产生耐渗透性植物的方法

专利名称：产生耐渗透性植物的方法
技术领域：
本发明涉及产生具有新颖特性的植物的方法，具体地说，本发明涉及产生耐盐性和/或耐渗透性植物的方法，该植物高度地抗恶劣环境的影响。
防止全球变暖的一种有效方法是绿化未开垦的土壤如沙漠或盐积聚的土。为此，一种方法是开发能抗恶劣环境的植物与如灌溉的工程方法结合，对于控制沙漠的侵蚀、促进绿化和防止全球变暖起重要作用。
盐积聚会引起以下损害作用(1)积聚的盐降低土壤中的水位从而阻止植物汲取水分；(2)吸收入(渗透入)植物的盐会干扰其代谢作用；(3)盐抑制植物为生长而对其它必需离子的吸收(Sato，F.，PlantCell Engineering，Supplement，“Environmental Problems andPhytobiotechnology”，pp.33-39，1994)。尤其是抑制对水的吸收而导致植物损失膨胀压并关闭气孔。于是，光合作用受破坏且生长严重受抑制。
植物逐渐形成各种机制以使自身适应这类环境。在一个简单的适应模型中，植物细胞以某种方式维持细胞内外的渗压差，并通过吸收水来恢复膨压。例如嗜盐细菌(halobacteria)，虽然不是植物，但可通过存储盐来保持细胞内外的渗压平衡。不过此时，它难于使自身适应环境(渗透压的)变化，因为要求胞内代谢酶本身就是耐盐性的。
因此，更好的适应机制是合成称为“相容性溶质”的专一性化合物以保持如许多耐盐性植物那样依赖于外在渗透变化的胞内渗透。
作为相容性溶质，已知的有如甘氨酸甜菜碱(glycinebetaine)或脯氨酸的双极性化合物和多元醇如蒎立醇、山梨醇或甘露醇。这些化合物的特征在于分子量低、水溶性高、代谢能力低、对代谢作用无影响等等，故适于渗透调节。
其中值得一提的是发现于植物和细菌中作为相容性溶质的甘氨酸甜菜碱(此后文中称为甜菜碱)，这些植物和细菌可适应盐积聚和/或缺水的环境。甜菜碱被认为是发现于如藜科、禾本科、茄科的高等植物中，以及蓝细菌(cyanobacteria)、大肠杆菌(Escherichia coli)等等(例如参见Rhodes，D.and Hanson，A.D.，Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.44357-3584，1993)中的相容性溶质。甜菜碱是一种渗透防护性物质，它能保持与环境的渗透平衡(Robinson，S.P.and Jones，G.P.，Aust.J.Plant Physiol.13659-668，1986)并防止可溶性酶因盐浓度高而引起的离解(Gabbay-Azaria et al.，Arch.Biochem.Biophys，264333-339，1988)。此外，甜菜碱能通过稳定光合释氧复合体中的相邻蛋白质和锰聚簇而保护光系统II复合体以抗高的盐浓度(例如，参见Murata etal.，FEBS Lett.296187-189，1992)。
在大肠杆菌和菠菜(Spinacia oleracea)中，甜菜碱是通过示于

图1中的两步氧化作用而从胆碱由生物合成的。大肠杆菌含两种脱氢酶其一是膜结合的依赖于氧的胆碱脱氢酶，它将胆碱氧化成甜菜醛(Landfald，B.and Strom，A.，J.Bacteriol.165849-855，1986)；其二是可溶性、依赖于NAD的甜菜醛脱氢酶，它将甜菜醛氧化成甜菜碱(Falkenberg，P.and Strom，A.R.，Biochim.Biophys.Acta.1034253-259，1990)。据报道，在高等植物中，甜菜碱是通过类似于大肠杆菌中的途径而合成于叶绿体中。在菠菜(Spinacia oleracea)中，氧化作用的第一步受依赖于铁氧还蛋白的胆碱单加氧酶催化(Brouquisse，R.etal.，Plant Physiol.90322-329，1989)，且业已分离出催化该氧化作用的第二步、依赖于NAD的甜菜醛脱氢酶(Weretilnyk，E.A.etal.，Planta.178342-352，1989)。已发现这些植物可提高这两种酶的活性，从而提高盐作用(salt stress)下甜菜碱的量(例如参见Hanson，A.D.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.823678-3682，1985)。
另外，得自革兰氏阳性土壤细菌球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)的胆碱氧化酶能在一步氧化反应中将胆碱氧化成甜菜碱(Ikuta，S.et al.，J.Biochem.821741-1749，1977)。
人们已试图通过将发现于大肠杆菌和高等植物中的这两种基因或胆碱氧化酶基因整合到植物中使之稳定表达这些基因而赋与植物耐盐性(例如参见Nomura M.et al.，Plant Physiol，107703-708，1995)。然而，在通过将这类基因整合到植物、尤其是高等植物中以稳定地表达它们而获得耐盐性和/或耐渗透性植物方面，迄今尚未取得成功。
胆碱氧化酶可商购，但它的氨基酸序列尚未被测定。因此，强烈需要测定编码可有效地将胆碱转变成甜菜碱的胆碱氧化酶的基因序列，并将它整合到植物中以使之稳定地表达所述序列，从而产生可耐环境(渗透性)变化如高的盐浓度的植物。
在深入研究该如何解决上述问题之后，本发明人成功地分离出一种编码胆碱氧化酶的新型基因(The Japanese Society of PlantPhysiologist，Annual meeting of 1994，the 34th Symposium held March28-30，1994)，并将其整合入蓝细菌，芥属(brassicaceous)植物和禾本科植物以获得耐盐性和/或耐渗透性植物。
因此，本发明提供一种产生耐盐性和/或耐渗透性植物的方法，它包括用携带编码胆碱氧化酶的基因的重组载体转化植物的步骤，还提供依所述方法获得的耐盐性和/或耐渗透性植物。
对图的简要描述图1表示从胆碱至甜菜碱的氧化过程。
图2A表示转化聚球蓝细菌(Synechococcus)PCC7942用的构建体。PAM是指用pAM1044转化的聚球蓝细菌PCC7942，而PAM COD是指用携带cod A基因的pAM1044转化的聚球蓝细菌PCC7942。虚划箭头指示用于PCR的引物。三角形表示conII启动子。箭头指示基因的取向。
图2B表示SDS-PAGE(电泳照片)，它示出染色体被耐壮观霉素的基因和聚球蓝细菌PCC7942的DNA中的cod A基因彻底置换。a栏λ-HindIII/φx174-HaeIII片段；b栏聚球蓝细菌PCC7942的野生型菌株；c栏菌株PAM；d栏和e栏菌株PAMCOD(b、c和d栏示出应用引物1和2的PCR结果，而e栏显示应用引物1和3的PCR结果)。
图3表示Western印迹分析(电泳照片)，示出在聚球蓝细菌菌株PAM和PAMCOD中表达胆碱氧化酶。a栏得自菌株PAMCOD的蛋白质提取物；b栏得自菌株PAM的蛋白质提取物；c栏纯化了的胆碱氧化酶。
图4示出NaCl对生长的影响，它显示了在0.4M NaCl的存在下，聚球蓝细菌菌株PAM(○)和PAMCOD(●)的生长情况。为了对比，还给出了在不含NaCl的培养基上培养的聚球蓝细菌菌株PAM(Δ)和PAMCOD(▲)的生长情况。
图5示出山梨醇对生长的影响，它显示了在0.8M山梨醇的存在下，聚球蓝细菌菌株PAM(○)和PAMCOD(●)的生长情况。为了对比，还给出了在不含山梨醇的培养基上培养的聚球蓝细菌菌株PAM(Δ)和PAMCOD(▲)的生长情况。
图6示出NaCl对叶绿素含量的影响，它显示了在0.4M NaCl的存在下，聚球蓝细菌菌株PAM(○)和PAMCOD(●)的叶绿素含量。
图7示出山梨醇对叶绿素含量的影响，它显示了在0.8M山梨醇的存在下，聚球蓝细菌菌株PAM(○)和PAMCOD(●)的叶绿素含量。
图8示出NaCl对光合活性的影响，它显示了在0.4M NaCl的存在下，从聚球蓝细菌菌株PAM(○)和PAMCOD(●)放出的氧量。
图9示出codA基因的限制酶图的示意图。
图10示出用于转化拟南芥属的双元载体质粒pGAH/cod A的结构示意图。
图11示出对于拟南芥属的野生型和转化体植物的可溶性部分中胆碱氧化酶的Western印迹分析(电泳照片)。1栏得自商品化球形节杆菌的胆碱氧化酶(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO，USA)；2栏野生型植物的可溶性部分；3栏转化体植物的可溶性部分。
图12示出NaCl对拟南芥属生长的影响。它显示在60mM NaCl存在下的野生型(A)和转化体C1-0(B)植物(显示有机体形态的照片)。
图13示出山梨醇对拟南芥属生长的影响。它显示在100、200和400mM山梨醇存在下的野生型(W)和转化体(T)植物(显示有机体形态的照片)。
图14示出盐作用对野生型和转化体植物(拟南芥属)叶子中光合作用系统II的影响。○在光亮条件下温育的野生型植物；●在光亮条件下温育的转化体植物；Δ在暗处温育的野生型植物；▲在暗处温育的转化体植物。每组数据表示标准偏差为±5％的三次试验的平均值。
图15示出用于转化稻的两种嵌合codA基因即35SINTPcodA和35SINcodA的结构。
图16示出的NMR谱图表示甜菜碱在野生型株、不表达codA基因的转化体(A)和表达codA基因的转化体(B)的稻类植物中的积累。图中GB和Ch分别表示相应于甜菜碱和胆碱的峰。
图17示出盐作用对野生型和转化体稻类植物的光合系统II活性的影响。
本发明的最佳实施方案本发明中所用编码胆碱氧化酶的基因是这种基因它编码能在一步反应中将胆碱转化成甜菜碱的蛋白质，它可得自革兰氏阳性土壤细菌节杆菌属。例如，它可优选得自球形节杆菌和滋养节杆菌(Arthrobacterpascens)，特别是球形节杆菌。
本发明人成功地克隆化得自球形节杆菌、编码胆碱氧化酶的codA基因并测定了它的核苷酸序列。该codA基因含有1641bp的开放读框，它编码547个氨基酸。codA基因的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No.1所示。
植物可用这种与合适的载体结合的胆碱氧化酶-编码基因转化。于是，通过在这些载体中引入合适的启动子或表达特性的序列，可在植物中表达该基因。
具有由编码序列表中SEQ ID No.1的氨基酸的核苷酸序列的添加、缺失或取代而产生的核苷酸序列的任意基因或其一部分可用作本发明的基因，只要它能编码显示胆碱氧化酶活性的多肽。
依本发明的方法，可赋与从蓝细菌至高等植物的大量植物以耐盐性和/或耐渗透性。蓝细菌被广泛地用作高等植物的有机体模型，因为它们与高等植物具有大致相同的光合机制，且它们易于在短时间内转化而给出结果。一些转化体型蓝细菌容易在其细胞中整合外源DNA而引起有效的重组。这类蓝细菌包括聚球蓝细菌PCC7942、聚球蓝细菌PCC6301(ATCC27144)和集胞蓝细菌PCC6803(ATCC27184)(Protein，Nucleic Acid，Enzyme，Vol.35，No.14，pp.2542-2551，1991；Crit.Rev.Microbiol.Vol.13，No.1，pp.111-132，1985)。
高等植物包括双子叶植物和单子叶植物。下述实施例中，高度耐盐性和/或耐渗透性植物可得自作为双子叶植物的芥属植物，但它不是限制性的，也可以用其它科和属的双子叶植物。本发明的方法也适合于单子叶植物。已发现原来缺乏甜菜碱合成能力的单子叶植物稻类可获得这种能力，于是用依本发明的方法转化后可获得耐盐性。
可根据待转化的植物性质来恰当地选择有待与编码胆碱氧化酶的基因结合的载体和转化方法，以及选择转化体植物原料。
例如，如pUC303的质粒可用于蓝细菌。这样，可通过插入这些质粒的抗生素抗性基因来选择具有所需性能的转化体。本发明通过用得自球形节杆菌的编码胆碱氧化酶的codA基因来转化蓝细菌聚球蓝细菌PCC7942，从而成功地获得可稳定地显示耐盐性和/或耐渗透性的植物。
如果将用codA基因转化的聚球蓝细菌PCC 7942置于补充氯化胆碱的培养基上培养，则发现聚球蓝细菌吸收了外源性供给的胆碱并将其转化为甜菜碱。鉴于该报道，即在数种耐盐性细菌中由盐作用引起胆碱迁移，导致积累更高含量的甜菜碱(Kaenjak，A.et al.，J.Bacteriol.1752400-2406，1993)，通过用不同浓度的NaCl处理由本发明产生的聚球蓝细菌转化体，测定盐作用对甜菜碱积聚的影响。但是，并未明显观察到NaCl浓度对甜菜碱积聚的影响，表明聚球蓝细菌中吸收胆碱用的转运蛋白并非专一性地由盐作用引起的。
据报道，甜菜碱不但起渗透防护剂作用，还在光自养生物中起重要的保护光合机制作用(Murata，N.et al，FEBS Lett.296187-189，1992)。将依本发明转化的聚球蓝细菌在高浓度NaCl或山梨醇的存在下培养以检验其生长情况、叶绿素含量和光合活性。结果发现，在高浓度的盐或山梨醇存在下，聚球蓝细菌转化体生长良好，叶绿素含量和光合活性也显示类似的结果，而对照物非转化体中的生长情况、叶绿素含量和光合活性均受到抑制。这些结果说明，依本发明的方法用编码胆碱氧化酶的基因转化的聚球蓝细菌被赋与良好的耐盐性和耐渗透性。
双子叶植物可通过引入基因的技术用原生质体或组织的一部分进行转化。至于应用组织片段的基因引入，可采用得自土壤杆菌属(Agrobacterium)的Ti质粒。可以用带原生质体的土壤杆菌来感染有愈伤组织的植物组织片段，其中的原生质体中整合有编码胆碱氧化酶的基因；通过对抗生素如卡那霉素的抗性进行选择，然后在茎干中分化而得转化体植物。
在本发明中，如下所示通过用编码胆碱氧化酶的基因来转化芥属植物拟南芥而得到耐盐性和/或耐渗透性植物。
制备携带codA基因的双元载体质粒pGAH-codA，并整合到携带Ti质粒的复盆子土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA101中。用所得整合有codA基因的土壤杆菌EHA101(pGAH/codA)感染拟南芥的下胚轴愈伤组织，然后形成枝，通过对卡那霉素和潮霉素的抗性进行选择，以产生根并形成籽。将得自所述杂合T2籽的植物进行自花受精而得纯合的T3个体，将其播种后形成转化体植物。这些转化体植物表明，胆碱氧化酶已被转运至叶绿体。即使在高浓度的氯化钠或山梨醇存在下，这种转化体植物也生长良好。
可用在质粒pUC119上制备的两种嵌合codA基因转化单子叶植物稻(稻属sativa L.cv.Nippon bare)，这些基因在花椰菜花叶病毒35S启动子转录控制下翻译后被定位于胞质溶胶或质体上。这两种嵌合基因在5′非翻译序列中包含得自稻的内含子以增强表达。
可用如下方法产生转化体稻，即可这样获得转化体植物用基因枪装置将所述嵌合codA基因与选择标记即潮霉素抗性基因一起引入得自稻籽盾片愈伤组织的悬浮培养细胞，然后基于对抗生素的抗性选择已转化的愈伤组织，并将它们再分化成植物。
虽然野生型稻缺乏合成甜菜碱的能力，但用本发明的方法转化过的稻获得了合成甜菜碱的能力。表达codA基因的转化体稻与未转化的植物生长得同样好，在耕作和溶液培养这两种条件下未显示任何异常。由此可见，在甜菜碱的合成中形成的产物过氧化氢已于细胞中被有效地解毒。
此外，培养于含NaCl的水中的转化体的耐盐性试验表明，转化体中光合活性的抑制比在野生型中观测到的慢。这是首例通过基因工程方法使稻获得合成甜菜碱的能力。
这些结果表明，用携带编码胆碱氧化酶的基因的重组载体转化的各种植物具有极好的耐盐性。
依本发明，可获得高度耐恶劣环境的耐盐性和/或耐渗透性转化体植物。可依本发明的方法赋与耐盐性和/或耐渗透性的植物范围很广，可以从蓝细菌到高等植物。特别是，本发明系首例从包括大部分主要作物在内的单子叶植物而得到耐盐性和/或耐渗透性植物，并有望在很广的范围内应用。
下述实施例进一步详细地阐述本发明，但并不是要限制本发明的范围。
实施例实施例1用codA基因转化蓝细菌聚球蓝细菌PCC7942(1)codA基因的克隆化依the Abstracts of Oral Reports in the abstracts，the 34th annualmeeting of the Japanese Society of Plant Physiologists，1994中描述的方法从球形节杆菌分离胆碱氧化酶基因。简言之，1)用溴化氰分裂胆碱氧化酶，2)测定合适的片段的N端氨基酸序列，3)从所述部分氨基酸序列中选择合适的部分来合成其对应的寡核苷酸，4)利用这些寡核苷酸作引物通过PCR(聚合酶链式反应)扩增胆碱氧化酶基因的部分序列，5)将胆碱氧化酶基因已扩增的部分序列用作探针来筛选球形节杆菌的基因组DNA文库。
将如此得到的阳性克隆亚克隆至质粒pBluescript(SK+)(Stratagene)以分离阳性克隆，再对阳性克隆进行Southern印迹分析。把一个与所述探针杂交的3.6kbp XbaI-XhoI片段亚克隆至pBluescript中并用限制酶作图。测定从第一个SalI位点至XhoI位点的区域(约2.5kbp)的核苷酸序列。
结果表明，胆碱氧化酶基因含有编码547个氨基酸残基的多肽的1641bp开放读框。编码胆碱氧化酶的基因的氨基酸序列和核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.1所示。
(2)用codA基因转化聚球蓝细菌PCC7942将携带codA基因的质粒pBluescript用BstEII(离翻译起始的位置为-40)限制酶和SmaI(终止密码子的下游)限制酶进行消化。用Klenow片段(Takara，Tokyo，Japan)补平BstEII粘端。把含codA基因的编码区和推定的核糖体结合位点的平端片段插入质粒pAM1044的SmaI位点。由限制酶切分析确证基因的正确取向，认为是在pAM1044的conII启动子的控制下表达的。conII启动子是大肠杆菌的启动子的共有序列，它含有碱基序列TTGGACA(-35)和TATAAT(-10)。
采用Elhai et al.的方法，用质粒pAM1044和含codA基因的质粒来转化聚球蓝细菌PCC7942。将所得转化体称为PAMCOD株。只用pAM1044转化的聚球蓝细菌PCC7942用作对照物并被称为PAM株。
在含30μg/ml壮观霉素的BG11琼脂板上选择转化体。将单个菌落接种到含壮观霉素的新鲜BG11板上数次之后，用图2A中指示的引物通过PCR(聚合酶链式反应)确证壮观霉素抗性基因和codA基因已完全插入所有染色体拷贝中。用引物1和2的组合通过PCR证实壮观霉素抗性基因和codA基因已完全插入聚球蓝细菌的染色体中。
实施例2对插入转化体中的基因的确证将得自聚球蓝细菌PCC7942的野生型株、PAM株和PAMCOD株的DNAs用作PCR的模板，并用SDS-PAGE分析扩增后的产物，结果如图2B中所示。
对得自野生型株的DNA进行的PCR显示约400bp的扩增产物(图2B，b栏)。得自PAM株的DNA用作模板时，则出现约2.4kb的条带，表示pAM1044插入染色体中。发现野生型株缺少约400bp的条带，证实天然染色体全部被PAM株内的突变染色体置换了。
得自PAMCOD株的DNA用作模板时，未观察到相应于野生型染色体的条带(图2B，c栏)。但是，约4.1kb的预期条带也未被扩增，可能是由于插入片段体积大和codA序列中的GC含量高的缘故。因此，将相当于codA基因的编码区的引物3(图2A)与引物1组合应用。约2.6kb的预期条带被扩增了(图2B，d栏)，表明PAMCOD株的染色体内存在codA基因。
实施例3在聚球蓝细菌PAMCOD株内表达codA基因通过Western印迹分析检验实施例1中所得PAMCOD株内codA基因的表达，其中应用抗纯化后胆碱氧化酶的多克隆抗血清。结果示于图3。在位置60kDa处检出得自PAMCOD株(a栏)和纯化后的胆碱氧化酶(c栏)的蛋白质提取物中有信号。而在得自PAM株(b栏)的蛋白质提取物中未检出这种信号。结果证实，在聚球蓝细菌PCC7942内，于conII启动子的控制下表达了codA基因。
实施例4细胞内甜菜碱浓度的分析转化后的细胞生长于添加5mM氯化胆碱的一升BG11培养基中。加入不同浓度的NaCl构成盐作用。在25℃下用1M H2SO4处理收获的细胞达20小时，并利用高碘酸盐沉淀技术(Wall，J.S.etal.，Analyt.Chem.32870-874，1960)从混合物中回收甜菜碱。将甜菜碱高碘酸盐溶于1ml甲醇-d4(Wako Pure Chemical Industries，Osaka，Japan)，其中含有作内标的2mM 2-甲基-2-丙醇(Wako PureChemical Industries)。该溶液被转入NMR管，并用Bruker AMX360Wb测定1H-NMR光谱。通过与标准曲线比较积分峰来定量甜菜碱。
基于从负染细胞的电子显微照片估测的细胞体积，测定PAMCOD株细胞内的甜菜碱浓度。单个细胞的细胞质为圆柱形，它长2.14μm、直径为0.82μm，且估测的细胞体积约为1.13μm3。
下列表1示出随着培养基中NaCl浓度的增大，细胞中甜菜碱浓度的变化情况。在没有codA基因的PAM株内未检测出甚至微量的甜菜碱。PAMCOD株细胞内的甜菜碱浓度范围为60-90mM。NaCl浓度未显著影响PAMCOD株细胞内甜菜碱的积聚。
表1NaCl(M) PAM(mM) PAMCOD(mM)00 67±30.2 0 73±40.3 0 86±2实施例5聚球蓝细菌PAMCOD株对盐作用和渗透作用的耐受性通过测定细胞生长情况、叶绿素含量和光合活性来估测细胞对盐作用和渗透作用的耐受性。聚球蓝细胞PAM株和PAMCOD株的细胞预先在添加有1mM氯化胆碱的BG11培养基中于30℃培养3天，然后将培养物转入添加有1mM氯化胆碱、其中含0.4M NaCl或0.8M山梨醇的BG11培养基。利用730nm处的光密度监测细胞的生长。用Arnon et al.描述的方法(Biochim.Biophys，Acta.357231-245，1974)测定叶绿素含量。用Clark型氧电极、以1mM1，4-苯醌和1mM K3Fe(CN)6为电子受体通过监测氧浓度而测定光合的氧放出量。以在不含NaCl的培养基上培养的同样细胞为对照物。
在NaCl存在下细胞生长试验的结果如图4所示，而在山梨醇存在下细胞生长试验的结果示于图5。PAM株的生长受到高的盐作用和渗透作用的抑制，但PAMCOD株却能在这些条件下生长。
在NaCl存在下叶绿素含量测试结果示于图6，而在山梨醇存在下叶绿素含量测试结果如图7所示。这些测试结果类似于细胞生长试验的结果。用高浓度的盐处理后的PAM株内叶绿素含量逐渐降低，而用0.8M山梨醇处理过的PAM株内叶绿素的含量迅速降低；反之，即使用盐或山梨醇处理后，PAMCOD株也能继续生长。
在NaCl存在下光合活性的测试结果如图8中所示。PAM株的光合活性严重地受盐作用的抑制。反之，PAMCOD株细胞的光合活性在盐处理的初始阶段暂时受抑制，但随后恢复并继续升高。在山梨醇存在下测得类似的光合活性结果。有趣的是，用0.8M山梨醇处理PAMCOD株细胞时，未观察到光合活性的暂时降低。
实施例6制备携带codA基因的双元载体质粒用5′CTGTCTAGATGTAATTAACAATGGCT3′和5′CCACATATGCATGCATTGCACTCT3′作引物，通过PCR对得自烟草(Nicotiana sylvestris)的rbcS(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基)转运信号XbaI-NdeI片段(约200bp)进行扩增以引入XbaI位点和NdeI位点。
然后，用5′AACCATATGCACATCGACAACATC3′和5′GCTCCATCCAGCGGTCCAGC3′作引物，通过PCR对codA基因的N端-BamHI片段(约100bp)进行扩增以引入NdeI位点。用限制酶制备codA基因的BamHI-SmaI片段(约1.6kbp)。进一步地，用5′GAAACAGTCCTGCTTCCACAC3′和5′GCG AG C TCTGCCTACACCGCCAT3′作引物通过PCR对codA基因的SmaI-C端片段(约80bp)进行扩增以引入SacI位点。
用这些片段置换双元载体质粒pBI221中的GUS(β-葡糖醛酸酶)基因。
codA基因的限制酶图示于图9。
将含35S启动子和花椰菜花叶病毒的NOS(胭脂氨酸合酶(nopalin synthase))终止子的HindIII-EcoRI片段引入双元载体质粒pGAH以制备质粒pGAH/codA(图10)。该质粒含抗卡那霉素和潮霉素的基因。
实施例7将双元载体质粒引入土壤杆菌将携带Ti质粒的复盆子土壤杆菌EHA101与实施例6中制得的双元载体质粒pGAH/codA混合，然后冷冻并融化，在含有四环素和卡那霉素的LB板上筛选。将所得其中整合了codA基因的土壤杆菌称为EHA101(pGAH/codA)。
实施例8拟南芥的转化让拟南芥WS株发芽以制备下胚轴片段。将该下胚轴用B5培养基(ICN Biochemicals)(pH5.7)，该培养基中含0.05mg/l的细胞分裂素(Wako Pure Chemical Industries)和0.5mg/l的2，4-D(Wako Pure Chemical Industries)进行愈伤组织化，以形成下胚轴愈伤组织。
然后，用实施例7中制备的含codA的土壤杆菌EHA101(pGAH/codA)感染该愈伤组织并共培养。用含250mg/l万古霉素、500mg/l羧苄青霉素和200mg/l头孢氨噻的B5培养基对土壤杆菌解毒之后，将培养物转入分化培养基(含25mg/l卡那霉素和15mg/l潮霉素的B5培养基)以形成分枝。然后，选择抗卡那霉素和潮霉素的枝以引入根并形成籽。只对所得T2籽的染色体之一进行杂合的转化。
然后，使得自T2籽的植物自花受精并通过卡那霉素和潮霉素选择而得纯合的T3籽。
让野生型株和转化体株的植物于22℃下在含0.1％HYPONEX(Hyponex Corporation，Marysville，OH，USA)的培养基(pH5.2)中生长30天，培养基基于水或由蛭石和珍珠岩组成的土壤，除非另有说明，一天的16小时照明度为75μmol·m-2·S-1而其余8小时是在暗室中；然后用于实验。
实施例9对已表达的胆碱氧化酶的免疫研究依本发明人在文献中描述过的方法(Deshniumn，P.etal.，Plant Mol.Biol.29897-907，1995)产生抗胆碱氧化酶的抗体。
将拟南芥的野生型和转化体株20天龄植物叶在0℃下置于微量离心机中旋转摩擦，匀浆物在10,000xg下离心10分钟以制备可溶性级分。用SDS-PAGE分离上清液的可溶性蛋白质后转入尼龙膜(Immobilon PVDF；Millipore，Bedford，MA，USA)。将膜与抗胆碱氧化酶的抗体一起温育，再用由生物素化次级抗体、亲和素和生物素化辣根过氧化物酶(ABC Kit；Vectastain，Burlingane，CA，USA)组成的系统检测。
Western印迹分析结果示于图11。验明存在相应于胆碱氧化酶的64kDa免疫应答蛋白。还观察到少量相应于胆碱氧化酶前体的70kDa蛋白质和rbcS转运肽。这些结果表明，codA基因在染色体中已被正确地整合和表达，且已表达的前体被加工成成熟蛋白质。
然后，依文献中所述方法(Mustardy，L.et al.，Plant Physiol.94334-340，1990)用抗胆碱氧化酶的抗体检测了已在植物中表达的胆碱氧化酶的定位。用1％戊二醛的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)固定植物的小片嫩叶达1小时。用相同的缓冲液漂洗后，样品用乙醇脱水，置于Lowicryl K4M树脂(TAAB LaboratoriesEquipment Ltd.Berkshire，U.K.)内。按文献中所述方法(Mustardy et al.，supra)进行免疫金标记。
结果发现，已表达的胆碱氧化酶被定位于叶绿体的基质内，表明胆碱氧化酶已被转运至叶绿体中。
实施例10转化体植物中甜菜碱和叶绿素含量的测定通过测定季铵化合物的NMR谱(Wall，J.et al.，Analyt.Chem.32870-874，1960)而计算植物叶中甜菜碱的含量。在液氮中用陶瓷磨机(motor)将5g野生型株和转化体植物的叶子磨成粉，使粉末悬浮于25ml 1.0M H2SO4并在25℃下保温2小时。除去不溶性物质后，在1000xg下离心10分钟以回收上清液。将上清液与10ml KI-I2溶液混合并在0℃下保温2小时。在1000xg下离心30分钟回收甜菜碱和胆碱的高碘化物加合物，再溶于0.5mlCD4OH(Wako Pure Chemical Industries)(含有作内标的0.5mM 2-甲基-2-丙醇(Wako Pure Chemical Industries))而测定1HNMR谱。观测到对应于甜菜碱和胆碱的两个主要峰，其中的甜菜碱积分峰用于测定其浓度。
通过下列方法测定叶内叶绿素的含量在液氮中用陶瓷磨机将叶(1g)磨成粉，让粉末悬浮于10ml丙酮∶水(4∶1，v/v)。保温30分钟后，除去不溶性物质，对上清液进行分光光度测定(Arnon，D.I.Plant Physiol.241-15，1949)。
结果发现，转化体植物中含甜菜碱和胆碱，而野生型株内只测出胆碱。甜菜碱含量为1.0μmol/g鲜叶，叶绿素含量为0.3μmol/g鲜叶。
实施例11拟南芥转化体对盐作用和渗透作用的耐受性(1)对盐作用的耐受性将得自实施例8的T3籽接种于用0.5％gellan gum凝胶化的Murashige & Skoog′s培养基上，比较子叶的发芽、生根和生长。在不含NaCl的培养基上，野生型株和转化体植物之间未发现任何差异。但是，在含60mM氯化钠的培养基上，与长势较差的野生型株相比，转化体植物之一C1-0相对地长势良好而显示出耐盐性(图12)。
在含100mM氯化钠的培养基上，野生型株在发芽10天后便停止生长，且它的叶子变白。然而，转化体植物继续生长同时保持绿色。尤其是转化体植物的根长势显著优于野生型株的根。在不含100mM氯化钠的对照试验中，野生型株和转化体株植物的长势相当，证实转化体植物已获得在盐作用条件下生长的能力。
(2)对渗透作用的耐受性对野生型株和转化体植物的籽灭菌后接种于含100、200和400mM山梨醇的半固态培养基上。将培养物置于22℃下的恒温箱中，一天中的16小时保持75μmol/m2/秒的照明度，而其余8小时是在暗室中；并定期观察。第15天的状态示于图13(左边的W表示野生型株而右边的T表示转化体植物)。当山梨醇浓度为100mM时，一些野生型株未发芽，或者即使它们发芽了，其叶子也变白。然而，转化体植物继续生长并保持绿色。在200mM的浓度下，两种株的生长均受抑制，但转化体植物的受抑制程度低于野生型株，尤其是转化体植物根的长势显著优于野生型株。在400mM的浓度下，野生型株不发芽，而转化体植物也未发芽，或者即使它们发芽了，也极少生长。
实施例12在盐作用下转化体植物的光合活性通过监测叶绿素的荧光来测定盐作用对成熟叶子光合系统II活性的影响。
将生长于对照培养基上的野生型株和转化体株植物转至含400mM氯化钠的HYPONEX培养基，并在上述光亮或黑暗条件下温育。在一定的时间后，从植物上摘下叶子，采用脉冲强度调制荧光计(PAM-2000；Walts，Effeltrich，Germany)测定光合系统II的效率并以叶绿素荧光变量与叶绿素荧光极大值的比(Fv/Fm)表示(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42313-349.1991)。
结果示于图14。在光亮条件下温育2天后，野生型株几乎丧失光合系统II活性，而转化体植物维持其光合系统II活性初始值的50％。在黑暗条件下，盐作用引起的失活作用要缓和得多，但转化体植物的光合系统II活性对盐作用的耐受性比野生型株更高。当植物被转至含200mM氯化钠的培养基时，光合系统II活性的降低比在含400mM氯化钠的培养基上时所观察到的要缓和得多，但转化体植物对盐作用的耐受性也比野生型株更高。
实施例13用于转化稻的嵌合codA基因的制备按实施例6中所述方法，在花椰菜花叶病毒35S启动子的转录控制下翻译得自球形节杆菌的胆碱氧化酶基因(codA)之后，于质粒pUC119上制得分别定位于胞质溶胶和质体上的两种嵌合codA基因(分别称为35SIN cod A和35SINTPcodA)(参见图15)。考虑到要求存在内含子以高表达稻内基因(例如参见Tanaka，A.et.al.Nucleic Acids Res.186767-6770，1990)，将稻的超氧化物歧化酶基因中5′非翻译序列内的内含子(SodCc2Sakamoto，A.et al.，FEBS Lett.35862-66，1995)引入这二种嵌合基因。进一步地，将得自豌豆rbc S转运肽的DNA序列(Coruzz，G.et al.，EMBO J 31671-1679，1984)加入35SINTPcodA，以将codA蛋白质转入叶绿体。
实施例14稻的转化将实施例13中制备的两种嵌合codA基因中的每种和潮霉素抗性基因这种选择标记一起用基因枪装置引入得自稻籽的盾片愈伤组织的悬浮培养细胞。基于对抗生素的抗性选择已转化的愈伤组织并再分化成植物。对已转化的愈伤组织或显示潮霉素抗性的已转化/再分化了的个体进行聚合酶链式反应(PCR)，用Northern印迹技术估测该codA基因整合和转录入核基因组的情况，并对每个codA基因选择80-100或更多个转化体。
实施例15codA基因在转化体稻内的表达分析利用Western印迹技术筛选实施例14中获得的转化体而得在蛋白质水平表达codA基因的转化体稻(本代)，最终包括6个携带质体定位化基因的个体和10个携带胞质溶胶定位化基因的个体。
稻缺乏内在胆碱氧化酶活性，但从转化体的叶或根制得的可溶性部分显示出胆碱氧化酶活性。与预料的相反，尽管是用相同的表达启动子，但发现所有的质体型转化体个体表达胆碱氧化酶蛋白质的量比胞质溶胶型更少。
当进一步用Northern印迹技术检验codA基因的表达时，未发现在转录水平表达的两种基因的量有什么明显差别。在用逆转录PCR检验内含子的加工时，从转录自质体型基因的mRNA检测出大量含不同的3′-接受位点的剪接变体，它不可能正常翻译成蛋白质。这启示，用质体型基因转化的植物表达的蛋白质量少可能是由于mRNA前体异常加工所致。此现象可能与下列事实有关，即编码用于胆碱氧化酶的质体导向的转运肽的序列是得自双子叶植物(豌豆rbcS基因)。因此，易于预测如果编码转运肽的序列得自如稻rbcS的单子叶植物，则稻叶绿体内codA的表达会更为有效，且所得转化体稻将会更能耐盐作用。
实施例16在转化体稻内生物合成甜菜碱用质子NMR检测表达胆碱氧化酶的转化体组织内甜菜碱的积聚。图16示出野生型株、不表达codA基因的转化体(图16A)和表达codA基因的转化体(图16B)三者的NMR结果。
表达胆碱氧化酶的转化体生物合成甜菜碱，甜菜碱积聚的量与由Western印迹技术测定的胆碱氧化酶的量呈正比关系。叶内积聚的甜菜碱多于根内的测定值，且在高水平表达codA基因的个体内达4μmol/g鲜叶。这是首例通过基因工程方法使稻获得合成甜菜碱的能力。
实施例17估测转化体稻的耐盐性在耕作和溶液培养这两种条件下，表达codA基因的转化体稻与非转化体(野生型)生长得同样好，未显示什么明显异常。这表明，甜菜碱生物合成中形成的副产物过氧化氢在细胞中已被有效地解毒。
然后，在含氯化钠的溶液培养条件下，使可在蛋白质水平表达codA基因、有酶活性和甜菜碱生产能力的转化体生长。用叶绿素荧光分析估测Na盐对光合活性的影响并与非转化体(野生型)的结果比较。将转化体稻和非转化体稻置于含100mM和10mM氯化钠的HYPONEX水溶液之后，测定叶绿素荧光随时间的关系，发现转化体中光合活性的抑制减慢了(图17)。因此，发现转化体更能耐盐环境。〔序列表〕SEQ ID No1序列长度2400序列类型核酸链型双链拓扑结构线型分子类型DNA序列特征特征键缠结肽位置361..2002序列描述GGGAATATCC GTCGTCGTAG ACGAGCCCTT CGGCCCGTGT AAAGGTGGAG ACCTTCCACA 60CCGAGGACGA GGCCGTCGCG ACCGCCAACG ACACCAACTA CGGGCTGTCC GGCGCGGTCC 120TGGACCCAGG ACGCCGGCAA GACGCAGCGC GTGGCCGGCC GGCTGCGACA CGGCACCGTC 180TGGATCAACG ACTTCCACCC CTACCTCCCA CAGACCGAGT GGGGCGGCTT CGGCCAGTCC 240GGCGTCGGCC GCGAACTCGG CCCGACCGGC CTGGCCGAGT ACCAGGAGGC CAAGCACATC 300TACCAGAACA CCAGCCCGCA GGTCACCGGC TGGTTCGCTG ACCACGGCAA GGAGAACTAG 360ATG CAC ATC GAC AAC ATC GAG AAC CTG AGC GAC AGG GAG TTC GAC TAC 408Met His Ile Asp Asn Ile Glu Asn Leu Ser Asp Arg Glu Phe Asp Tyr1 5 10 15ATC GTC GTC GGC GGC GGG TCC GCC GGG GCC GCC GTC GCC GCC CGG CTG 456Ile Val Val Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Arg Leu20 25 30AGC GAG GAT CCC GCA GTG AGC GTG GCG CTG GTG GAG GCC GGC CCG GAT 504Ser Glu Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Val Glu Ala Gly Pro Asp
35 40 45GAC CGC GGC GTG CCC GAG GTG CTG CAG CTG GAC CGC TGG ATG GAG CTG 552Asp Arg Gly Val Pro Glu Val Leu Gln Leu Asp Arg Trp Met Glu Leu50 55 60CTG GAA TCG GGC TAC GAC TGG GAC TAC CCG ATC GAG CCG CAG GAG AAC 600Leu Glu Ser Gly Tyr Asp Trp Asp Tyr Pro Ile Glu Pro Gln Glu Asn65 707580GGC AAC TCC TTC ATG CGC CAT GCC CGT GCC AAG GTC ATG GGC GGC TGC 648Gly Asn Ser Phe Met Arg His Ala Arg Ala Lys Val Met Gly Gly Cys85 9095TCC AGC CAC AAC TCC TGC ATC GCC TTC TGG GCC CCG CGC GAG GAC CTG 696Ser Ser His Asn Ser Cys Ile Ala Phe Trp Ala Pro Arg Glu Asp Leu100 105 110GAC GAG TGG GAG GCC AAG TAC GGC GCC ACC GGC TGG AAC GCC GAG GCG 744Asp Glu Trp Glu Ala Lys Tyr Gly Ala Thr Gly Trp Asn Ala Glu Ala115 120125GCC TGG CCG CTG TAC AAG CGG CTG GAA ACC AAC GAG GAC GCG GGC CCG 792Ala Trp Pro Leu Tyr Lys Arg Leu Glu Thr Asn Glu Asp Ala Gly Pro130 135140GAC GCG CCG CAC CAC GGG GAC TCC GGC CCC GTG CAC CTG ATG AAC GTG 840Asp Ala Pro His His Gly Asp Ser Gly Pro Val His Leu Met Asn Val145 150 155 160CCC CCG AAG GAC CCG ACC GGC GTC GCG CTC CTG GAC GCC TGC GAG CAG 888Pro Pro Lys Asp Pro Thr Gly Val Ala Leu Leu Asp Ala Cys Glu Gln165 170 175GCC GGC ATC CCG CGC GCG AAG TTC AAC ACC GGC ACC ACC GTG GTC AAC 936Ala Gly Ile Pro Arg Ala Lys Phe Asn Thr Gly Thr Thr Val Val Asn180 185 190GGC GCC AAC TTC TTC CAG ATC AAC CGG CGC GCG GAC GGC ACC CGC TCC 984Gly Ala Asn Phe Phe Gln Ile Asn Arg Arg Ala Asp Gly Thr Arg Ser195200 205TCC AGC TCG GTC TCC TAC ATC CAC CCG ATC GTC GAG CAG GAG AAC TTC 1032Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Pro Ile Val Glu Gln Glu Asn Phe210 215 220ACC CTG CTA ACC GGC CTG CGC GCC CGC CAG CTG GTG TTC GAC GCG GAC 1080Thr Leu Leu Thr Gly Leu Arg Ala Arg Gln Leu Val Phe Asp Ala Asp225 230 235 240AGG CGC TGC ACC GGC GTC GAC ATC GTG GAC TCC GCC TTC GGC CGC ACC 1128Arg Arg Cys Thr Gly Val Asp Ile Val Asp Ser Ala Phe Gly Arg Thr245 250 255CAT CGG CTG ACG GCG CGC AAT GAA GTC GTG CTC TCC ACC GGC GCG ATC 1176His Arg Leu Thr Ala Arg Asn Glu Val Val Leu Ser Thr Gly Ala Ile260 265 270GAT ACG CCG AAG CTG TTG ATG CTC TCC GGA ATC GGC CCC GCC GCC CAC 1224Asp Thr Pro Lys Leu Leu Met Leu Ser Gly Ile Gly Pro Ala Ala His275280 285CTC GCC GAG CAC GGC ATC GAG GTC CTT GGT GGA CTC CCC CGG CGT GGG 1272Leu Ala Glu His Gly Ile Glu Val Leu Gly Gly Leu Pro Arg Arg Gly290295 300CGA GCA CCT GCA GGA CCA CCC GGA AGG CGT GGT GCA GTT CGA GGC CAA 1320Arg Ala Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Arg Gly Ala Val Arg Gly Gln305 310 315 320GCA GCC CAT GGT CGC CGA GTC CAC GCA GTG GTG GGA GAT CGG CAT CTT 1368Ala Ala His Gly Arg Arg Val His Ala Val Val Gly Asp Arg His Leu325 330 335CAC CCC CAC CGA GGA CGG CCT GGA CCG CCC CGA CCT GAT GAT GCA CTA 1416His Pro His Arg Gly Arg Pro Gly Pro Pro Arg Pro Asp Asp Ala Leu340 345350CGG CTC CGT GCC GTT CGA CAT GAA CAC CCT GCG GCA CGG CTA CCC CAC 1464Arg Leu Arg Ala Val Arg His Glu His Pro Ala Ala Arg Leu Pro His355 360 365CAC GGA GAA CGG GCT TCA GCC TCA CCC CGA ACG TCA CGC ACG CCC GCT 1512His Gly Glu Arg Ala Ser Ala Ser Pro Arg Thr Ser Arg Thr Pro Ala370 375 380CCC GCG GCA CTG TCC GGC TGC GCA GCC GCG ACT TCC GCG ATA AGC CCA 1560Pro Ala Ala Leu Ser Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ser Ala Ile Ser Pro385390 395 400TGG TCG ACC CGC GCT ACT TCA CCG ACC CAG AAG GGC CAT GAC ATG CGC 1608Trp Ser Thr Arg Ala Thr Ser Pro Thr Gln Lys Gly His Asp Met Arg405 410 415GTC ATG GTC GCC GGC ATC CGC AAG GCC CGC GAA ATC GCC GCC CAG CCC 1656Val Met Val Ala Gly Ile Arg Lys Ala Arg Glu Ile Ala Ala Gln Pro420 425 430GCC ATG GCG GAA TGG ACC GGC CGC GAG CTC TCC CCC GGC GTC GAG GCG 1704Ala Met Ala Glu Trp Thr Gly Arg Glu Leu Ser Pro Gly Val Glu Ala435 440 445CAG ACC GAC GAG GAG CTG CAG GAC TAC ATC CGC AAG ACG CAC AAC ACC 1752Gln Thr Asp Glu Glu Leu Gln Asp Tyr Ile Arg Lys Thr His Asn Thr450 455 460GTC TAC CAC CCC GTG GGC ACC GTG CGC ATG GCC GCG GTC GAG GAC GAG 1800Val Tyr His Pro Val Gly Thr Val Arg Met Gly Ala Val Glu Asp Glu465 470475 480ATG TCC CCG CTC GAC CCC GAG CTG CGG GTC AAG GGC GTC ACC GGT CTG 1848Met Ser Pro Leu Asp Pro Glu Leu Arg Val Lys Gly Val Thr Gly Leu
485 490 495CGC GTC GGC GAC GCC TCG GTC ATG CCC GAG CAC GTG ACC GTC AAC CCC1896Arg Val Gly Asp Ala Ser Val Met Pro Glu His Val Thr Val Asn Pro500 505 510AAC ATC ACC GTC ATG ATG ATC GGC GAG CGC TGC GCG GAC CTT ATC CGC1944Asn Ile Thr Val Met Met Ile Gly Glu Arg Cys Ala Asp Leu Ile Arg515520 525TCC GCC CGC GCC GGT GAA ACA ACG ACG GCG GAC GCC GAG CTG AGC GCG1992Ser Ala Arg Ala Gly Glu Thr Thr Thr Ala Asp Ala Glu Leu Ser Ala530 535 540GCC CTC GCC TAAGCGGGAG CGGCCAGCCG CGGGGCCTGT CCGGAACCAC CTGGCGGGCC 2051Ala Leu Ala545 547CCGCATGGGG CCGGACACAA TGCCGGTAAC TAAGGGTGCG GAAGCAGTCC TGCTTCCACA 2111CCCGCGTTTT GCACGCCCGG GCCGGCAACT GGCCCGGCCG GCTAAGCCGA AGGTCTTCCG 2171GGGGCGGGCC GGATCGCTGC GGGCAGTCCG TCGGCGAGCC GCTGCAGCGT GCCGGCGGTA 2231ATGGCGGTGT AGGCAGGGAT CGCGTCGGGG TAGATGTACT CGTTGCGGGC GTGCGCGCCG 2291TCGCCCACCG CGCCCAGGCC GCACAGGACC GGGATGCCGA GGGCGGAGAC GAAGTTGGCG 2351TCGCTGCCCC CGCCCACCGA GGCGGTTTCC AGCTCCCGGC CCTGCTCCA 2400
权利要求
1.产生耐盐性和/或耐渗透性植物的方法，它包括用携带编码胆碱氧化酶的基因的重组载体转化植物的步骤。
2.权利要求1的方法，其中编码胆碱氧化酶的基因得自土壤细菌节杆菌属。
3.权利要求1或2的方法，其中编码胆碱氧化酶的基因是编码序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的碱基序列，或者是编码SEQ ID No.1的修饰氨基酸序列的核苷酸序列，其中的修饰氨基酸序列是通过添加和/或缺失一个或多个氨基酸序列和/或被其它氨基酸取代而产生的，只要该核苷酸序列能编码具有胆碱氧化酶活性的蛋白质即可。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中的耐盐性和/或耐渗透性植物是蓝细菌。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中的耐盐性和/或耐渗透性植物是高等植物。
6.权利要求5的方法，其中的高等植物是双子叶植物。
7.权利要求6的方法，其中的双子叶植物是芥属植物。
8.权利要求5的方法，其中的高等植物是单子叶植物。
9.权利要求8的方法，其中的单子叶植物是禾本科植物。
10.依权利要求1的方法产生的耐盐性和/或耐渗透性植物，或其具有相同特性的子代。
全文摘要
一种产生耐盐性和/或耐渗透性植物的方法,它包括用携带编码胆碱氧化酶的基因的重组载体转化植物的步骤,以及用所述方法产生的耐盐性和/或耐渗透性植物或其有相同特性的子代。
文档编号C12N9/04GK1182348SQ9619350
公开日1998年5月20日 申请日期1996年3月27日 优先权日1995年3月27日
发明者村田纪夫 申请人:三得利株式会社