抗真菌植物及其构建方法

专利名称：抗真菌植物及其构建方法
技术领域：
本发明涉及抗真菌植物和构建这类植物的方法。更具体地说，本发明涉及已经转移了编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列的抗真菌植物，还涉及构建这类植物的方法。
背景技术：
已知植物在对病原体感染应答时，合成并积累一抗生剂称为植物抗毒素(M.Yoshikawa(1978)Nature 257546)。发现一些植物病原体有诱导它们进行这种抵抗反应的物质(N.T.Keen(1975)Science 18774)，称作“激发剂”。据信从用病原体感染植物到合成和积累植物抗毒素的生化过程如下当病原体的菌丝体侵犯植物细胞时，植物细胞中的葡聚糖酶工作以切割病原体菌丝体壁表面的多糖，因而释放一激发剂。如果该激发剂与该植物细胞的受体结合，则产生一个在信号传导中起作用的第二信使。该信号传导物质加入该植物细胞核中，并激活编码植物抗毒素合成酶的基因转录以诱导合成植物抗毒素。同时，抑制植物抗毒素降解。结果，植物抗毒素有效地在该植物细胞中积累。
在大豆抗性中起重要作用的一种植物抗毒素称为glyceollion，其结构已被确定(M.Yoshikawa等，(1978)Physiol.Plant.Pathol.1273)。大豆的激发剂有一特征结构；它有β-1，6连接的不同长度的葡聚糖做为主链，从其上伸出β-1，3连接的葡聚糖侧链[J.K.Sharp等，(1984)J.Biol.Chem.25911321；M.Yoshikawa(1990)Plant Cell Technology 1.2695]。据信对得自大豆致病性霉菌真菌大雄疫霉glycinea种型的葡聚糖激发剂有特异性的受体是一蛋白质，该蛋白质在该抗生剂glyceollin的的合成和积累中起重要作用。已经公开了对该激发剂有特异性的激发剂受体的纯化方法[E.G.Cosio等，(1990)FEBS 264235；E.G.Cosio等，(1992)Eur.J.Biochem.2041115，T.Frey等(1993)Phytochemistry 32543]和该激发剂受体的部分氨基酸序列(Kakitani等，日本未审查专利公开No.6-321995)。然而，尚未知编码该葡聚糖激发剂受体的任何基因。如果发现编码激发剂受体的基因，将有可能通过将该基因整合入植物的染色体中并在该植物中表达该激发剂受体创造对致病性真菌有抗性的植物。因此，可以预期改进农产品生产率。
本发明的一个目的是提供其中转移了编码葡聚糖激发剂受体基因的植物。
本发明的另一个目的是提供创造其中转移了编码葡聚糖激发剂受体基因的植物的方法。
本发明说明书做为对上述课题的解决进行深入广泛研究的结果，本发明人已经成功地从大豆cDNA文库中克隆了葡聚糖激发剂受体基因，将该基因转移到烟草植株中并在该植株中表达该基因。因此，本发明已经完成。本发明提供创造抗致病性真菌的植物的方法，包括将编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列整合入植物染色体并在该植物中表达该葡聚糖激发剂受体。本发明也提供对致病性真菌有抗性的植物，其特征在于已将编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列转移至该植物中，并在该植物中表达该葡聚糖激发剂受体。
附图简述

图1展示三个纯化步骤的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图案。
图2展示质粒pER23-1和质粒pER23-2的图谱。
图3展示构建质粒pKV1-ER23的程序。
图4展示在向培养大豆细胞加入激发剂后胞内Ca2+浓度的瞬时增加。
图5展示在向已转化的培养烟草细胞加入激发剂后胞内Ca2+浓度的瞬时增加。
图6展示在大肠杆菌中表达的全长或部分长度ER的激发剂结合活性。
图7展示用抗激发剂结合域的抗体抑制激发剂与大豆子叶膜部分中的激发剂结合蛋白的结合。
图8展示用抗激发剂结合域的抗体抑制激发剂诱导的植物抗毒素在大豆子叶中的积累。
图9展示转化烟草植株对芝麻疫霉的抗性。
图10提供照片展示转化烟草植株对立枯丝核菌的抗性。
图11展示转化烟草植株对立枯丝核菌的抗性。
图12展示在用芝麻疫霉的游动孢子的接种试验中转化烟草植株对芝麻疫霉的抗性。
图13展示质粒pPG1的结构。
图14展示谷胱甘肽-S-转移酶/菜豆葡聚糖酶融合蛋白的葡聚糖酶活性测定结果。
实施本发明的推荐实施方案葡聚糖激发剂受体是参与植物抗毒素产生的蛋白质，它做为得自葡聚糖(真菌细胞壁的组分)的葡聚糖激发剂的受体而起作用。它的功能是给微粒体和核以信号，以增加细胞中植物抗毒素的含量；该功能是通过与葡聚糖激发剂结合而实现，后者是当病原体例如疫霉属的微生物已侵入植物组织时，由植物细胞中的β-1，3-葡聚糖酶切割病原体菌丝体壁的一部分产生的。做为葡聚糖激发剂受体的具体实例，本发明人已发现具有大致如SEQ ID NO1所示氨基酸序列的一个葡聚糖激发剂受体(日本专利申请6-136100号)。“大致如SEQ ID NO1所示氨基酸序列”包括SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，其中可以有一个或多个氨基酸的缺失、置换或加入，只要它们保持葡聚糖激发剂受体的功能。
可以通过例如部分修改的Cosio法(E.J.B(1992)2041115)制备葡聚糖激发剂受体。简言之，将大豆最好是green homer变种的根、叶和茎匀浆，从所得浆液中收集膜部分，用离子交换层析纯化并用以激发剂做为配体的亲和层析进一步纯化。在亲和层析中使用的配体最好得自大雄疫霉glycinea种型小种1(ATCC34566)，因为它与green homer不亲和(即对该病原体有抗性)。
可以下述方法确定由此制备的该葡聚糖激发剂受体的氨基酸序列通过电印迹将该纯化的葡聚糖激发剂受体转移至PVDF膜(Millipore Co.)并用赖氨酰内肽酶(AP-I)消化。从该PVDF膜上回收片段化的肽，并用反相HPLC(μ-Bondasphere 5μC8)分步分离。用气相蛋白测序仪(Applied Biosystems Co.)分析峰部分。
葡聚糖激发剂受体可以用于阐明植物对真菌的抵抗机制和开发能够诱导抗真菌性的激发剂衍生物，它可以用做生产抗葡聚糖激发剂受体抗体的抗原。
编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列最好具有至少一个邻近3’端的终止密码子。
更具体地说，可以使用包含编码葡聚糖激发剂受体的核苷酸序列的DNA分子，而该葡聚糖激发剂受体具有大致如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。“包含编码葡聚糖激发剂受体的核苷酸序列的DNA分子”包括所有简并异构体。名词“简并异构体”指以不同简并密码子编码同一多肽的DNA分子。如果以具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA分子为例，则一个DNA分子中的任何氨基酸的密码子例如编码Asn的AAC变为简并密码子AAT，则该DNA分子称为简并异构体。这类简并异构体的实例包括含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA分子。可以使用导入质粒pER23-1、含有编码葡聚糖激发剂受体的核苷酸序列的DNA序列。用质粒pER23-1转化的大肠杆菌DH5αEKB633已于1994年6月15日以登记号FERM BP-4699保藏于工业科学和技术局的国立生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi 1chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305，JAPAN)。
编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列可以可选地与朝向5’端的上游部分的一个转译框架一起与起始甲硫氨酸的ATG密码子结合，并且也可以与做为在朝向5’端的上游部分和朝向3’端的下游部分内的非转译区的具有适当长度的其他DNA分子结合。
编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列通常可以以质粒或噬菌体DNA分子的组分部分的形式存在，或以导入微生物(具体地说，包括大肠杆菌和农杆菌的细菌)的质粒、噬菌体或基因组DNA分子、噬菌体颗粒或植物的组分部分的形式存在。
为在植物中稳定地表达编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列，可以以适当的组合将一启动子、一编码起始密码子(ATG)的DNA分子和一终止子加入这些DNA序列中。该启动子的实例包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚单位编码基因的启动子(Fluhr等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA(1986) 832358)、产生花椰菜花叶病毒19S-RNA的启动子(Guilley等，Cell(1982)30763)、产生花椰菜花叶病毒35S-RNA的启动子(Odell等，Nature(1985)313810)等等。该终止子的实例包括蓝曙红合酶基因的终止子(Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561)、章鱼碱合酶的终止子(Gielen等，EMBO J.(1984)3835)等等。
编码葡聚糖激发剂受体的DNA分子可以用以下方法得到，该方法包括的步骤为按照常规核酸合成方法化学合成该DNA分子的至少一部分，并通过常规方法例如免疫学方法或杂交法，用该合成DNA分子做为探针从适当的cDNA文库中获得所需DNA分子。上述方法中所用的一些质粒、各种限制性酶、T4 DNA连接酶和其它酶都有市售。按照分子克隆(J.Sambrook等，CSH实验室(1989)、CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，John Wiley & Sons(1987))和其他描述的方法，进行DNA克隆、质粒构建、宿主转染、转染子培养、从培养物中回收DNA分子和其它步骤。
更具体地说，可以如下得到编码葡聚糖激发剂受体的DNA分子从葡聚糖激发剂受体的氨基酸序列中选择两种部分氨基酸序列。制备可以编码所选部分序列的C末端的由所有碱基组合组成的引物和可以编码所选部分序列的N末端的由所有碱基组合组成的引物。使用适当大豆cDNA文库做为模板，用这些合成引物做为混合引物进行两个PCR。接着，挑出预期扩增的给定长度的两个扩增片段(这些片段对应于编码上述两个部分氨基酸序列的DNA分子)并测定其核苷酸序列。在该测定的核苷酸序列的基础上，合成具有位于葡聚糖激发剂受体C末端一侧的氨基酸部分序列的C末端编码核苷酸序列的引物和具有位于葡聚糖激发剂受体N末端一侧的氨基酸部分序列的N末端编码核苷酸序列的引物。使用这两个合成引物以上述大豆cDNA文库DNA分子做为模板进行PCR。使用所得的扩增片段做为探针与前述大豆cDNA文库杂交，由此产生含有编码该葡聚糖激发剂受体的核苷酸序列的DNA分子。
可以用任何已知方法，例如，Maxam-Gilbert法(Methods Enzymol.，65499，1980)、使用M13噬菌体的双脱氧核苷酸链终止法(J.Messing等，Gene，19269，1982)等等，对得到的含有编码该葡聚糖激发剂受体的核苷酸序列的DNA分子测序。
由于对葡聚糖激发剂的各种研究的结果提示葡聚糖激发剂受体在植物中对真菌的抗性起重要作用，如果将编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列按照常规方法导入没有葡聚糖激发剂受体的植物细胞(特别是高等植物细胞)并在其中表达，那么预期这些DNA序列可以赋予植物真菌抗性。已经提出可以感染植物的真菌一般都有抑制剂，因此获得抑制植物抗真菌性的能力。预期通过导入和表达编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列，使得葡聚糖激发剂受体工作，或通过修饰该DNA分子或调控其表达水平，可以开发对真菌具有抗性的新植物。
另外，如果将编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列与诸如赋予植物抗真菌性的葡聚糖酶基因的真菌抗性增强基因或特征一起，导入植物细胞特别是高等植物细胞并在其中表达，预期赋予植物的真菌抗性会高于导入葡聚糖酶基因时的抗性。编码葡聚糖酶的DNA序列的具体实例包括一包含具有大致如SEQ ID NO3或34所示氨基酸序列的葡聚糖酶的编码核苷酸序列的DNA。“包含葡聚糖酶的编码核苷酸序列的DNA”应包括所有简并异构体。做为这种简并异构体的具体实例，可以提出包含SEQ ID NO4或33所示核苷酸序列的DNA。
可以构建用于导入编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列的载体，使得该葡聚糖激发剂受体可以在植物中稳定表达。更具体地说，可以以适当的组合，将一启动子、一编码起始密码子(ATG)的DNA分子和一终止子加入编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列中。该启动子的实例包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚单位编码基因的启动子(Fluhr等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)832358)、蓝曙红合酶基因启动子(Langridge等，Plant Cell Rep(1985)4355)、产生花椰菜花叶病毒19S-RNA的启动子(Guilley等，Cell(1982)30763)、产生花椰菜花叶病毒35S-RNA的启动子(Odell等，Nature(1985)313810)等等。该终止子的实例包括蓝曙红合酶基因的终止子(Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561)和章鱼碱合酶的终止子(Gielen等，EMBO J.(1984)3835)。
可以用任何通常已知方法，例如在“Plant genetic transformationand gene expression；a laboratory manual”(J.Draper，等编辑，BlackwellScientific Publications，1988)中描述的方法，将编码葡聚糖激发剂受体的DNA分子导入植物细胞中。这些方法的实例包括，诸如使用病毒或农杆菌的生物学方法和物理化学的方法，诸如电穿孔、聚乙二醇法、微注射、粒子枪法、葡聚糖法等等。
当欲转化的植物是双子叶植物时，一般优选使用农杆菌的方法。当欲转化的植物是单子叶植物或对农杆菌感染不敏感的双子叶植物时，最好用诸如电穿孔的物理/化学方法。做为将要转移目的DNA的植物材料，适当的材料可以根据转移方法等等选自叶、茎、根、块茎、原生质体、愈伤组织、花粉、种子胚、苗原基等。
当欲将目的DNA转移至培养植物细胞时，一般以原生质体做为材料，并用诸如电穿孔、聚乙二醇法等的物理/化学方法向其中转移该DNA。另一方面，当欲将目的DNA转移至植物组织时，使用叶、茎、根、块茎、愈伤组织、花粉、种子胚、苗原基等等做为材料；最好使用叶或茎。通过使用病毒或农杆菌的生物学方法或诸如粒子枪、微注射等等的物理/化学方法将该DNA转移至这种植物组织中；最好采用使用农杆菌的生物学方法。
为了由已转移了编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列的这类植物组织或植物细胞再生植株，假如它们得自自烟草，则可以在诸如无激素MS培养基的培养基中培养这些转化植株或细胞。可以将得到的生根的苗转移至土壤中以得到成长的植株。
做为可以通过用上述方法转移编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列并表达该葡聚糖激发剂受体而被赋予或增强抗致病性真菌的植物，可以提出对在细胞壁中含有葡聚糖的致病性真菌敏感的植物。这些植物的具体实例包括(但不限于)茄科植物和豆科植物。更具体地说，这些植物包括(但不限于)烟草、大豆、马铃薯、水稻、菊属和石竹属植物。
作为致病性真菌，本发明包括含那些在细胞壁中含有葡聚糖的致病性真菌。该致病性真菌的特定实例包括(但不限于)疫霉属、丝核菌属、Pyricularia属、柄锈菌属、镰孢属、单孢锈菌属和葡萄孢属。更具体地说，该致病性真菌包括(但不限于)芝麻疫霉、立枯丝核菌、Pyricularia oryza、堀柄锈菌、尖镰孢、石竹单孢锈菌和灰葡萄孢。
按照本发明，转移至植物中的编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列可以通过种子遗传至后代。因此，该转移的DNA序列也存在于那些由本发明植物的花粉或子房形成的种子中，并且该遗传性状可以传递给子代。因此，可以通过种子繁殖其中已转移了编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列的本发明植物，而不丧失其对致病性真菌的抗性。也可以通过采用植物组织培养的大规模繁殖方法或通过诸如插条、压条、嫁接、分株等常规技术繁殖本发明的植物，而不丧失其对致病性真菌的抗性。
可以用以下试验方法检测一转化植物是否具有抗真菌性。
通过将真菌菌丝体直接接种到植物中并观察病痕的扩大，可以检测对疫霉属真菌的抗性。或者，通过接种该真菌的游动孢子并观察病痕的形成和扩大可以检测该抗性。
通过将培养真菌细胞和土壤混合，在该土壤中播种或栽植植株并观察立枯病现象，可以检测对土壤真菌的抗性。
现在参考下列实施例可以更加详细地解释本发明，这些实施例决不限制本发明的范围。在下列实施例中，葡聚糖激发剂受体缩写为“ER”。实施例1大豆根葡聚糖激发剂受体的纯化1)测定ER的葡聚糖激发剂结合活性按照Jong-Joo Cheong(The Plant Cell(1991)3127)的方法，合成一激发剂(平均分子量10,000)和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD.)的复合物。用氯胺T给该激发剂-酪胺复合物标记碘。
将样品(蛋白量＜500μg)悬浮于500μl的检测缓冲液(50mMTris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mM MgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)并在0℃保温2小时。将7.0nM的碘标记激发剂-酪胺复合物(70Ci/mmol，摩尔数的计算基于假设该激发剂的分子量是10,000，这也适用于以下描述)加入该悬浮液中，将该混合物在4℃保温2小时。将该反应溶液通过用0.3％聚乙烯亚胺水溶液处理至少1小时的WhatmanGF/B过滤。残留物用5ml冰冷缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.0，1MNaCl，10mM MgCl2)洗涤三次。用γ计数器测定滤膜上保留的放射性活性(读数A)。为消除非特异性结合的影响，同样进行上述程序，但将17μM的该激发剂加入同一样品中，将该混合物悬浮于该检测缓冲液中，将该悬浮液在0℃保温2小时。将所得的读数从读数A中减去，得到激发剂特异性结合的读数(Δcpm)。将得到的读数(Δcpm)除以计数的总数，然后乘以试验中使用的激发剂的总量，以计算激发剂结合蛋白的量(以摩尔计)。
用上述方法检查ER的纯度。2)大豆根ER的纯化将大豆(Glycinemax栽培品种Green Homer)种子(Takayama SeedCo.)在蛭石中培养一周，然后溶液培养15天以收获根(约40kg，湿重)。将收获的根储存于-80℃直至将其用于ER纯化。将1.2L冰冷缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.0，、30mM MgCl2、2mM二硫苏糖醇、2.5mM焦亚硫酸钾和1mM PMSF)加入根(2kg，湿重)，用韦林氏搅切器将该混合物匀浆2分钟。
将得到的浆液通过Miracloth(Calbiochem Co.)过滤，将滤液于4℃、9,000rpm离心15分钟。将上清液于4℃、37,000rpm超离心20分钟。将沉淀悬浮于160ml冰冷缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mM MgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)以得到膜部分。将两性电解质去污剂ZW3-12(Boehringer Co.)加入该膜部分中，使最终浓度为0.25％，以加溶膜部分的ER，将该混合物于8℃搅拌30分钟。将得到的混合物于4℃、37,000rpm超离心20分钟，以收集含有加溶ER(可溶部分)的上清液。将该可溶部分(165ml)对2升缓冲液(50mMTris-HCl pH 8.0，0.2％ZW3-12，4℃)透析四次。将5ml Protrap(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)加入该样品中，将该混合物于8℃搅拌30分钟以除去样品中的蛋白酶并稳定ER。将得到的混合物于4℃、2,800rpm离心2分钟以收集上清液。将得到的上清液(160ml)用超滤膜YM-10(Amicon Co.)浓缩至约50ml，将浓缩液对A缓冲液(50mMTris-HCl pH8.0、0.1M蔗糖、5mM MgCl2、1mM PMSF、5mMEDTA和0.2％ZW3-12，4℃)透析。
将透析液上Q-Sepharose HP 26/10柱(Pharmacia Co.)，用0-1MNaCl线性梯度洗脱ER(Q-Sepharose活性部分，8ml)。在NaCl浓度约0.45M时，ER被洗脱。用A缓冲液将Q-Sepharose活性部分稀释三倍，将该稀释部分上Mono Q 10/10柱(Pharmacia Co.)。用0-1M NaCl线性梯度洗脱ER(Mono Q活性部分)。在NaCl浓度约0.25M时，ER被洗脱。
按下述，用以激发剂为配体的亲和层析凝胶纯化ER按照具有某些修改的N.T.Keen方法(Plant Physiol.(1983)71460，Plant Physiol.(1983)71466)制备激发剂。简言之，用酵母裂解酶100T(KIRIN BREWERY CO.，LTD.)处理致病性大雄疫霉glycinea种型小种1(ATCC34566)的菌丝体壁以释放激发剂。处理后，通过装在柱中的CM-纤维素吸附除去酵母裂解酶100T。将得到的透过部分用凝胶渗透层析G-75(Pharmacia Co.)纯化以收集平均分子量为10,000Da的激发剂部分。用M.Yoshikawa的方法(Nature(1978)257546)测定收集部分的glyceollin诱导激发剂活性。将8μg激发剂加入大豆子叶，导致在培养24小时后诱导约550μg glyceollin。
为消除凝胶载体上的非特异性吸附，收集Mono Q活性部分并与约33mg麦芽糖偶联玻璃凝胶(床体积约100μl)于8℃搅拌1小时。离心(1,000rpm，4℃，2分钟)沉淀该凝胶以收集上清液(麦芽糖偶联玻璃凝胶透过部分)。按照A.M.Jeffrey等的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1975)62608)制备麦芽糖偶联玻璃凝胶。简言之，将120mg麦芽糖和6g Glass Aminopropyl(Sigma Co.)悬浮于36ml H2O中，将该悬浮液于室温搅拌过夜。向得到的悬浮液中加入36ml乙醇。之后立即将硼氢化钠(864mg)的乙醇(72ml)溶液加入该混合物。将得到的混合物超声处理2分钟并在室温搅拌5小时。将水(288ml)加入该反应混合物中，用冰冷却得到的混合物并用乙酸调至pH 5.6。用约1.8升水洗涤该凝胶以除去游离的麦芽糖。通过J.H.Roe的方法(J.Biol.Chem.(1955)212335)，用蒽酮试剂定量测定洗涤溶液中含有的麦芽糖。从洗涤溶液中的麦芽糖含量估算凝胶偶联的麦芽糖量。结果，发现60mg的麦芽糖偶联到6g Glass Aminopropyl上。
将约17mg的激发剂偶联玻璃凝胶(床体积约50μl)加入8ml的麦芽糖偶联玻璃凝胶通过部分，将该混合物于8℃温和搅拌过夜。离心(1,000rpm，4℃，2分钟)收集该凝胶并用二倍床体积的A缓冲液洗涤二次。另外用四倍床体积的0.1％SDS洗涤该凝胶三次以收集凝胶偶联的ER(激发剂偶联玻璃凝胶洗脱部分)。按照A.M.Jeffrey等的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1975)62608)制备激发剂偶联玻璃凝胶。简言之，将激发剂(37mg)和Glass Aminopropyl(490mg)悬浮于6ml H2O中，并于室温搅拌过夜。向该悬浮液中加入乙醇(6ml)，之后立即加入硼氢化钠(144mg)的乙醇(72ml)溶液。将该混合物超声处理2分钟并在室温搅拌5小时。将48ml水加入得到的混合物中。用冰冷却该混合物并用乙酸调至pH5.6。用蒽酮试剂定量测定游离激发剂。从洗涤溶液中的游离激发剂含量估算凝胶偶联的激发剂量。结果，发现34mg的激发剂被偶联至490mg Glass Aminopropyl。
上述纯化步骤中的蛋白量和ER量概述于表1中。
表1.纯化步骤中蛋白量和ER量(湿重40kg的大豆根用作原材料)蛋白(mg) ER(pmol)膜部分 1790030可溶部分 2000 214Q-Sepharose活性部分190 205Mono Q活性部分 49 233麦芽糖偶联玻璃凝胶 45 220通过部分激发剂偶联玻璃凝胶 0.004*45洗脱部分*根据SDS-PAGE后银染获得的条带强度估算。
将Mono Q活性部分、麦芽糖偶联玻璃凝胶透过部分和激发剂偶联玻璃凝胶洗脱部分在一电泳梯度凝胶SDS-PAGE板10/20(DaiichKagaku Yakuhin Co.)上电泳并进行银染(Daiich Kagaku Yakuhin Co.)。电泳图示于图1。在图1中，泳道1是Mono Q活性部分，泳道2；麦芽糖偶联玻璃凝胶通过部分，泳道3；激发剂偶联玻璃凝胶洗脱部分。图1展示在约70,000 Da分子量处检测到ER条带。
通过使用125I标记的光亲和性试剂SASD(Pierce Co.)和该激发剂的复合体，给分子量约70,000的该蛋白质进行125I标记。用western印迹法将膜部分的SDS-PAGE条带转移至PVDF膜上，并同与测定PVDF膜上ER的激发剂结合活性使用的相同的125I标记激发剂一起保温，使得分子量约70,000 Da的该蛋白质被125I标记。这些事实显示分子量约70,000 Da的该蛋白质有激发剂结合活性。
通过上述方法从湿重约40kg的大豆根纯化约4μg ER。3)ER片段化肽的分析用蛋白酶消化将ER片段化为肽。通过Iwamatsu的方法(AkihiroIwamatsu，Seikagaku(1991)63139，A.Iwamatsu，Electrophoresis(1992)13142)确定该片段化肽的氨基酸序列。将用上述方法纯化的ER溶液用Centricon-30(Amicon Co.)浓缩至约100μl并进行10-20％聚丙烯酰胺SDS电泳。将得到的蛋白条带用电泳吸印装置(Sartrius Co.)转移至PVDF膜(Millipore Co.)。用0.1％Ponceau S(Sigma Co.)/1％乙酸对转移至PVDF膜上的条带染色。将分子量70,000 Da处的主带切出并用0.5mM NaOH脱色。该带被还原性E-羧甲基化。以酶∶底物(mol∶mol)为1∶100的比例将赖氨酰内肽酶(AP-1)加入得到的条带中，将该混合物于30℃反应16小时。将得到的片段化肽上μ-Bondasphere 5μC8-300(2.1×150mm，Waters)柱，该柱用98％溶剂A和2％溶剂B平衡，以0.25ml/分钟的流速用2-50％溶剂B线性梯度洗脱30分钟(溶剂A0.05％TFA溶液，溶剂B含0.02％TFA的2-丙醇∶乙腈＝7∶3(v/v))。以在214nm的吸收值检测洗脱肽，手动收集每个峰部分。用气相蛋白测序仪(Applied Biosystems的470A型)分析得到的峰部分。做为得到的所有峰部分的分析结果，清楚地确定了该片段化肽的下列氨基酸序列。#1Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Asn Ile Ser Pro Gln(N-末端)(SEQID NO5)#5Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Ser(SEQ ID NO6)#6Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp(SEQ ID NO7)#7Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile Lys(混合序列)(SEQ ID NO8)实施例2大豆ER基因的克隆1)制备大豆mRNA将大豆(Glycinemax栽培品种Green Homer)种子(Takayama SeedCo.)在蛭石中培养一周，然后溶液培养15天以收获根(约40kg，湿重)。将一部分收获的根储存于-80℃直至使用。按照Ishida的方法(CellTechnology Laboratory Manipulation Manual，Kodansha Scientific)得到总RNA。简言之，将储存的根(28.5g，湿重)在研钵上边研磨边加液氮。向得到的粉末中加入保持于65℃的35.6ml GTC溶液，将该混合物用韦林氏搅切器匀浆。将得到的悬浮液于室温、6,000rpm离心15分钟以收集40ml的上清液。将该上清液轻轻地铺于离心管中的铯垫层溶液上，于25℃、35,000rpm离心20小时。将得到的沉淀溶于9ml的TE/0.2％SDS中。进行两次酚/氯仿抽提后，通过乙醇沉淀回收总RNA(4.37mg)。
按照该手册，得到的总RNA(2.2mg)用oligotex dt30(Japan RocheCo.)纯化，然后得到68μg纯化的poly(A)+RNA。2)制备大豆cDNA文库按照该手册，用cDNA合成药盒(Pharmacia Co.)由5μg的该poly(A)+RNA合成cDNA分子。用T4连接酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)将这些合成cDNA片段与λ噬菌体载体λgt10(Stratagene Co.)连接。使用Gigapack(Stratagene Co.)将一DNA混合物包入噬菌体颗粒中，以制备约1.5×106pfu.的大豆cDNA文库。将该文库扩增至160ml1.6×1011pfu/ml的大豆cDNA文库。
按下述制备该cDNA文库内的总DNA向500μl的噬菌体溶液(1.6×1011pfu/ml)中加入等量的氯仿/异戊醇(24∶1)。将该混合物振荡30秒并离心收集水层。将该水层再次用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提。向得到的水层中加入5μl 3M乙酸钠溶液(pH 5.4)和125μl乙醇，并将该混合物离心以收集沉淀。将沉淀用70％乙醇溶液洗涤并溶于含有1μg/ml RNase A(Sigma Co.)的10mM Tris-HCl溶液(pH8)。将该溶液用作PCR的模板。3)通过PCR扩增和克隆大豆ER cDNA片段在实施例1得到的片段化肽氨基酸序列的基础上(#5和#6)，用自动核酸合成仪(Applied Biosystems Co.的394型)合成下列四种寡聚脱氧核苷酸(混合引物U5、U7、U10和U12)引物U5 5′-AARAGYATHGAYGGNGA-3′(SEQ ID NO9)引物U7 5′-WRTCNCCNACNAC-3′(SEQ ID NO10)引物U10 5′-GTNAAYAARATNCARAC-3′(SEQ ID NO11)引物U12 5′-ARRTTNAGRAARTCYTC-3′(SEQ ID NO12)(RA/G，YC/T，WA/T，HA/C/T，NA/G/T/C)将0.5μg的cDNA文库中的总DNA溶于79μl蒸馏水。将或者引物U5和U7的组合或者引物U10和U12的组合(每种100pmol)与0.5μl Taq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)一起加入8μl含2.5mM dNTP的10μl 10×PCR缓冲液中(TAKARA SHUZO CO.，LTD.的Taq DNA聚合酶附带的)使最终量为100μl。用Gene Amp PCRSystem 9600(Perkin-Elmer Co.)进行50个循环的PCR反应1)94℃×30秒变性，2)47℃×30秒复性和3)72℃×1分钟延伸。反应后，将15μl的反应溶液在15％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将该凝胶用0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色10分钟。在紫外灯下观察并切出显示预期扩增的40bp和47bp的特异性扩增片段的条带。将该凝胶切片用槊料棒研磨并用洗脱缓冲液(0.5M乙酸铵、10mM乙酸镁、1mM EDTA和1％SDS)洗脱过夜以收集含DNA的溶液。
用pT7Blue T-Vector药盒(Novagene Co.)将收集的DNA片段克隆入质粒pT7Blue(R)。用荧光自动DNA测序仪(Applied Biosystems Co.的373A型)对得到的质粒p#5-1、2和p#6-1、2、3、4、5、6、7、8和9测序。结果显示除了引物之外，得到的扩增DNA片段也编码片段化肽#5和#6的氨基酸序列。
在该DNA测序的基础上，用自动核酸合成仪合成下列两种寡聚脱氧核苷酸(混合引物U18和U19)。引物 U18 5′-AAGTAYAAGCCRCAAGCCTATTCA-3′(SEQ ID NO13)引物 U19 5′-ATCGCCRACAACMCCAA-3′(SEQ ID NO14)(Y和R按上述定义，MA/C)将0.5μg cDNA文库内的总DNA溶于79μl蒸馏水。将引物U18和U19的组合(每种100pmol)与0.5μl Taq DNA聚合酶一起加入8μl含2.5mM dNTP的10μl 10×PCR缓冲液中，使最终量为100μl。进行40个循环的PCR反应1)94℃×30秒变性，2)52℃×30秒复性和3)72℃×1分钟延伸。反应后，将15μl的反应溶液在1％琼脂糖凝胶上电泳。
将该凝胶用0 5μg/ml溴化乙锭溶液染色15分钟。在紫外灯下观察并切出显示约540bp的特异性扩增片段的条带。将该凝胶切片用Gene Clean II(Bio101 Co.)处理以收集含DNA的溶液。
用pT7Blue T-Vector药盒将收集的DNA片段克隆进入质粒pT7Blue(R)。用荧光测序仪对得到的质粒p#5-#6测序。结果显示该扩增DNA片段由539bp组成，并且不仅编码两边片段化肽#5和#6的氨基酸序列，而且编码该扩增部分的肽#7。4)通过杂交筛选和克隆文库将其中克隆了ER cDNA片段的质粒#5-#6用限制性酶BamHI和PstI消化。回收约540bp的DNA片段并将其用做探针。按照手册用Megaprime DNA标记系统(Amersham Co.)将该回收DNA片段用[α-32P]dCTP标记，并将该反应溶液用于杂交实验。
将该cDNA文库的噬菌体用大肠杆菌C600 hfl(Invitrogen Co.)感染，并接种至约15cm直径平板上的含有10mg/ml MgCl2的L培养基，以形成总共约1×106个噬菌斑。将这些噬菌斑印迹至尼龙膜(Hybond-N；Amersham Co.)。该膜与32P-dCTP标记的ER cDNA片段反应，用放射自显影检测到的阳性噬菌体用同样方法重新筛选，得到约30个具不同信号强度的噬菌体克隆。选择具有最长的插入DNA片段的克隆λER23。
用LambdaSorb(Promega Co.)从杂交实验中分离的阳性克隆λER23溶液中纯化λ噬菌体的DNA分子。将10微升10xEcoRI酶切缓冲液(限制性酶EcoRI 10U)加入5μg的该DNA溶液，使总量为100μl，将该混合物在37℃反应过夜。将该反应溶液在1％琼脂糖凝胶上电泳。切出约2.3kb的条带并用Gene Clean II(Bio101 Co.)处理以收集含DNA的溶液。用限制性酶EcoRI酶切载体pBluescriptII KS-(0.02μg)(Stratagene Co.)。
在这两种DNA溶液混合后，加入2μl的10x连接酶缓冲液和0.2μl的T4 DNA连接酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD)，使总量为20μl。将该混合物在16℃反应4小时，并将该反应混合物溶液用于转化大肠杆菌DH5α(Gibco BRL Co.)。用25ml含有50μg/ml氨苄青霉素、40μg/ml IPTG和40μg/ml X-gal的L培养基制备2％琼脂平板培养基。将该转化的大肠杆菌接种至该琼脂平板培养基并在37℃生长过夜。从形成的菌落里挑选白色的菌落，并在3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的L培养基中于37℃培养8小时。用碱法从这些细菌细胞中回收质粒并用该限制性酶确定它们是否是克隆了所需片段的克隆，由此产生与载体取向相反的质粒pER23-1和pER23-2(5225 bp)。质粒pER23-1和pER23-2的图谱示于图2。5)测定ER编码克隆的核苷酸序列使用荧光测序仪从两个方向测定质粒pER23-1和pER23-2的DNA核苷酸序列1)使用用适当限制性酶消化的质粒pER23-1和pER23-2，2)使用在有关已测定核苷酸序列的信息的基础上合成的适当的引物，或3)用限制性酶KpnI和XhoI酶切pER23-1，用限制性酶KpnI和ClaI酶切pER23-2，然后使用千序列缺失药盒(kilosequence deletionkit)(TAKARA SHUZO CO.，LTD)制备具有间隔约200-300bp的缺失的质粒。该DNA核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO2。结果显示该DNA片段含有编码667个氨基酸的2001bp的开放读框，后者起始于对应于用氨基酸测序仪测开发解读框架序的N末端序列(片段化肽#1)的核苷酸序列。该氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO1。从得到的DNA核苷酸序列推断的氨基酸序列与先前测定的大豆ER的氨基酸序列一致。
另外，使用核酸和氨基酸序列数据库(EntrezNCBI)、用核酸和氨基酸序列分析软件包(MacVectorKodak Co.)检索高度同源的氨基酸序列。然而，没有发现与此已知序列高度同源的氨基酸序列。因此，很清楚，该制备的ER是一新蛋白质。实施例3大豆ER在烟草植株中的表达1)构建植物表达质粒pKV1-ER23如图3所示，按下述从含有花椰菜花叶病毒35S启动子的质粒pCaP35J(J.Yamaya等，(1988)Mol.Gen.Genet.211520)制备用于本实施例的植物表达载体pKV1用限制性酶BamHI彻底消化质粒pCaP35J以切除存在于该35S启动子上游的多克隆位点。用PvuII部分消化后，用Klenow片段(TAKARA SHUZO CO.，LTD)处理以产生平端。通过连接将得到的质粒DNA环化并导入大肠杆菌DH5α。从得到的克隆中选择所需质粒。将选择的质粒用限制性酶PstI消化，以插入存在于该35S启动子下游的多克隆位点。用Klenow片段处理以产生平端。将得到的质粒DNA用HindIII消化。用自动核酸合成仪合成下列合成接头DNA，将其退火并与HindIII消化的质粒连接。将得到的质粒DNA导入大肠杆菌DH5α。从得到的克隆中选择所需质粒pCaP35Y(2837bp)。5′-GGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA-3′(SEQ ID NO15)5′-CCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGA-3′(SEQ IDNO16)为将蓝曙红合酶终止子导入该pCaP35Y，用SacI和EcoRI消化质粒pBI121(Clontech Co.)，将该SacI-EcoRI片段用Klenow片段处理以产生平端；然后，将得到的pBI121片段与在其35S启动子下游的HindIII位点产生平端的质粒pCaP35Y连接。将得到的质粒DNA导入大肠杆菌DH5α。从得到的克隆中选择所需质粒。为将卡那霉素抗性盒导入该选择的质粒，将后者用PvuII消化并与pLGVneo1103的片段(约1620bp)(R.Hain等，(1985)Mol.Gen.Genet.199161)连接，该片段通过以下步骤得到在章鱼碱合酶终止子下游的PvuII位点切割，用Ba131(TAKARA SHUZO CO，LTD)处理以产生缺失，在蓝曙红合酶启动子上游EcoRI位点切割，并在这两端都产生平端。将得到的质粒DNA导入大肠杆菌DH5α。从得到的克隆中选择所需质粒或植物表达载体pKV1(4828bp)。
将制备的pKV1在独特的位点用限制性酶BamHI和SalI消化，并连接含有ER基因的片段(即pER23-1的BamHI-SalI片段，约2.3kbp)。将得到的质粒DNA导入大肠杆菌DH5α。从得到的克隆中选择所需ER表达质粒pKV1-ER23(约7.1kbp)。2)ER在培养烟草细胞中的瞬时表达通过部分修改的Watanabe的方法(Y.Watanabe(1987)FEBS 21965)，用电穿孔将ER基因导入培养烟草细胞，以瞬时表达ER。用碱法纯化质粒pKV1-ER23的DNA分子。通过Hirai等的方法(Plant CellCultivation Manual，Gakkai Shuppan Center，1982)得到培养烟草细胞，以用于ER瞬时表达。烟草种子(变种Bright Yellow，由东京大学的Hirofumi Uchimiya教授提供)用1％次氯酸钠溶液灭菌，然后发芽。将刚发芽的烟草幼生组织移植至烟草培养琼脂培养基(MS培养基(FlowLaboratories Co.)，补加了2 ppm 2，4-二氯苯氧乙酸、3％蔗糖和8％琼脂)，以在三周后诱导愈伤组织。将约1g的愈伤组织块悬浮于50ml烟草培养培养基(MS培养基(Flow Laboratories Co.)，补加了2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸、3％蔗糖)以制备培养细胞。培养这些烟草细胞直至它们进入对数生长期。离心收集这些培养细胞(600rpm，3分钟)，并悬浮于一溶液中，该溶液含有1％纤维素酶Onozuka(Yakult Co.)、1％Dricelase(Kyowa Hakko Co.，Ltd)、0.1％Pectriase(Seishin Seiyaku Co.)和0.4 M D-甘露醇(Wako Pure Chemicals Co.，Ltd.)并用HCl调至pH5.7。于30℃反应90分钟以制备原生质体。于4℃用0.4 MD-甘露醇通过三次离心洗涤该反应溶液以除去酶液。电穿孔的操作包括将1×106细胞悬浮于0.8ml的电穿孔溶液中(70mM KCl、5mM MES和0.3M甘露醇)、将该悬浮液与10μg的pKV1-ER23 DNA分子混合以及用基因脉冲发生器(Biorad Co.)于125μF和300V在一电穿孔池(BioradCo，电极距离0.4cm)中处理该混合物。处理后，用巴斯德吸管收集该溶液并置于冰上30分钟。在30℃反应5分钟，并将该反应溶液重悬浮于原生质体培养基(MS培养基(Flow Laboratories Co.)，补加了0.2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸、1％蔗糖和0.4M甘露醇并调至pH 5.7)。将细胞于25℃黑暗静置过夜并离心(8,000rpm，3分钟)收集。将60微升的悬浮缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.0、30mM MgCl2、2mM二硫苏糖醇、2.5mM焦亚硫酸钾和1mM PMSF)加入细胞中，在涡旋器上搅拌该混合物3分钟。将得到的样品储存于-80℃，直至进行激发剂结合实验。
对于对照，重复进行上述程序，但是将pKV1的DNA分子而不是pKV1-ER23的DNA分子导入烟草细胞。3)ER在烟草悬浮培养细胞中的稳定表达按下述，从能够瞬时表达ER的培养烟草细胞选择能够恒定保留ER基因的转化培养烟草细胞将在制备能够瞬时表达ER的培养烟草细胞中得到的原生质体悬浮于含有1％琼脂糖的原生质体培养基(MS培养基(Flow LaboratoriesCo.)，补加了0.2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸、1％蔗糖和0.4M甘露醇并调至pH 5.7)。在琼脂糖固化之前，用滴液吸液管将该悬浮液滴至一平板上，藉此原生质体被固定在珠状固体培养基中。琼脂糖固化后，将无琼脂糖原生质体培养基加至该平板，由此将原生质体固定琼脂培养基浸入该液体培养基中。原生质体黑暗培养一周后，加入卡那霉素，使最终浓度为100μg/ml并继续进行培养。将从生长的群落中选择的转化子转移至含有卡那霉素的液体培养基并进行培养。
得到两个稳定转化pKV1-ER23的培养烟草细胞克隆(I1和I6)和两个稳定转化pKV1的培养烟草细胞克隆(C2-1和C2-4)。4)激发剂结合活性实验按照下述测定激发剂结合活性按照Jong-Joo Cheong(The Plant Cell(1991)3127)的方法，合成一激发剂和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD.)的复合物。用氯胺T给该激发剂-酪胺复合物标记碘。将得到的样品(蛋白量＜500μg)悬浮于500μl的检测缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4、0.1M蔗糖、5mMMgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)并在0℃保温2小时。将100nM(70 Ci/mmol)碘标记的激发剂-酪胺复合物加入该悬浮液中，将该混合物在4℃保温2小时。将该反应溶液通过Whatman GF/B(用0.3％聚乙烯亚胺水溶液处理至少1小时)过滤，并用5ml冰冷缓冲液(10mMTris-HCl pH7.0、1M NaCl、10mM MgCl2)洗涤三次。用γ计数器测定滤膜上保留的放射性活性(读数A)。为消除非特异性结合的影响，同样进行上述程序，但将17μM的该激发剂加入同一样品中，将该混合物悬浮于该检测缓冲液中，将该悬浮液在0℃保温2小时。将所得的读数从读数A中减去，得到激发剂特异性结合的读数(Δcpm)。将得到的读数(Δcpm)除以计数的总数，然后乘以试验中使用的激发剂的总量，以计算激发剂结合蛋白的量(以摩尔计)。
结果，在用pKV1-ER23 DNA分子转化的烟草细胞中观察到对激发剂的特异性结合，而在导入pKV1 DNA分子的对照烟草细胞中没有观察到对激发剂的特异性结合(表2)。该事实表明，上述得到的基因编码具有激发剂结合活性的蛋白质。表2.培养烟草细胞的激发剂结合活性部分转化DNA 结合活性(fmol/mg)瞬时表达 pKV1 ＜0pKV1-ER23 90.5稳定表达C2-1pKV1 ＜0C2-4pKV1 ＜0I1pKV1-ER23 150I6pKV1-ER23 1965)通过加入葡聚糖激发剂在转化烟草培养细胞中胞内Ca2+浓度的瞬时增加植物通过特异性受体识别该激发剂，然后促进积累植物抗毒素或诱导超敏反应以防止真菌侵犯。已经报道对一些植物而言，在这类抗性反应的早期钙离子向细胞内的流入是重要的(U.Conrath等，(1991)FEBS LETTERS 279141，M.N.Zook等(1987)Plant Physiol.84520，F.Kurosaki等(1987)Phytochemistry 261919；C.L.Preisig和R.A.Moreau(1994)Phytochemistry 36857)。有报告建议钙离子流入细胞触发大豆中植物抗毒素积累的启动，而本发明人正是用大豆得到ER(M.R.Stab和J.Ebel(1987)Archi.Biochem.Biophys.257416)。因此，如果通过将该ER基因导入无ER烟草培养细胞制备转化培养烟草细胞以表达ER，丙醛如果通过加入葡聚糖激发剂改变胞内钙离子浓度，预期这种改变将在除了大豆之外的植物(例如烟草)中触发由该葡聚糖激发剂引起的抗性反应，由此使得它们对以葡聚糖做为菌丝体壁组分的种类繁多的真菌显示抗性。
测定了通过加入该激发剂的转化培养烟草细胞的胞内Ca2+浓度的变化。
在该实验中，使用通过卡那霉素选择得到的转化培养烟草细胞(I6)和含有质粒的培养烟草细胞(C2-4)。
按下述，用Ca2+测量的荧光螯合剂(Fura-2)的乙酸基甲基衍生物(Fura-2 AM)测定培养细胞的胞内Ca2+浓度通过离心(600rpm，30秒)从约2ml该转化烟草细胞培养物(相当于静置10分钟后的约250μl的细胞体积)收获细胞并除去上清液。向细胞中加入2ml烟草培养的培养基并温和搅拌该混合物，离心(600rpm，30秒)除去上清液。重复同样的操作以洗涤该培养细胞。将洗涤过的培养细胞均匀地悬浮于2ml的该培养基中。向1ml该培养细胞在培养基中的悬浮液中加入1ml的该培养基和4μl的1mM Fura-2 AM(最终浓度2μM，Dojin Chemical Co.)，将该混合物黑暗培养30分钟并偶尔进行搅拌。接着，通过离心(600rpm，30秒)用2ml的该培养基洗涤这些细胞二次，以消除未渗入该细胞的游离Fura-2 AM。将该洗涤的培养细胞均匀地悬浮于2ml的该培养基中，将该悬浮液(2ml)转移至荧光测定池。在胞内酯酶的水解作用下，渗入的Fura-2 AM应变为Fura-2。在335nm激发光下，于505nm的荧光波长测定Fura-2与胞内Ca2+结合产生的荧光，同时搅拌培养细胞以确保培养细胞不沉淀。通过测定向培养细胞加入50μl葡聚糖激发剂(1mg/ml)或去离子水后特定时间间隔式的荧光强度，检测胞内Ca2+浓度的变化。对于对照，按照上述同样方法检测含有质粒的培养烟草细胞的胞内Ca2+浓度变化。对于另一个对照，按照上述同样方法检测培养大豆细胞的胞内Ca2+浓度变化，只是用以下配方的大豆细胞培养基洗涤该培养细胞。NaH2PO4·H2O 75mg/ml、KH2PO4170mg/ml，KNO32,200mg/ml、NH4NO3600mg/ml、(NH4)2SO467mg/ml、MgSO4·7H2O 310mg/ml、CaCl2·2H2O 295mg/ml、FeSO4·7H2O 28mg/ml、EDTA·Na237.3mg/ml、KI 0.75mg/ml、MnSO4·4H2O 10.0mg/ml、H3BO33.0mg/ml、ZnSO4·7H2O 2mg/ml、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/ml、CuSO4·5H2O 0.025mg/ml、CoCl2·6H2O 0.025mg/ml、肌醇100mg/ml、烟酸1.0mg/ml、盐酸吡哆醇1.0mg/ml、盐酸硫胺素10.0mg/ml、葡萄糖5g/ml、蔗糖25g/ml、木糖250mg/ml、丙酮酸钠5.0mg/ml、柠檬酸10.0mg/ml、苹果酸10.0mg/ml、延胡索酸10.0mg/ml、N-Z-胺500.0mg/ml、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/ml和玉米素(Zeatine)核苷0.1mg/ml，用KOH调至pH5.7。
做为该实验的结果，加入该激发剂3分钟后，在培养大豆细胞中观察到荧光强度约7％的瞬时增加，而在加入去离子水后则未观察到这种变化(图4)。该结果提示在该实验中可以观察到该ER与该葡聚糖激发剂结合引起Ca2+瞬时流入细胞的现象，由此支持钙离子在培养大豆细胞中的激发剂引起的抗性反应中起重要作用的报道。在转化培养烟草细胞中，加入该激发剂3分钟后，观察到荧光强度约10％的瞬时增加，而在加入去离子水后则未观察到这种变化。
在含有质粒的培养烟草细胞中，加入该激发剂后，没有观察到任何在这些转化培养烟草细胞中发生的荧光强度的变化(图5)。
这些结果表明，通过导入得自大豆的葡聚糖激发剂受体基因以表达ER，除大豆之外的不与该葡聚糖激发剂反应的植物(例如烟草)获得了该反应性。尽管尚未完全阐明每种植物的该信号传导途径，预期通过导入现在的ER基因以表达ER，除烟草之外的植物将获得与该葡聚糖激发剂的反应性(即胞内Ca2+浓度的瞬时增加)，由此使得可以开发对以葡聚糖做为菌丝体壁组分的种类繁多的真菌具有抗性的植物。实施例4在大肠杆菌中表达大豆ER并测定激发剂结合域1)在大肠杆菌中表达激发剂结合域用蛋白融合和纯化系统(New England Biolabs Co.)制备该大豆ER的部分片段与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白以在大肠杆菌中表达该大豆ER的部分片段。以pER23-1做为模板进行PCR以制备不同长度的DNA片段。设计引物，以通过在编码图6所示大豆ER的全长部分和片段的DNA分子外的5’侧加入一BamHI位点、在3’侧加入一SalI位点，产生克隆入质粒pMAL-c2(New England Biolabs Co.)的该MBP融合蛋白。用自动核酸合成仪(Applied Biosystems Co.的394型)合成这些引物。下列引物用于该DNA链的扩增。引物U35 5′-ATGGATCCATGGTTAACATCCAAACC-3′(SEQ ID NO17)；引物U36 5′-ATGGATCCGAATATAACTGGGAGAAG-3′(SEQ ID NO18)；引物U37 5′-ATGGATCCCCAGCATGGGGTAGGAAG-3′(SEQ ID NO19)；引物U38 5′-TAGTCGACTACTTCTCCCAGTTATATTC-3′(SEQ ID NO20)；引物U39 5′-TAGTCGACTACTTCCTACCCCATGCTGG-3′(SEQ ID NO21)；引物U40 5′-TAGTCGACTATTCATCACTTCTGCTATG-3′(SEQ ID NO22)；引物U41 5′-ATGGATCCGCCCCACAAGGTCCCAAA-3′(SEQ ID NO23)；和引物U42 5′-ATGGATCCAATGACTCCAACACCAAG-3′(SEQ ID NO24)将pER23-1的DNA分子(0.01μg)溶于79μl蒸馏水。将或者引物U5和U7的组合或者引物U10和U12的组合(每种100pmol)与0.5μlTaq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)一起加入8μl含2.5mMdNTP的10μl 10×PCR缓冲液中(TAKARA SHUZO CO.，LTD.的TaqDNA聚合酶附带的)使最终量为100μl。用Gene Amp PCR系统9600(Perkin-Elmer Co.)进行30个循环的PCR反应1)94℃×30秒变性，2)55℃×30秒复性和3)72℃×1分钟延伸。反应后，15μl的反应溶液用限制性酶BamHI和SalI消化，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。
将该凝胶用0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色15分钟。在紫外灯下观察并切出显示预期特异性扩增的条带。将该凝胶切片用Gene CleanII(Bio101 Co.)处理，以收集含DNA的溶液。将收集的DNA片段克隆入质粒pMAL-c2的BamHI-SalI位点，并将该克隆导入大肠杆菌DH5α。2)从大肠杆菌制备可溶蛋白部分将导入这些质粒的大肠杆菌细胞在表达培养基[10g/l胰蛋白胨(Gibco Co.)、5g/l酵母膏(Gibco Co)、5g/l NaCl、2g/l葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素]上预培养。将预培养溶液(0.4ml)加入40ml该表达培养基中，并于37℃振荡培养直至OD600达到0.55。将异丙基硫代半乳糖苷加入该培养溶液中，使最终浓度为0.3mM，再继续进行该振荡培养4小时以诱导表达。通过离心收集该大肠杆菌，并用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4、200mM NaCl和1mM EDTA)洗涤这些大肠杆菌细胞。对细胞超声处理共2分钟(15秒×8)。向超声处理过的细胞中加入ZW3-12使最终浓度为0.25％，并将该混合物于4℃保温30分钟。离心(10,000rpm，5分钟)收集上清液，以得到大肠杆菌可溶蛋白部分。通过免疫印迹技术，用抗麦芽糖结合蛋白抗体(New EnglandBiolabs Co.)证实该融合蛋白的表达。3)激发剂结合实验按下述测定激发剂结合活性按照Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)，合成一激发剂和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD.)的复合物。用氯胺T给该激发剂-酪胺复合物标记碘。将得到的样品(蛋白量＜800μg)悬浮于500μl的检测缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mM MgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)并在0℃保温2小时。将100nM(70 Ci/mmol)该碘标记的激发剂-酪胺复合物加入该悬浮液中，将该混合物在4℃保温2小时。将该反应溶液通过Whatman GF/B(用0.3％聚乙烯亚胺水溶液处理至少1小时的)过滤，并用5ml冰冷缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.0、1M NaCl、10mM MgCl2)洗涤三次。用γ计数器测定滤膜上保留的放射性活性(读数A)。为消除非特异性结合的影响，同样进行上述程序，但将17μM的该激发剂加入同一样品中，将该混合物悬浮于该检测缓冲液中，将该悬浮液在0℃保温2小时。将所得的读数从读数A中减去，得到激发剂特异性结合的读数(Δcpm)。将得到的读数(Δcpm)除以计数的总数，然后乘以试验中使用的激发剂的总量，以计算该激发剂结合蛋白的量(以摩尔计)。
结果，在用编码该ER的DNA分子转化的大肠杆菌中观察到与激发剂的特异性结合(图6)。因此，证实了该得到的基因编码具有激发剂结合活性的蛋白质，并且表明在SEQ ID NO1的239-442氨基酸序列中有一激发剂结合域。实施例5用抗激发剂结合域抗体抑制大豆子叶膜部分中葡聚糖激发剂与激发剂结合蛋白的结合以及抑制大豆子叶中植物抗毒素的积累1)在大肠杆菌中表达激发剂结合域用蛋白融合和纯化系统(New England Biolabs Co.)制备来自该ER的激发剂结合域与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白，以在大肠杆菌中大量表达该激发剂结合域。进行PCR以产生编码该激发剂结合域的DNA分子。用自动核酸合成仪(Applied Biosystems Co.的394型)合成下列引物引物U36 5′-ATGGATCCGAATATAACTGGGAGAAG-3′(SEQ ID NO25)；和引物U39 5′-TAGTCGACTACTTCCTACCCCATGCTGG-3′(SEQ ID NO26)将pER23-1的DNA分子(0.01μg)溶于79μl蒸馏水。将或者引物U5和U7的组合或者引物U10和U12的组合(每种100pmol)与0.5μlTaq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)一起加入8μl含2.5mMdNTP的10μl 10×PCR缓冲液中(TAKARA SHUZO CO.，LTD.的TaqDNA聚合酶附带的)使最终量为100μl。用Gene Amp PCR系统9600(Perkin-Elmer Co.)进行30个循环的PCR反应1)94℃×30秒变性，2)55℃×30秒复性和3)72℃×1分钟延伸。反应后，将15μl的反应溶液用限制性酶BamHI和SalI消化，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。
将该凝胶用0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色15分钟。在紫外灯下观察并切出显示特异性扩增的条带。将该凝胶切片用Gene CleanII(Bio101 Co.)处理，以收集含DNA的溶液。将收集的DNA片段克隆入质粒pMAL-c2的BamHI-SalI位点，并将该克隆导入大肠杆菌DH5α。2)在大肠杆菌中表达的该融合蛋白的纯化和抗体的制备将用质粒转化的大肠杆菌细胞在表达培养基(10g/l胰蛋白胨(Gibco Co.)、5g/l酵母膏(Gibco Co.)、5g/l NaCl、2g/l葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素)上预培养过夜。将预培养溶液(150ml)加入1.5L该表达培养基中，并在Sakaguchi烧瓶中于37℃振荡培养，直至OD600达到0.55。将异丙基硫代半乳糖苷加入该培养溶液中，使最终浓度为0.3mM，再继续进行该振荡培养4小时以诱导表达。通过离心收集该大肠杆菌，并用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4、200mM NaCl和1mM EDTA)洗涤大肠杆菌细胞。对细胞超声处理共2分钟(15秒×8)。离心得到可溶蛋白部分。用直链淀粉树脂从该部分纯化MBP融合蛋白。用因子Xa切割MBP结合域和激发剂结合域，通过凝胶过滤柱层析纯化该激发剂结合域。用E.Harlow和D.Lane的方法(Antibody(1988)Cold Spring Harbor Co，第53-137页)，二次将该纯化蛋白注射至小鼠腹腔进行免疫。通过ELISA法证实效价增加后，得到腹水并用50％饱和硫酸铵沉淀和用蛋白A Sepharose(Pharmacia Co.)处理，以产生纯化的抗体。在用蛋白A Sepharose处理时，用0.1M磷酸钠(pH 8.0)将该抗体结合到蛋白A Sepharose上，并用0.1M柠檬酸(pH 3.5)洗脱。已通过免疫印迹证实该得到的抗体仅识别大豆的该ER蛋白。3)制备大豆子叶膜部分按下述制备大豆子叶膜部分向在土壤中培养9天的大豆子叶(湿重36g)中，加入47ml的冰冷缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.0、30mM MgCl2、2mM二硫苏糖醇、2.5mM焦亚硫酸钾和1mM PMSF)，用韦林氏搅切器将该混合物匀浆，然后通过离心分级分离形成子叶膜部分的沉淀；该程序与实施例1的第2)节描述的制备大豆根膜部分的程序相同。将该子叶膜部分悬浮于冰冷缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mMMgCl2、1mM PMSF、5mM EDTA)并储存于-80℃。4)葡聚糖激发剂与大豆子叶膜部分激发剂结合蛋白结合的抑制的测定按下述测定激发剂结合活性按照Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)，合成一激发剂和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD.)的复合物。用氯胺T给该激发剂-酪胺复合物标记碘。将大豆子叶膜部分(100μl，820μg)悬浮于500μl的检测缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mMMgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)并在0℃保温2小时。将714ng(143nM；70Ci/mmol)该碘标记的激发剂-酪胺复合物加入该悬浮液中，将该混合物在4℃保温2小时。将该反应溶液通过WhatmanGF/B(用0.3％聚乙烯亚胺水溶液处理至少1小时的)过滤，并用5ml冰冷缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.0、1M NaCl、10mM MgCl2)洗涤三次。用γ计数器测定滤膜上保留的放射性活性(读数A)。为消除非特异性结合的影响，同样进行上述程序，但将100倍摩尔(75μg，15μM)的冷激发剂加入同一样品中，将该混合物悬浮于该检测缓冲液中，将该悬浮液在0℃保温2小时。将所得的读数从读数A中减去，得到激发剂特异性结合的读数(Δcpm)。将加入3.6、7.1、10.8、14.4和28.8μg的该纯化抗体而不是该冷激发剂得到的读数从读数A中减去。将得到的值与减去该冷激发剂读数得到的值比较并以百分比表示，以激发剂特异性结合的读数(Δcpm)做为100％(图7)。加入28.8μg的该抗体导致该激发剂结合被抑制约51％。这些结果证实了该抗该激发剂结合域抗体抑制了该激发剂与该激发剂结合蛋白的结合。5)由抗激发剂结合域抗体抑制植物抗毒素的积累通过M.G.Hahn等的方法((1992)Molecular Plant Pathology第II卷A Practical Approach，IRL Press，第117-120页)，用大豆子叶测定由葡聚糖激发剂的作用积累的植物抗毒素的量。
将纯化的抗该激发剂结合域抗体(0，1，2，3，4，10和20μg/25μl/子叶)或做为对照的纯化的抗来自酵母的dsRNA酶的抗体pacl(4、10和20μg/25μl/子叶)加入大豆子叶并将该混合物培育1小时。将葡聚糖激发剂(200ng/25μl/子叶)加入大豆子叶并将该混合物培育20小时以确定由葡聚糖激发剂的作用引起的植物抗毒素积累是否被该抗体抑制。将加入该抗体后由加入激发剂诱导的植物抗毒素积累的量以百分比表示，以仅加入该激发剂积累的植物抗毒素的量做为100％((图8)。当以每片子叶加入20.0μl的抗激发剂结合域抗体时，植物抗毒素积累的量降低了53％。在对照中，甚至当以每片子叶加入20.0μg的抗pacl抗体时，植物抗毒素积累量也几乎没有变化。这些结果表明该得到的基因不是仅编码一个激发剂结合蛋白，而是编码在大豆中诱导抗性反应的该ER。实施例6将ER基因转移至烟草植株按下述将来自大豆的ER基因转移至烟草，并证实了该基因的表达。1)构建植物表达载体质粒用BamHI和SalI消化质粒pER23-1以产生位于这二个限制性酶位点之间的ER基因片段。将该片段插入下述的植物载体中。在一独立的步骤中，用限制性酶BamHI和SacI消化植物表达型双质粒pBI121(Clonetech)。然后，将用自动核酸合成仪合成的下列接头DNA被退火和连接至该消化的双质粒，将其导入大肠杆菌DH5α。从所得的克隆中选择所需质粒pBIlinker。5′-CTAGAGGATCCGGTACCCCCGGGGTCGACGAGCT-3′(SEQ ID NO27)5′-CGTCGACCCCGGGGGTACCGGATCCT-3′(SEQ ID NO28)将上述基因片段插入所得的质粒pBIlinker中的花椰菜花叶病毒35S启动子和蓝曙红合酶终止子之间(BamHI-SalI)以产生一导入植物的载体(pBI-ER)。2)将pBI-ER导入农杆菌将根癌农杆菌LBA4404(Clonetech)接种至50ml的YEB培养基(每升含有5g牛肉膏、1g酵母膏、1g胨、5g蔗糖和2mM MgSO4，pH7.4)，并于28℃培养24小时。然后，于4℃和3,000rpm离心20分钟收集细胞。将细胞用10ml 1mM Hepes-KOH(pH 7.4)洗涤三次，用3ml 10％甘油洗涤一次，最后悬浮于3ml 10％甘油中，以得到将要导入目的DNA的农杆菌。
将50μl由此得到的细菌悬浮液和1μg的质粒pBI-ER置于一池中，用电穿孔装置向该池施加25μF、2500V和200Ω的电脉冲，以将该质粒DNA导入该农杆菌。将得到的溶液转移至Eppendorf管，然后加入800μl SOC培养基(每升含有20g胰蛋白胨、5g酵母膏、0.5gNaCl、2.5mM KCl、10mM MgSO4、10mM MgCl2和20mM葡萄糖，pH7.0)。于28℃静置培养该细菌1.5小时。将50μl得到的培养溶液铺平板于含100ppm卡那霉素的YEB琼脂培养基(琼脂1.2％)，并于28℃培养2天。
从所得的菌落中选出一单菌落，用碱法从该菌落制备质粒DNA。将该质粒DNA用适当的限制性酶消化，将所得的DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳分级分离和分析。结果，证实了该质粒DNA含有质粒pBI-ER。将该根癌农杆菌命名为Agro-ER。3)转化烟草将上述Agro-ER菌株于28℃在含有50ppm卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养2小时。将1.5ml的该培养溶液在10,000rpm离心3分钟收获细胞，并用1ml LB培养基洗涤以除去卡那霉素。然后，再次于10,000rpm离心3分钟收获细胞，并再悬浮于1.5ml LB培养基以得到用于感染的细菌悬浮液。
在用该细菌感染烟草变种Bright Yellow中，从无菌植株采摘嫩叶。用外科手术刀无菌地将这些叶子切成1cm2大小的片，以叶背面向上置于该农杆菌悬浮液上，温和振荡2分钟。然后，将这些叶片置于无菌滤纸上以除去多余的农杆菌。将Whatman 1号滤纸(φ7.0cm)置于一培养皿中的MS-B5培养基上(含有1.0ppm苄基腺嘌呤、0.1ppm萘乙酸和0.8％琼脂)(Murashige，T和Skoog，F.Plant Physiol.，15473，(1962))。以叶背面向上将叶片置于该滤纸上。用PARAFILM(AmericanNational Can)封住该培养皿，然后于25C以16小时光照和8小时黑暗的循环培养这些叶片2天。接着，将这些叶片转移至含有250ppmclaforan的MS-B5培养基上，并以同样方式再培养10天以除去该农杆菌。将这些叶片再转移至含有250ppm claforan和100ppm卡那霉素的MS-B5培养基上，并以同样方式再培养7天。在此期间，围绕叶片的区域变为愈伤组织，产生苗原基。再培养10天后，将伸长的苗置于含有250ppm claforan和100ppm卡那霉素的MS-HF培养基(无苄基腺嘌呤和无萘乙酸的MS-B5培养基)上。培养10天后，将生根的那些苗做为卡那霉素抗性转化子置于植物箱内的含有250ppm claforan的MS-HF培养基上。4)转化体烟草的基因组DNA的PCR和免疫印迹分析为证实该目的基因已转移入该转化体，进行PCR。用自动核酸合成仪(Applied Biosystems；394型)合成下列引物并用于PCR。引物ER1 5′-CACCTTCAGCAACAATGGTT-3′(SEQ ID NO29)引物ER2 5′-CTATTCATCACTTCTGCTAT-3′(SEQ ID NO30)从该卡那霉素抗性转化体烟草提取DNA并对其测定。按下述提取基因组DNA。简言之，将20mg的烟草叶在200μl的提取缓冲液(0.5M NaCl、50mM Tris-HCl，pH8、50mM EDTA)中用槊料棒捣碎。然后，加入60μl 20％聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量40kDa)和52μl10％SDS，并于65℃加热30分钟。接着，加入40μl 5M乙酸钾，将得到的混合物置于冰上30分钟。然后，将该混合物离心以回收上清液；然后加入180μl异丙醇以回收DNA沉淀。用70％乙醇洗涤后，将该DNA溶于150μl TE溶液(10mM Tris-HCl，pH8、1mM EDTA、1μg/ml RNase A)。向79μl蒸馏水中，加入1μl该DNA溶液、10μl10×PCR缓冲液(Taq DNA聚合酶附带的；Takara Shuzo)、8μl 2.5mM dNTP、引物ER1和ER2各100 pmol以及0.5μl Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)，配成100μl溶液。用该溶液按下述进行PCR。做为反应装置，使用Gene Amp PCR系统9600(Perkin-Elmer)。首先，于94℃进行变性反应5分钟。然后，进行30个循环的PCR1)94℃变性30秒，2)55℃复性30秒和3)72℃延伸1分钟。反应后，将15μl的该反应溶液在1％琼脂糖凝胶上电泳。将该凝胶用0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色15分钟，并在紫外灯下检查。通过证实预期扩增的约2 kbp的特定DNA片段，证实了该目的基因已被整合进入该烟草基因组DNA。
亦进行了免疫印迹分析以检查目的基因的表达。简言之，将20mg的烟草叶在100μl的冰冷提取缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH7.5、1mMPMSF)中用槊料棒捣碎。然后，加入50μl 3x SDS-PAGE样品缓冲液(30％甘油、3％β-巯基乙醇、3％SDS、0.19 M Tris-HCl，pH 6.8、0.001％BPB)并于100℃加热5分钟。将得到的混合物于12,000rpm离心5分钟以回收上清液。将该提取蛋白的一部分(15μl)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜(Millipore)。在此膜上进行免疫印迹，使用在实施例5制备的抗ER小鼠抗体做为第一抗体，以抗小鼠免疫球蛋白碱性磷酸酶标记的抗体(Jackson)做为第二抗体，并使用碱性磷酸酶着色底物(Wako Pure Chemical Industries)以检测该ER蛋白的表达。有许多植株表达不同量的该ER蛋白。从这些植株中，选择那些大量表达该ER蛋白的植株并对它们进行超敏反应试验和真菌抗性试验。实施例7该烟草转化体的超敏反应试验使用在实施例6中证实高表达该ER蛋白的烟草转化体的叶、以及做为对照的非转化体烟草植株叶和仅用该载体(pBI121)转化的那些烟草植株的叶，检测大豆激发剂对超敏反应的诱导。
将温室中生长的烟草植株的叶从叶柄处剪下并置于透光的塑料盒中。将一段直径5mm高5mm的硅胶管置于每片叶的上表面以保持一溶液。使得该段管保持一溶于缓冲液(3mM碳酸氢钠，4mM乙酸钠，pH8.0)的化学合成激发剂(β-D-glucohexaoside)、[N.Hong和T.Ogawa(1990)，Tetrahedron Lett.313179；来自东京大学和物理和化学研究所的Ogawa教授]或仅仅该缓冲液以使该溶液与每片叶的表面保持接触。在过湿的情况下以防止该溶液干涸、以16小时光照和8小时黑暗的循环于25℃培养这些叶7天。培养后，移去硅胶管，在UV光源(Funakoshi)上检测烟草植物抗毒素合成的诱导。从非转化烟草与该化学合成葡聚糖激发剂的组合或从仅用该载体转化的烟草植株与该葡聚糖激发剂的组合上什么也未发现。这意味着该烟草不能识别该葡聚糖激发剂。另一方面，从用该ER基因转化的烟草TF1-11-1-15与该化学合成葡聚糖激发剂的组合上，发现了显著数量的荧光物质(植物抗毒素)的积累。而且，在对照(即烟草植株与该缓冲液或去离子水的那些组合)中未发现任何变化。
从这些结果证明，如果该ER基因可以在大豆之外的其它宿主植物中表达，则有可能该转化宿主可以获得识别非转化宿主不能识别的葡聚糖激发剂的能力。本发明不仅提供改变该植物对一物质识别的可能性，而且提供一种机制，植物依靠这种机制可以识别诸如在其细胞壁等中有葡聚糖结构的真菌的植物病原体。结果，在该植物中激发了诸如密切涉及抗病性的植物抗毒素的诱导的抗性反应。这种抗性反应的激发对于培育抗病性植物是重要的。实施例8该烟草转化体的真菌抗性试验将实施例6中证实高表达该ER蛋白的烟草转化体自交或与表达葡聚糖酶的烟草植株(日本未审查专利申请No.4-320631)杂交以收获种子，即后代。1)对芝麻疫霉的抗性将在Hokkaido大学保存的一菌株(在Difco的PDA培养基中继代培养)转移至一燕麦片琼脂并于26℃培养4天。伸展于整合培养基的菌丝体的生长末端用瓶塞钻孔器打孔以形成菌丝体碟，后者做为接种物使用。按下述制备该试验用的燕麦片琼脂培养基。将100克燕麦片粉悬浮于1升水中，于58℃加热1小时并用纱布过滤。向滤液中加入20g琼脂并高压灭菌。然后，将得到的混合物分装到培养皿中做为培养基使用。
在实施例6描述方法的基础上，测试从上述种子获得的幼苗的ER表达。然后，将该真菌接种至那些证实有显著ER表达的幼苗的伤口处。简言之，将叶从萌发2月的烟草植株切下并置于一塑料盒中的润湿的滤纸上。将绑在一起的10根针在这些叶的左右两侧的各一点扎30次，产生同心圆式的刺伤。将少量去离子水加至这些伤口上，然后将该菌丝体碟接种至每个伤口。然后，将这些叶置于25℃ 96小时。本试验的结果示于图9和表3。每片测试的烟草叶抗性以抗性指数表示。抗性指数如下。“4”无病症；“3”该叶两侧多达25％的表面出现病症；“2”该叶两侧多达50％的表面出现病症；“1”该叶两侧多达75％的表面出现病症；“0”该叶两侧不少于75％的表面出现病症。表3.对芝麻疫霉的抗性烟草植株 P-1 2 3 4 5 6 7 G-1 4 6 7 8 9 10个体编号抗性指数 0 0 0 0 0 0 01 0 0 1 0 1烟草植株 ER-51 55 56 57 GxER-10 11 16 24 28 34 38个体编号抗性指数 00 1 0 2 4 2 1 1 2 2P用pBI121转化的烟草(对照)G表达葡聚糖酶的烟草ER表达ER的烟草GxER共表达葡聚糖酶/ER的烟草结果，在对照植株(用pBI121转化的植株和仅表达葡聚糖酶的植株)观察到了病痕的形成和扩大，而在大多数共表达葡聚糖酶和ER的转化体中，病痕的扩大没有那么显著。因此，相信通过转移该ER基因提高了对真菌的抗性。2)对立枯丝核菌的抗性将Gifu大学保存的菌株(Rhizoctonia solani AG3 M菌株；得自Gifu大学的Hyakumachi教授；在Difco的PDN培养基中继代培养)接种至高压灭菌的大麦粒和去离子水的混合物(50∶50按体积计)，于24℃培养10天并干燥10天。然后，用制咖啡机将大麦粒磨碎并以0.5％(w/w)的比例与土壤(河沙∶蛭石∶泥炭藓＝2∶2∶1)彻底混合。将受测试的种子播种到该混合物上，通过16小时光照和8小时黑暗的循环于25℃在60-80％湿度下生长。观察它们的生长，并最终计数每个该测试烟草植株的健康个体的数目(图10和图11)。
结果，在对照植株(非转化烟草)中观察到病痕的形成和扩大；健康个体数急剧下降；大多数的植株枯萎。另一方面，在表达ER的植株中，几乎观察不到病痕或者观察到病症发展的延迟(图10)。因此，相信通过转移ER基因提高了对真菌的抗性。3)使用Phytophthora nicotianae的游动孢子进行真菌抗性试验除了实施例8的第1)节描述的针头接种的真菌抗性试验之外，通过接种游动孢子悬浮液进行另一真菌抗性试验。将Hokkaido大学保存的一真菌菌株(在Difco的PDA培养基中继代培养)转移至一燕麦片琼脂并于25℃黑暗培养一周。按下述制备燕麦片琼脂培养基，将100克燕麦片粉悬浮于1升水中，于58℃加热1小时并用纱布过滤；向滤液中加入20g琼脂并高压灭菌，将其分装到培养皿中做为培养基使用。从得到的菌丝体菌区系，用6mm直径的瓶塞钻孔器冲出碟。将这些碟以规则的间隔(7碟/培养皿)置于9cm槊料培养皿上。向每个培养皿中加入25ml大豆煎汁培养基(soybean decoction medium)(通过研磨400g新鲜大豆，纱布过滤所得材料，向滤液中加入蒸馏水制成1升溶液，接着高压灭菌制得)，将这些培养皿于25℃黑暗培养3天。在证实在几乎所有培养皿上形成菌丝体丛后，废弃该培养基。用水性Petri溶液(1mM KCl、2mM Ca(NO3)2、1.2mM MgSO4、1mMKH2PO4)洗涤该菌丝体丛三或四次，以尽可能地完全去除培养基组分。最后，用土壤提取物(通过加水至11.5g大田土壤使体积为1升，过滤该混合物并在高压灭菌器中灭菌制备)洗涤该菌丝体丛一次。把水漱洗掉后，将该菌丝体置于15℃光照几天，直至其表面有些干燥。第一次发现该干燥处理对大量形成该真菌的游动孢子囊非常重要。将该土壤提取物加入由此形成的游动孢子囊，并于15℃静置光照2-3小时。证实形成足够量的游动孢子后，收集游动孢子做为接种物。
将该游动孢子接种至根据实施例6描述的方法证实显著表达ER的那些植株中。简言之，剪下萌发约四个月的烟草植株的叶子并将其置于在塑料盒中的湿润的滤纸上。将切成约5mm长的硅胶环置于每片叶的左右二侧。然后，将100μl的游动孢子悬浮液(3-5×105游动孢子/ml)用微量吸管加入该硅胶环内，由此将游动孢子接种至该烟草叶的表面。然后，每片叶置于25℃ 144小时。本试验的结果示于图12和表4中。
每片测试的烟草叶抗性以抗性指数表示。抗性指数如下。“4”无病症；“3.5”病痕局限于接种部位；“3”多达半边叶的25％出现病症；“2.5”多达半边叶的37.5％出现病症；“2”多达半边叶的50％出现病症；“1”多达半边叶的75％出现病症；“0”半边叶的75％以上出现病症。表4.对芝麻疫霉游动孢子的抗性烟草植株 BY-12345678G-123个体编号抗性指数0 0010000 2 00烟草植株 ER-1 2 3 4 5 6 GxER-1 2 3 45个体编号抗性指数41 3 3 2.5 3.5 3.5 2 3 30BY非转化烟草(对照)G表达葡聚糖酶的烟草ER表达ER的烟草GxER共表达葡聚糖酶/ER的烟草结果，在对照植株(非转化烟草和仅表达葡聚糖酶的烟草)中观察到病痕的形成和扩大，而在只表达ER或表达ER和葡聚糖酶的大多数植株中，病痕的扩大被抑制。因此，相信通过转移ER基因提高了对真菌的抗性。实施例9新菜豆葡聚糖酶的克隆1)制备大豆mRNA将菜豆(Hirasaya Fancy Saitou)种子(Takayama Seed Co.)在蛭石上培养12天，然后按照U.Vogeli等的方法[Planta(1988)174364]用乙烯处理48小时以诱导葡聚糖酶表达。将植株于液氮中冷冻并储存于-80℃直至使用。按照Ishida等的方法(“Cell Technology LaboratoryManipulation Manual”作者Ishida和Misawa，Kodansha Scientific)，从12g冷冻菜豆粉中得到2.35mg的总RNA。
接着，使用1.0mg的由此得到的总RNA，按照手册用Oligo(dT)纤维素(Pharmacia)纯化，然后得到31.5μg的纯化poly(A)+RNA。2)制备菜豆cDNA文库用Time Saver cDNA合成药盒(Pharmacia)和随机六聚引物，由5μg的该poly(A)+RNA合成cDNA。用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)将合成cDNA片段连接至λ噬菌体载体λgt10(Stratagene)。接着，使用DNA混合溶液，用Gigapack(Stratagene)将噬菌体载体包装形成噬菌体颗粒，由此制备约1×105pfu的菜豆cDNA文库。3)制备筛选探针基于B.V.Edington等关于克隆菜豆葡聚糖酶cDNA的报道[PlantMolecular Biology(1991)1681]，按下述准备PCR引物有义引物5’-CAAATGTTGTGGTGAGGGATGGCC-3’(SEQ ID NO31)和反义引物5’-AAATGTTTCTCTATCTCAGGACTC-3’(SEQ ID NO32)。按照Ishida的方法(“Gene High Expression Experiment Manual”，Ishida和Ando(Eds.)，Kodansha Scientific)用这些引物进行RT-PCR以产生约300bp的PCR片段。将该片段亚克隆入pBluescriptSKII+(Stratagene)的EcoRV位点。对于cDNA合成，使用1mg的总RNA和0.5mg的随机六聚引物(Takara Shuzo)。测定了在该亚克隆中的该插入物(0.3 kbp)的DNA序列。结果，发现该DNA序列与B.V.Edington等(见上述)报道的葡聚糖酶cDNA相同。将该质粒DNA用HindIII和EcoRV消化，并用琼脂糖凝胶电泳分级分离。用Gene Clean II(Bio 101)纯化该插入DNA，以产生在上述2)中制备的菜豆cDNA文库的筛选探针。4)通过杂交筛选和克隆该文库将得到的做为筛选探针的DNA片段按照手册用Megaprime DNA标记药盒(Amersham)用[α-32P]dCTP标记并将该反应溶液用于后续杂交实验。
将大肠杆菌C600 hfl(Invitrogen Co.)用在上述2)中制备的菜豆cDNA文库转染，并接种至在直径约15cm培养皿上的补加了10mg/mlMgCl2的L培养基，以形成总共约1×105个噬菌斑。将这些噬菌斑印迹至尼龙膜(GeneScreen(+)；NEN DuPont)。该膜与32P-dCTP标记的葡聚糖酶cDNA片段反应，用放射自显影检测到的阳性噬菌体再用同样方法筛选，得到1个噬菌体克隆。
用Lambda Sorb(Promega)从杂交实验中分离的该阳性克隆中纯化λ噬菌体DNA分子。将5μg的该DNA用EcoRI消化并用1％琼脂糖凝胶电泳分级分离，以切出约1.2kb的条带。用Gene Clean II(Bio101)处理该条带，以回收含该DNA的溶液，将其亚克隆至载体pBlueseriptII KS+(Stratagene)的EcoRI位点。图13展示了质粒pPG1的结构。5)测定编码菜豆葡聚糖酶的DNA的核苷酸序列通过使用千序列缺失药盒(Takara Shuzo)制备一系列具有间隔约200-300bp的缺失的质粒，使用荧光测序仪从两个方向对其中克隆了该葡聚糖酶cDNA的该质粒DNA测序。得到的该DNA核苷酸序列示于SEQ ID NO33。结果发现该DNA片段含有一993 bp的ORF，后者起始于对应于预测为一信号序列的氨基酸序列的核苷酸序列，推测在该ORF中编码了331个氨基酸残基。该氨基酸序列示于SEQ IDNO34。
使用BLAST蛋白检索的结果，发现从该得到的核苷酸序列推断的氨基酸序列是一全新序列。与B.V.Edington等[Plant MolecularBiology(1991)1681]先前报道的氨基酸序列比较，有49％同源性(不包括象是信号序列的那部分)。此外，它与Y.Takeuchi等[Plant Physiol.(1990)93673]报道的得自大豆的氨基酸序列在全长度上有51％同源性。因为该推断的氨基酸序列表现出与先前报道的葡聚糖酶的氨基酸序列有高度同源性，预期该得到的DNA序列也变一葡聚糖酶。我们也预期这里讨论的葡聚糖酶与先前报道的菜豆葡聚糖酶不同，它是胞外分泌型，因为该推断的氨基酸序列在其N末端有一可能的信号序列，而在其C末端缺少一可能的导向液泡的序列。实施例10该菜豆葡聚糖酶的表达1)构建质粒pGST-PG1设计PCR有义引物5’-GGAATTCCGAATCTGTGGGTGTGTGTTAT-3’(SEQ ID NO35)和反义引物M13反序列引物(SEQ ID NO36)，使得该菜豆葡聚糖酶序列[不包括该信号序列，即N末端的Met(1)-Val(21)]可以以框架内方式连接至谷胱甘肽-S-转移酶表达载体(Pharmacia；pGEX-4T-3)的下游。用这些引物，用EX-Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)在0.1mg的模板质粒pPG1 DNA上进行PCR(退火温度＝50℃；20个循环)。将扩增的PCR片段用EcoRI消化并用琼脂糖凝胶电泳分级分离，以产生约1kbp的DNA片段。用Gene CleanII纯化该片段，并用JM109感受态细胞(Toyobo)将其亚克隆至pGEX-4T-3表达载体的EcoRI位点(pGST-PG1)。2)在大肠杆菌BL21中表达从上述1)中得到的亚克隆纯化该质粒DNA，并将其重新转移至大肠杆菌BL21感受态细胞(Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press)。该大肠杆菌BL21得自东京大学科学系的MasayukiYamamoto教授。3)纯化GST融合葡聚糖酶将上述1)中得到的大肠杆菌的过夜培养物(4ml)转移至200ml的含有100mg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基并于37℃培养1.5小时。向其中加入IPTG(Takara Shuzo)，使其最终浓度为0.1mM，将这些细胞再培养4小时。通过10,000rpm 4℃离心10分钟从该培养溶液中收获细胞。按照Gene Expression Experiment Manual(见上述)，用谷胱甘肽Sepharose(Pharmacia)纯化约1mg的谷胱甘肽-S-转移酶/葡聚糖酶融合蛋白(分子量约62kDa)。
4)测定葡聚糖酶活性通过下述程序测定纯化的谷胱甘肽-S-转移酶/葡聚糖酶融合蛋白的葡聚糖酶活性。简言之，将酶促反应溶液于37℃保温。分别从反应开始的0、10、20和30分钟时终止反应，用Nelson的方法[N.Nelson，J.Biol.Chem.(1944)153，375]定量测定释放的葡萄糖。该酶促反应溶液的组成是0.5ml的50mM乙酸缓冲液(pH5.5)、做为底物的2.5mg昆布多糖和做为酶的0、0.51或5.1μg的谷胱甘肽-S-转移酶/葡聚糖酶融合蛋白。
结果，葡萄糖以依赖于酶浓度和反应时间的方式从昆布多糖释放(见图14)。因此很清楚，该新克隆的cDNA有葡聚糖酶活性。这提示可以利用考虑之中的葡聚糖酶提高植物抗真菌性的可能性，同SEQ IDNO4编码的来自大豆的葡聚糖酶一样。工业应用性按照本发明，提供向其中转移了编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列并表达该葡聚糖酶激发剂受体的植物以及构建这种植物的方法。
本发明的植物对真菌有高抗性。
序列表SEQ ID NO1的信息长度667个氨基酸类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述SEQ ID NO1Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Tyr Ile Phe Pro Gln Thr Gln Ser Thr Val1 5 10 15Leu Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Ser Asn Leu Leu Ser Ser Pro Leu Pro20 25 30 35Thr Asn Ser Phe Phe Gln Asn Phe Val Leu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr40 45 50Ile His Pro Tyr Leu Ile Lys Ser Ser Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Pro55 60 65 70Ser Arg Gln Ala Ser Ser Ala Val Ile Phe Gln Val Phe Asn Pro Asp Leu Thr75 80 85 90Ile Ser Ala Pro Gln Gly Pro Lys Gln Gly Pro Pro Gly Lys His Leu Ile Ser95 100 105Ser Tyr Ser Asp Leu Ser Val Thr Leu Asp Phe Pro Ser Ser Asn Leu Ser Phe110 115 120 125Phe Leu Val Arg Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Val Ser Val Thr Gln Pro Thr Pro130 135 140Leu Ser Ile Thr Thr Ile His Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Asn Asp Ser Asn145 150 155 160Thr Lys Tyr Thr Phe Gln Phe Asn Asn Gly Gln Thr Trp Leu Leu Tyr Ala Thr165 170 175 180Ser Pro Ile Lys Leu Asn His Thr Leu Ser Glu Ile Thr Ser Asn Ala Phe Ser185 190 195Gly Ile Ile Arg Ile Ala Leu Leu Pro Asp Ser Asp Ser Lys His Glu Ala Val200 205 210 215Leu Asp Lys Tyr Ser Ser Cys Tyr Pro Val Ser Gly Lys Ala Val Phe Arg Glu220 225 230Pro Phe Cys Val Glu Tyr Asn Trp Glu Lys Lys Asp Ser Gly Asp Leu Leu Leu235 240 245 250Leu Ala His Pro Leu His Val Gln Leu Leu Arg Asn Gly Asp Asn Asp Val Lys255 260 265 270Ile Leu Glu Asp Leu Lys Tyr Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val275 280 285Gly Asp Ser Trp Val Leu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile290 295 300 305Lys Gly Ile Lys Glu Glu Ser His Asp Glu Ile Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp310 315 320Val Glu Ser Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Thr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Gly325 330 335 340Lys Leu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Leu Val Leu Ile Ala Glu Glu Leu Asn Tyr345 350 355 360Pro Asp Val Ile Pro Lys Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Thr Ile Glu Pro Trp365 370 375Leu Glu Gly Thr Phe Ser Gly Asn Gly Phe Leu His Asp Glu Lys Trp Gly Gly380 385 390 395Ile Ile Thr Gln Lys Gly Ser Thr Asp Ala Gly Gly Asp Phe Gly Phe Gly Ile400 405 410Tyr Asn Asp His His Tyr His Leu Gly Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Ala Val Leu415 420 425 430Thr Lys Leu Asp Pro Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile435 440 445 450Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp Thr Lys Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Arg Leu
455 460 465Arg Cys Phe Asp Pro Tyr Val Leu His Ser Trp Ala Gly Gly Leu Thr Glu Phe470 475 480 485Thr Asp Gly Arg Asn Gln Glu Ser Thr Ser Glu Ala Val Ser Ala Tyr Tyr Ser490 495 500Ala Ala Leu Met Gly Leu Ala Tyr Gly Asp Ala Pro Leu Val Ala Leu Gly Ser505 510 515 520Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ile Glu Gly Thr Lys Met Trp Trp His Val Lys Glu525 530 535 540Gly Gly Thr Leu Tyr Glu Lys Glu Phe Thr Gln Glu Asn Arg Val Met Gly Val545 550 555Leu Trp Ser Asn Lys Arg Asp Thr Gly Leu Trp Phe Ala Pro Ala Glu Trp Lys560 565570 575Glu Cys Arg Leu Gly Ile Gln Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ile Ser Glu Ala Ile580 585 590Phe Ser Asn Val Asp Phe Val Lys Glu Leu Val Glu Trp Thr Leu Pro Ala Leu595 600 605 610Asp Arg Glu Gly Gly Val Gly Glu Gly Trp Lys Gly Phe Val Tyr Ala Leu Glu615 620 625 630Gly Val Tyr Asp Asn Glu Ser Ala Leu Gln Lys Ile Arg Asn Leu Lys Gly Phe635 640 645Asp Gly Gly Asn Ser Leu Thr ASn Leu Leu Trp Trp Ile His Ser Arg Ser Asp650 655 660 665Glu667SEQ ID NO2的信息长度2004个碱基对类型核酸链型双链拓扑学线性分子类型cDNA来源生物体大豆(GlycinemaxL.)品系Green Homer序列描述 SEQ ID NO29 18 27 36 45 54GTT AAC ATC CAA ACC AAT ACA TCT TAC ATC TTC CCT CAA ACA CAA TCC ACT GTTVal Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Tyr Ile Phe Pro Gln Thr Gln Ser Thr Val63 72 81 90 99 108CTT CCT GAT CCC TCC AAA TTC TTC TCC TCA AAC CTT CTC TCA AGT CCA CTC CCCLeu Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Ser Asn Leu Leu Ser Ser Pro Leu Pro117 126 135 144 153 162ACA AAC TCT TTC TTC CAA AAC TTT GTC CTA AAA AAT GGT GAC CAA CAA GAA TACThr Asn Ser Phe Phe Gln Asn Phe Val Leu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr171 180 189 198 207 216ATT CAT CCT TAC CTC ATC AAA TCC TCC AAC TCT TCC CTC TCT CTC TCA TAC CCTIle His Pro Tyr Leu Ile Lys Ser Ser Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Pro225 234 243 252 261 270TCT CGC CAA GCC AGT TCA GCT GTC ATA TTC CAA GTC TTC AAT CCT GAT CTT ACCSer Arg Gln Ala Ser Ser Ala Val Ile Phe Gln Val Phe Asn Pro Asp Leu Thr279 288 297 306 315 324ATT TCA GCC CCA CAA GGT CCC AAA CAA GGT CCC CCT GGT AAA CAC CTT ATC TCCIle Ser Ala Pro Gln Gly Pro Lys Gln Gly Pro Pro Gly Lys His Leu Ile Ser342 351 360 369 378TCC TAC AGT GAT CTC AGT GTC ACC TTG GAT TTC CCT TCT TCC AAT CTG AGC TTCSer Tyr Ser Asp Leu Ser Val Thr Leu Asp Phe Pro Ser Ser Asn Leu Ser Phe387 396 405 414 423 432TTC CTT GTT AGG GGA AGC CCC TAT TTG ACT GTG TCT GTG ACT CAA CCA ACT CCTPhe Leu Val Arg Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Val Ser Val Thr Gln Pro Thr Pro441 450 459 468 477 486CTT TCA ATT ACC ACC ATC CAT TCC ATT CTC TCA TTC TCT TCA AAT GAC TCC AACLeu Ser Ile Thr Thr Ile His Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Asn Asp Ser Asn495 504 513 522 531 540ACC AAG TAC ACC TTT CAG TTC AAC AAT GGT CAA ACA TGG CTT CTT TAT GCT ACCThr Lys Tyr Thr Phe Gln Phe Asn Asn Gly Gln Thr Trp Leu Leu Tyr Ala Thr549 558 567 576 585 594TCC CCC ATC AAG TTG AAC CAC ACC CTT TCT GAG ATA ACT TCT AAT GCA TTT TCTSer Pro Ile Lys Leu Asn His Thr Leu Ser Glu Ile Thr Ser Asn Ala Phe Ser603 612 621 630 639 648GGC ATA ATC CGG ATA GCT TTG TTG CCG GAT TCG GAT TCG AAA CAC GAG GCT GTTGly Ile Ile Arg Ile Ala Leu Leu Pro Asp Ser Asp Ser Lys His Glu Ala Val657 666 675 684 693 702CTT GAC AAG TAT AGT TCT TGT TAC CCC GTG TCA GGT AAA GCT GTG TTC AGA GAALeu Asp Lys Tyr Ser Ser Cys Tyr Pro Val Ser Gly Lys Ala Val Phe Arg Glu
711 720 729 738 747 756CCT TTC TGT GTG GAA TAT AAC TGG GAG AAG AAA GAT TCA GGG GAT TTG CTA CTCPro Phe Cys Val Glu Tyr Asn Trp Glu Lys Lys Asp Ser Gly Asp Leu Leu Leu765 774 783 792 801 810TTG GCT CAC CCT CTC CAT GTT CAG CTT CTT CGT AAT GGA GAC AAT GAT GTC AAALeu Aia His Pro Leu His Val Gln Leu Leu Arg Asn Gly Asp Asn Asp Val Lys819 828 837 846 855 864ATT CTT GAA GAT TTA AAG TAT AAA AGC ATT GAT GGG GAT CTT GTT GGT GTT GTCIle Leu Glu Asp Leu Lys Tyr Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val873 882 891 900 909 918GGG GAT TCA TGG GTT TTG AAA ACA GAT CCT TTG TTT GTA ACA TGG CAT TCA ATCGly Asp Ser Trp Val Leu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile927 936 945 954 963 972AAG GGA ATC AAA GAA GAA TCC CAT GAT GAG ATT GTC TCA GCC CTT TCT AAA GATLys Gly Ile Lys Glu Glu Ser His Asp Glu Ile Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp981 990 999100810171026GTT GAG AGC CTA GAT TCA TCA TCA ATA ACT ACA ACA GAG TCA TAT TTT TAT GGGVal Glu Ser Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Thr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Gly103510441053106210711080AAG TTG ATT GCA AGG GCT GCA AGG TTG GTA TTG ATT GCT GAG GAG TTG AAC TACLys Leu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Leu Val Leu Ile Ala Glu Glu Leu Asn Tyr
108910981107111611251134CCT GAT GTG ATT CCA AAG GTT AGG AAT TTT TTG AAA GAA ACC ATT GAG CCA TGGPro Asp Val Ile Pro Lys Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Thr Ile Glu Pro Trp114311521161117011791188TTG GAG GGA ACT TTT AGT GGG AAT GGA TTC CTA CAT GAT GAA AAA TGG GGT GGCLeu Glu Gly Thr Phe Ser Gly Asn Gly Phe Leu His Asp Glu Lys Trp Gly Gly119712061215122412331242ATT ATT ACC CAA AAG GGG TCC ACT GAT GCT GGT GGT GAT TTT GGA TTT GGA ATTIle Ile Thr Gln Lys Gly Ser Thr Asp Ala Gly Gly Asp Phe Gly Phe Gly Ile125112601269127812871296TAC AAT GAT CAC CAC TAT CAT TTG GGG TAC TTC ATT TAT GGA ATT GCG GTG CTCTyr Asn Asp His His Tyr His Leu Gly Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Ala Val Leu130513141323133213411350ACT AAG CTT GAT CCA GCA TGG GGT AGG AAG TAC AAG CCT CAA GCC TAT TCA ATAThr Lys Leu Asp Pro Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile135913681377138613951404GTG CAA GAC TTC TTG AAC TTG GAC ACA AAA TTA AAC TCC AAT TAC ACA CGT TTGVal Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp Thr Lys Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Arg Leu141314221431144014491458AGG TGT TTT GAC CCT TAT GTG CTT CAC TCT TGG GCT GGA GGG TTA ACT GAG TTCArg Cys Phe Asp Pro Tyr Val Leu His Ser Trp Ala Gly Gly Leu Thr Glu Phe146714761485149415031512ACA GAT GGA AGG AAT CAA GAG AGC ACA AGT GAG GCT GTG AGT GCA TAT TAT TCTThr Asp Gly Arg Asn Gln Glu Ser Thr Ser Glu Ala Val Ser Ala Tyr Tyr Ser152115301539154815571566GCT GCT TTG ATG GGA TTA GCA TAT GGT GAT GCA CCT CTT GTT GCA CTT GGA TCAAla Ala Leu Met Gly Leu Ala Tyr Gly Asp Ala Pro Leu Val Ala Leu Gly Ser157515841593160216111620ACA CTC ACA GCA TTG GAA ATT GAA GGG ACT AAA ATG TGG TGG CAT GTG AAA GAGThr Leu Thr Ala Leu Glu Ile Glu Gly Thr Lys Met Trp Trp His Val Lys Glu162916381647165616651674GGA GGT ACT TTG TAT GAG AAA GAG TTT ACA CAA GAG AAT AGG GTG ATG GGT GTTGly Gly Thr Leu Tyr Glu Lys Glu Phe Thr Gln Glu Asn Arg Val Met Gly Val168316921701171017191728CTA TGG TCT AAC AAG AGG GAC ACT GGA CTT TGG TTT GCT CCT GCT GAG TGG AAALeu Trp Ser Asn Lys Arg Asp Thr Gly Leu Trp Phe Ala Pro Ala Glu Trp Lys173717461755176417731782GAG TGT AGG CTT GGC ATT CAG CTC TTA CCA TTG GCT CCT ATT TCT GAA GCC ATTGlu Cys Arg Leu Gly Ile Gln Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ile Ser Glu Ala Ile179118001809181818271836TTC TCC AAT GTT GAC TTT GTA AAG GAG CTT GTG GAG TGG ACT TTG CCT GCT TTGPhe Ser Asn Val Asp Phe Val Lys Glu Leu Val Glu Trp Thr Leu Pro Ala Leu184518541863187218811890GAT AGG GAG GGT GGT GTT GGT GAA GGA TGG AAG GGG TTT GTG TAT GCC CTT GAAAsp Arg Glu Gly Gly Val Gly Glu Gly Trp Lys Gly Phe Val Tyr Ala Leu Glu189919081917192619351944GGG GTT TAT GAC AAT GAA AGT GCA CTG CAG AAG ATA AGA AAC CTG AAA GGT TTTGly Val Tyr Asp Asn Glu Ser Ala Leu Gln Lys Ile Arg Asn Leu Lys Gly Phe195319621971198019891998GAT GGT GGA AAC TCT TTG ACC AAT CTC TTG TGG TGG ATT CAT AGC AGA AGT GATAsp Gly Gly Asn Ser Leu Thr Asn Leu Leu Trp Trp Ile His Ser Arg Ser Asp2004GAA TAGGluSEQ ID NO3的信息序列长度347个氨基酸序列类型氨基酸拓扑学线性分子序列类型肽序列描述SEQ ID NO3Met Ala Lys Tyr His Ser Ser Gly Lys Ser Ser Ser Met Thr Ala Ile Ala Phe1 5 10 15Leu Phe Ile Leu Leu Ile Thr Tyr Thr Gly Thr Thr Asp Ala Gln Ser Gly Val20 25 30 35Cys Tyr Gly Arg Leu Gly Asn Asn Leu Pro Thr Pro Gln Glu Val Val Ala Leu40 45 50Tyr Asn Gln Ala Asn Ile Arg Arg Met Arg Ile Tyr Gly Pro Ser Pro Glu Val55 60 65 70Leu Glu Ala Leu Arg Gly Ser Asn Ile Glu Leu Leu Leu Asp Ile Pro Asn Asp75 80 85 90Asn Leu Arg Asn Leu Ala Ser Ser Gln Asp Asn Ala Asn Lys Trp Val Gln Asp95 100 105Asn Ile Lys Asn Tyr Ala Asn Asn Val Arg Phe Arg Tyr Val Ser Val Gly Asn110 115 120 125Glu Val Lys Pro Glu His Ser Phe Ala Gln Phe Leu Val Pro Ala Leu Glu Asn130 135 140Ile Gln Arg Ala Ile Ser Asn Ala Gly Leu Gly Asn Gln Val Lys Val Ser Thr145150 155 160Ala Ile Asp Thr Gly Ala Leu Ala Glu Ser Phe Pro Pro Ser Lys Gly Ser Phe165 170 175 180Lys Ser Asp Tyr Arg Gly Ala Tyr Leu Asp Gly Val Ile Arg Phe Leu Val Asn185 190 195Asn Asn Ala Pro Leu Met Val Asn Val Tyr Ser Tyr Phe Ala Tyr Thr Ala Asn200 205 210 215Pro Lys Asp Ile Ser Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Arg Ser Pro Ser Val Val Val220 225 230Gln Asp Gly Ser Leu Gly Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Ala Ser Val Asp Ala Val235 240 245 250Tyr Ala Ala Leu Glu Lys Ala Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ile Val Val Ser Glu255 260 265 270Ser Gly Trp Pro Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Ala Arg Thr275 280 285Tyr Asn Thr Asn Leu Val Arg Asn Val Lys Gln Gly Thr Pro Lys Arg Pro Gly290 295 300 305Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Val Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn Gln Lys Gln Pro310 315 320Glu Phe Glu Lys Phe Trp Gly Leu Phe Ser Pro Ile Thr Lys Gln Pro Lys Tyr325 330 335 340Ser Ile Asn Phe Asn345 347SEQ ID NO4的信息序列长度1044个碱基对序列类型核酸序列描述SEQ ID NO49 18 27 36 45 54ATG GCT AAG TAT CAT TCA AGT GGG AAA AGC TCT TCC ATG ACT GCT ATA GCC TTCMet Ala Lys Tyr His Ser Ser Gly Lys Ser Ser Ser Met Thr Ala Ile Ala Phe63 72 81 90 99 108CTG TTT ATC CTT CTA ATC ACT TAT ACA GGC ACA ACA GAT GCA CAA TCC GGG GTALeu Phe Ile Leu Leu Ile Thr Tyr Thr Gly Thr Thr Asp Ala Gln Ser Gly Val117 126 135 144 153 162TGT TAT GGA AGA CTT GGC AAC AAC TTA CCA ACC CCT CAA GAA GTT GTG GCC CTCCys Tyr Gly Arg Leu Gly Asn Asn Leu Pro Thr Pro Gln Glu Val Val Ala Leu171 180 189 198 207 216TAC AAT CAA GCC AAC ATT CGC AGG ATG CGA ATC TAC GGT CCA AGC CCA GAA GTCTyr Asn Gln Ala Asn Ile Arg Arg Met Arg Ile Tyr Gly Pro Ser Pro Glu Val225 234 243 252 261 270CTC GAA GCA CTA AGA GGT TCC AAC ATT GAG CTT TTG CTA GAC ATT CCA AAT GACLeu Glu Ala Leu Arg Gly Ser Asn Ile Glu Leu Leu Leu Asp Ile Pro Asn Asp279 288 297 306 315 324AAC CTC AGA AAC CTA GCA TCT AGC CAA GAC AAT GCA AAC AAA TGG GTG CAA GACAsn Leu Arg Asn Leu Ala Ser Ser Gln Asp Asn Ala Asn Lys Trp Val Gln Asp333 342 351 360 369 378AAC ATC AAA AAC TAT GCC AAC AAT GTC AGA TTC AGA TAC GTT TCA GTG GGA AATAsn Ile Lys Asn Tyr Ala Asn Asn Val Arg Phe Arg Tyr Val Ser Val Gly Asn387 396 405 414 423 432GAA GTG AAA CCC GAA CAC TCA TTT GCA CAA TTT CTA GTG CCT GCA TTG GAA AACGlu Val Lys Pro Glu His Ser Phe Ala Gln Phe Leu Val Pro Ala Leu Glu Asn441 450 459 468 477 486ATT CAG AGG GCC ATT TCT AAT GCT GGC CTT GGA AAC CAA GTA AAA GTT TCC ACTIle Gln Arg Ala Ile Ser Asn Ala Gly Leu Gly Asn Gln Val Lys Val Ser Thr495 504 513 522 531 540GCC ATT GAT ACT GGT GCC TTG GCA GAA TCA TTC CCA CCA TCA AAG GGT TCC TTCAla Ile Asp Thr Gly Ala Leu Ala Glu Ser Phe Pro Pro Ser Lys Gly Ser Phe549 558 567 576 585 594AAA TCT GAT TAT AGA GGA GCA TAT CTT GAT GGT GTC ATC AGA TTT CTA GTG AACLys Ser Asp Tyr Arg Gly Ala Tyr Leu Asp Gly Val Ile Arg Phe Leu Val Asn603 612 621 630 639 648AAT AAT GCC CCA TTA ATG GTT AAT GTG TAC TCT TAC TTC GCT TAC ACT GCA AACAsn Asn Ala Pro Leu Met Val Asn Val Tyr Ser Tyr Phe Ala Tyr Thr Ala Asn657 666 675 684 693 702CCT AAG GAC ATT AGT CTT GAC TAT GCA CTT TTT AGG TCT CCT TCG GTG GTA GTGPro Lys Asp Ile Ser Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Arg Ser Pro Ser Val Val Val711 720 729 738 747 756CAA GAT GGT TCA CTT GGT TAC CGT AAC CTC TTT GAT GCT TCG GTT GAT GCT GTTGln Asp Gly Ser Leu Gly Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Ala Ser Val Asp Ala Val765 774 783 792 801 810TAT GCT GCA TTG GAG AAA GCA GGA GGA GGG TCA TTG AAC ATA GTT GTG TCT GAGTyr Ala Ala Leu Glu Lys Ala Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ile Val Val Ser Glu819 828 837 846 855 864AGT GGA TGG CCT TCT TCT GGT GGA ACT GCA ACT TCA CTT GAT AAT GCA AGA ACTSer Gly Trp Pro Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Ala Arg Thr873 882 891 900 909 918TAC AAC ACA AAC TTG GTT CGG AAT GTG AAG CAA GGA ACC CCT AAA AGG CCT GGTTyr Asn Thr Asn Leu Val Arg Asn Val Lys Gln Gly Thr Pro Lys Arg Pro Gly927 936 945 954 963 972GCA CCC CTT GAA ACT TAT GTG TTT GCC ATG TTT GAT GAA AAT CAG AAG CAG CCAAla Pro Leu Glu Thr Tyr Val Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn Gln Lys Gln Pro981 990 999100810171026GAG TTT GAA AAA TTT TGG GGG CTC TTT TCT CCT ATA ACT AAG CAG CCC AAA TACGlu Phe Glu Lys Phe Trp Gly Leu Phe Ser Pro Ile Thr Lys Gln Pro Lys Tyr10351044TCG ATT AAT TTC AAT TAASer Ile Asn Phe AsnSEQ ID NO5的信息序列长度13个氨基酸序列类型氨基酸拓扑学线性分子序列类型肽序列描述SEQ ID NO5Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Asn Ile Ser Pro Gln1 5 10 13SEQ ID NO6的信息序列长度14个氨基酸序列类型氨基酸拓扑学线性分子序列类型肽序列描述SEQ ID NO6Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Ser1 510 14SEQ ID NO7的信息序列长度17个氨基酸序列类型氨基酸拓扑学线性分子序列类型肽序列描述SEQ ID NO7Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp1 510 15 17SEQ ID NO8的信息序列长度13个氨基酸序列类型氨基酸拓扑学线性分子序列类型肽序列描述SEQ ID NO8Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile Lys1 510 13SEQ ID NO9的信息序列长度17个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO9AARAGYATHG AYGGNGA 17SEQ ID NO10的信息序列长度13个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO10WRTCNCCNAC NAC 13SEQ ID NO11的信息序列长度17个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO11GTNAAYAARA TNCARAC 17SEQ ID NO12的信息序列长度17个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO12ARRTTNAGRA ARTCYTC 17SEQ ID NO13的信息序列长度24个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO13AAGTAYAAGC CRCAAGCCTA TTCA 24SEQ ID NO14的信息序列长度17个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO14ATCGCCRACA ACMCCAA 17SEQ ID NO15的信息序列长度54个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO15GGAATTCGAG CTCGGTACCC GGGGGATCCT CTAGAGTCGA CCTGCAGGCA TGCASEQ ID NO16的信息序列长度58个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO16CCTTAAGCTC GAGCCATGGG CCCCCTAGGA GATCTCAGCT GGACGTCCGT ACGTTCGASEQ ID NO17的信息序列长度26个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO17ATGGATCCAT GGTTAACATC CAAACC 26SEQ ID NO18的信息序列长度26个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO18ATGGATCCGA ATATAACTGG GAGAAG 26SEQ ID NO19的信息序列长度26个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO19ATGGATCCCC AGCATGGGGT AGGAAG 26SEQ ID NO20的信息序列长度28个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO20TAGTCGACTA CTTCTCCCAG TTATATTC28SEQ ID NO21的信息序列长度28个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO21TAGTCGACTA CTTCCTACCC CATGCTGG 28SEQ ID NO22的信息序列长度28个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO22TAGTCGACTA TTCATCACTT CTGCTATG 28SEQ ID NO23的信息序列长度26个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO23ATGGATCCGC CCCACAAGGT CCCAAA 26SEQ ID NO24的信息序列长度26个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO24ATGGATCCAA TGACTCCAAC ACCAAG 26SEQ ID NO25的信息序列长度26个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO25ATGGATCCGA ATATAACTGG GAGAAG 26SEQ ID NO26的信息序列长度28个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO26TAGTCGACTA CTTCCTACCC CATGCTGG28SEQ ID NO27的信息序列长度34个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO27CTAGAGGATC CGGTACCCCC GGGGTCGACG AGCT 34SEQ ID NO28的信息序列长度26个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO28CGTCGACCCC GGGGGTACCG GATCCT 26SEQ ID NO29的信息序列长度20个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO29CACCTTCAGC AACAATGGTT 20SEQ ID NO30的信息序列长度20个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO30CTATTCATCA CTTCTGCTAT 20SEQ ID NO31的信息序列长度24个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO31CAAATGTTGT GGTGAGGGAT GGCC 24SEQ ID NO32的信息序列长度24个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO32AAATGTTTCT CTATCTCAGG ACTC 24SEQ ID NO33的信息序列长度996个碱基对序列类型核酸链型双链拓扑学线性分子序列类型cDNA来源生物体菜豆(PhaseolusvulgarisL.)品系Hirasaya Fancy Saitou序列描述SEQ ID NO339 18 27 36 45 54ATG TCT GCC TTA TTG CTG CTT CTT GGA GTA TTA TCT TCC ACT GGA GTA CTG CTTMet Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ser Ser Thr Gly Val Leu Leu63 72 81 90 99 108ACT GGG GTA GAA TCT GTG GGT GTG TGT TAT GGA GGA AAT GGA AAC AAT CTA CCAThr Gly Val Glu Ser Val Gly Val Cys Tyr Gly Gly Asn Gly Asn Asn Leu Pro117 126 135 144 153 162ACA AAG CAA GCA GTG GTG AAT CTC TAC AAA TCA AAC GGA ATT GGC AAA ATC CGTThr Lys Gln Ala Val Val Asn Leu Tyr Lys Ser Asn Gly Ile Gly Lys Ile Arg171 180 189 198 207 216TTA TAC TAT CCA GAT GAA GGT GCC CTT CAA GCC CTC AGA GGT TCA AAC ATA GAALeu Tyr Tyr Pro Asp Glu Gly Ala Leu Gln Ala Leu Arg Gly Ser Asn Ile Glu225 234 243 252 261 270GTG ATA CTT GCT GTT CCT AAT GAT CAA CTT CAA TCT GTC TCC AAC AAT GGA AGTVal Ile Leu Ala Val Pro Asn Asp Gln Leu Gln Ser Val Ser Asn Asn Gly Ser279 288 297 306 315 324GCA ACA AAT TGG GTC AAC AAT TAC GTG AAA CCC TAT GCA GGA AAC GTG AAA TTGAla Thr Asn Trp Val Asn Asn Tyr Val Lys Pro Tyr Ala Gly Asn Val Lys Leu333 342 351 360 369 378AAG TAC ATT GCA GTT GGC AAC GAA GTT CAC CCT GGT GAT GCT CTA GCA GGC TCALys Tyr Ile Ala Val Gly Asn Glu Val His Pro Gly Asp Ala Leu Ala Gly Ser387 396 405 414 423 432GTT CTT CCA GCA CTT CAA AGC ATT CAG AAC GCA ATT TCT GCA GCA AAT TTG CAAVal Leu Pro Ala Leu Gln Ser Ile Gln Asn Ala Ile Ser Ala Ala Asn Leu Gln441 450 459 468 477 486CGC CAA ATC AAA GTC TCC ACA GCA ATA GAC ACC ACT CTA CTG GGC AAC TCT TACArg Gln Ile Lys Val Ser Thr Ala Ile Asp Thr Thr Leu Leu Gly Asn Ser Tyr495 504 513 522 531 540CCA CCA AAA GAT GGC GTT TTC AGC AAC AGT GCA AGT TCA TAC ATA ACT CCA ATCPro Pro Lys Asp Gly Val Phe Ser Asn Ser Ala Ser Ser Tyr Ile Thr Pro Ile549 558 567 576 585 594ATA AAC TTT TTA GCC AAA AAC GGT GCC CCA CTT CTT GCA AAC GTG TAC CCT TACIle Asn Phe Leu Ala Lys Asn Gly Ala Pro Leu Leu Ala Asn Val Tyr Pro Tyr603 612 621 630 639 648TTC GCC TAC GTT AAC AAT CAA CAA AAC ATT GGT CTT GAT TAT GCC TTG TTT ACCPhe Ala Tyr Val Asn Asn Gln Gln Asn Ile Gly Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Thr657 666 675 684 693 702AAA CAA GGC AAC AAC GAA GTT GGG TAC CAA AAC CTG TTT GAT GCA TTG GTG GATLys Gln Gly Asn Asn Glu Val Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Leu Val Asp711 720 729 738 747 756TCT CTG TAC GCA GCT CTT GAG AAA GTG GGA GCA TCA AAT GTG AAG GTT GTT GTGSer Leu Tyr Ala Ala Leu Glu Lys Val Gly Ala Ser Asn Val Lys Val Val Val765 774 783 792 801 810TCT GAG AGT GGG TGG CCA TCA CAA GGT GGA GTT GGA GCC ACT GTT CAA AAC GCASer Glu Ser Gly Trp Pro Ser Gln Gly Gly Val Gly Ala Thr Val Gln Asn Ala
819 828 837 846 855 864GGA ACG TAT TAC AGG AAT TTG ATC AAA CAT GTT AAG GGT GGC ACC CCA AAG AGGGly Thr Tyr Tyr Arg Asn Leu Ile Lys His Val Lys Gly Gly Thr Pro Lys Arg873 882 891 900 909 918CCT AAT GGA CCC ATA GAG ACT TAC CTC TTT GCC ATG TTT GAT GAA AAC CAG AAGPro Asn Gly Pro Ile Glu Thr Tyr Leu Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn Gln Lys927 936 945 954 963 972GGT GGT GCA GAA ACT GAG AAA CAC TTT GGT CTC TTC AGG CCT GAT AAA TCA CCAGly Gly Ala Glu Thr Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Arg Pro Asp Lys Ser Pro981 990 996AAA TAC CAA CTC AGT TTC AAT TGALys Tyr Gln Leu Ser Phe Asn***SEQ ID NO34的信息序列长度331个氨基酸序列类型氨基酸拓扑学线性分子序列类型肽序列描述SEQ ID NO34Met Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ser Ser Thr Gly Val Leu Leu1 510 15Thr Gly Val Glu Ser Val Gly Val Cys Tyr Gly Gly Asn Gly Asn Asn Leu Pro20 25 30 35Thr Lys Gln Ala Val Val Asn Leu Tyr Lys Ser Asn Gly Ile Gly Lys Ile Arg40 45 50Leu Tyr Tyr Pro Asp Glu Gly Ala Leu Gln Ala Leu Arg Gly Ser Asn Ile Glu55 60 65 70Val Ile Leu Ala Val Pro Asn Asp Gln Leu Gln Ser Val Ser Asn Asn Gly Ser
75 80 85 90Ala Thr Asn Trp Val Asn Asn Tyr Val Lys Pro Tyr Ala Gly Asn Val Lys Leu95 100 105Lys Tyr Ile Ala Val Gly Asn Glu Val His Pro Gly Asp Ala Leu Ala Gly Ser110 115 120 125Val Leu Pro Ala Leu Gln Ser Ile Gln Asn Ala Ile Ser Ala Ala Asn Leu Gln130 135 140Arg Gln Ile Lys Val Ser Thr Ala Ile Asp Thr Thr Leu Leu Gly Asn Ser Tyr145 150 155 160Pro Pro Lys Asp Gly Val Phe Ser Asn Ser Ala Ser Ser Tyr Ile Thr Pro Ile165 170 175 180Ile Asn Phe Leu Ala Lys Asn Gly Ala Pro Leu Leu Ala Asn Val Tyr Pro Tyr185 190 195Phe Ala Tyr Val Asn Asn Gln Gln Asn Ile Gly Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Thr200 205 210 215Lys Gln Gly Asn Asn Glu Val Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Leu Val Asp220 225 230Ser Leu Tyr Ala Ala Leu Glu Lys Val Gly Ala Ser Asn Val Lys Val Val Val235 240 245 250Ser Glu Ser Gly Trp Pro Ser Gln Gly Gly Val Gly Ala Thr Val Gln Asn Ala255 260 265 270Gly Thr Tyr Tyr Arg Asn Leu Ile Lys His Val Lys Gly Gly Thr Pro Lys Arg275 280 285Pro Asn Gly Pro Ile Glu Thr Tyr Leu Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn Gln Lys290 295 300 305Gly Gly Ala Glu Thr Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Arg Pro Asp Lys Ser Pro310 315 320Lys Tyr Gln Leu Ser Phe Asn***325 330SEQ ID NO35的信息序列长度29个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO35GGAATTCCGA ATCTGTGGGT GTGTGTTAT 29SEQ ID NO36的信息序列长度25个碱基对序列类型核酸链型单链拓扑学线性分子序列类型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO36GGAAACAGCT ATGACCATGA TTAGC 2权利要求
1.构建抗致病性真菌的植物的方法，包括将编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列整合入植物染色体并在该植物中表达该葡聚糖激发剂受体。
2.权利要求1的方法，其中该编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列包含大致示于SEQ ID NO1中的氨基酸序列的编码核苷酸序列。
3.权利要求1的方法，其中该编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列包含大致示于SEQ ID NO2中的核苷酸序列。
4.权利要求1的方法，其中该编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列包含导入质粒pER23-1的核苷酸序列。
5.权利要求1的方法，另外包含将编码葡聚糖酶的DNA序列整合入植物染色体并在该植物中表达该葡聚糖酶。
6.权利要求5的方法，其中该编码葡聚糖酶的DNA序列包含大致示于SEQ ID NO3或34中的氨基酸序列的编码核苷酸序列。
7.权利要求5的方法，其中该编码葡聚糖酶的DNA序列包含大致示于SEQ ID NO4或33中的核苷酸序列。
8.权利要求1的方法，其中将该编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列转移至农杆菌中，然后使该农杆菌感染植物，由此将所述葡聚糖激发剂受体编码DNA序列整合入该植物的染色体。
9.权利要求1的方法，其中将该编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列转移到选自叶、茎、根、块茎、原生质体、愈伤组织、种子胚、苗原基和花粉的植物材料中。
10.权利要求9的方法，其中将该编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列转移到选自叶、茎、根、块茎、原生质体、愈伤组织、种子胚、苗原基和花粉的植物材料中，然后由所述植物材料再生植株。
11.权利要求1的方法，其中该致病性真菌在其细胞壁组分中含有葡聚糖。
12.权利要求1的方法，其中该致病性真菌属于疫霉属或丝核菌属。
13.权利要求1的方法，其中该植物易受在细胞壁组分中含有葡聚糖的致病性真菌的感染。
14.权利要求1的方法，其中该植物是茄科植物或豆科植物。
15.对致病性真菌有抗性的植物或所述植物的子代，所述植物具有转移入的编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列并表达该葡聚糖激发剂受体。
16权利要求15的植物或其子代，其中该编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列包含大致示于SEQ ID NO1中的氨基酸序列的编码核苷酸序列。
17.权利要求15的植物或其子代，其中该编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列包含大致示于SEQ ID NO2中的核苷酸序列。
18.权利要求15的植物或其子代，其中该编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列包含导入质粒pER23-1的核苷酸序列。
19.权利要求15的植物或其子代，其中该植物还具有转移入的编码葡聚糖酶的DNA序列并表达该葡聚糖酶。
20.权利要求19的植物或其子代，其中该编码葡聚糖酶的DNA序列包含大致示于SEQ ID NO3或34中的氨基酸序列的编码核苷酸序列。
21.权利要求19的植物或其子代，其中该编码葡聚糖酶的DNA序列包含大致示于SEQ ID NO4或33中的核苷酸序列。
22.权利要求15的植物或其子代，其中该致病性真菌在其细胞壁组分中含有葡聚糖。
23.权利要求15的植物或其子代，其中该致病性真菌属于疫霉属或丝核菌属。
24.权利要求15的植物或其子代，其中该植物易受在细胞壁组分中含有葡聚糖的致病性真菌的感染。
25.权利要求15的植物或其子代，其中该植物是茄科植物或豆科植物。
26.编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列的用途，其目的是赋予植物抗致病性真菌性，或其目的是增强植物对致病性真菌的抗性。
27.编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列的用途，其目的是构建抗致病性真菌的植物。
全文摘要
通过将编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列整合入植物染色体以实现表达产生抗致病性霉菌的植物的方法;抗致病性霉菌的植物,该植物有导入的编码葡聚糖激发剂受体的DNA序列并在该植物中表达;以及它们的用途。
文档编号C12N15/82GK1209038SQ96199945
公开日1999年2月24日 申请日期1996年12月13日 优先权日1995年12月15日
发明者柿谷诚, 梅基直行, 石田功, 山冈直人 申请人:麒麟麦酒株式会社