专利名称：化妆品生物活性有效成份添加剂的检测和筛选方法
技术领域：
本发明涉及采用生物的方法检测和筛选化妆品生物活性有效成份随着人民生活水平的提高，人们对化妆品的需求日益增加，化妆品市场迅速发展，各种各样的化妆品品种和剂型充斥市场，与此同时因化妆品引起的皮肤不良反应已成为一种公害，它直接影响着消费者身心健康。因此进一步强化化妆品质量的评价是十分必要的。本发明针对目前存在的问题，研制出一种对化妆品生物活性有效成份添加剂检测和筛选方法。
本发明目的在于，利用正常人和小鼠表皮细胞体外培养系统，直接对化妆品生物活性有效成份添加剂进行检测和筛选，观察各种化妆品生物有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。同时采用了四种评价手段衡量化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用；(1)多孔培养板培养表皮细胞检测和筛选化妆品生物活性有效成份添加剂最佳浓度梯度； (2)放射性同位素掺入标记观察化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞DNA复制和蛋白质合成的影响；(3)培养的表皮细胞原位包埋、电镜切片观察表皮细胞形态及细胞器结构；(4)在培养的表皮细胞增殖，生长、衰老和脱落过程中，跟踪固定染色光学显微镜下观察，评价化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞生长周期的影响，通过采用该方法的检测和筛选，完全可以确定化妆品生物活性有效成份的价值。
本发明所述的化妆品生物活性有效成份添加剂的检测和筛选方法，该方法首先利用正常人和小鼠表皮细胞体外培养系统，直接对化妆品生物活性有效成份进行检测和筛选；在检测和筛选过程中，采用多孔培养板培养表皮细胞；放射性同位素掺入标记；培养的表皮细胞原位包埋、电境切片，在培养的表皮细胞增殖，生长，衰老和脱落过程中，跟踪固定染色光学显微镜下观察等评价手段，衡量化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用；正常人和小鼠表皮细胞体外培养系统是采用以下方法(a)、以199培养基，Eagle培养基、RPNI-1640培养基，NEN培养基、DNEN培养基，其中一种为基础培养基，用胶原凝胶、鼠313细胞、人真皮成纤维细胞和掺入成纤维细胞的胶原凝胶其中之一为表皮细胞培养的滋养层，在培养液中添加5-20％小牛血清或胎牛血清，加入蛋白质生长因子(表皮生长因子，霍乱毒素，胰岛素等)及类固醇激素(氢化可的松，16-甲基脱氢皮质醇等)将消化、过滤和离心后获得的表皮基底细胞悬液接种在PH5-8的培养液中，控制温度36-38℃即可。(b)、以选择性培养基(如NCD8153培养基)为基础培养基，用胶原凝胶、鼠313细胞、人真皮成纤维细胞和掺入了成纤维细胞的胶原凝胶其中一种为表皮细胞培养的滋养层，添加脑下垂体提取物，加入蛋白质生长因子，(表皮生长因子、霍乱毒素、胰岛素等)及类固醇激素(氢化可的松、16-甲基脱氢皮质醇等)，将消化，过滤和离心后获得的表皮基底细胞悬液接种在PH5-75的培养液中，控制温度36-38℃即可。
然后采用下列四种评价手段，衡量化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用(1)将正常人或小鼠表皮细胞接种培养在多孔培养板上，在同一培养条件下，在培养液中添加要检测和筛选的化妆品生物活性有效成份添加剂样品，并根据多孔培养板的孔数，设置要检测和筛选的浓度梯度，根据多孔培养板每孔中表皮细胞在限定天数内染色后形成的表皮膜片面积，厚度判断要检测样品中有无或促进表皮细胞增殖的最佳浓度梯度；(2)通过氚标记的核苷(如氚标记的胸苷H3-Thynuidine)和氚标记的氨基酸(氚标记的亮氨酸H3-Leu)在表皮细胞培养过程中掺入情况检测和筛选的化妆品生物活性有效成份添加剂，在不同剂量下促进DNA复制和蛋白质合成情况，衡量是否具有营养作用；(3)、在表皮细胞培养的不同时间，取不同化妆品生物活性有效成份添加剂浓度下培养的表皮细胞，进行原位包埋，电镜切片观察，了解化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞角质化程度、细胞器结构、表皮膜片复层化的影响；(4)将正常人或小鼠表皮细胞培养在培养瓶、培养皿中，置于不同的化妆品生物活性有效成份活加剂浓度下，每隔1-2天，将细胞固定染色，进行光学显微镜下观察表皮细胞增殖、生长、衰老和脱落的生物形态变化，综上所述通过四种手段可以评价化妆品生物活性有效成份添加剂的作用和价值。
实施例1(1)首先建立小鼠体外表皮细胞培养系统取199培养基为基础培养基，用胶原凝胶作为表皮细胞培养的滋养层，在培养液中添加5％小牛血清，然后加入胰岛素及氢化可的松，再将消化、过滤和离心后获得的表皮基底细胞悬液接种在PH5-8的培养液中，控制温度36-38℃，即可建成离体的小鼠表皮细胞培养系统，直接对化妆品生物活性有效成份添加剂进行检测和筛选，观察各种有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
(2)采用下列四种评价手段衡量化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
(a)、多孔培养板培养表皮细胞检测和筛选化妆品生物活性有效成份添加剂最佳浓度梯度。
(b)、放射性同位素掺入标记观察化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞DNA复制和蛋白质合成影响。
(c)、培养的表皮细胞原位包埋、电镜切片观察表皮细胞形态及细胞器结构。
(d)、在培养的表皮细胞增殖、生长、衰老和脱落过程中，跟踪固定染色光学显微镜下观察，评价化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞生长周期的影响。
实施例2(1)首先建立小鼠体外表皮细胞培养系统取Eagle培养基为基础培养基，用鼠313细胞作为表皮细胞培养的滋养层，在培养液中添加10％牛血清，再将消化、过滤和离心后获得的表皮基低细胞悬液接种在PH5-8的培养液中，控制温度36-38℃，即可建成离体的小鼠表皮细胞培养系统，直接对化妆品生物活性有效成份添加剂进行检测和筛选，观察各种有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
(2)采用下列四种评价手段衡量化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮的生理作用。
(a)、多孔培养板培养表皮细胞检测和筛选化妆品生物活性有效成份添加剂最佳浓度梯度。
(b)、放射性同位素掺入标记观察化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞DNA复制和蛋白质合成影响。
(c)、培养的表皮细胞原位包埋、电镜切片观察表皮细胞形态及细胞器结构。
(d)、在培养的表皮细胞增殖、生长、衰老和脱落过程中，跟踪固定染色光学显微镜下观察，评价化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞生长周期的影响。
实施例3(1)首先建立正常人体外表皮细胞培养系统取DNEN培养基为基础培养基，用人真皮成纤维细胞作为表皮细胞培养的滋养层，在培养液中添加20％小牛血清，然后加入表皮生长因子、氢化可的松，再将消化、过滤和离心后获得的表皮基低细胞悬液接种在PH5-8的培养液中，控制温度36-38℃，即可建成离体的正常人表皮细胞培养系统，直接对化妆品生物活性有效成份添加剂进行检测和筛选，观察各种有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
(2)采用下列四种评价手段衡量化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
(a)多孔培养板培养表皮细胞检测和筛选化妆品生物活性有效成份添加剂最佳浓度梯度。
(b)、放射性同位素掺入标记观察化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞DNA复制和蛋白质合成影响。
(c)、培养的表皮细胞原位包埋、电镜切片观察表皮细胞形态及细胞器结构。
(d)、在培养的表皮细胞增殖、生长、衰老和脱落过程中，跟踪固定染色光学显微镜下观察，评价化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞生长周期的影响。
实施例4(1)首先建立正常人体外表皮细胞培养系统取RPN1-1640培养基为基础培养基，用掺入成纤维细胞的胶原凝胶作为表皮细胞培养的滋养层，在培养液中添加10％胎牛血清，然后加入表皮生长因子及激素16-甲基脱氢皮质醇，再将消化、过滤和离心后获得的表皮基低细胞悬液接种在PH5-8的培养液中，控制温度36-38℃，即可建成离体的正常人表皮细胞培养系统，直接对化妆品生物活性有效成份添加剂进行检测和筛选，观察各种有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
(2)采用下列四种评价手段衡量化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
(a)多孔培养板培养表皮细胞检测和筛选化妆品生物活性有效成份添加剂最佳浓度梯度。
(b)、放射性同位素掺入标记观察化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞DNA复制和蛋白质合成影响。
(c)、培养的表皮细胞原位包埋、电镜切片观察表皮细胞形态及细胞器结构。
(d)、在培养的表皮细胞增殖、生长、衰老和脱落过程中，跟踪固定染色光学显微镜下观察，评价化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞生长周期的影响。
实施例5(1)首先建立正常人或小鼠体外表皮细胞培养系统取NCDB153培养基为基础培养基，用胶原凝胶作为表皮细胞培养的滋养层，添加脑下垂体提取物，然后加入霍乱毒素、氢化可的松，再将消化、过滤和离心后获得的表皮基低细胞悬液接种在PH5-8的培养液中，控制湿度36-38℃，即可建成离体的正常人或小鼠表皮细胞培养系统，直接对化妆品生物活性有效成份添加剂进行检测和筛选，观察各种有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
(2)采用下列四种评价手段衡量化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
(a)多孔培养板培养表皮细胞检测和筛选化妆品生物活性有效成份添加剂最佳浓度梯度。
(b)、放射性同位素掺入标记观察化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞DNA复制和蛋白质合成影响。
(c)、培养的表皮细胞原位包埋、电镜切片观察表皮细胞形态及细胞器结构。
(d)、在培养的表皮细胞增殖、生长、衰老和脱落过程中，跟踪固定染色光学显微镜下观察，评价化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞生长周期的影响。
权利要求
1.一种化妆品生物活性有效成份添加剂的检测和筛选方法，其特征在于，该方法利用正常人或小鼠表皮细胞体外培养系统，直接对化妆品生物活性有效成份进行检测和筛选；采用多孔保养板培养表皮细胞，放射性同位素掺入标记；培养的表皮细胞原位包埋、电境切片观察，在培养的表皮细胞增殖，生长，衰老和脱落过程中，跟踪固定染色光学显微镜观察等评价手段，衡量化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用。
2.根据权利要求1所述的化妆品生物活性有效成份添加剂的检测和筛选方法，其特征在于，正常人或小鼠表皮细胞体外培养系统是采用以下方法建成(a)、以199培养基，Fagle培养基、RPHI-1640培养基，WEN培养基、ONEN培养基，其中一种为基础培养基，用胶原凝胶、鼠313细胞、人真皮成纤维细胞和掺入成纤维细胞的胶原凝胶其中之一为表皮细胞培养的滋养层，在培养液中添加5-20％小牛血清或胎牛血清，加入蛋白质生长因子(表皮生长因子，霍乱毒素，胰岛素等，及类固醇激素(氢化可的松，16-甲基脱氢皮质醇等)，将消化、过滤和离心后获得的表皮基底细胞悬液接种在PH5-8的培养液中，控制温度36-38℃即可。(b)、以选择性培养基(如NCDB153培养基)为基础培养基，用胶原凝胶、鼠373细胞、人真皮成纤维细胞和掺入了成纤维细胞的胶原凝胶其中一种为表皮细胞培养的滋养层，添加脑下垂体提取物，加入蛋白质生长因子，(表皮生长因子、霍乱毒素、胰岛素等)及激素(氢化可的松、16-甲基脱氢皮质醇等)，将消化、过滤和离心后获得的表皮基底细胞悬液接种在PH5-7.5的培养液中，控制温度36-38℃即可。
3.根据权利要求1所述的化妆品生物活性有效成份添加剂的检测和筛选方法，其特征在于，采用下列四种评价手段，衡量有效成份添加剂对表皮细胞的生理作用；(1)将正常人或小鼠表皮细胞接种培养在多孔培养板上，在同一培养条件下，在培养液中添加要检测和筛选的化妆品生物活性有效成份添加剂样品，并根据多孔培养板的孔数，设置要检测和筛选的浓度梯度，根据多孔培养板每孔中表皮细胞在限定天数内染色后形成的表皮膜片面积，厚度判断要检测样品中有无或促进表皮细胞增殖的最佳浓度梯度；(2)通过氚标记的核苷(如氚标记的胸苷H3-Ibynoidine)和氚标记的氨基酸(氚标记的亮氨酸H3-Leu)在表皮细胞培养过程中掺入情况检测和筛选的化妆品生物活性有效成份添加剂，在不同剂量下促进DNA复制和蛋白质合成情况，衡量其是否具有营养作用；(3)、在表皮细胞培养的不同时间，取不同化妆品生物活性有效成份添加剂浓度下培养的表皮细胞，进行原位包埋，电镜切片观察，了解化妆品生物活性有效成份添加剂对表皮细胞角质化程度、细胞器结构、表皮膜片复层化的影响；(4)将正常人或小鼠表皮细胞培养在培养瓶、培养皿中，置于不同的化妆品生物活性有效成份活加剂浓度下，每隔1-2天，将细胞固定染色，进行光学显微镜下观察表皮细胞增殖、生长、衰老和脱落的生物形态变化。
全文摘要
本发明涉及一种采用生化手段对化妆品生物活性有效成分添加剂的检测和筛选方法,该方法利用正常人或小鼠表皮细胞体外培养系统,直接对化妆品生物活性有效成分添加剂进行检测和筛选,观察有效成分添加剂对表皮细胞的生理作用,同时采用多孔培养板培养表细胞检测和筛选最佳浓度梯度;放射性同位素掺入标记;培养的表皮细胞原位包埋;表皮细胞增殖、生长、衰老和脱落的方法,评价手段衡量有效成分添加剂对表皮细胞的生理作用。
文档编号C12Q1/02GK1218837SQ9711949
公开日1999年6月9日 申请日期1997年12月2日 优先权日1997年12月2日
发明者王亮, 李维琪 申请人:中国科学院新疆化学研究所