专利名称：培育快速生长转基因动物的方法
技术领域：
本发明涉及动物育种，特别涉及应用基因工程技术研制快速生长动物养殖品种的方法。
鱼类育种是渔业生产中的重要环节，高产、优质、抗逆养殖品种的研制和培养是加速渔业发展的有力保障。传统的鱼类品种选育是一个漫长的过程，加之物种遗传壁垒和育种资源的限制，已不能满足日益增长的社会需求。1982年，应用基因转移技术，将生长激素基因导入小鼠受精卵，获得快速生长的转基因小鼠，该研究成果预示了基因工程育种的巨大潜力(Palmiter,R.et al,1982,Nature 300,611615)。但在猪、牛、羊等畜牧养殖品种转移外源生长激素基因，未能得到预期的生长性状改善(Westhusin,M.1997,NatureGenetics 17.4-5)。我们将人生长激素基因导入鲤鱼受精卵，研制出世界首例快速生长的转基因鱼(Zhu,Z.et al,1985,Z.angew.Ichthyol.1,31-34)。除了个别的转生长激素基因鲑鱼实验外(Delvin,R.H.et al,1994,Nature,371,209-210)，其它各种转生长激素基因鱼的快速生长效应均没有预期的显著。这一出乎预想的结果有多方面的原因。一方面，生物的生长是一个复杂的过程，受到多种基因产物影响，生长激素只是其中之一；另一方面，生长的调节要求相关基因表达和在时空上的协同作用。通过转移单一生长激素基因的方法，以求改良动物生长性状的目的是难以实现的。
生长激素(GH)和胰岛素样生长因子(IGF)是调节脊椎动物生长的两个重要因子。已有的研究证实，生长激素刺激动物肝脏等靶器官细胞产生胰岛素样生长因子，后者促进蛋白质合成及骨骼肌生长；体内生长激素或胰岛素样生长因子的含量对生长激素基因的表达均起调控作用。因此，生长激素和胰岛素样生长因子是调节生长的两个协同因子。
本发明采用外源生长激素基因和胰岛素样生长因子基因同步转移方法，将两个基因导入鱼受精卵中，通过两者表达产物的协同作用，大大促进转基因鱼个体的生长，由此筛选和培育快速生长的鱼类养殖新品系，以达到应用于渔业生产的目的。
为实现本发明的目的，其技术方案是基于鱼类生长的多因子调节特点，以及生长激素和胰岛素样生长因子在鱼类生长调节中的协同作用。采用DNA体外重组技术，将鱼类的生长激素基因和胰岛素样生长因子基因分别与鱼类的基因表达强启动子拼接，构建“全鱼”重组基因转移载体。将两种“全鱼”重组基因转移载体同步导入鱼受精卵，使之整合到由此发育而成的受体鱼染色体基因组中。在强启动子的驱动下，外源生长激素基因和胰岛素样生长因子基因得以有效表达，并协同发挥作用。应用多聚酶链反应(PCR)技术和逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，鉴定外源基因稳定整合并有效表达的阳性转基因鱼群体。在此基础上，筛选具显著快速生长性状的转基因鱼，培育繁殖，建立快速生长的转基因鱼新品系。
有益效果1、“全鱼”生长激素重组基因和“全鱼”胰岛素样生长因子重组基因整合到鱼染色体基因组中，并有效表达。在两种鱼类生长调节重要因子的协同作用下，转基因鱼可获得显著的快速生长效应。我们对黄河鲤受精卵同步转移“全鱼”生长激素重组基因和“全鱼”胰岛素样生长因子重组基因，转基因黄河鲤最大个体体重是对照鱼平均体重的3.4倍(鱼苗生长118天，最大实验鱼2750g，最大对照鱼1414g)。
2、在同等条件下，转生长激素基因鱼更有效地利用饵料，特别是更有效地利用低蛋白质饵料，具有更高的蛋白质合成能力。鱼体干物质和蛋白质含量分别提高1.6％和3.3％，而脂肪含量降低8.5％。
3、稳定整合在鱼染色体中的外源基因可通过生殖腺系细胞传递给后代。
附图
“全鱼”生长激素重组基因转移载体pCAgcGH和“全鱼”胰岛素样生长因子重组基因转移载体pCAsIGFc示意图，CA为鲤鱼肌动蛋白基因启动子调控顺序，gcGH为草鱼生长激素结构基因部分，sIGF-Ic为鲑鱼胰岛素样生长因子-I的cDNA。
实施例即本发明的方法与步骤1、基因转移载体构建转移载体基因元件包括本实验室克隆的鲤鱼6-肌动蛋白基因启动子(CA)和草鱼生长激素基因(gcGH)，以及引进的鲑鱼胰岛素样生长因子基因-I的cDNA,(sIGF-Ic)。质粒载体为pUC118。采用PCR技术将gcGH和sIGF-Ic分别与CA精确连接，构建“全鱼”重组基因转移载体pCAgcGH和pCAsIGFc。见附图。
2、外源基因转移用限制性内切酶EcoRⅠ将重组基因转移载体线性化，用胰蛋白酶消化去除黄河鲤鱼受精卵卵膜，采用显微注射方法，在第一次卵裂前将混合外源基因同时导入受精卵动物极，导入基因剂量5×105拷贝/卵，导入基因的受精卵及去卵膜的受精卵在实验室无菌环境中孵化。
3、转基因鱼鉴定筛选转基因鱼经室外鱼池饲养，进行个体标记。取尾鳍DNA，采用PCR技术检测外源基因gcGH和sIGF-I的整合；制备肝脏RNA，采用RT-PCR技术检测外源基因gcGH和sIGF-I的表达，鉴定转基因阳性鱼，筛选快速生长转基因阳性鱼，培育繁殖，进而建立快速生长转基因鱼品系。
4、转基因鱼营养及代谢测定用三种等能的合成鲤鱼饵料(分别含40％、30％和20％的蛋白质及相应的30％、40％和50％的碳水化合物)饱和投喂鱼8周，测定鱼的体重、饵料吸收、消化率和躯体组成的变化。
权利要求
应用基因转移技术的一种培育快速生长转基因动物的方法，其特征是将外源生长激素基因和胰岛素样生长因子基因分别与基因表达强启动子拼接，构建重组基因转移载体，以此两种重组基因转移载体同步导入受体动物受清卵，使之整合到由此发育而成的受体动物染色体基因组中，经鉴定筛选培育出快速生长的转基因动物群体。
全文摘要
生物的生长是一个复杂的过程,受到多种基因产物影响,因此,通过转移单一生长激素基因的方法,难以实现动物生长性状的改良目的。本发明采用协同基因同步转移方法,将脊椎动物生长调节中的两个重要因子－生长激素和胰岛素样生长因子的重组基因同时导入受体动物受精卵中,外源基因在染色体中的整合、表达,在其产物的协同作用下,促进转基因动物个体的生长。
文档编号C12N15/63GK1217384SQ9710930
公开日1999年5月26日 申请日期1997年11月17日 优先权日1997年11月17日
发明者朱作言, 汪亚平, 崔宗斌, 张甫英, 陈尚萍 申请人:中国科学院水生生物研究所