。如果滴加酸，这就是说pH值一直维持在指出的最终数值不变。
在每一实例中，采用对整个系列均一致的标准反应时间。每次反应之后，测定过滤并洗涤后滤液中β-内酰胺类抗菌素的浓度。这些浓度值的变化情况示于相应的图中；曲线切线的斜率作为有关实验中酶活性降低的度量。为了获得对酶活性降低的深入了解，为每个实例选择的标准反应时间是如此之短，以致在第一次反应中尚未生成最佳数量的β-内酰胺类抗菌素。
实例I酶循环实验条件为使用600mM D-PGA.H2SO4及400mM 7-ADCA，pH从7.5到最终7.8以及滴加用酸为12N H2SO4。
20克湿酶用水洗涤并引入到反应釜中。向其中加入组成如下的进料61.0克D-PGA.H2SO4、43.7克7-ADCA(纯度98.3％(质量))、1.8克D-PG、375毫升水以及27.5毫升25％(质量)的NH4OH水溶液(进料的pH值＝7.5)。反应混合物在25℃下进行搅拌。搅拌均匀后，pH值升高到7.8，此后借助滴加12N H2SO4使pH值恒定在7.8。
2小时之后，混合物进行抽滤。然后，酶用水洗涤两遍；洗涤水也经过过滤然后并入第一次的滤液中。
剩余的澄清溶液经过称重，然后用HPLC(高压液体色谱)测定头孢氨苄的含量。
结果每次反应后的头孢氨苄含量见
图1。估计的酶活性平均每次降低值约为5.5％。
实例2酶循环实验条件为使用600mM D-PGA.H2SO4及400mM 7-ADCA，pH从7.5到最终7.8以及滴加用酸为2N H2SO4。
实验过程与实例1类似，使用20克湿酶并向其中加入组成如下的进料61.0克D-PGA.H2SO4、43.7克7-ADCA、1.8克D-PG、375毫升水以及27.5毫升25％(质量)的NH4OH水溶液。初始pH值＝7.5，最终pH＝7.8，借助滴加2N H2SO4保持最终pH值恒定。反应时间2小时。
结果见图1。估计的酶活性平均每次降低值约为3.4％。
实例3酶循环实验条件为使用600mM D-PGA及400mM 7-ADCA，pH＝7.5变至7.8以及滴加用酸为12N H2SO4。
实验过程与实例1类似，使用20克湿酶并向其中加入组成如下的进料45.0克游离D-PGA 43.7克7-ADCA、1.8克D-PG、413毫升水以及5毫升25％(质量)的NH4OH水溶液。初始pH值＝7.6，最终pH＝7.8，借助滴加12N H2SO4保持最终pH值恒定。反应时间2小时。
结果见图1。估计的酶活性平均每次降低值约为2.4％。
实例4酶循环实验条件为使用500mM D-PGA及500mM 7-ADCA，pH从7.4到7.55，在380mM(NH4)2SO4的存在下。
实验过程与实例1类似，使用25克湿酶并向其中加入组成如下的进料37.5克游离D-PGA 54.6克7-ADCA、25克(NH4)2SO4、 375毫升水。未滴加。初始pH值＝7.4，最终pH值＝7.55。反应时间75分钟。
结果见图2。估计的每次酶活性降低值约为0.5％。
实例5酶循环实验条件为使用600mM D-PGA.H2SO4及400mM 7-ADCA，pH从7.2到7.5，在100mM(NH4)2SO4的存在下。
实验过程与实例1类似，使用25克湿酶并向其中加入组成如下的进料60.0克D-PGA.H2SO443.8克7-ADCA、6.6克(NH4)2SO4、14.2克25％(质量)的NH4OH水溶液以及390毫升水。未滴加。初始pH值＝7.2，最终pH值＝7.5。反应时间75分钟。
结果见图2。估计的每次酶活性降低值约为0.9％。
实例6酶循环实验条件为使用500mM D-PGA及500mM 7-ADCA，pH从7.3到7.5，在500mM NH4Cl的存在下。
实验过程与实例1类似，使用25克湿酶，进料组成如下37.5克游离D-PGA 54.6克7-ADCA、13.4克NH4Cl以及375毫升水。未滴加。初始pH值＝7.3，最终pH值＝7.5。反应时间75分钟。
结果见图2。估计的每次酶活性降低值约为0.6％。
实例7酶循环实验条件为使用500mM D-PGA及500mM 7-ADCA，pH从7.3到7.4，在1000mM NH4Cl的存在下。
实验过程与实例1类似，使用25克湿酶，进料组成如下37.5克游离D-PGA、54.6克7-ADCA、26.8克NH4Cl以及375毫升水。未滴加。初始pH值＝7.3，最终pH值＝7.5。反应时间75分钟。
结果见图2。估计的每次酶活性降低值约为1.3％。
实例8酶循环实验条件为使用300mM D-PGA及300mM 7-ADCA，pH从7.2到7.8。
实验过程与实例1类似，使用50克湿酶，进料组成如下45.0克游离D-PGA、65.0克7-ADCA、1.8克D-PG以及900毫升水。未使用氨，也未滴加。初始pH值＝7.2，最终pH值＝7.8。反应时间75分钟。
结果见图3。估计的每次酶活性降低值小于0.05％。
实例9酶循环实验条件为使用400mM D-PGA及400mM 7-ADCA，pH从7.3到7.8。
实验过程与实例1类似，使用25克湿酶，进料组成如下30.0克游离D-PGA、43.7克7-ADCA以及425毫升水。未使用氨，也未滴加。初始pH值＝7.3，最终pH值＝7.8。反应时间75分钟。
结果见图3。估计的每次酶活性降低值约为0.1％。
实例10酶循环实验条件为使用500mM D-PGA及500mM 7-ADCA，pH从7.4到7.8。
实验过程与实例1类似，使用25克湿酶，进料组成如下37.5克游离D-PGA、54.6克7-ADCA以及375毫升水。未使用氨，也未滴加。初始pH值＝7.4，最终pH值＝7.8。反应时间75分钟。
结果见图3。估计的酶活性每次降低值约为0.2％。
从酶循环实验得出的结论从图2以及图2与图3的比较可以看出，如果存在无机盐，酶活性将降低。这种效应随盐的含量增加而加剧，正如从实例6与实例7的对比中所看到的。
从图1也可以看出盐含量的高低对酶活性有影响，这可以从实例1与实例3的比较中看出，它们都是从D-PGA·H2SO4和D-PGA开始反应(在前一种情况下生成的盐量较多)。而且，由于滴加强酸，会出现热点现象，这从实例1与实例2的比较可以看出，从中可看出分别采用12N与2N硫酸进行滴加所造成的差异，以及从图1与图2的比较，对照着未滴加的实例也有所区别。底物浓度的影响从图3可以看出，该图表明，酶的稳定性在高底物浓度时下降。
如果加入的底物浓度高(如实例10)，这在实践中是所希望的，可以看出，酶活性的降低速度可通过令其在酶反应期间不含无机盐而限制在极低的水平。从图3可看出，如果其中不含有任何无机盐，则酶活性的下降速度最小，也就是如果使用游离形式的酰化试剂且不进行任何滴加，此时，酶活性下降得极少，因而酶可多次循环使用(远高于50次)，底物浓度高时也是如此，正如从实例10看出的。
实例11由D-苯基甘氨酰胺·H2SO4制备D-苯基甘氨酰胺600克D-苯基甘氨酰胺·H2SO4悬浮在25℃的750毫升水中。在搅拌下加入260毫升25％(质量)的NH4OH，其间借助冷却维持温度≤35℃。将悬浮体冷却至5℃。滤出生成的晶体，每次用200毫升5℃水反复洗涤4次，最后干燥至恒重。收率421克(93％)。
得到的D-苯基甘氨酰胺的鉴定采用HPLC对D-PGA进行了分析D-PGA含量100±0.5％(质量)D-PG含量＜0.01％(质量)e.e.D(D-对映体的对映异构过量)＝99.7％另外，采用滴定法确定了含量D-PGA99.5％(质量)SO42-＝0.14％(质量)熔点＝134～135℃在甲醇及水中的旋光率αD25＝-115.8°(c＝1，甲醇)αD25＝-97.8°(c＝1，水)1H NMR(D2O)δ7.40(s，5H)、4.52(s，1H)13C NMR(D2O)δ179.1、140.4、129.6、128.8、127.3、58.9
权利要求
1.一种通过以酰化试剂对β-内酰胺环实施酶催化酰化制备β-内酰胺类抗菌素的方法，其中β-内酰胺环与酰化试剂之间的摩尔比为0.5∶1～2∶1，反应混合物中无机盐的浓度低于1000∶n mM，n代表阴离子的化合价，且β-内酰胺类抗菌素与β-内酰胺环的浓度之和为200～800mM。
2.按照权利要求1的方法，其中使用游离氨基酸酰胺或游离氨基酸酯作为酰化试剂。
3.按照权利要求1或2的方法，其特征在于，β-内酰胺环与酰化试剂的摩尔比为0.7∶1～1.3∶1。
4.按照权利要求1～3中任何一项的方法，其反应温度为5～35℃。
5.按照权利要求4的方法，其反应温度为15～28℃。
6.按照权利要求1～5中任何一项的方法，避免向反应混合物中直接加入酸。
7.按照权利要求1～6中任何一项的方法，其中β-内酰胺类抗菌素与β-内酰胺环的总浓度为300～600mM。
8.按照权利要求1～7中任何一项的方法，其中使用固相酶。
9.按照权利要求1～8中任何一项的方法，其中在酰化反应之后，酶被从反应混合物中分离出来，随后在下次酰化反应中重复使用。
10.按照权利要求9的方法，其中酶在酰化反应中重复使用50次以上。
11.按照权利要求1～10中任何一项的方法，其中以游离氨基酸酰胺作为酰化试剂。
12.按照权利要求11的方法，其中使用的酰化试剂是固态D-苯基甘氨酰胺，其制法为用碱将浓度为0.5～4M以强酸盐形式存在的D-苯基甘氨酰胺中和，冷却至-5～25℃后，回收游离固体形式的D-苯基甘氨酰胺。
全文摘要
本发明涉及一种通过以酰化试剂对β－内酰胺环实施酶催化酰化制备β－内酰胺类抗菌素的方法,其中β－内酰胺环与酰化试剂之间的摩尔比为0.5∶1～2∶1,反应混合物中无机盐的浓度低于1000∶nmM,n代表阴离子的化合价,且β－内酰胺类抗菌素与β－内酰胺环的浓度之和为200～800mM。本方法提供的优点在于酶可以多次重复使用而酶活性不显著降低。这使得本方法成为具有商业吸引力的、通过对β－内酰胺环实施酶催化酰化制备β－内酰胺类抗菌素的方法。
文档编号C12P35/00GK1179795SQ96192906
公开日1998年4月22日 申请日期1996年2月1日 优先权日1996年2月1日
发明者W·H·J·波斯藤, T·J·G·M·范多伦, J·C·M·思密斯 申请人:切姆费姆公司