特异于呼吸道合胞病毒融合蛋白的高亲和性人单克隆抗体的制作方法

专利名称：：特异于呼吸道合胞病毒融合蛋白的高亲和性人单克隆抗体的制作方法
背景技术：
：呼吸道合胞病毒(RSV)是肺病毒属的Parmixovirus，它常感染上下呼吸道，它的传染性很强以致于大多数两岁左右的孩子曾经被它感染，甚至实质上所有四岁左右的孩子已经对RSV有免疫力。典型地，RSV感染是温和的，它局限于上呼吸道并引起与感冒类似的综合征，不需广泛的治疗。然而对某些受试者而言，如免疫受抑制的个体(如婴儿、老人)或患有潜在的心肺病的病人，此病毒可渗入下呼吸道，从而需要住院治疗以及支持器。在一些这种病例中，RSV感染可导致永久的肺部损害或甚至对生命造成威胁，仅在美国RSV就会导致每年约有90,000人次入院治疗，并导致约4500人死亡。主要依据与吸附糖蛋白G有关的血清学差异将RSV划分为两个主要的毒株亚群A和B。在分离株之间主要的表面糖蛋白，即90KD的G蛋白在氨基酸水平上的差异超过50％，Johnsonetal.Proc.Natl.Acad.Sci.(1987)，84，5625-5629。与之相反，不同RSV毒株的潜在治疗靶70KD融合(F)蛋白是高度保守的，即在氨基酸水平上约有89％相同，Johosonetal，J，Gen，Virol.(1988)，69，2623-2628。Johnsonetal.J.Virol，(1987)，10，3163-3166，P.L.Collins，PlenumPress，NY(1991)，103-162。而且已知抗特定型F-蛋白产生的抗体可以与其他型交叉反应。F-蛋白是由线性前体产生的异二聚体，它分别由48和23KD的二硫键连接的片段组成，Walshetal，J.Gen，Virol，(1985)，66，401-415。通过多克隆抗体抑制合胞体的形成与23KD片段的显著反应有关。正如所指出的，尽管RSV感染通常是温和的，但在一些个体中RSV感染可能会威胁生命。最近通过服用抗病毒剂Ribavarin来治疗严重的RSV感染，然而，尽管Ribavarin对于控制RSV感染有一些效力，但它的使用因几个原因而受到冷遇，例如它很昂贵并且只有在医院才能施用。其他已知的RSV治疗法仅仅治疗RSV感染的综合征，包括给患有气管炎的病人使用烟雾化的支气管扩张药，给患有支气管炎和RSV肺炎的病人使用皮质类固醇疗法。迄今为止，欲加强抗病毒保护性抗体的RSV疫苗很不成功，例如，基于约25年前试验的福尔马林灭活的RSV的疫苗所诱导的抗体在融合抑制活性方面有缺陷，Murphyetal，ClinicalMicrobiology(1988)，26，1595-1597，有时甚至会加重病情。这可以解释为被福尔马林灭活的病毒不具备诱导保护性抗体的能力。当在疫苗受体中检测到高抗体滴度时，特殊的保护性滴度比对照群中的低，这可能是由于被福尔马林灭活的RSV不能显示产生保护性抗体所需的必需构象表位所致。尽管目前还没有已知有效的RSV疫苗，但存在一些临床证据，即对于易感个体而言，抗体疗法可能会赋予抗RSV感染的保护作用，甚至可能会清除现存的RSV感染，例如，已有极道称新生儿严重气管炎的发生率低，假定这归功于保护性母体抗体的存在，Ogilvieetal，J.MedVirol(1981)，7，263-271。而且对再次感染有免疫力的孩子与被再次感染的那些孩子相比，在统计学上显示出较高的抗-F-蛋白滴度。另外，由高滴度RSV-免疫供体制备的静脉内免疫球蛋白(IVIG)可减少鼻内RSV的流出并可改善氧合作用。Hemmingetal，Anti.ViralAgentsandChemotherapy(1987)，31，1882-1886。最新的研究已暗示通过施用富含RSV的免疫球蛋白(RSVIG)可与病毒抵抗并防止肺的损害，Groothuisetal，TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1524-1530，K.McIntosh.TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1572-1573，J.R.Groothuis，AntiviralResearch，(1994)，23，1-10，Siberetal.J.InfectiousDiseases(1994)，169，1368-1373，Siberetal.J.InfectiousDiseases(1992)，165456-463。类似地，一些动物研究暗示含病毒中和抗体的抗体疗法可赋予抗RSV的保护作用，或甚至可清除现存的RSV感染，例如，已报道体外中和的小鼠单克隆抗体可保护小鼠以抗感染，也可清除已确立的RSV感染，Tayloretal.J.Immunology，(1984)，52，137-142，Stottetal.，“ImmuneResponses，VirusInfectionsandDisease，I.R.L.Press，London(1989)，85-104。而且在体外和体内RSV模型中RSVF-蛋白的单克隆抗体显示出高的亲和性。Tempestetal.Bio/Technology，(1991)，9，266-271，Croweetal.，Proc.Natl.Acad.Sci(1994)，91，1386-1390，WalshetalInfectionandImmunity，(1984)，43，756-758，BarbasIII，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci(1992)，89，10164-10168，Walsh.etal.，JGen.Vitol.(1986)，67，505-513。已报道在动物研究中低至520-2000μg/kg体重的抗体浓度可导致几乎立即恢复，Croweetal.Proc，Natl.Acad，Sci.(1994)，91，1386-1390。而且已公开这些单克隆抗体既可中和A株也可中和B株，包括实验室毒株和野生型毒株。或者通过注射，Croothuisetal.TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1524-1530，Siberetal.，J.InfectiousDiseases(1994)，169，1368-1373或者通过烟雾化Croweetal，Proc.Natl.Acad.Sci(1994)，91，1386-1390可施用这些抗体。在以前的文献中已描述了两种不同类型的有潜在治疗作用的RSVF-蛋白单克隆抗体，人源化的鼠抗体在Tempestetal.，Biol.Technology，(1991)9，266-271，或真正的人抗体(Fab片段)在BarbasIII，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)，89，10164-10168。通过将中和交叉毒株的鼠抗-F-蛋白抗体CDR移植到普通的人FC以及可变区部分的结构区域即可产生人源化的鼠抗体，通过组合文库技术可产生人Fab片段，所述技术使用了得自HIV阳性供体(免疫妥协的)的人骨髓细胞。人源化的和人的RSV抗体治疗的活体内滴度分别为5和2mg/kg体重。然而应注意人源化抗体是在合胞体抑制试验中被检测的，而检测人抗-RSVFab片段是为了测定它们的病毒中和活性，因此有关人源化和人抗-RSV抗体的报道结果不能直接相比较。据报道由组合文库技术产生的Fab片段在烟雾化的形式下是有效的，这可能是由于相对小的分子大小。这些结果很能鼓舞人，因为RSV疫苗的主要靶群体是婴儿，因此烟雾剂是十分合乎需要的施用模式。然而，不抵制先前已公开的特异于RSV的人源化和人的Fab片段的有关报道，仍然很需求是有改良的治疗潜力的改良的抗-RSV抗体，尤其是对RSVF蛋白有高亲和性和特异性的抗-RSV抗体，它能有效中和和预防RSV感染。抗体疗法可被次分为两个主要的不同行为(i)使用未受损的不经标记的抗体或经标记的抗体的被动免疫疗法和(ii)使用抗-独特型以重新建立自身免疫的网络平衡的主动免疫疗法。在被动免疫疗法中，施用裸露的抗体以中和抗原或者将效应子功能导向被击靶的膜相关抗原。中和作用可以是中和淋巴因子，激素或敏毒素，即C5a。效应子功能包括补体的结合，巨噬细胞的激活和征集以及依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。已经使用裸露的抗体来治疗白血病，Ritzetal.，S.F.Blood，(1981)，58，141-152，使用GD2的抗体来治疗成神经细胞瘤Schulzetal，CancerRes.(1984)，445914和黑素瘤Irieetal，ProcNatl.Acad.Sci.(1986)，838694。最近在实验性试验中使用了具有高的抗-RSV滴度的静脉内免疫γ球蛋白(IVIG)抗体以治疗由RSV感染引起的呼吸窘迫Hemmingetal，Anti.ViralAgentsandChemotherapy，(1987)，31，1882-1886，Groothuisetal.，TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1524-1530，K.McIntosh，TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1572-1573，J.R.Groothuis、AntiviralResearch，(1994)，23，1-10，Siberetal，J.InfectiousDiseases(1994)，169，1368-1373。单克隆抗体的治疗效力取决于下列因素。包括例如与抗原结合之抗体的量，反应性，特异性和类别，抗体的体内半寿期也是值得注意的治疗因素。可显著影响抗体治疗潜力的另一个因素是它们来源的种，最近，用于免疫疗法的单克隆抗体几乎全部来源于啮齿动物。Schulzetal.CancerRes，(1984)，445914，Milleretal，Blood(1981)。58，78-86，Lanzavecchiaetal，J.Edp.Med.(1988)，167，345-352，Sikoraetal，Br.Med.Bull.(1984)，40240，Tsujisakietal.，CancerResearch(1991)，512599。这大半是由于啮齿动物单克隆抗体的产生使用了被详尽描述和高度有效的技术Khleretal，Nature，(1975)，256495，Galfreetal，Nature，(1977)，266550。然而尽管啮齿动物单克隆抗体具有治疗效力，但它们相对于人抗体而言却存在限制和不利之处，例如，它们经常诱导宿主效应子功能(如CDCC，ADCC等)的亚-最适刺激，鼠抗体也可诱导人抗-鼠抗体(HAMA)反应，Schroffetal，Can，Res，(1985)，45879-885，Shawleretal，J.Lmmunol(1985)，1351530-1535。这可以导致抗体半寿期缩短，Dillmanetal，Mod.(1986)，5，73-84，Milleretal，Blood，(1983)，62988-995，在一些情况下会导致毒性副作用，如血清疾病和过敏症。在一些受试者中，如免疫受重度抑制的受试者(如遭受大剂量化学物质或放射介导的癌症治疗的病人，Irieetal，Proc，Natl.Acad，Sci，(1986)，838694，Dillmanetal，Mod，(1986)，5，73-84，Koprowskietal，Proc.NatlAcad.Sci，(1984)，81216-219)，鼠单克隆抗体的使用会导致受限制的消极副作用。与之相比，对于具有正常或超高活性免疫系统的病人，鼠抗体至少对某些疾病状态的效力受到限制。在排除鼠单克隆抗体的局限性的努力中，已使用重组DNA技术产生嵌合的抗体，Morrisonetal，Proc.Natl，Acad.Sci.(1984)，81216-219，Boulianneetal，Nature，(1984)，312，644-646，通过“CDR移植”产生了人源化抗体，Riechmannetal，Nature(1984)，332，323-327，通过用其他氨基酸取代特异的表面残基以减轻或消除抗原性产生了“虚饰”抗体。然而，尽管这种抗体在临床上已被成功地使用，Gillisetal，J.Immunol，Meth(1989)，25191，但已证实这种抗体的制备很麻烦，这是由于有关最适抗原识别和亲和性需求的认识仍未被完全理解，人构架和小鼠的CDR区域在空间上也常常相互作用，给抗体活性造成消极影响，而且这种抗体有时仍会在病人体内诱导强烈的HAMA反应。人抗体与它们的鼠同类物相比存在很多优点；它们诱导可任意选择的效应子功能，它们不诱导HAMA反应，宿主抗原-特异性的抗体可导致有治疗价值之表位的鉴定，所述表位因太稀少而不能被异种生殖的免疫系统识别，Lennoxetal，“MonoclonalAntibodiesinClinicalMedicine，”LondonAcademicPress(1982)。尽管人抗体很合乎需要，但它们的生产因多种因素而变得复杂，包括伦理学上的考虑，以及常规下用于生产人抗体的方法经常无效这一事实，例如出于伦理学和安全性的考虑，一般不能用多数抗原充分地免疫接种人受试者，结果，有关分离对特殊抗原是有有用的亲和性，≥108摩尔的人单克隆抗体的报道非常少，McCabeetal，CancerResearch，(1988)，48，4348-4353。经证实从供体致敏细胞中分离抗-病毒的人单克隆抗体也不方便，例如，Gorny报道了HIV阳性供体的外周血单核细胞(PMBC)经EBV转化的14329个培养物中只稳定有7个可成为能产生的特异性抗-HIV抗体的细胞系，Gornyetal，Proc.Natl，Acad，Sci(1989)，861624-1628。迄今为止，从癌症患者的外周血淋巴细胞(PBL)Irieetal，Br.J.Cancer，(1981)，44262或肿瘤正在消退的淋巴结淋巴细胞Schlometal，Proc.Natl，Acad.Sci.(1980)，776841-6845，Coteetal，Proc.Natl.Acad.Sci，(1983)，882026-2030中已生产出大多数人抗-肿瘤抗体。然而，这种抗体经常与细胞内的，因而在治疗上没什么用的抗原反应，Hoetal，InHybridomaTechnology，Amsterdam(1988)。37-57，或者为IgM类，McCabeetal，CancerResearch(1988)，48，4348-4353，此类抗体与IgG相比，渗入实体肿瘤的能力较差，很少将这些人抗体搬到临床试验中，Probyskietal，R.C.Transplantation(1991)，51，1190-1196，这暗示着被获救的抗体可能具有亚-最适的特性，而且即然这些方法利用了试验供体致敏的B细胞，那么显然这些细胞不是有用的单克隆抗体获救的最佳来源。最近，通过用CD40刺激以导致人B细胞的扩展Banchereauetal，F.Science(1991)，25170，Zhangetal，J.Immunol.(1990)，144，2955-2960，Tohmaetal，J.Immunol(1991)，1462544-2552，或通过额外的体外加强步骤引发无限增殖化Chaudhurietal，CancerSupplement(1994)，73，1098-1104已经改善了由致敏供体产生人抗体。此原理已被用于使致敏供体的细胞对巨细胞病毒，Epstein-Barr病毒(EBV)和流感嗜血杆菌(Hemophilusinfluenza)产生人单克隆抗体(42-44)，而且产量明显高于用其他方法得到的产量(32)。另外，为了论述供体致敏的限制，已报道了健康供体淋巴细胞的体内免疫和培养，使用致敏供体的PBL细胞的来自于人(exhomine)的加强作用产生人单克隆抗体取得的一些成功已有报道，Maedaetal，Hybridoma(1986)，533-41，Kozboretal，J.Immunol，(1984)，1423，Duchosaletal，Nature.(1992)，355258-262。1967年Mishell和Dutton使用鼠淋巴细胞首次阐明了体外免疫的可行性Mishelletal，J.Exp.Med(1967)，126423-442，1973年，Hoffman成功地免疫了人淋巴细胞Hoffmanetal，Nature(1973)，243408-410。也已报道了外周血(Luzzatietal，J.Exp.Med，(1975)，144573-585，Misitietal，J.Exp.Med.(1981)，1541069-1084，Komatsuetal，Int，Archs.AllergyAppl.Immunol.(1986)，80431-434，Ohlinetal，C.A.K.Immunology(1989)，68325(1989))，扁桃腺(Strikeetal，J.Immunol，(1978)，1321789-1803)和脾[后者得自外伤(Hoetal.InHybridomaTechnology，Amsterdam(1988)，37-57，Boerneretal.J.Immunol.(1991)，14786-95，Hoetal.J.Immunol.(1985)，1353831-3838，Wassermanetal，J.Immunol.Meth.(1986)，93275-283，Wassermanetal.J.ImmunolMeth.(1986)，93275-283，Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas(1993)，4，47-56，Bramsetal，Hum.Antibod.Hydribomas(1993)，4，57-65)和原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者(Boerneretal，J.Immunol.(1991)，14786-95，Bramsetal，Hum，Antibod，Hybridomas(1993)4，47-56，Bramsetal，Hum，Antibod，Hybridomas(1993)，4，57-65，McRobertsetal，“InVitroImmunizationinHybridomaTechnology”，Elsevier，Amsterdam(1988)，267-275，Luetal.P.Hybridoma(1993)，12，381-389)]的淋巴细胞成功的初次免疫接种。体外免疫接种显现出相当多的优点，如易于再现的免疫接种，利用适当的培养和操作技术将其自身很容易地提供给抗体类操作。Chaudhurietal，CancerSupplement(1994)，73，1098-1104，也有证据表明在IVI过程中对自身抗原的体内耐受性较少见Boerneretal，J.Immunol，(1991)，14786-95，Bramsetal，J.Immunol，Methods(1987)，9811。因此，此技术有望可用于产生自身抗原的抗体，所述自身抗原如肿瘤标记物和涉及自身免疫的受体。几个研究小组已报道了对多种仅在体外攻击的抗原，如肿瘤相关抗原(TAA)之反应的产生Boerneretal，J，Immunol，(1991)，14786-95，Borrebaecketal，ProcNatl.Acad.Sci(1988)，853995。然而不幸的是所得抗体典型地为IgM而非IgG亚类，McCabeetal，CancerResearch(1988)，48，4348-4353，Kodaetal，Hum.Antibod，Hybridomas，(1990)，115，仅在有关使用经免疫之供体的淋巴细胞的方案中报道了再次(IgG)应答。因此，显然这些方案仅仅成功地诱导了初次免疫应答，但需要供体经免疫的细胞产生回忆应答。已经开展的研究系统地分析了培养和免疫接种的变化，以开发出一种一般性的方案，能有效地在体外诱导人单克隆抗体Boerner.J.Immunol.(1991)14786-95，Bramsetal.HumAntibodHybridomas(1993)，4，47-56，Luetal，Hybridoma(1993)，12，381-389。这已经导致经原初人脾细胞的IVI诱导，特异于铁蛋白之人单克隆抗体的分离Boerneretal，J.Immunol，(1991)，14786-95。此项研究还导致了一个方案，通过它可在体外从头开始完整地诱导再次(IgG)应答Bramsetal，Hum，Antibod，Hybridomas(1993)，4，57-65。然而，尽管IVI有很大的潜在优势，但由于免疫细胞在培养容器内以单层生长这一事实使得这种方法的效力受到严重限制。与之相比，在免疫应答的活性期，脾脏中发现了具有三维结构的体内生发中心，这些三维结构含有被激活的T-和B-细胞，所述细胞被抗原-呈递细胞包围，大多数免疫学家相信所述抗原呈递细胞可比得上B-细胞抗原-特异性激活的位点。天然脾脏环境的替代物是在免疫妥协的动物宿主，如“重度联合免疫缺损”(SCID)小鼠体内“再造”或模拟脾脏的条件。人淋巴细胞易于被SCID小鼠过继(hu-SCID)并产生高水平的免疫球蛋白Mosieretal，Nature(1988)，335256，McCuneetal，L，Science(1988)，241，1632-1639。而且，如果用于重建的供体已被暴露于特殊的抗原，在这种小鼠体内会产生对相同抗原强烈的再次应答，例如，Duchosal等人，Douchosaletal，Nature(1992)，355258-262报道了得自17年前被破伤风类毒素接种之供体的人外周血B-细胞在SCID环境中可再次被刺激以产生较高的血清水平，即104左右。他们进一步公开了使用λ和M13噬菌体组合文库法Huseetal，R.A.Science(1989)，2461275克隆和表达得自经提取的人细胞的两个人抗-TT抗体的基因。此抗体被报道的抗原亲和性范围为108-109/M，然而此方案需要供体致敏细胞且产量非常低，从370,000个克隆的文库中仅能得到2个克隆。因此，以前hu-SPL-SCID小鼠仅被用于产生针对抗原的人单克隆抗体，其中供体或者已被有效地自然致敏或者已被免疫接种Sthlietal，MethodsinEnzymology(1983)，92，26-36，大多数情况下均涉及暴露于病毒或细菌抗原。使用hu-SCID动物模型被报道的血清滴度水平显著低于通过免疫接种正常小鼠典型获得的血清滴度水平。另外，已描述了两种方案，通过它们在hu-SCID小鼠中使用原初人淋巴细胞诱导了初次抗体应答之后还可诱导再次抗体应答。然而，这两种方案的使用实质上受到了限制，在第一个方案中，在hu-SCID小鼠中诱导了初次应答，其中已知被手术移植了人胎儿的肝脏，胸腺和淋巴结，然而此方法受到胎儿组织有限的可用性以及该方案繁杂的外科方法学的很大的限制McCuneetal，L.Science(1988)，241，1632-1639、在第二个方案中，用T-和B-细胞描述的人骨髓和SCID小鼠骨髓细胞重建了经致死剂量放射的正常小鼠Lubinetal，Science，(1991)，252427。然而此方法是不利的，因为它需要四个月的保温期，而且两种方案的结果产生了很低的抗体滴度，即108以下。Carlson等人Carlssonetal，J.Immunol，(1992)，1481065-1071于1992年描述的方法使用了得自被抗原(破伤风类毒素)致敏的供体的PBMC。在转移至SCID小鼠之前的简短体外培养和致敏期，细胞首先要被耗尽巨噬细胞和NK细胞，然后用抗原加强免疫hu-SPL-SCID小鼠，据报道此方法可导致在hu-SPL-SCID血清中平均的TT特异性人IgG滴度≈104，还有报道称大于5×105。人单克隆抗体的产生进一步典型地需要无限增殖化B-细胞的产生以得到的可分泌所需人单克隆抗体连续不断的理想的永久来源的细胞。B-细胞的无限增殖化一般通过下列四种方法中的一种来实现(i)用EBV转化，(ii)小鼠-人异源融合，(iii)EBV转化，接着再异源融合，和(iv)组合免疫球蛋白基因文库技术。在大量报道中成功使用了EBV转化，主要是用于产生抗-HIV抗体，Gorny，etal，Proc.Natl，Acad.Sci.(1989)，861624-1628，Posner，etal，J.Immunol，(1991)，1464325-32。主要的优点在于每200个B-细胞中约有个被转化，然而，被EBV转化的细胞典型地是不稳定的，产生了少量主要的IgM抗体，克隆少得可怜，培养几个月之后停止制备抗体。异源融合Carrol，etal，J.Immunol，Meth，(1986)，8961-72典型地利于产生可分泌高水平IgG抗体的杂交瘤，通过有限稀释易于克隆杂交瘤，然而不利之处是产量低，即每20,000个淋巴细胞≤1个杂交瘤Boerner.etal，J.Immunol，(1991)，14786-95，Ohlin，etal，C，A，K.Immunology(1989)，68325，Xiu-meietal，Hum.Antibod，Hybridomas(1990)，142，Borrebaeck.C.A.K.Abstractatthe“SecondInternationalConference”on“HumanAntibodiesandHybridomas，”April26-28，1992，Cambridge，England.联合EBV转化接着再异源融合有两个优点(i)经EBV转化之后人B-细胞更易于融合伙伴融合，和(ii)产生更稳定，更高产的杂交瘤。Ohlin，etal，Immunology，(1989)，68325，Xiu-mei，etal，Hum，Antibod，Hybridomas(1990)，142，BorrebaeckC.A.K.Absractatthe“SecondInternationalConference”on“HumanAntibodiesandHybridomas”April26-28，1992，Cambridge，England.最后一个技术，即组合免疫球蛋白基因文库技术的优点是利用M13Fab表达技术可筛选出很大的文库Huse，etal，Science(1989)，2461275，WilliamHuse，AntibodyEngineeringAPracticalGuide，BorrebaeckC.A.K..ed5103-120，基因易于被转移到生产细胞系中这一事实，然而，产量典型地非常低，大约每370,000克隆中有1个Duchosal，etal，Nature(1992)，355258-262。因此，基于上述内容，生产人单克隆抗体，尤其是特异于RSV之抗体的更有效的方法将会很有利，这一点是显而易见的，而且，比那些最近使用的具有更高结合亲和性，特异性和效应子功能的特异于RSVF-蛋白的人抗体也是很合乎需要的，这一点也是显而易见的。本发明的目的本发明的目的是提供产生特异于所需抗原的高滴度的人抗体的改良方法。本发明更具体的目的是提供产生高滴度人抗体的新的方法，所述方法包括(i)在体外用抗原致敏原初人脾细胞，(ii)将在体外被抗原致敏的脾细胞转移至免疫妥协的供体，如SCID小鼠，和(iii)用抗原加强免疫。本发明另一个具体的目的是提供产生特异于呼吸道合胞病毒(RSV)，尤其是RSV融合(F)蛋白的人单克隆抗体的改良方法。本发明的另一个目的是提供产生EBV无限增殖化B-细胞的改良方法，所述方法利于形成分泌IgG占优势的EBV无限增殖化的B-细胞。本发明更具体的目的是提供产生分泌IgG占优势的EBV无限增殖化的人B-细胞的改良方法，此方法包括(i)在体外用抗原致敏原初人脾细胞；(ii)将这种在体外用抗原致敏的原初脾细胞转移至免疫妥协的动物供体内，如SCID小鼠；(iii)用抗原加强免疫免疫妥协的动物供体如SCID小鼠；(iv)从被抗原加强免疫的免疫妥协供体如SCID小鼠中分离产生人抗体的B-细胞；(v)用EBV转化所述经分离的产生人抗体的B-细胞。本发明的另一个目的是提供含有EBV转化的得自SCID小鼠的人B细胞的新组合物，所述人B细胞分泌人IgG占优势。本发明更具体的目的是提供含有EBV转化的人B细胞的新组合物，所述人B细胞分泌人IgG占优势，并且是由包括以下步骤的方法产生的(i)在体外用抗原致敏原初人脾细胞；(ii)将这种在体外用抗原致敏的原初脾细胞转移至免疫妥协的动物供体内，如SCID小鼠；(iii)用抗原加强免疫免疫妥协的动物供体如SCID小鼠；(iv)从被抗原加强免疫的免疫妥协供体如SCID小鼠中分离产生人抗体的B-细胞；(v)用EBV转化所述经分离的产生人抗体的B-细胞。本发明另一个具体的目的是产生可中和RSV的人单克隆抗体，所述抗体与RSVF-蛋白的亲和性≤2×10-9M。本发明另一个目的是提供EBV无限增殖化细胞系，所述细胞系可分泌能中和RSV的人IgG单克隆抗体，所述抗体与RSVF-抗原的亲和性≤2×109M。本发明更具体的目的是提供两个EBV无限增殖化细胞系，RF-2和RF-1，它们分别分泌的人单克隆抗体也被称作RF-2和RF-1，所述抗体在体内可中和RSV，每种抗体对RSVF-蛋白的亲和性≤2×10-9M。本发明的另一个目的是用编码RF-1和RF-2重链和轻链可变区的DNA序列转染真核细胞以产生可分泌含RF-1或RF-2可变区的人抗体的转染子。本发明的更具体的目的是提供经转染的CHO细胞，所述细胞可表达RF-1或RF-2重链和轻链可变区。本发明的另一个目的是通过施用治疗或预防有效量的特异于RSVF-蛋白的可中和RSV的人单克隆抗体以治疗或预防人类RSV感染，所述抗体对RSVF-蛋白的Kd≤2×10-9M。本发明更具体的目的是通过施用治疗或预防有效量的在经转染的真核细胞中表达的RF-1或RF-2或人单克隆抗体以治疗或预防人类RSV感染，所述真核细胞含有并表达RF-1或RF-2的可变重链和轻链区。本发明的另一个目的是提供治疗或预防RSV感染的疫苗，所述疫苗含有治疗或预防有效量的特异于RSVF-蛋白，对RSVF-蛋白的Kd≤2×10-9M的人单克隆抗体，和药用可接受的载体或赋形剂的联合，所述抗体可在体外中和RSV。本发明更具体的目的是提供治疗或预防RSV感染的疫苗，所述疫苗含有治疗或预防有效量的得自经转染的真核细胞的RF-1和RF-2或人单克隆抗体和药用可接受的载体和赋形剂的联合，所述真核细胞含有和表达编码RF-1或RF-2可变重链和轻链区的DNA序列。本发明的另一个目的是提供通过使用对RSV融合(F)蛋白的亲和性≤2×10-9M的人单克隆抗体检测分析物，如呼吸道中的液体中RSV的存在以诊断RSV感染的方法。本发明的另一个目的是提供用于检测RSV感染的新的免疫探针和检测试剂盒，它包括特异于RSVF-蛋白的人单克隆抗体，所述抗体对RSVF蛋白的亲和性≤2×10-9M，其抗体直接或间接地与适当的报道分子，如酶或放射性核素结合。在优选的实施方案中，这些人单克隆抗体可含有真核细胞，如CHO细胞产生的RF-1或RF-2或重组人单克隆抗体，所述细胞被RF-1或RF-2的可变重链和轻链区转染。发明简述本发明最宽的实施方案涉及制备所需抗原之人抗体，尤其是涉及预防，治疗或检测人类疾病状态之抗原的人抗体的新方法。这些方法包括在体外用抗原致敏原初人脾细胞，将所得的在体外经抗原致敏的脾细胞转移至免疫妥协的供体，如SCID小鼠，并用抗原加强免疫所述免疫妥协的供体。本发明也涉及产生利于生产可分泌IgG之细胞的Epstein-Barr病毒(EBV)无限增殖化的B-细胞的方法，所述方法包括在体外用抗原致敏原初人脾细胞；将所得的在体外经抗原致敏的脾细胞转移至免疫妥协的供体，如SCID小鼠；并用抗原加强免疫免疫妥协的供体；从被抗原加强免疫的免疫妥协供体，如SCID小鼠中分离可分泌人抗体，尤其是可分泌IgG的B-细胞；用EBV转化所述的经分离的可分泌人抗体的细胞。本发明更具体地涉及制备RSV，尤其是RSV融合(F)蛋白的人抗体的改良方法以及这些方法产生的人单克隆抗体，所述抗体对RSVF-蛋白有高亲和性，也可中和RSV感染。优选通过下列步骤实现此方法，即在体外用I1-2和任选地用RSVF-蛋白致敏原初人脾细胞；将所得的在体外被致敏的脾细胞转移至免疫妥协的供体，如SCID小鼠中，并用RSVF-蛋白加强免疫以产生可分泌中和性抗-RSVF-蛋白人抗体的人B-细胞，所述抗体对RSVF-蛋白具有高亲和性，即≤2×10-9M。优选使所得B-细胞无限增殖化以便提供人抗-RBVF-蛋白单克隆抗体的连续不断的稳定来源。在优选的实施方案中，从被抗原加强免疫的SCID小鼠中分离B-细胞，并用EBV病毒转化此细胞以产生经EBV转化的分泌人IgG占优势的人B-细胞。然后克隆这些细胞以选择被EBV转化的可分泌对RSVF-蛋白具有高亲和性，即≤10-7和优选≤2×10-9M的人单克隆抗体的细胞系。本发明也涉及这种抗-RSVF-蛋白人单克隆抗体作为治疗和/或预防以及诊断剂的用途。正如上文所提及的，本发明方法可导致人单克隆抗体的产生，所述抗体对RSVF-蛋白具有高亲和性，即对RSVF-蛋白的Kd≤2×10-9M，所述抗体在体外也可中和RSV。因此，由于RSVF-蛋白是不同RSV分离株之间高度保守的表面蛋白这一事实的存在，这些抗体理想的适于用作预防和治疗剂以预防或治疗RSV感染。假定本发明的人单克隆抗体对RSVF-蛋白有高亲和性和特异性，它们也可被用来诊断RSV感染。本发明更具体地提供了两个特殊的针对RSVF-蛋白的人单克隆抗体，即RF-1和RF-2以及由它们衍生的重组人抗体，所述抗体优选在CHO细胞中产生，所述细胞已被编码RF-1或RF-2可变重链或轻链区的DNA序列转染。这些抗体作为治疗或预防RSV感染的预防和/或治疗剂特别有用。而且这些抗体作为诊断剂是有用的，因为它们以高亲和性与RSVF-蛋白结合，即它们对RSVF-蛋白的亲和性各≤2×10-9。它们用作治疗剂特别有用，因为它们对RSVF-蛋白有高亲和力和特异性，它们在体外能有效中和RSV感染。附图简述图1显示了用抗-F蛋白hu-SPL-SCID血清免疫印迹F蛋白，在SDS-PAGE中电泳原始(A)和变性的(B)F蛋白并通过Western印迹转移至硝酸纤维素上。硝酸纤维素条与阳性对照小鼠抗-F蛋白MAb反应(泳道1A和1B)，与阴性对照hu-SPL-SCID血清抗-TT反应(泳道2A和2B)，和来自小鼠#6(泳道3A和3B)，#3(泳道4A和4B)和#4(泳道5A和5B)的hu-SPL-SCID抗-F蛋白血清反应。图2显示了用hu-SPL-SCID血清抗-F蛋白使HEP-2细胞发免疫荧光，未被感染(左)和被RSV感染的HEP-2细胞与加强免疫后15天取出的以1∶50稀释的hu-SPL-SCID小鼠#6的血清反应，结合表现为GAHIgG-FITC。图3表示纯化的RF-1和RF-2与结合于塑料板上经亲和纯化的RSVF-蛋白的反应性，也记录了作为参照的人抗-RSV血清LN的反应性。ELISA板被50ng的RSVF-蛋白包被。图4表示纯化自肿瘤细胞上清液的RF-1(泳道2)和RF-2(泳道3)人MAb的IEF。IEF在pH梯度为3-10下进行，泳道1表示pi标准。图5表示HEP-2细胞和被RSV感染的HEP-2细胞(1×106，与不同量的RF-1一起保温，随后与FITC-标记的GAHIgG一起保温)的间接免疫荧光流式细胞计量试验，整个群相对平均强度被记录下来。图6表示用于表达人抗体的NEDSPLA载体，CMV＝巨细胞病毒启动子，EBTA＝小鼠β珠蛋白主要的启动子，BGH＝牛生长激素聚腺苷酸化信号，SVO＝SV40复制起点，N1＝新霉素磷酸转移酶外显子1，N2＝新霉素磷酸转移酶外显子2，LIGHT＝人免疫球蛋白Kappa恒定区，HEAVY＝人免疫球蛋白γ1或γ4PE恒定区，L＝前导序列，SV＝SV40聚腺苷酸化区域。图7a表示RF-1可变轻链区的氨基酸和核酸序列图7b表示RF-1可变重链区的氨基酸和核酸序列。图8a表示RF-2可变轻链区的氨基酸和核酸序列。图8b表示RF-2可变重链区的氨基酸和核酸序列。图9a表示RF-1轻链，前导序列和人Kappa恒定区序列的氨基酸和核酸序列。图9b表示RF-1重链，前导序列和人γ/恒定区序列的氨基酸和核酸序列。图9c表示人恒定区序列。图10表示被称为NSKE1的NEOSPLA载体，它含有图9a-9c所列的RF-1核酸序列和人γ/恒定区。图11a表示RF-2轻链，前导序列和人Kappa恒定区的氨基酸核酸序列。图11b表示RF-2重链，前导序列和人γ/恒定区的氨基酸和核酸序列。图11c表示人γ/恒定区的氨基酸和核酸序列。图12图解表示了被称为NSKG1的NEOPLA表达载体，它含有图11a-11c所示的RF-2核酸序列和人γ/恒定区序列。发明详述如上文所讨论的，本发明提供了产生抗所需抗原，优选为人类疾病状态所涉及的抗原的人单克隆抗体的新的高效方法。人类疾病状态所涉及的抗原典型地为含有适当的抗体治疗靶的表面抗原，例如它包括病毒的表面蛋白以及人类癌细胞表面表达的抗原，在优选的实施方案中，表面抗原包括RSV的融合蛋白(F-蛋白)。人类疾病状态包括例如病毒感染，如RSV，乳头状瘤病毒，肝炎病毒，ALDS等，癌症，细菌感染，酵母菌感染，寄生虫感染，如疟疾等。实质上人类疾病状态欲包含通过施用特异于特殊抗原的人单克隆抗体可潜在地预防或治疗的任何人类疾病状态。产生人单克隆抗体的本发明的方法实质上涉及体外致敏原初人脾细胞，将这些脾细胞转移至免疫妥协的供体，即SCID小鼠中，接着用抗原加强免疫已经施用了所述脾细胞的SCID小鼠。令人惊奇地是发现了产生人抗体的这两个已知方法的联合会导致协同的结果，具体地说，导致对免疫抗原的抗原特异性反应大大增强，IgG同种型人单克隆抗体的滴度很高，更具体地说，已发现这种联合导致前所未有的高的再次应答hu-SPL-SCID血清中的人IgG反应比那些将原初细胞转移至SCID得到的要高10倍，特异性的抗体反应增加1000倍。已发现所得抗体的高亲和性和特异性可以与实验用高活性的免疫动物产生的抗体相比。也已发现当使用原初脾细胞时，为了得到这种出乎意料的结果，必须既在体外又在导入所得hu-SPL-SCID小鼠之后用抗原攻击，优选但不是必需在用抗原加强免疫前的瞬间将额外的新鲜的未致敏脾细胞导入hu-SPL-SCID供体中，已发现这可以导致抗体反应的进一步增强。在由原初人脾细胞产生再次应答的最适体外初次和加强免疫方案已经公开之后(Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas(1993)，4，57-65)，本发明得以有所进展。已发现此方案(Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas(1993)，4，57-65)所提供的抗原特异性IgG反应约比由经受一次抗原攻击的培养物得到的高2-10倍。使用很不相同的抗原可使这种体外免疫接种(IVI)方案得以开发和最优化，所述抗原即为马铁蛋白(HoF)，钙调蛋白，前列腺特异性抗原(PSA)，小鼠IgG，运铁蛋白，与依赖T-细胞的蛋白载体结合的匙孔血蓝蛋白(KLH)二硝基苯基(DNP)以及RSV融合(F)蛋白。实质上此方案涉及在以抗原和自身脾细胞的比率为1∶1开始培养1天后再次刺激脾细胞培养物。已阐明使用此方案测得的IgG反应是重复暴露于抗原的结果，与再次应答相当。这些实验进一步阐明未受损伤的脾脏是淋巴细胞的最佳来源，包括愈伤的和ITP脾脏。与之形成对照的是经证实外周血淋巴细胞(PBL)和扁桃体或淋巴结的细胞不适宜诱导抗原特异性反应。而且，除去或中和任何细胞成分会导致低劣的反应(Boerneretal，J.Lmmunol.(1991)，14786-95)。这些实验也表明对于特定脾细胞制品和抗原，存在唯一最适的抗原浓度。因此，已经建立了最适的体外初次和加强免疫方案以由原初人脾细胞产生再次应答；已设想出将此方案与以前的体内方法联合起来试验以产生人单克隆抗体，即SCID小鼠。在试验前，不知道什么影响(如果有的话为被抗原致敏的脾细胞的施用)会施加于由SCID小鼠最终产生的抗特定抗原的人单克隆抗体或者人淋巴细胞在SCID小鼠体内维持的能力，然而我们希望能使在体外被抗原致敏的原初脾细胞的抗原加强免疫和表达增强。在这点上，以前有人报道人淋巴细胞可在SCID中建立自身并在其中存活几个月(McCuneetal，Science(1988)，241，1632-1639，Lubinetal，Science(1991)252427)。而且如上文所提及，使用SCID或针对抗原的人单克隆抗体的前述方法已使用了先前或自然地或通过免疫接种暴露于抗原之供体的细胞，该方法典型地不会产生高的人抗体滴度。十分令人惊奇地是，已发现在hu-SCID模型中，用于使人原初脾细胞产生再次应答的体外初次和加强免疫方案的联合会导致协同的结果(Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas(1993)，4，57-65)，这一点已由对免疫抗原的高度显著的抗原特异性IgG反应所证实。已进一步发现这些方法的联合(使用马铁蛋白(HOF)作为模式抗原)(i)在转移至SCID之前引入体外免疫接种步骤对于可靠地诱导显著抗原特异性反应是必需的；(ii)必须将人细胞转移至腹膜内以在SCID小鼠体内非强制性地维持人脾细胞；(iii)最适的体外培养约为3天；(iv)在体外使用IL-2和任选使用IL-4或IL-6会在hu-SPL-SCID体内导致抗原特异性反应的最高抗体滴度；(v)优选使用在佐剂，如弗氏完全佐剂(FCA)和/或明矾中乳化的抗原加强免疫hu-SPL-SCID小鼠；(vi)令人奇怪地是无论是鼠源或人源的NK细胞的杀伤或中和对抗体的产生都没什么益处，然而已发现将SCID-米色小鼠(NK地位较低的系)用作体外致敏细胞的宿主，当使用佐剂的联合，即FCA和明矾来实现加强免疫时可提供较强的应答。(vii)约1/3hu-SPL-SCID小鼠的脾脏，而不是淋巴结比正常的SCID胀大了25倍，而且在这种脾脏中有多至2/3的细胞被检测到正常的人淋巴细胞膜标记物。更具体地说，本发明的方法包括用抗原在体外致敏原初人脾细胞约1-10天，优选约3天，将经致敏的细胞转移至SCID小鼠，随后用抗原加强免疫此小鼠，随后意味着约3-14天后，优选约7天后。已阐明从约第24天之前，所得hu-SPL-SCID小鼠的血清中就出现了高的抗原特异性IgG反应。典型地，使用首次用于实验的抗原马铁蛋白时，血清终点稀释滴度约为106(在约为50mgIgG/ml时最大反应的一半)，当用病毒抗原即RSV的融合蛋白诱导回忆应答时，血清终点稀释滴度约为107(在约为50mgIgG/ml时最大反应的一半)，根据这些结果我们希望使用其他抗原也能得到类似的反应。如上文所提及，在hu-SPL-SCID小鼠中所需抗体反应的最佳诱导需要既在体外也在体内用抗原攻击人细胞，还发现在体外致敏过程中IL-2是必需的，而IL-4和IL-6与IL-2相伴施用会进一步增强hu-SPL-SCID小鼠的反应，而且，SCID的重建被促进了，但它不依靠相伴随的腹膜内施用经照射的同种异型淋巴细胞。已进一步发现一个脾脏与另一个脾脏之间抗体反应有显著差异，例如一些脾脏需要在第10天相伴施用抗原和新鲜的自身脾细胞以产生抗原特异性抗体反应。也已发现在不同的hu-SPL-SCID小鼠中抗体反应的水平也有某种程度上的差异，然而基于本申请的教导，本领域的技术人员会容易选择适当的条件以对特定抗原产生最适抗原特异性抗体反应。例如，通过检测几个不同的脾脏制品在培养物中产生特异性抗体的能力(例如体外免疫接种10天后)，即可鉴定出最强的反应者。而且，既然从每个脾脏中已制备和冷冻了大量细胞，就可以从选定的脾脏中建立一套为期3天的新的体外免疫接种方案，随后再转移至SCID小鼠中。与之形成对照的是假定从单次转移的一个供体中可回收的PBL的量完全受限制其他细胞材料，如外周血细胞不适宜这种最优化。如上文所提及的，与以前的报道形成对比的是已发现对于本方法而言，当使用外周血细胞时，中和人NK活性对于脾脏没什么影响，而且，用结合补体的抗-唾液酸GMI抗体中和SCIDNK细胞会减小抗原特异性IgG反应。与之相比，使用一株NK细胞水平降低的SCID/米色小鼠与使用正常SCID相比，不会提供显著增加的抗原特异性IgG反应。另外，还比较了两种免疫接种途径(静脉内(IV)和腹膜内(IP)所提供的SCID小鼠重建的能力，即脾细胞在其中维持并产生人抗体的能力。已发现腹膜是细胞转移和免疫接种的最佳场所，而且迄今为止，当在小鼠血清中检测到大于0.01μg/ml的人IgG时，从未发现静脉内转移细胞会产生重新进入的群体。也已发现所得IgG的浓度与被转移的人细胞数目直接相关，例如，当腹膜内注射5×106个体外致敏脾细胞时，SCID重新进入的群体为92％，当腹膜内注射5×107个体外致敏脾细胞时，SCID重新进入的群体实质上为100％。根据本申请的教导本领域技术人员可选择最适当数目的体外致敏脾细胞供注射用，通常约为104-108个细胞，更优选约106-108个细胞，最优选至少约为107-108个细胞。也已发现特殊佐剂的存在会影响抗体反应，更具体地说据观察当使用被完全弗氏佐剂(CFA)或CFA和明矾的联合乳化的抗原加强免疫hu-SPL-SCID小鼠时可得到最大的人抗体反应。对被铁蛋白加强免疫的hu-SPL-SCID的试验表明CFA是比明矾更好的佐剂，它们各自产生了33mg和13mg/ml人IgG。CFA和明矾的联合不能改善SCID中的反应，然而，在SCID/米色-hu(此小鼠含有能导致NK细胞活性降低的突变)中使用这些佐剂与仅使用CFA相比，其IgG的产量增加了8-10倍。然而，希望其他佐剂或它们的联合也可产生类似的或甚至更强的结果。同时使用完全弗氏佐剂和明矾的最高的人IgG总浓度约为10mg/ml，特异性的最高IgG浓度约为500μg/ml单克隆抗体等价物。使用包括铁蛋白的此方法产生了在特异性，反应性和Ig链同种型的使用方面与得自高免疫力山羊、兔和猪的可以相比的多克隆抗体反应。hu-SPL-SCID血清抗体大多数为IgG，它仅与铁蛋白含量高的组织的细胞结合，而不与铁蛋白含量低或不含铁蛋白的组织的细胞结合，在Western印迹中既能被天然的铁蛋白识别，也能被变性的铁蛋白识别，这些结果在抗体浓度和所得人抗体的抗原特异性方面都十分出乎意料，而且使用不同的抗原得到了类似的结果。注射后发现人细胞趋向于在两处积累，即腹膜和小鼠脾脏。尽管在血液中发现的人细胞不超过约7％，但淋巴结和肝脏为人抗原，在一些动物肿胀的脾脏和偶发的肿瘤中有25％-33％的细胞来源于人。在肿胀的脾脏中这些人细胞几乎全是B和T-细胞，有少量CD14+细胞，主要为单核细胞。通过流式细胞计量术研究脾脏，淋巴结，肝脏和腹膜来测定这些结果。在那些人脾细胞重新进入脾脏的情况下，发现脾脏经常肿胀，比原初SCID的脾脏大25倍。提取后立即测量，脾脏中人细胞构成了总细胞数的约30％，剩下的不知其来源。然而培养3天后，由于细胞与抗体结合并未表现出与小鼠淋巴细胞的交叉反应性，故所发现的大多数存活细胞来源于人。进一步观察到经重构的小鼠可被分为两组，即具有正常大小脾脏的那些和具有肿大脾脏的那些。具有肿胀脾脏，即25倍于正常大小的脾脏的Hu-SPL-SCID小鼠所具有的人IgG水平约比具有正常脾脏的那些小鼠高150倍，在经类似处理的具有正常大小的脾脏上述小鼠中，抗原特异性人IgG约高10,000倍。也已发现在反应始末抗原特异性反应的相对亲和性有所增加，这表明较高百分比的总免疫球蛋白库由具有较好结合特性的抗体组成，这些结果表明系统是由抗原驱动的。这些结果非常有意义，且表明了一般应该可以从hu-SPL-SCID中拯救人细胞，并将之用于产生组合人抗体基因文库，从而得到能用于临床和/或诊断的高亲和性和特异性的人单克隆抗体。更具体地说，本发明提供了抗RSVF-蛋白的新的人单克隆抗体，所述抗体对RSVF-蛋白具有高亲和性，即≤2×10-9M蛋白质，所述人单克隆抗体能在体外中和RSV。本发明进一步提供了制备这种抗RSVF-蛋白人单克隆抗体的方法。通常按下述生产这种人抗体，即在体外用RSVF-蛋白免疫接种原初人脾细胞，将这种在体外经免疫接种的人脾细胞转移至免疫妥协的动物供体，即SCID小鼠中，用RSVF-蛋白加强免疫所述动物，从中分离人B细胞，所述细胞分泌抗RSVF-蛋白的人单克隆抗体，免疫接种所述人B细胞，克隆所述经免疫的B细胞并选择能分泌对RSVF-蛋白具有高亲和性(优选至少10-7M，更优选≤2×10-9M)的人单克隆抗体的细胞。如上文所讨论的，已发现体外免疫接种，尤其是人脾细胞的联合相对于在SCID小鼠中制备人抗体的常规方法可提供显著的优点，上述联合即为先前已经或未曾暴露于RSVF-抗原并转移至免疫妥协的动物供体，即SCID小鼠中，随后用RSVF-蛋白抗原加强免疫所述供体。也就是上述联合可提供很高的抗体滴度，即最高的抗-F蛋白滴度约为10-7，还可提供高IgG浓度，即对于最强的反应者而言约为3mg/ml。而且此方法考虑到产生具有高度有利的特性组合的人抗体，即所述抗体既对RSVF-蛋白有高亲和性，又显示出显著的体外中和活性。在实施例中将要更详细地描述本发明人已分离了两个人单克隆抗体，RF-1，当通过胞质基因组共振测定时，RF-1显示出对F-蛋白的亲和性常数Ka，Ka＝1010M，RF-2，当通过微量滴定比色法测定时，RF-2显示出亲和性常数Ka＝5×108M，RF-2经计算的Kd＝2×10-9M。而且这两种抗体在浓度为8-120ng/ml时会显示出体外中和病毒的特性，并表现出抑制先前已被RSV感染的细胞融合的能力。值得注意地是可使用这种体外中和活性抵抗多种不同的野生型和实验室RSV毒株，包括A和B病毒型。假定这些结果，即本发明抗体对RSVF-蛋白的高亲和性(所述RSVF-蛋白包括被RSV感染的细胞表面表达的表面蛋白)以及有效中和病毒和抑制被病毒感染之细胞的融合的能力，本发明的人单克隆抗体应该适于作为治疗剂和预防剂，即在易感的或经RSV感染的受试者中治疗或预防RSV感染。如上文所提及，RSV感染在婴儿以及免疫妥协的人群中特别流行，因此，本发明的单克隆抗体特别适于在这种受试者中预防或治疗RSV感染。而且假定本发明的单克隆抗体来源于人，它们特别适于被动免疫疗法，这是因为它们可能不会遭受鼠单克隆抗体潜在的约束。即HAMA反应和正常人效应子功能的缺乏。实际上，根据本发明的人单克隆抗体的鉴定(下文实施例中有述)，RF-1和RF-2显然比以前公开的鼠或嵌合抗-F蛋白抗体和得自重组文库的人Fab片段具有实质上更高的体外中和活性和抑制先前已被RSV感染之细胞的融合的能力。假定它们是来源于人的，还希望这种中和活性通过体内施用得以维持。本发明的人单克隆抗体的另一个优点是它们实质上缺乏与正常组织的反应性。如下文所示，本发明的人单克隆抗体仅与被RSV感染的细胞结合，而不与代表淋巴样组织，肝脏，前列腺的或喉的表皮的细胞系结合。因此，通过体内施用的这些抗体应能有效地与被RSV感染的细胞结合，而不与正常的组织结合，从而应能提供对RSV感染的中和作用。另外基于已公开的特性，希望使用本发明抗RSVF-蛋白的人单克隆抗体以保护易感受宿主免受RSV感染。更具体地说，例如通过从外伤或LTP来源得到人脾细胞，然后在体外致敏即可产生本发明抗RSVF-蛋白的人单克隆抗体。此方法实质上包括在足够量的IL-2和任选为RSVF-蛋白的存在下在体外培养所述原初人脾细胞以诱导免疫接种，这也称作抗原致敏。通常可以使用的RSVF-蛋白的量的范围约为1-200ng/mlRSV蛋白，更优选10-100ng/ml，最优选约为40ng/mlRSVF-蛋白。体外培养的培养基优选含有淋巴因子，尤其是IL-2，任选含有IL-4和IL-6。其用量应能供免疫接种和按所需产生生产抗体的细胞，例如对IL-2而言，适当的其量的范围约为5-200IU/ml，更优选约为10-50IU/ml，最优选25IU/ml。此培养基也可含有在培养物中维持人脾细胞的存活所必需的其他成分，如氨基酸和血清。在实施例中，使用的培养基含有IMDM，其中添加有2mM各氨酰胺，2mM丙酮酸钠，非必需的氨基酸，25IU/mlIL-2和20％胎牛血清。然而根据本申请的教导本领域技术人员可使用常规的最优化方案改变培养基。体外免疫接种步骤可以在足以诱导免疫接种的时间内实现，通常在RSVF-蛋白的存在下将细胞培养约1-10天，优选培养约3天，然而根据例如特殊的脾脏样品也可改变培养时间。类似地，本领域技术人员根据本申请的教导使用已知方法可确定体外免疫接种步骤适当的期限。用于体外免疫接种的抗原优选为经纯化的RSVF-蛋白以确保脾细胞被免疫接种是为了抗F-蛋白，而不是抗其他无用的(非表面的)抗原。得到纯化的RSV蛋白的方法是本领域技术人员已知的，本发明人特别使用了Walshetal，J.Gen.Virol.，70，2953-2961，1989的方法。然而，如果已得到足够纯度的RSVF-蛋白，从而可得到对RSVF-蛋白有特异性的人单克隆抗体，那么对特殊的方法不必苛求。另外，通过1994年2月22日授予的美国专利No.5288630中所述的重组方法可生产RSVF-蛋白。体外免疫接种之后，将经RSVF-蛋白免疫或致敏的原初人脾细胞导入免疫妥协的供体，即SCID小鼠体内。这优选通过将经RSVF-蛋白致敏的人脾细胞腹膜内施用给SCID小鼠来实现，所施用的这种脾细胞的数目典型地在约104-108个脾细胞间变化，优选为107-108个脾细胞，这种细胞的数目应能导致所需的重建，即可产生特异性RSVF-蛋白的可回收浓度的人抗体的SCID小鼠，优选在施用前将这种脾细胞悬浮于HBSS中，使其浓度约为8×108个细胞/ml。在腹膜内转移脾细胞之后，再用RSVF-蛋白加强免疫SCID小鼠，此步骤可在与脾细胞转移足够接近的时刻实现，以使按所需产生人抗-RSVF-蛋白抗体得以实现。通常此步骤在转移之后要实行3-14天，最适在转移之后的实行7天。所述抗原的施用优选在腹膜内实现，所施用的RSVF-蛋白的量的范围约为1-50μg，优选均为1-10μg。在实施例中施用了5μg蛋白。然而，根据特殊的小鼠，脾脏样品和RSVF-蛋白的纯度，免疫接种的量和时间会有所变化。优选在佐剂(如完全弗氏佐剂，明矾，皂苷等，其中优选完全弗氏佐剂(CFA)和明矾)的存在下实现抗原的加强免疫，然而预计其他已知的佐剂可以取代以得到实质上相当的或甚至更强的结果。抗原加强免疫之后，对SCID小鼠取血，如尾血，并检测它们的血清中人IgG浓度和抗-F蛋白抗体滴度，然后使用那些显示出最高抗体滴度和浓度的动物以回收可分泌人IgG的细胞。已发现具有最高抗-F人抗体滴度的SCID小鼠长出了大的腹部肿瘤，此肿瘤可提供分泌人抗体之细胞的良好来源。优选通过在无菌状态下切除以回收这些肿瘤，制备单细胞悬浮液，然后洗涤细胞并培养之。在实施例中，用含有2％胎牛血清的IMDM洗涤细胞，在含有含10％FCS的IMDM的T-25烧瓶中的106个细胞/ml的悬浮液中培养细胞，然而本领域技术人员可改变这种培养条件。然后优选使用EBV使这些细胞无限增殖化，然后用已知方法(如ELISA)鉴定可分泌抗-F蛋白抗体的无限增殖化细胞。如上文所提及，此方法已被阐明可导致特异性结合RSVF-蛋白的两个不同的人单克隆抗体，即RF-1和RF-2的鉴定。然而根据申请中的教导，尤其是根据实施例中的教导，本领域技术人员无需经过过多的实验即可得到具有类似特性的抗RSVF-蛋白的其他人单克隆抗体。假定这些抗体中的大多数是使用不同的SCID在两个不同的实验中产生这一事实，这些抗体则是不同的。表达RF-1和RF-2的细胞系已经能在培养物中维持更长的时间，即分别约为18和16个月；用约36-48小时的大致的双倍时间来划分。在以0.5×106个细胞/ml接种，培养了3天的培养物中特异性抗体浓度平均约为0.8-1μg/ml。如下文将更详细讨论的，RF-1和RF-2都是IgG(l，k)，在ELISA中对F-蛋白的一半-最大结合分别为0.6和1ng/ml，分别在约8.8和8.9处显示出等电点。而且这些抗体对RSVF-蛋白表现出高亲和性，具体地说，对RF-1而言，在IASYS仪上通过胞质基因组共振测得的RF-1解离常数约为10-10M，RF-2的Ka常数同样很高；当根据Wisemanetal，(1989)和Robertetal.(1989)通过微量滴定比色法测定时，约为2×10-9M。另外，已阐明这些抗体可有效结合被RSV感染的细胞，而不会结合被检测的正常的人细胞，如呼吸道内表面(HEp-2，喉表皮癌，CCL23)，肝脏(HepG2，人肝细胞瘤细胞系，HB8068)，淋巴样组织(SB，人B成淋巴细胞样细胞系，Cat.No.CCL120和HSB，T成淋巴细胞样细胞系，Cat.No.CCL120.1)和前列腺(LNCaP，FGC，人前列腺癌系，Cat.No.CRL1740)。值得注意的是RF-1和RF-2已显示出实质上在体外的对RSV病毒的中和作用，这一点已被两个不同的试验阐明(下文将更详细地描述)，即通过在将病毒加入至细胞之前，使之与纯化的单克隆抗体预-反应而实现的感染中和试验(此试验是为了测定抗体抑制病毒感染性的能力)和为测定单克隆抗体抑制病毒生长和抑制病毒进入细胞后的扩充的能力的融合抑制试验。而且，如下文将要详细讨论的，RF-1和RF-2分别在浓度约为30ng/ml-1000ng/ml时可抑制病毒感染12个不同的分离株，因此RF-2显然工作得比RF-1好，它在浓度比RF-1低约1.25-10倍的情况下产生50％病毒抑制作用(ED50)。与之相比，在以前已被感染的细胞中需要更高浓度的单克隆抗体来抑制融合和病毒抗原的表达，RF-1的效力比RF-2要高5-10倍，而且RF-1和RF-2都能有效地抵抗TypeBRSV，TypeB原型RS6556和TypeARSV，TypeA原型RSLong。因此体外结果表明本发明的人单克隆抗体可被用于治疗或预防由TypeA和TypeB原型的不同RSV毒株引起的RSV感染。如上文所讨论的，RSVF-蛋白在不同的RSV分离株中非常保守，因此本发明的抗RSVF-蛋白的单克隆抗体有可能与RSVF-蛋白保守的表位结合。如上文所讨论的，含有可变重链和轻链序列的本发明人单克隆抗体或重组人抗体(其制备在下文中讨论)将被用作治疗和预防剂以通过被动抗体疗法治疗或预防RSV感染。具体地说，可将编码这些DNA可变区的DNA序列掺入图2所示的归IDEC所有的表达载体中。此形式实质上被描述于1995年1月25日提交的共同转让的美国申请No.08/379,072中，本文将它列入参考文献。此载体含有人恒定区，如人γ1，人γ4或被称为γ4PE的它们的突变形式(见美国申请No.08/379,072，本文将它列入参考文献)。通常还包括给易感的受试者或显示出RSV感染的个体施用治疗或预防有效量的本发明的人单克隆抗体。有效剂量的量优选范围为约50-20,000μg/kg，更优选约为100-5000μg/kg。然而根据如被治疗宿主的身体状况，体重等的因素可改变适当的剂量，本领域技术人员可确定合适的有效剂量。可通过适于施用抗体的任何施用方式施用本发明的人单克隆抗体，典型地可通过注射，如静脉内，肌内或腹膜内注射，或更优选通过烟雾化施用本发明的抗体。如上文所提及的如果被治疗的受试者包括新生儿则特别优选烟雾化施用。可通过使用已知药用载体和赋形剂的已知方法实现药用可接受形式的抗体的配制，适当的载体和赋形剂包括例如缓冲盐水，牛血清白蛋白等。而且，假定本发明抗体对RSV感染细胞具有高特异性和亲和性，那么可将它用作免疫探针以诊断RSV感染。它通常包括从怀疑有RSV感染的个体身上取样，如呼吸道液体，并将此样品与本发明的人单克隆抗体一起保温以检测被RSV感染的细胞的存在。此方法包括用报道分子直接或间接地标记本发明的人抗体，所述报道分子可提供对人单克隆抗体-RSV免疫复合物的检测，已知标记物的例子包括例如酶(如β-内酰胺酶，萤光素酶等)和放射性标记物。本领域的技术人员已知使用单克隆抗体实现抗原的免疫检测的方法，本发明的抗-RSVF-蛋白抗体联合诊断有效量的适当报道分子也可被配制成检测试剂盒以检测RSV感染。材料和方法实施例1-6中使用了下述材料和方法。F蛋白的制备和纯化实质上可根据Walshetal.J.Gen.Virol，70，2953-2961，(1989)的方法制备F蛋白，简单地说，即用RSV的Long毒株(A型实验室适应株)感染70％铺满的HEp-2细胞，在T-150培养烧瓶中的添加有5％胎牛血清，ZmM谷氨酰胺和2mM丙酮酸钠的IMDM中培养48小时之后，将细胞置于含1％Triton-x-100和1％脱氧胆酸盐的PBS裂解缓冲液中裂解，在偶联有鼠单克隆抗-F抗体B4(HiroykiTsutsumi友情赠送)的Sephadex亲和柱上从细胞粗裂解液中纯化F蛋白(Tsutsumietal.1987)，用裂解缓冲液充分洗涤上述亲和柱，在含0.1％脱氧胆酸盐的0.1M甘氨酸pH2.5中洗脱经纯化的F蛋白，立即用1MTris，pH8.5中和洗脱液并对PBS透析，当在Extracti-D凝胶柱(Pierce，Rockford，IL，Cat.No.20346)上除去去污剂后，通过EIA测定F蛋白的浓度，并通过γ照射使溶液灭菌。淋巴样细胞的制备在临床上对特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者行脾切除术后可得到脾脏，通过过金属筛可制备单细胞悬液，并在添加有2％胎牛血清的IMDM培养基中洗涤，通过在37℃下用氯化铵裂解缓冲液处理90秒可除去红血细胞，然后用含血清的培养基将富含白血细胞的悬浮液洗涤两次，以108个细胞/ml的浓度重新悬浮于冰冷的正在结冰的培养基中(95％FCS，5％DMSO)，并在液氮中冷冻直至使用。体外免疫接种(IVI)在添加有2mM谷氨酰胺，2mM丙酮酸钠，非必需氨基酸，25μg/mlIL-2和10％胎牛血清的IMDM中建立培养，加入抗生素混合液，其中包括2.5μg/ml两性霉素，100μg/ml氨苄青霉素，100μg/ml卡那霉素，5μg/ml氯四环素，50μg/ml新霉素和50μg/ml庆大霉素，在6-孔群中以3×106个细胞/ml的浓度将细胞与40ng/ml的F蛋白一起培养，3天后收集细胞，洗涤之并以8×108个细胞/ml的浓度重新悬浮于HBSS中以供SCID重建。SCID小鼠的重建通过腹膜内注射200μl含4×107个经IVI的人脾细胞的HBSS来重建5-8周龄的雌性CB17/SCID小鼠；腹膜内注射1周后用于CFA中的5μgF蛋白加强免疫小鼠，再过15天后抽尾血，检测其血清中人IgG的浓度和抗-F蛋白的抗体滴度。从hu/SCID小鼠中回收人细胞两个具有高抗-F人抗体滴度的hu-SPL-SCID小鼠长出大的腹部肿瘤，在无菌状态下从被处死的小鼠身上行切除术以回收肿瘤，制备单细胞悬浮液，用含2％胎牛血清的IMDM洗涤细胞，并在T-25烧瓶中的含10％FCS的IMDM中培养至106个细胞/ml。检测人IgG和抗-F蛋白抗体在ELISA中进行人IgG和抗-F抗体的检测，为了此目的，分别用于0.1M碳酸氢盐缓冲液，pH9.5中的GAH-Ig(0.05μg/孔)或F蛋白(0.05μg/孔)将培养板包被过夜，并用含1％胎牛血清的PBS转闭，使小鼠血清，培养物上清或纯化抗体的连续释放液在培养板中反应，通过随即加入GAHIgG-HRP和OPD底物(Sigma，…，…，)显示出结合的人IgG，在两个试验中，将选定的高滴度人血清用作阳性对照，在估计人IgG和单克隆抗体的浓度时，分别使用纯化的多克隆人IgG，或(γ.K.)骨髓瘤蛋白作为标准。人抗体的同种定型如上所述在经F蛋白包被的培养板上用ELISA进行同种定型，通过随即加入与HRP偶联的特异于人γ1，γ2，γ3，γ4，μ，k和λ链的小鼠单克隆抗体可显示结合的人IgG，阳性对照与(γ1，k)，(γ2，k)，(γ3，λ)，(γ4，λ)或(λ，λ)同种型骨髓瘤蛋白和游离的K和λ链一起泳动。A蛋白的纯化在A蛋白-Sepharose4B柱上从培养物上清液中纯化抗体，简单地说，收集上清液，通过0.2mm的滤纸器过滤，并添加0.02％叠氮化钠，用含0.02％叠氮化钠的PBS平衡柱(凝胶体积约为0.5ml)，然后以低速上样上清液，充分洗涤后，在0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH3.5中洗脱结合的人单克隆IgG，使用Centricon10滤器(Amicon，)对PBS-叠氮化物进行透析，并通过γ照射灭菌直至使用，用柠檬酸(pH2.5)使柱再生，并用含0.02％叠氮化钠的PBS再次平衡柱以供再次使用。等电聚焦在聚丙烯酰胺预制凝胶(Pharmacia，Uppsala，Sweden，Cat.No.80-1124-80)，pH3-pH10中进行人抗体的等电聚焦(IEF)，简单地说，上样20μl样品并在1500伏下电泳90分钟，pi5.8-10.25的标准物被用作pi参照物(…)，在考马斯亮蓝染料中将凝胶染色，并在含25％甲醇，68％水和8％醋酸的脱色缓冲液中脱色。Western印迹原始的和通过煮沸变性的纯化F蛋白在10％聚丙烯酰胺凝胶中迁移，将凝胶印迹到硝酸纤维素膜上，30伏下2小时，60伏下过液。转移后在室温下用含1％BSA和0.1％吐温-20的PBS将硝酸纤维素膜封闭1小时，用PBS洗涤不同的条，并加入初次抗体，hu-SPL-SCID抗-F蛋白血清，或hu-SPL-SCID抗破伤风类毒素阴性对照或小鼠抗-F蛋白阳性对照达1小时，所有血清以1∶500稀释，用PBS充分洗涤之后，对于样品和阴性对照加入再次抗体，GAHIgG-HRP达1小时，或对于阳性对照加入GAMIgG达1小时，印迹用4-氯-1-萘酚显示。免疫荧光使用冰冷的丙酮将被RSV感染的HEp-2细胞(4×104)固定在玻璃载玻片上，在37℃下与20μl以1∶10稀释的血清，或纯化的MAb，2μg/ml反应1小时，洗涤载玻片，在37℃下用GAHIgG-FITC显示结合抗体达30分钟，并在荧光显微镜下观察。FACScan分析用洗涤缓冲液(含0.1％叠氮化钠的PBS)洗涤被RSV感染的HEp-2细胞(106个细胞/样品)，将细胞碎片重新悬浮于50μl含2μg/mlRF-1或RF-2的保温缓冲液中(添加有0.1％BSA并含0.1％叠氮化钠的PBS)，在冰上保温15分钟后，洗涤细胞并重新在冰上将细胞重新悬浮于含GAHIgG-FITC保温缓冲液中达15分钟，洗涤3次后，在1ml含1％甲醛的PBS中固定细胞并在Becton-DickinsonFACScan装置上进行分析。亲和性测定使用两种方法测定人MAb对可溶性F蛋白的亲和性在使用IASYS仪的胞质基因组共振中，抗体与装置潮湿的那边共价结合，根据装置干燥的那边所发出光的折射的变化可测定质量的变化，加入不同浓度的F-蛋白，随后用不断流过的PBS洗脱下F-蛋白，测量作为从抗体上释放下来的F-蛋白的结果的质量上的变化，从动力学上讲测定了Koff，通过检测从不同水平的最初饱和上脱下的速率可计算出Ka。另外，通过根据Wiseman等人和Robert等人的微量量热法可测定亲和性常数，方法如下，在42℃的热容器中将已知浓度的RF-2和F蛋白一起保温，测量由于溶液中免疫复合物的形成而造成的焓变化，在50℃下重复反应，根据Robert等人的理论，在下列等式中将与结合相关的常数K计算成温度和焓变的函数K＝Kobs.eΔllobslR.(1/T-1/Tobs)·eΔCTobs/R.(1/T-1/TTobs)·(T/Tobs)ΔC/R其中Kobs是在特定绝对温度Tobs下的结合平衡常数，ΔHobs是在特定绝对温度Tobs下实验观察到的焓变；R是大气常数(1.987)，ΔC是实验测得的结合热容的变化。补体-增强的病毒中和试验使用两个实验室毒株(Long，A型和18537，B型)和从住院婴儿体内分离到的10株野生型RS病毒分离物来评价抗-F蛋白人MAb的中和能力。室温下在微量滴定培养板的100μlIMDM/孔中，在补体的存在下将连续稀释的人MAb与病毒(50-100pfu)一起预保温30分钟，在100μlMEM中加入HEp-2细胞(5×104孔)并在37℃，5％CO2下保温3天，洗涤培养板用丙酮固定并风干，通过使用小鼠MAb的ELISA检测RSV抗原，将中和作用的终点任意测定为与无抗体的对照孔相比可将抗原的产生降低50％的稀释度。病毒融合抑制试验通过在37℃，5％CO2下，将100TCID50RSVLong(A原型病毒)或RS6556(B型临床分离物)与VERO细胞(5×103/孔)在微量滴度培养板中预保温4小时可测定融合抑制作用的滴度，在每孔中加入不同浓度的人单克隆抗体或对照，并在37℃，5％CO2下将一式四份的培养物保温6天。对照培养物含有未被病毒感染的细胞(阴性)或在抗体缺乏的情况下被感染的细胞(阳性)，在使用兔多克隆抗-F蛋白抗血清和经HRP-标记的抗-兔IgG的ELISA中检测病毒的生长，用TMBlue底物(KPI，Gaithersburg，MD)进行反应，根据MAb剂量反应的回归分析，滴度(ED50)被定义为抑制50％病毒生长的抗体浓度。实施例1HU-SPL-SCID滴度15只SCID小鼠接受了患有ITP三单个供体的人脾细胞，在IL-2和不同浓度之可溶性F蛋白的存在下将细胞预培养3天，成功地重建了所有动物，并在用F蛋白加强免疫之后，血清中人IgG总浓度在12μg/ml-10mg/ml之间变化，抗-F蛋白滴度在3×102-106之间变化(表1)，在体外暴露于F蛋白和体内抗-F蛋白滴度之间没有观察到相关性。有关本发明的方法，以前已在马铁蛋白抗原系统中观察到在脾细胞的体外培养期间必需暴露于抗原以确保随后的体内特异性抗体滴度。这两个系统之间的差异可归结为所涉及抗原的差异由于人不会自然暴露于马铁蛋白，IVI步骤涉及用抗原致敏脾细胞并在体外诱导初次应答；另一方面，通过幼年时自然的感染实质上所有人对RSV都有免疫力，这里所说的自然感染会导致对F蛋白永久的记忆，因此在体外仅用IL-2刺激，随后在体内加强免疫一次就足以诱导再次应答。由等电聚焦模式判断(数据未显示)，抗血清为多克隆的，在Western印迹中检测了它们对F蛋白的反应性，我们的结果表明二聚体形式(140KD)和单聚体形式(70KD)的多克隆人Ab都不能识别可溶性的原始下蛋白；它们也能与变性F蛋白强烈反应，特异性地与48KD和23KD的这2个亚单位结合(代表性的数据见图1)，这暗示着至少对下蛋白的体液反应的一部分直接抗分子的线性，非构象表位。免疫荧光研究进一步阐明了hu-SPL-SCID血清的特异性，这是由于免疫血清而不是原始SCID小鼠血清能与RSV-感染的HEp-2细胞强烈地反应(图2)。对用作阴性对照的未被感染的HEp-2细胞未观察到反应性，因此可得出结论可溶性的F蛋白是产生特异于自然感染的细胞上表达的膜病毒抗原之抗体的适当的抗原。实施例2鉴定肿瘤细胞培养物中的抗体处死具有高抗-F蛋白滴度的所有小鼠，从腹腔灌洗和脾脏中收获人细胞。两只小鼠(hu-SPL-SCID#6和hu-SPL-SCID#15)同时长出腹部的实体肿瘤，回收所述肿瘤并刮成单细胞悬液，肿瘤细胞分泌的特异性抗-F蛋白抗体在ELISA中得以测定，这些肿瘤和抗体被称作RF-1(RSVF-蛋白)和RF-2。RF-1和RF-2在间隔约2个月的两个不同实验中产生，并从各个hu-SPL-SCID小鼠中分离得到，因此它们是不同的抗体；它们分别在培养物中已建立自身达18个月和16个月以上，以36-48小时的双倍时间分开。以0.5×106个细胞/ml的浓度接种并培养3天，培养物中特异性抗体浓度典型地为0.5-1μg/ml。为了进一步鉴定，通过使用A蛋白Sepharose柱的亲和层析从培养物上清液中纯化两种人MAb。RF-1和RF-2都是IgG(l，k)，在ELISA中与F-蛋白最大结合的一半分别为0.6和1ng/ml(图3)。从IEF中的迁移模式看，RF-1和RF-2的等电点分别被测定为8.8和8.9(图4)，在流式细胞术中RF-1和RF-2特异性地识别被RSV感染的HEp-2细胞(图5)。在LASYS仪上通过胞质基因组共振测定的RF-1解离常数Kd约为10-10M，根据Wiseman等人(1989)和Robert等人(1989)的微量滴定比色法测定的RF-2Kd常数为2×10-9M。实施例3抗-F蛋白的组织特异性利用通过流式细胞术测量的间接免疫荧光试验筛选纯化抗体与一系列可得自ATCC的人细胞系的反应性(表11)。此结果表明抗体不与以下列为代表的细胞系结合，即呼吸道内表面(HEp-2，喉表皮癌，Cat.No.CCL23)，肝脏(HEpG2，人肝细胞瘤细胞系，Cat.No.HB8065)，淋巴样组织(SB，人B成淋巴细胞样细胞系，Cat.No.CCL120和HSB，T成淋巴细胞样细胞系，Cat.No.CCL120.1)和前列腺(LNCaP.FGC.人前列腺癌系，Cat.No.CRL1740)。实施例4体外功能活性为了测定抗体在体外是否具有中和病毒的作用，将抗体经受两种类型的功能性测定在将病毒加入细胞之前，使之与纯化的MAb预反应可进行感染中和试验，因此反映出MAb抑制病毒感染性的能力；融合抑制作用反映出Ab抑制病毒生长和病毒进入细胞之后的扩展的能力。如EIA中通过病毒抗原滴定所测定的，两个试验的结果被测定为特定保温时间之后培养物中释放的病毒量。对于所测试的所有12个分离株而言，浓度分别为30ng/ml-1000ng/ml和8ng/ml-165ng/ml的RF-1和RF-2Ab能抑制病毒感染，RF-2始终比RF-1工作得更好，在浓度比RF-1低1.25-10倍时产生50％病毒抑制作用(ED50)，代表性的数据列于表III。正如所期望的，在以前曾被感染的细胞中需要较高浓度的MAb抑制融合和病毒抗原表达，在此试验中，RF-1的效力比RF-2高5-10倍。在TypeB原型RS6556中的两种MAb比TypeA原型RSLong中的更有效(表III)。表I</tables>表I在IL-2存在下，将单个供体的脾细胞与或不与F蛋白一起培养3天，用4×107个细胞重建SCID小鼠并用于CFA中的10μgF蛋白腹膜内加强免疫所述小鼠，在小鼠#1，2，3，4和5中注射新鲜的自身细胞(20×106)以加强免疫，通过与多克隆IgG的标准曲线比较可测定人IgG的浓度，通过EIA中的终点稀释测定抗-F蛋白滴度。表II</tables>表IIRF-2与多种细胞系的反应性。用RF-2，200ng/106个细胞间接免疫荧光标记不同的细胞系。Fab山羊抗-人IgG-FITC被用作第二步骤，(-)表示RF-2的存在不会导致平均荧光波道的变化；(+)表示平均标记量以0.5log增加。表III</tables>表IIIED50被定义为根据单克隆抗体剂量反应的回归分析抑制50％病毒生长的抗体浓度。实施例5(比较实施例)在体外诱导对F-蛋白的IgG回忆应答两岁以上的群体中，95％以上已经暴露于RSV并对RSV作出了成功的反应(Hendersonetal，J.Med.(1979)，300，530-534)。因此在体外用RSVF-蛋白攻击脾细胞应该导致回忆应答，而事实上在体外诱导了脾细胞主要的IgG反应(见图5)。最适抗原浓度40ng/ml至少比所观察到的诱导初次应答的抗原浓度即铁蛋白，Ilig/ml要小一个数量级(Boerneretal.，J.Immunol.，1991，147，86-95；Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas，1993，4，47-56)。因此应考虑到在体外用F-蛋白致敏会诱导类似的再次应答，对于PBMC和得自扁桃体的细胞而言，几种在体外诱导对RSVF-蛋白的显著反应的尝试均告失败。由体外致敏的脾细胞产生单克隆抗体的有限的努力产生几个抗RSVF-蛋白的单克隆IgG抗体，然而在ELISA中，大多数所述抗体会与几个对照抗原中的一个交叉反应(结果未显示)。实施例6克隆编码RF-2的基因RF-1和RF-2克隆都不能产生显著量的抗体。这两个细胞系在含20％FCS的培养基中长得最好，这是不利的，因为它会导致纯化抗体被牛IgG污染。因此为了能产生和纯化大量进行有意义的动物模型试验所需的抗体(所述试验典型地需要多至1克的一种选定抗体)，将编码RF-1和RF-2的基因转移至生产载体和细胞系是有利的。本受让人IDEC制药公司已开发出很有效的真核生产系统，该系统在CHO细胞中可产生人单克隆抗体，此载体系统被描述于共同转让的美国申请No.08/379,072(1995年1月25日提交)和No.08/149,099(1993年11月3日提交)中，本文将它们都列为参考文献。常规下使用此系统，在每升旋动培养的无血清培养基中被抗体基因转染的CHO细胞产生了约200mg抗体，比用氨甲蝶呤扩增后发酵罐中的抗体高500mg/l。使用mRNA分离试剂盒，FastTract(InVitroGen，SanDiego，California)提取经克隆的RF-2细胞的细胞培养物(见下文)，约5×106中的RNA，使用寡-dT引物和逆转录酶制备单链cDNA，将cDNA的等分试样用作聚合酶链反应(PCR)的起始物质以扩增可变区的基因，使用两套引物进行PCR(见表IV)。表IV*含Mlu1位点的重链引物VH15’(AG)10ACGCGTG(T/C)CCA(G/C)TCCCAGGT(G/C)CAGCTGGTG3’VH25(AG)10ACGCGTGTC(T/C)TGTCCCAGGT(A/G)CAG(C/T)TG(C/A)AG3’VH35(AG)10ACGCGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTG3’VH45(AG)10ACGCGTGTCCTGTCCCAGGTGCAG3’VH55(AG)10ACGCGTGTCTGGCCGAAGTGCAGCTGGTG3’含Nhe1位点的重链恒定区引物反义链IgGl-4(AG)10GCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGG3’含DraIII位点的Kappa链引物1.5’(AG)10CCAGGTGCACGATGTGACATCCAGATGACC3’2.5’(AG)10CCTGGATCACGATGTGATATTGTGATGAC3’3.5’(AG)10CCAGATACACGATGTGAAATTGTGTTGAC3’4.5’(AG)10TCTGGTGCACGATGTGACATCGTGATGAC3’含BsiWI位点的Kappa恒定区引物反义链Ck5(AG)10TGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCA(G/C)CTT3’*表IV的说明合成的寡核苷酸引物用以PCR扩增人免疫球蛋白重链和轻链可变区，下划粗线的是克隆的限制性位点。设计第一套引物是为了扩增重链可变区，它由一个与J区结合的3′引物和五个与晚期前导序列和构架1区域结合的家族特异性5′引物组成。设计第二套引物是为了扩增Kappa可变区，它由一个3′引物和4个与晚期前导序列和构架1区域结合的5′引物组成。在球脂糖凝胶上电泳PCR反应产物，切下正确大小的350碱基对带，电洗脱DNA，用适当的限制性酶切割并克隆到IDEC的NEOSPLA表达载体(见图6)中，用于表达人抗体的NEOSPLA载体含有CMV＝巨细胞病毒启动子，BETA＝小鼠β株蛋白主要的启动子，BGH＝牛生长激素聚腺苷酸化信号，SVO＝SV40复制起点，N1＝新霉素磷酸转移酶外显子1，N2＝新霉素磷酸转移酶外显子2，LIGHT＝人免疫球蛋白Kappa恒定区，HEAVY＝人免疫球蛋白γ1或γ4PE恒定区，L＝前导序列，SV＝SV40聚腺苷酸化区域。IDEC的NEOSPLA表达载体被设计用于大量生产免疫球蛋白基因(见全部列入参考文献的Reffetal，Blood，(1994)，83，435-445)，使用这些载体已高水平地成功表达了小鼠/人嵌合，灵长类动物/人嵌合和人抗体。NEOSPLA含有新霉素磷酸转移酶基因以选择已稳定整合了质粒载体DNA的CHO细胞。另外，NEOSPLA含有二氢叶酸还原酶基因以在氨甲蝶呤中扩增人恒定轻链(k或λ)和人恒定重链区(γ1或γ4(PE))。γ4(PE)是具有2处突变的人γ4恒定区，在CH2区引入谷氨酸是为了消除残基的FcR结合，在轻链区的脯氨酸取代欲增强重链二硫键相互作用的稳定性，Algreetal，J.Immunol.，148，3461-3468，(1992)；Angaletal，Mol.Immunol.，30，105-108(1993)，这两篇都已列入本文参考文献。在载体中还掺入了独特的限制性位点已便于所需的区域和轻链可变区的插入，Reffetal.，Blood，(1994)，83，435-445。在重复实验中，RF-2的轻链已被克隆到NEOSPLA，并根据Sangeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1977)，74，5463-5467的方法测定其序列。Kappa链是Kappa2亚组中的成员，类似地，已分离出人RF-2重链可变区并将它克隆到人γ1恒定区的前面。RF-1和RF-2的轻链编码基因易于克隆，而使用普通的Tac逆转录酶不能产生编码重链之基因的cDNA，然而通过替换高温(70℃)逆转录酶，此问题可迎刃而解，从而用主要来自VH2家族基因的引物可产生完整的PCR产物。RF-1轻链和重链可变区的氨基酸序列和核酸序列分别示于图7a和7b，RF-2轻链和重链可变区的氨基酸序列和核酸序列分别示于图8a和8b，图9a-9c表示本发明NEOSPLA载体表达的RF-1的核酸和氨基酸序列，图9a和9b表示前导序列，可变轻链和重链序列，和人恒定区序列，即人Kappa区和人γ/恒定区，图9c表示人γ/恒定区的氨基酸和核酸序列，图10图解表示了在CHO细胞中可表达图9a-9c所示序列从而得到重组RF-1的表达载体。图11a-11c类似地表示了前导序列，RF-1可变轻链，人Kappa恒定区，RF-2可变重链和人γ/恒定区的氨基酸和核酸序列，图12图解表示了可在CHO细胞中表达重组RF-2的表达载体。实施例7克隆经EBV转化之细胞的方案的建立经EBV转化之细胞的抗体生产不断地减少并最终停止，Kozboretal.，J.Immunol.(1981)，127，1275-1280。因此为了使抗体的生产无限增殖化，必需在此事件之前从细胞中提取编码免疫球蛋白的基因，并将所述基因转移到适当的表达系统。为了分离编码由EBV-转化细胞产生的结合抗原之抗体的可变区的基因，必需确保细胞材料是单克隆的，然而无论通过有限稀释或在半固体琼脂培养基中都很难克隆经EBV转化的细胞，本发明的两个抗-F蛋白抗体RF-1和RF-2的A蛋白纯化制品的等电聚焦凝胶电泳表明在RF-2制品中至少有两群抗体，在RF-1制品中可能有寡克隆性。通过将小鼠胸腺瘤细胞系EL-4B5(Zhangetal，J.Immunol.，(1990)，144，2955-2960)用作饲养层，细胞通过有限稀释由单个细胞得以扩充，人胸腺瘤细胞系EL-4B5可表达膜受体形式的gp39，gp39可诱导B细胞生长，将5×104个EL-4B5细胞/孔平铺于微量滴定培养板上，将培养物中的细胞以不同浓度(从0.38个细胞/孔起逐渐升高)平铺于EL-4B5层上，适当长的时间后，计数对所铺的每个浓度有生长现象的孔的数目。检测上清液中人IgG和抗原-特异性IgG的存在，用此方案我们从原始的寡克隆制品中已分离和克隆了分别产生RF-1(见表V)和RF-2(见表VI)的细胞。克隆过程中发现的非特异性抗体仅被分析了其同种型方面的内容，发现它与特异性抗体IgG1K相同。根据在RF-1培养过程中的不同时间点冰冻制备的F-蛋白特异性克隆的产量，以及所产生的IgG的量，估计从培养一开始，特异性抗体就构成了总抗体量的约1/20，培养约8个月后特异性抗体消失，RF-2构成了总IgG的更大的一部分，在任何特定的时间都不少于10％。使用寡克隆制品的抗体来产生体外中和数据，结果超出了对ED50滴度的估计，然而我们使用胞质基因组共振来研究亲和性不必依赖纯抗体的使用，对经克隆的物质进行使用微量滴定比色法的亲和性研究。表V**表V的说明通过有限稀释克隆RF-1，以5×104个细胞/孔将EL4-B5细胞平铺于平底96孔培养板上，约24小时之后，将所述浓度的指数生长的RF-1细胞平铺于饲养层上，2-3周后，对孔进行生长和抗-F活性存在的评分。表VI**表VI的说明通过有限稀释克隆RF-2，接与表V相同的方式进行。为了进一步证实这两个具有体外中和病毒之活性的人单克隆抗体的临床可用性，在两个不同的动物模型中进一步鉴定了这些抗体清除RSV感染的效力，通过CHO细胞产生的物质来进行这些预临床表现的评价，所述CHO细胞被插入专用表达载体(见图6)中的编码抗体的克隆基因所转染。将检测两个抗体模型，一个具有完整的补体和Fc受体结合区γ1，一个没有这些区域，γ4(PE突变)(Alegreetal，J.Immunol.，(1992)，148，3461-3468；Angaletal.，MolecularImmunology，(1993)，30，105-108)。出于两个考虑来确定检测γ4形成的基本原理(i)尽管当直接施用于肺时，抗-F蛋白Fab已显示出显著的体外Barbasetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)，89，10164-10168以及体内Croweetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)，91，1386-1390中和病毒的作用，(ii)在通过病毒感染已经应激的敏感组织中由效应子功能激活作用引起的潜在的可避免的肺损伤是有利可图的。由机构内部的非特异性杂交瘤IgG1抗体产生一套非特异性的对照抗体，一个γ1和一个γ4(PE)。第一个动物模型是小鼠模型，Tayloretal.，J.Immunology(1984)，52，137-142；Walsh，E.E.，J.InfectiousDiseases(1994)，170，345-350，此模型被用于测定有效剂量，所述有效剂量被定义为在保温1周后，导致肺组织中荷载病毒2log降低的最小剂量，此模型也可被用来测定哪个抗体模型会继续下去。第二个动物模型是使用非洲绿候的灵长类动物模型，Kakuketal，J.InfectiousDiseases(1993)，167，553-561，RSV在非洲绿猴中导致肺部损伤，此模型的主要目的是评价抗体预防损伤的特性。用此模型的试验数目被限定为以5个不同的剂量检测1个抗体，可根据在小鼠模型中的发现确定抗体，剂量和相对于感染日期的输注日期。在噬斑检测试验中检查肺切片负载病毒的情况，并通过光学显微镜检测由RSV引起的损伤。可观察到在刺激和扩充产生两个抗体之细胞的过程中，氨基酸序列中是否已发生了任何变化。通过用一套根据RF-1和RF-2重链·CDR3区域的PCR引物检测，可确定编码RF-1和RF-2的基因序列是否存在于原始冷冻的产生了两个细胞系的细胞材料中。阳性对照是RF-1和RF-2被抑制的来源的细胞，根据下列原理进行分析Levyetal.，1989，Levyetal.，J.Exp.Med.(1989)，1692007和Alegreetal.，J.Immunol.(1992)，148，3461-3468；Angaletal.，MolecularImmunology(1993)，30，105-108；Footeetal.，Natwre(1991)，352，530-532；Radaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1991)，85，5508-5512；Kocksetal.，Rev.Immunol.(1989)，7，537-559；Wysockietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1986)，83，1847-1851；Kippsetal.，J.Exp.Med.(1990)，171，189-196；Uekietal.，Exp.Med.(1990)，171，19-34。实施例8生产能产生大量(＞100mg/l)RF-1和RF-2的CHO细胞系a.转染表达质粒，分离和扩充G418抗性的可表达最高水平RF-1和RF-2的CHO克隆。一旦RF-1和RF-2可变区基因被克隆到NEOSPLA中，中国仓鼠卵巢(CH0)细胞(DG44)(Urlanbetal，J.Somat.CellMol.Genet.，(1986)，16，555)即可被质粒DNA转化，在SSFMH-次黄嘌呤和胸苷(GIBCO)中培养CHO细胞，使用BTX600电穿孔装置(BTX，SanDiego，CA)在0.4ml一次性样品池中用25μg质粒DNA电穿孔4×106个细胞，在电穿孔前，用PacI限制性酶切质粒DNA，该酶可将在哺乳动物细胞中表达的基因从用于在细菌中生长的质粒部分上切割下来。电穿孔的条件是230伏，400微法拉第，13欧姆。每个电穿孔在96孔盘(约40,000个细胞/孔)中展开，电穿孔3天后用含400μg/mlG418(Geneticin，GIBCO)的培养基饲养盘中的细胞，然后周期性地用所述培养基饲养细胞直到集落产生，在ELISA中检测集落上清液中人IgG和抗-F蛋白活性的存在。b.在氨甲蝶呤中扩增抗体的表达。然后将G418抗性的可产生最大量免疫球蛋白的集落转移到较大容器中并扩充之，通过基因扩增，通过在96孔盘中的JnM氨甲蝶呤(MIX)中选择可增加能分泌最多G418的克隆的表达。然后扩充能产生最大量抗体的5nM集落，再通过在96孔盘中的50nMMTX中选择再次扩增表达。根据此方案，我们以前已能分离出在旋动培养7天后能分泌大于200mg/l之抗体的CHO细胞(比在发酵罐中6天后产生的抗体高0.5克/升)，然后使用A蛋白亲和层析从上清液中纯化人抗体。c.生产和纯化抗体。每种抗体生产了100mg，以在小鼠模型研究中确定的量生产选定的抗体，使用旋动烧瓶生产所需量的抗体，所述烧瓶中含有于CHO-SSFMII无血清培养基中的选定CHO转染瘤(GIBCOCat.No.91-0456DK)，所述培养基中含有50nM氨甲蝶呤。收获上清液并通过一套滤器过滤以除去特殊的物质，以0.2nM滤器结束过滤。根据抗体总量，通过预定大小的A蛋白标注动上清液，洗涤后，用0.1M甘氨酸/HCl，pH2.8从柱上将抗体洗脱到中和缓冲液中(1MTris/HCl，pH7.4)，通过AmiconCentriprep或Centricon30(Cat.no.4306和4209)进行超滤，用无菌PBS使洗脱/中和缓冲液充分交换(≥1000次)。抗体的浓度被调节约2mg/ml，并穿过0.2nm滤器过滤以使抗体无菌。纯化抗体，并置于2ml冷冻管中在冰上贮藏直至用于动物。实施例9就在RSV动物模型中的性能而言鉴定RF-1和RF-2。使用适当的动物模型检测RF-1和RF-2的性能，评价工作分两步进行，首先(a)使用Balb/c模型(Tayloretal.，J.Immunology(1984)，52，137-142；Croweetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)，91，1396-1390；Connorsetal.，J.Virology(1992)，66，7444-7451)以检测抗体的效力，以及检测哪种类型的支持物(效应物)功能对于抗体清除病毒荷载是必需的。从小鼠模型中得到的数据看，可选择一个候选者在灵长类动物模型中进一步研究。灵长类动物模型是非洲绿猴模型(Kakuketal.，J.LnfectiousDiseases(1993)，167，553-561)。灵长类动物模型特别适合于进一步证实本发明的单克隆抗体可用于预防与病毒相关的肺部损伤。a.在小鼠模型中检测性能。我们已选择的啮齿类动物模型是Balb/c小鼠，此模型已被详细地描述(Croweetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)，91，1386-1390；Connorsetal.，J.Virology(1992)，66，7444-7451)，以用于有关被动疗法研究的研究。所有年龄的Balb/c小鼠都很能容忍RSV在上下呼吸道中生长，(Tayloretal.，J.Immunology(1984)，52，137-142)。分5组圈养动物，饲喂标准的小鼠食物并随意喂小，并根据RochesterGeneralHospital动物园守则照顾这些小鼠，这些守则遵照纽约州卫生部的联邦动物福利条例和DHHS法则。在开口的罩布下用penthrane麻醉小鼠后进行所有程序，包括注射，病毒感染，眼窝取血和通过颈关节脱位处死小鼠。i.测定抗体的有效剂量并比较RF-1和RF-2的γ1和γ4(PE形式)的性能。通过在第0天鼻内滴注于100μl体积中的RSV106Long(A亚组)或10518537(B亚组)噬斑形成单位(PFU)以感染5组小鼠，在第4天病毒滴度到达峰值时，给动物腹膜内注射四种F-蛋白特异性单克隆抗体制品中的每一种或对照抗体。检测到的剂量最初与参照剂量差不多，由体外研究计算出的参照剂量提供的血清中和滴度约为1∶300或更高。在小动物中此滴度可与抵抗RSV攻击的保护性水平相联系，通过用25，5，1，1/5和1/25的参照剂量处理来评价剂量反应，如果许可的话可进行较高或较低剂量实验。如上所述，给对照注射相同剂量的同种型匹配的单克隆抗体。24小时后，第5天是病毒流出的高峰期，处死小鼠。通过心脏内穿刺得到血清，除去鼻甲骨和肺，称重，并分别在1和2mlNMM中匀浆，滴定匀浆液中HEp-2细胞上的病毒，病毒滴度以TCID50/gm组织表示，通过学生t-试验将组之间的平均滴度与对照组的相比，在感染和处死的时刻得到血清，以通过酶免疫测定法和中和试验测定人单克隆抗体的量。既然在上呼吸道中，IgG同种型不能有效地被分泌出来(与IgA相比)，那么可期望病毒滴度最大程度的降低会是肺部病毒的生长，在感染第4天可能的治疗被证明在降低肺部病毒方面是无效的，在第2和/或3天的治疗将被评价。如上文所述，使用ELISA测定贮存溶液和经注射动物的血清中每种单克隆抗体的滴度，在固相中使用了根据确立的方法(82)通过亲和层析纯化的RSV融合蛋白，也要设计测定RSVG蛋白的分离试验以评价小鼠IgG对实验性RSV感染的反应。在ELISA中使用特异于人IgG和小鼠IgG的兔抗体(可购自VirionSystems，Inc.，Bethesda，MD)检测人单克隆抗体或小鼠抗体。对于抗体而言，单克隆抗体的剂量反应效果被测定为可将病毒滴度降低2log10以上或使病毒滴度降低＞99％的最低抗体滴度。保护的程度与处死小鼠时得到的血清抗体水平相关，另外，测定了人单克隆抗体不同联合的潜在协同效果。上文所述的最初的体外研究的结果被用来指导体内实验，例如，如果RF-1和RF-2具有RSVF蛋白上的不同的抗原结合位点，相同同种型(γ1或γ4)的联合会提供协同保护作用。ii.肺组织的组织学评价。通过标准的组织病理学和免疫组化技术评价被动疗法对肺部炎症的疗效，初次或再次感染后的小鼠中的细支气管周围的浸润和肺泡的浸润都已被描述，Connersetal.，J.Virology，(1992)，66，7444-7451。如上所述用单克隆抗体处理实验动物，未被感染的未经处理的对照小鼠被用作对比物以评价组织学效果。在感染后第5和8天，摘下肺，并在恒定的填充压(30cmH2O)下用福尔马林使肺充气30分钟，切片并用苏木精-伊红染色后，使用标准化的评分系统测定细支气管周围和肺泡区炎症浸润的程度(分别为PMN和淋巴细胞)。由于期望γ1和γ4单克隆抗体可以有区别地结合和激活补体，使用商购的兔抗-小鼠C3抗体(VironSystems，Inc.Bethesda，MD)和与过氧化物酶偶联的山羊抗-兔IgG染色肺切片以显示炎症区域小鼠C3的沉积。除了评价在被固定的肺组织中看到的组织学变化以外，通过评价肺泡细胞学评价了肺部的炎症。处死按上述处理的多组小鼠，通过将3mlPBS重复地灌进下呼吸道以进行支气管肺泡灌洗(BAL)，进行BAL细胞计数，通过染色细胞离心制品鉴定细胞类型。iii.抗体疗法对抗感染的自然免疫应答的影响。在棉田鼠和夜猴模型中，尽管动物通过再次攻击已被完全保护，用多克隆的IgG制品抗RSV感染的被动疗法消除了随后对病毒的自然抗体反应(Hemmingetal.，J.InfectiousDiseases(1985)，152，1083-1086；Princeetal.，VirusResearch(1985)，3，193-206)。与之形成对照的是，Graham发现经处理的小鼠的抗体反应减弱，而且所述小鼠对病毒的再次攻击敏感(Grahametal.，Ped.Research(1993)，34，167-172)。为了使用人单克隆抗体评价这种可能性，如上所述用RSVLong毒株感染小鼠，并在第4天用保护性剂量的抗体处理小鼠，对照包括被感染的未经处理的动物和未被感染的经处理动物。隔周(共8周)然后第4周(共8周)给小鼠抽血以检测抗体，通过ELISA测定抗RSVF和G蛋白的人单克隆抗体和小鼠抗体，另外，测定每个时间点的血清中和滴度，从ELISA结果和未被感染的经抗体处理之对照的中和活性结果中可推断出残留的人单克隆抗体和活跃产生的小鼠抗体对中和作用的贡献。当通过ELISA检测不到人单克隆抗体时，用相同的RSV毒株再次攻击动物，4天后处死动物，测定肺和鼻组织中病毒的滴度并与对照组相比。为了评价单克隆抗体疗法对细胞毒T-细胞(CTL)诱导的影响，进行类似的实验，但感染6周后处死小鼠，并用活RSV刺激脾细胞培养物5天(Walsh，E.E.，J.InfectiousDiseases(1994)，170，345-350)。通过使用持续被感染的Balb/c成纤维细胞细胞系(BCH4细胞)的标准铬51释放试验评价CTL活性并与未被感染的Balb/c成纤维细胞细胞系比较。主要根据确定的RSV感染被动疗法的有效剂量研究，再测定哪种抗体，RF-1或RF-2能最有效地预防或治疗RSV感染。在γ1或γ4(PE)形式之间的选择考虑到肺组织学研究，尤其是补体的征集是否能被Clq结合抗体显著增强，尽管随后被增强的血管形成可能会增强病毒-抗体对抗补体的大规模激活作用潜在地具有不利的作用。c.在猴模型中检测性能对于选定抗体的决定性试验在灵长类动物模型中进行，我们选择了非洲绿猴(Cercopithecusaethiops)，因为它能高度容忍RSV，感染可导致增强的肺病理学和可测的损伤(Kakuketal.，J.InfectiousDiseases(1993)，167，553-561)非洲绿猴也易于使用并且没有增加危险性。这种猴重量为5-10kg。最高希望的抗体最大剂量是20mg/kg，每只10kg的含20mg/kg抗体的3只动物等于600mg抗体，一些野生的非洲绿猴对RSV有自然的免疫力，之所以需要将猴纳入我们的研究之中，是因为它们对RSV为血清阴性。根据在小鼠模型中建立的基准，有效剂量/kg和治疗前的感染时间，进行有限系列的试验以确立减少病毒的有效剂量，以及进一步证实所述剂量是否与肺病理学的预防，尤其是薄壁组织炎症的卷入有关，仅检测了一个病毒株，Long(A亚型)，起初检测了25，5，1和1/25倍的参照剂量，分析了两个对照组，一个接受了病毒但未接受抗体，另一个接受了病毒和最大剂量的同种型匹配的对照抗体，实质上如上所述进行实验，也通过鼻内滴注106PFU病毒感染3组猴，用病毒感染猴6-7天后，处死猴，如上所述取出肺和咽样品以检测病毒和进行组织学研究。实质上如上所述进行组织学研究，简而言之，在恒定的填充压下用10％中性缓冲的福尔马林灌注肺，将肺置于福尔马林中至少一周，切片并用苏木精-伊红染色后，根据Kakuketal.，J.InfectiousDiseases(1993)，167，553-561评价载玻片的组织病理学，在ELISA和感染中和试验中取血清样品以测定抗RSV人抗体的滴度。实施例101.通过人组织切片的体外试验证实组织特异性通过在两个不同个体的不同冷冻正常组织切片上的免疫组织学研究进一步检测抗体对正常组织的潜在的交叉反应性，简单地说，使冷冻组织的低温控制切片机切片经受3个试验结合分析，硝化分析和特异性/分布分析，加入于含1％BSA的PBS中的纯化的经生物素标记的抗-RSVF-蛋白抗体，于200℃下在潮湿的小容中将载玻片保温30分钟，然后用含1％BSA的PBS洗涤载玻片，再将载玻片与含1％BSA的PBS中的亲和素-HRP保温30分钟，HRP可与3，3二氨基联苯胺-四氢氯化物反应，通过HRP氧化作用的介导形成不溶性的沉淀染料，这就可以鉴定本发明的人单克隆抗体的任何潜在的交叉反应。ImpathLaboratories，N.Y.，N.Y.可进行此试验，此试验已获FDA批准I.N.D.提交人疗法指定的产物，此组织学方法使用了预先已存在的组织，并比可代替的用放射性标记的抗体对被RSV感染的猴的击靶研究更便宜。权利要求1.人单克隆抗体，所述抗体与RSV融合蛋白特异性地结合，并且对RSVF-蛋白的亲和性≤2×10-9M。2.权利要求1的人单克隆抗体，所述抗体可在体外中和RSV。3.人单克隆抗体，所述抗体与RSV融合蛋白特异性地结合，并选自由RF-1，RF-2和含有RF-1或RF-2可变重链和轻链区的重组人单克隆抗体组成的组中。4.权利要求3的人单克隆抗体，其中所述抗体是RF-1。5.权利要求3的人单克隆抗体，其中所述抗体是RF-2。6.权利要求3的人抗体，其中所说抗体是含有人γ1、人γ4或人γ4PE恒定区的重组抗体。7.被编码RF-1或RF-2重链和轻链可变区的DNA序列转染的真核细胞。8.权利要求7的细胞，其中所述真核细胞是CHO细胞。9.权利要求7的真核细胞，其中所述DNA序列选自图7a、7b、8a、8b、9a、9b、10a或10b中的任一个所列的DNA序列。10.Epstein-Barr无限增殖化B细胞系，所述细胞系可分泌人单克隆抗体，所述抗体对RSV融合蛋白的亲和性≤2×10-9M。11.权利要求10的细胞系，其中所述抗体在体外中和RSV。12.权利要求10的细胞系，其中所述细胞系选自RF-1和RF-2。13.生产特异于RSV融合(F)蛋白的人抗体的方法，所述方法包括(i)在IL-2存在下体外致敏人脾细胞；(ii)将所述经致敏的人脾细胞转移至SCID小鼠；(iii)用RSVF-蛋白加强免疫所述SCID小鼠；(iv)从所述SCID小鼠中分离可分泌特异于RSVF-蛋白的人单克隆抗体的人B细胞。14.权利要求13的方法，其中所述经分离的人B细胞被无限增殖化。15.权利要求14的方法，其中使用Epstein-Barr病毒(EBV)实现无限增殖化。16.权利要求15的方法，其中使用小鼠胸腺瘤细胞系EL-4B5作为饲养层克隆所述的EBV无限增殖化细胞。17.权利要求13的方法，其中在IL-4或IL-6的存在下实现致敏步骤。18.编码RF-1或RF-2可变重链和/或可变轻链区的DAN序列。19.可表达根据权利要求18之DNA序列的表达载体。20.权利要求18的DNA序列，所述DNA序列选自图7a、7b、8a、8b、9a、9b、10a或10b所列DNA序列。21.在易感的或已感染RSV的人群中预防或治疗RSV感染的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的一种或多种人单克隆抗体，所述抗体对RSVF-蛋白的亲和性≤2×10-9M，并可在体外中和RSV。22.权利要求21的方法，其中所述抗体选自RF-1、RF-2和含有RF-1或RF-2的可变重链和轻链区的重组人单克隆抗体。23.权利要求21的方法，其中所述抗体通过注射或烟雾化的形式被施用。24.权利要求21的方法，其中所述抗体与佐剂联合施用。25.权利要求24的方法，其中所述佐剂是完全弗氏佐剂(CFA)、明矾或它们的联合。26.适于预防或治疗易感或已感染RSV的人群中的RSV感染的药物组合物，所述药物组合物包括预防或治疗有效量的人单克隆抗体和药用可接受的载体，所述抗体可在体外中和RSV，对RSVF-蛋白的亲和性≤2×10-9M。27.权利要求26的药物组合物，其中所述人单克隆抗体选自RF-1、RF-2和含RF-1或RF-2可变重链和轻链区的重组人单克隆抗体。28.检测分析物中RSV的存在的方法，所述方法包括在可形成RSVF-蛋白抗体免疫复合物的条件下，将所述分析物与人单克隆抗体一起保温，所述单克隆抗体对RSVF-蛋白的亲和性≤2×10-9M；检测所述RSVF-蛋白抗体免疫复合物的存在以确定分析物中是否有RSV存在。29.权利要求28的方法，其中所述抗体是RF-1或RF-2。30.权利要求29的方法，其中所述抗体直接或间接与报道分子结合。31.权利要求30的方法，其中所述报道分子是可检测的酶或放射性核素。32.权利要求28的方法，其中分析物含有得自呼吸组织的液体。33.检测分析物中RSV的存在的检测试剂盒，其中包括(i)对RSVF-蛋白的亲和性≤2×10-9M的人单克隆抗体；(ii)直接或间接与所述人单克隆抗体结合的报道分子。34.权利要求33的检测试剂盒，其中所述人单克隆抗体是RF-1或RF-2。全文摘要本发明提供了生产人抗体,尤其是特异于RSV融合蛋白之人抗体的高效方法,所述方法包括在SCID小鼠中体外致敏人脾细胞,并且用抗原加强免疫。此方法可产生以IgG同种型占优势的很高的人抗体滴度,所述抗体对所需抗原有高特异性和亲和性。此方法很适于产生能用于治疗和诊断以及用于拯救人细胞以产生组合人抗体基因文库的人单克隆抗体。本发明提高了两个人单克隆抗体,RF－1和RF－2以及它们相应的氨基酸和DNA序列,RF－1和RF－2对RSVF－蛋白的亲和性各≤2×10文档编号C12N5/10GK1192695SQ96196163公开日1998年9月9日申请日期1996年6月6日优先权日1995年6月7日发明者P·布拉姆斯,S·S·沙马特,L·Z·潘,E·E·沃尔什,C·J·赫德,R·A·纽曼申请人:艾德药品公司