专利名称：真菌食品的制作方法
技术领域：
本发明涉及真菌。
由一种单倍体真菌镰刀菌商业化生产人类食料。美国植物专利4,347中描述了一种特别适合的镰刀菌A3/5菌株IMI 145425。
为了生产有吸引人口感的人类食料，最理想的是该镰刀菌表现出几乎无菌丝分支，而镰刀菌IMI 145425的情况是这样。然而，镰刀菌在延长的连续发酵过程中总是变得分支更多，这是由于在发酵培养时变种的出现。高分支变种的出现似乎是延长的真菌发酵的一个普通特征。(Trinci，A.P.J等，(1990)Microbial Growth Dynamics，第17-38页，IRL出版社，Oxford，英国)因此，最理想的是生产形态学稳定性更好的镰刀菌菌株。
常有报道在真菌菌株育种程序中，准性世代作为工业上改良重要生产菌株的一种有价值的方法，因为它通过重组、异核现象或二倍性，可使两个个体的有利特征结合在一起。例如，已证明二倍性增加柠檬酸(Das & Roy，1978)、青霉素(Elander et al.，1973)及头孢菌素C(TakedaChemical co.，1997)的生产率。性质改良的报道包括产黄青霉中孢子形成能力的恢复(Calam等，1976)、在黑曲霉中提高过滤特性(Ball等，1978)、在C.acremonium中通常能增加活力(Hamlyn & Ball，1979)、在M.inyoensis中减少氧需求(Crueger，1982)以及在产黄青霉中消除羟基青霉素V的产生(Chang等，1982)。相比之下，虽然已经描述了尖镰刀菌的假定二倍体(Buxton，1956)，但在镰刀菌中似乎没有清楚地证明准性生殖(Booth，1984)。证明禾本科镰刀菌NRRL 319二倍体的尝试(Bu′Lock等，1986)没有成功，但报道了异核细胞。
根据Rowland(1984)的报道，在发酵期间二倍体是不稳定的，并且很易断裂，同时生产能力逐渐丧失，除非施加某种选择压力。在酿酒酵母中，有证据显示在演变中的二倍体中其适应性突变发生的频率比单倍体群体高(x1.6)(Paquin和Adams，1983)。这支持了真菌的二倍体群体不稳定的观点。然而，我们发现某些半知菌类较高倍性的菌株在与单倍体亲本相应的典型生长条件下，表现出(形态学)稳定性增加。
我们已经生产了较高倍性的镰刀菌菌株，并且已设计出可以凭此产生其它半知菌类、特别是镰刀菌的较高倍性菌株的方法。这些菌株比单倍体菌株形态学稳定性更好。这可能至少部分是由于导致形成较高分支的突变基因是隐性的，并且在这种情况下，在通过遗传特征无性繁殖传递前，较高倍性菌株中两个重复基因必须相应地突变，从而减低它对突变的敏感性。半知菌类区别于其它真菌在于，它们不是正常地通过有性阶段。因此，可以预言，倘若较高倍性的菌株在培养条件使得可以忽略单倍体形式的回复或部分回复，较高倍性菌株在遗传特征上一般将比单倍体菌株表现出更大的稳定性。
“较高倍性”是指比单倍体包括无倍体高的倍性。
本发明包括一种人类食品，它包括半知菌类一个成员的较高倍性菌株，这些菌类的每个亲本的生长能力都有遗传限制，这种生长能力是另一亲本所不享有的。本发明还包括一个较高倍性的镰刀菌菌株。最好一个亲本为选自组氨酸，精氨酸，亮氨酸和腺嘌呤的两种化合物的营养缺陷型，而另一个亲本为其它两种所述化合物的营养缺陷型。适合的菌株由Marlow食品有限公司(Marlow Foods Limited)，StationRoad，Stokesley，Middlesbrough TS9 7AB以IMI 369190、369191和369192于1995年11月6日保藏于国际真菌研究所，Bakeham Lane，Egham，Surrey TW20 9TY。
从半知菌类得到的人类食料的核酸含量最好较低，最好是低于2％(重量)。
本发明包括一个死的较高倍性的半知菌菌株，其核酸含量不到2％(重量)。通过用至少60℃温度的水处理，该真菌可能被杀死，并且同时其核酸含量减少到不到2％，该水可能是它本身的生长培养基。
遗传限制可能是每个亲本都是一种不同代谢产物营养缺陷的，或每个亲本产生一个生长所必需的基因产物，该产物比另一亲本相应的基因产物具有更大的温度或PH敏感性。通过使较高倍体菌株在一种合适的环境下(在上述情况中，该环境缺乏营养缺陷型亲本缺少的营养物，或该环境的温度或pH是任一亲本不供给另一亲本的基因产物时都不能生长的，人们可以筛选出抗向单倍体菌株恢复的菌株，因此可维持真菌较高的形态学稳定性。
本发明也包括包含半知菌的一个较高倍性菌株的人类食物，其中这些真菌已经过处理，以去除了核酸和/或改变它的质地、味道和口感。
可以如下生产较高倍性的菌株，培养相应的单倍体菌株并进行诱变，例如用紫外线照射直至产生营养缺陷型菌株，该菌株失去了产生特定的代谢产物的能力。将该培养物例如平板接种到琼脂平板上，添加可使营养缺陷型和未突变生物均能生长的完全培养基。通过复制平板接种到基本培养基上，鉴定未突变菌株，而从完全培养基平板上选出营养缺陷型来并鉴定其营养需求。然后可以选择例如需要不同的氨基酸作为营养物的两个营养缺陷型用来按下述产生较高倍性的菌株，或单独培养它们并重复该方法(只是这时该基本营养物将包含每种营养缺陷型需要的适当氨基酸)。通过这种方法，可得到两个双营养缺陷型，最好是它们每一个需要两种氨基酸，而彼此需要的互不相同。如果可以通过相应的方法制备所需的三营养缺陷型或更高的营养缺陷型，那么它们最好应是应当是没有普通成员的一组代谢产物的营养缺陷型。
本发明包括制备半知真菌一员(例如镰刀菌)的较高倍性菌株的方法，该方法包括在含有两种需要不同营养缺陷营养物的营养缺陷型生长均需要的培养基中培养两个营养缺陷型(接合培养阶段)，然后培养从缺少营养缺陷组分的培养基(基本培养基)中的这种培养物得到的有机体(基本培养基培养阶段)，并从该基本培养基培养阶段回收一个较高倍性菌株。
在该接合培养阶段，诱导孢子形成是必需的。这可通过已知方法实施，适当地通过使有机体经历营养挑战，例如仅供应一种复合碳源作为主要营养。
我们已发现，当转移到如缺少营养缺陷组分的基本培养基中时，从两个营养缺陷型获得的较高倍性菌株相对于单倍体菌株和那些得自相一营养缺陷型的较高倍性菌株进行倍增，通过使有机体经受诱变剂作用，可能增加这种作用，该诱变剂为适当的辐射，如紫外光，其强度足够量杀死存在的高比例的单倍体菌株。
然后最好例如通过平板培养，用较强的抗诱变性，例如通过紫外光作为选择标准，选择较高倍性菌株。如有必要，选择的有机体可以再在基本培养基中培养，希望时在诱变下如用紫外光进行，再筛选存活的较高倍性菌株。
从按以上方法产生的较高倍性菌株，进一步筛选其它特征，如生长率。实施例1.1亲本单倍体镰刀菌菌株A3/5(CMI 145425，ATCC 20334)是该单倍体的野生型。用常规突变技术，从已经经受紫外射线照射的A3/5孢子的悬浮液中回收菌株UMDA4-C和UMDA6-N。二者均为双自养菌。UMDA4-C的营养需要为组氨酸和精氨酸，而比A3/5更抗氯酸盐。UMDA6-N需要亮氨酸和腺嘌呤，并且比A3/5更抗氮芥。1.2培养物保存和种子培养物的制备有机体以菌丝片段保存在50％(v/v)甘油中并贮存在保持在-196℃的小瓶(2ml)中。通过从这些小瓶中的一个将几个等份转移至含有50ml或200ml的RHM生长培养基(见下文)的1升Ehrlenmeyer烧瓶中，制备种子培养物。通过于28℃培养多至72小时，发展培养物。1.3生长培养基1.3.1 RHM培养基每升的量d-葡萄糖，10g；K2SO4，0.3g；NH4Cl，4.4g；MgSO4·7H2O，0.25g；KH2PO4，20.0g；微量元素溶液A，5.0ml；生物素，30μg。
A1升微量元素溶液含有CaCl2·2H2O，2.0g；FeCl3·6H2O，2.0g；柠檬酸，1.5g；ZnCl2，1.0g；MnCl2·4H2O，1.0g；CuCl2·2H2O，0.2g；CoCl2·2H2O，0.2g；NaMoO4·2H2O，0.2g。
将基本盐类(除了葡萄糖和生物素)混合，并用20％(v/v)的NaOH将pH调至6.0。然后将产生的溶液按需要分装到烧瓶中。葡萄糖单独制备为含500gl-1d-葡萄糖的贮液。这两种液体均于121℃高压灭菌灭菌20分钟。冷却后，每个烧瓶中按需要补充葡萄糖。也由单独过滤除菌的含30mgl-1生物素的贮液加入生物素。
1.3.2 YPG培养基每升的量酵母抽提物，3g；真菌蛋白胨，5g；D-葡萄糖，10g。将该酵母抽提物和蛋白胨混合，形成基本溶液，将该溶液于121℃高压灭菌20分钟。然后从依1.3.1节所述方法制备的含500g l-1D-葡萄糖的单独的贮液加入葡萄糖。
1.3.3 CMC培养基每升含有羧甲基纤维素(CMC)，15g；NH4NO3，1.0g；KH2PO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g。溶解这些组分，于121℃高压灭菌20分钟之前，用20％的NaOH将pH调至6.0。
1.3.4发酵罐培养基这由三种单独的贮液制成，每种制备为10升体积，并于121℃高压灭菌30分钟。a)基本盐浓缩液每10l中的了量K2SO4，40g；MgSO4·7H2O，18g；(CH3COO)2Ca，4g；H3PO4(85％v/v)，23ml；微量元素溶液，10ml；每升微量元素溶液含有MnSO4·2H2O，40g；ZnSO4·7H2O，50g；CuSO4·5H2O，5g；生物素，50mg；cH2SO4，5ml。b)葡萄糖用水溶解730g葡萄糖一水合物，使其总体积为10l，制备含66gl-1D-葡萄糖的贮液。c)铁每10升的量FeSO4·7H2O，5g；cH2SO4，5ml。
高压灭菌后，将含基本盐浓缩液的容器和含葡萄糖的容器连接在一起，将内容物混合，形成营养物主流。单独供应含大约100mg l-1Fe2+的铁溶液。
1.3.5补充培养基按需要，将精氨酸、组氨酸、亮氨酸和腺嘌呤加入基本培养基中，其浓度为500mg l-1。
1.3.6固体培养基需要固体培养基时，在高压灭菌前加入15g l-1琼脂。灭菌后让熔化的琼脂冷却至55℃，然后将其璇涡混匀后，将大约20ml的等份分装到9cm的陪替氏培养皿中。1.4异核体的形成和分离按1.2节中描述的，用适当地补充了精氨酸和组氨酸或腺嘌呤和亮氨酸的RHM培养基(50ml)，制备双营养缺陷型的液体培养物。然后通过在加入精氨酸、组氨酸、腺嘌呤和亮氨酸的CMC培养基中传代培养两个菌株，诱导孢子形成，并且将烧瓶在28℃再培养24小时。得到的大型分生孢子的悬浮液以1∶1的比例混合，并且将40微升等份转移到10×96孔无菌微量检测板的各个孔中，每孔中已加入了160μl无菌的YPG培养基。混合后，将这些板在28℃培养48-72小时。在某些情况下，这包括暴露于樟脑或紫外照射的一个时期
樟脑将板放在一个密闭容器中，容器底部洒有几个d-樟脑晶体，将微孔板在樟脑氛围中于28℃保温4小时。处理后，将板取出并在空气中于28℃再培养44小时。
紫外线将这些板于28℃上常规保温48小时，然后将其取出，暴露于20μW.cm-2的紫外线下210秒。暴露后，将板放回28℃，并再培养24小时。
在培养期结束时，从每个孔中取出等份试样(10微升)，在第二组微量测试板中与190μl RHM培养基混合。然后将其在28℃培养7天，以突出原养型生长。1.5假定的多倍体的筛选和分离将孔中事先填装190μl RHM培养基的新微量测试板与已表现出原养型生长证据的培养物的10μl等份试样一同培养。然后将板于28℃培养5天，该循环重复两次，以突出能在基本培养基中持续生长的菌株。然后将100μl筛选出的培养物转移到含5ml RHM培养基的通用瓶中，扩大体积。将这些瓶于28℃搅拌培养多至4天。
将从以上筛选方法回收的菌株在液体中进行再次传代培养，将2ml通用瓶中的培养物转入含50ml RHM和50ml CMC生长培养基的烧瓶中。两个烧瓶均于28℃搅拌培养4天，然后收获内容物并用于制备长期贮存的贮存培养物。1.6用对紫外线照射的剂量反应分析菌株所需菌株的种子培养物在50ml RHM培养基的烧瓶中生长，培养基中按双营养缺陷型的需要加入添加物。每个烧瓶于28℃搅拌培养多至48小时，然后将10ml转入第二个含50ml CMC培养基的烧瓶中传代培养。在相同条件下培养16-20小时以促进孢子形成。然后通过两层无菌晶状体组织过滤至一个无菌容器中去除营养菌丝体后，将20ml孢子悬浮液转入一个9cm陪替氏培养皿中。用磁力搅拌器不断地搅拌该悬浮液。
用一个功率额定为高处的能量率为20uW.cm-2的灯，将每个板用紫外光照射多至10分钟。在Ringers溶液中连续稀释0.5ml样品，并将每个稀释液的0.2ml体积涂布于含琼脂固化的RHM培养基(补充特定的成分)的平板上，测定整个暴露期间的存活率。这些平板在28℃培养，48小时出现的菌落数用于构成平均存活数的时间系列图。从这些图中可以定量测定每个菌株同使其致死水平相关的暴露时间。1.7连续流动培养培养物在Braun(B.Braun Biotech，Aylesbury，Bucks)Biostat ER3发酵罐中生长，工作体积为2.8升。强制设置点是温度28℃；pH6.0(通过自动滴定7M NH4OH来维持)；搅拌1000rpm；空气流速2.211min-1。通过以0.1-0.2ml h-1定时加入聚丙二醇消泡油抑制泡沫形成。
向发酵罐容器中加入基本盐+葡萄糖溶液，然后在生长培养基中补充硫酸铁，使Fe2+终浓度为1mg l-1。确立控制设置点并导入种子培养物。通过借用质谱联机分析出口气组成来监控生长，出口气组成用来测定二氧化碳放出速率(CER)。当CER达到35毫摩尔升-1小时-1时，通过打开传送消泡剂、铁和基本盐+葡萄糖的泵来建立连续流动培养。以等于流入的生长培养基中0.8-1.0mg 1-1Fe2+浓度的固定速率加入铁。
作为中心控制可变性的一个加入CER的反馈环用于在连续流动起见调节基本盐+葡萄糖流的流速。从质谱计接收的信号通过软件处理，将该软件编程，以产生响应高于或低于CER设置点变化的两个输出电压中的一个。该输出电压控制一个传送基本盐+葡萄糖流的蠕动泵的转速，由于该流单独占通入发酵罐总液体流的95％以上，因而该输出电压控制该稀释率。实际上，两个输出电压对应于在0.15h-1和0.25h-1间的稀释率。设计这些输出电压分别进一步浓缩或者稀释该生物量。在该软件监控下进行这两个界限之间的受调转换，并且将平衡维持在对应于有机体的最大生长速率的值上。当在最大允许稀释率下操作时，该操作方法可使在培养发酵液中维持葡萄糖的过量水平。菌落形态学的监测每日从发酵罐中取新鲜培养物的样品，并在无菌Ringers溶液中连续地稀释。将适当稀释度的等份试样(0.1ml)涂于含固化RHM培养基的10个琼脂平板的表面。这些平板于28℃培养多至72小时，按(Wiebe等，1991)描述的方法测定菌落变异体的比例。2结果2.1原养型微生物的选择性回收共进行34,650个个体交配；11,520个无特殊处理；11,520个暴露于樟脑以及11,520个用紫外光照射。表1给出了用每种方法在RHM基本培养基中经3次(倒数第二次)和四次(最终)选择性传代培养后得到的原养微生物的数目。表1用该微量测试方法的三种变化方法的原养微生物的选择性回收
从常规杂交，即从那些没有暴露于樟脑或紫外光的培养物中没有回收到原养微生物，表明原养型生长的自然收率不到8.7×10-5。很清楚，用樟脑处理是最成功的方法，产生总共12个菌株，并且将收率提高了两个数量级，即1.0×10-3。这些菌株指定为菌株编码D2和D11-D21。
包括紫外照射的筛选只产生了一个目的培养物(编码为11-1/M1)，它最初含两个具有不同菌落形态的变异体。因为它们在直径上相对的不同，随后被称为“大的”或“小的”。两个类型中较大的也比较小的更有活力，它外观上的菌丝密度比较小的大。剂量反应试验(1.6)显示大型培养物更抗紫外照射，提示它本质上突变频率较低。在此基础上，决定主要集中于该型培养物，而忽视较小型培养物。回收在剂量反应试验中制备的生长于稀释平板上的总共9个大菌落作为亚克隆，并定为菌株编码指D1和D3-D10。
这些培养物和用樟脑处理的12个培养物的谱系总结于
图1。2.2用对紫外照射有剂量反应分析菌株对应于存活计数减少90％、99％和99.9％的暴露(或杀死)时间用来定量测定每个菌株的剂量反应(表2)。表2-禾赤镰刀菌亲本单倍体和假定多倍体的孢子悬浮液中使90、99和9.9％死亡的紫外暴露时间的比较
所有时间以分钟计*通过外推法得到的有机体D1、D2和D21已根据布达佩斯条约的规定，于1995年10月19日保藏在国际真菌研究所(Bakeham Lane，Egham，Surrey TW20 9TY，英国)，保藏号为IMI 369192、IMI 369191和IMI 369190。
对于A3/5，各自的死亡时间为4.4、5.7和7.4分钟。在双营养缺陷型的情况下，显然需要更长的暴露期，以建立比较数据的完全补充，因为代表99.9％死亡的值(而UMDA4-C为99％)在10分钟的暴露期内没有下降。
通常，对来自紫外交配的假定的更高倍体而言，代表90和99％死亡的值与那些记录的亲本单倍体的值的数量级相同。虽然有证据显示其中两个菌株(D1和D5)不同于其它菌株，但该组的大多数获得反映90％死亡时间在A3/5获得时间的0.5分钟内，亦即3.9-4.9分钟。D1的值高于该组中其它分离物的值，而D5的值则持续地较低。这些描绘表明，D1类似于双营养缺陷型，亦即比A3/5抗性更高，而D5的抗性在一定程度上低于A3/5。
相反，从樟脑交配回收的半数分离物需要的暴露时间超过10分钟，以迫使99％死亡。大部分聚集在4.9-6.8分钟的范围内，虽然有四个显著的例外。菌株D14、D19和D21似乎更易受影响，而D20不仅在樟脑组中而且在该程序过程中分离的所有原养微生物中都明显地具有最强的抗性。2.4在D1和D2的连续流动培养中菌落变异体的出现一般在A3/5的107+/-14代，亦即448+/-60小时后，检出具有局限性菌落表型的变异体。然而，在用D1和D2进行的发酵中，直到540和594代(1,957和2,028小时)才检出具有局限性菌落表型的变异体(表3)。因此在QUORN工业发酵的生产运行期间，增加的稳定性接近提高至少四倍。表3在镰刀菌A3/5、D1和D2连续流动培养中局限性菌落突变体的第一次出现<
表4真菌中准性世代的发生
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权利要求
1.包含半知菌类一员的一个较高倍性菌株的人类食料，其每个亲本对其生长能力具有一不与另一亲本共有的遗传限制。
2.可食用的镰刀菌的较高倍性菌株，其每个亲本菌株是一种不同代谢产物的营养缺陷型。
3.根据权利要求2的菌株，其一个亲本是选自组氨酸、精氨酸、亮氨酸和腺嘌呤的两个氨基酸的营养缺陷型，而另一亲本是另外两个所述化合物的营养缺陷型。
4.镰刀菌菌株IMI 369190、IMI 369191和IMI 369192以及它们的变异体突变体和高倍性衍生物。
5.半知菌类的一个较高倍性菌株，它是死的并且其核酸含量低于2％(重量)。
6.根据权利要求5的菌株，其每个亲本对其生长能力都有一个不与另一亲本共有的遗传限制。
7.如权利要求1、2、3或4中要求保护的菌株或食品，其中该菌株是死的并且其核酸含量低于2％(重量)。
8.制备权利要求5、6或7中要求保护的半知菌类菌株的方法，其中包括通过用温度至少为60℃的水处理，杀死半知菌类的较高倍性的菌株，同时使其核酸含量减少至2％(重量)以下。
9.权利要求1-8中任一项中要求保护的方法，其中该真菌是镰刀菌A3/5。
10.制备可食用的镰刀菌较高倍性菌株的方法，该方法包括将需要不同的营养缺陷的营养物的两个营养缺陷型在含有允许二者均生长的营养物的培养基中一同培养(接合培养阶段)，然后将得自这种培养物的有机体在缺乏营养缺陷的组分的培养基(基本培养基)中培养(基本培养基培养阶段)，并从基本培养基培养阶段回收较高倍性菌株。
11.权利要求10中要求保护的方法，其中这些营养缺陷型都是通过突变和选择制备的。
12.权利要求11中要求保护的方法，其中这两个营养缺陷型都得自同一菌株。
13.权利要求10-12的任何权利要求中要求保护的方法，其中这些营养缺陷型需要不同的氨基化合物作为营养物。
14.权利要求13中要求保护的方法，其中每个营养缺陷型都需要两种氨基化合物作为营养物，这两种化合物中的任一种都与另一营养缺陷型需要的不同。
15.权利要求9-14的任一项中要求保护的方法，其中该接合培养阶段产生的真菌经受的严格诱变，足以杀死相当大比例存在的任何单倍体真菌，而允许至少一些较高倍性的真菌存活，由此较高倍性的真菌比单倍体真菌经过诱变存活的比例更大。
16.权利要求9-15中要求保护的方法，其中真菌在基本培养基培养阶段或由其回收后经受诱变，诱变的严格性足以杀死相当大比例存在的任何单倍体真菌，而允许至少一些较高倍性的真菌存活，由此较高倍性的真菌比单倍体真菌经过诱变存活的比例更大。
17.权利要求15或16中要求保护的方法，其中通过照射进行该诱变。
18.权利要求17中要求保护的方法，其中该照射是紫外照射。
19.生产人类食品的方法，该方法包括培养半知真菌类的较高倍性菌株，其中其每个亲本对其生长能力都有一个不与另一亲本共有的遗传限制，该方法在使得减少回复为单倍体型的回复突变或部分回复突变的条件下进行。
20.包含半知真菌类较高倍性菌株的人类食品，其中该真菌已被处理，以去除核酸和/或改变其质地、味道或口感。
全文摘要
一种人类食品包含一种半知菌类较高倍性的菌株,其每个亲本都具有一个不与另一亲本共有的遗传生长限制。一个亲本例如是选自组氨酸、精氨酸、亮氨酸和腺嘌呤的两种化合物的营养缺陷型,而另一亲本则是另两种化合物的营养缺陷型。该菌株的核酸含量最好不到2%(重量)。通过用水处理杀死半知菌类的较高倍性菌株并同时将其核酸含量降至2%(重量)以下,制备该菌株。该方法可以包括通过在含允许二者都生长的营养物的培养基中一起培养两个营养缺陷型,然后在基本培养基中培养得自这种培养物的有机体,制备可食用的一种镰刀菌的较高倍性菌株。本发明可通过在使得减少单倍体型回复突变或部分回复突变的条件下培养该菌株,应用于人类食品的生产。
文档编号A23J3/20GK1209166SQ96199948
公开日1999年2月24日 申请日期1996年12月9日 优先权日1995年12月16日
发明者T·W·奈罗尔, T·威廉逊, A·P·J·特林斯, G·D·罗布森, M·G·维贝 申请人:曾尼卡有限公司