专利名称：植物成视网膜细胞瘤相关蛋白的制作方法
描述本发明涉及植物及动物系统中有生物活性的蛋白、编码用于这类蛋白表达的多核苷酸序列、用于鉴定和合成这类蛋白及多核苷酸序列的寡核苷酸、包含重组多核苷酸的载体及细胞、包含这些的植物及动物、以及所述蛋白和多核苷酸及其片段在控制植物的生长及对病毒攻击的易受性中的应用。
细胞周期的进程由正效应因子和负效应因子调控。在负效应因子调控中，成视网膜细胞瘤易感性基因的产物(Rb)控制着哺乳类细胞通过G1期的通道。在哺乳类细胞中，Rb通过抑制转录因子E2F家族的功能而调控G1/S转变，而已知E2F家族能与细胞DNA复制所需的基因的启动子区相互作用(见如Weinberg,R.A.Cell81,323(1995)；Nevins,J.R.Science258,424(1992))。感染动物细胞的DNA肿瘤病毒表达癌蛋白，所述癌蛋白通过一个LXCXE基序与Rb蛋白相互作用，破坏Rb-E2F复合物，并驱使细胞进入S期(Weinberg idid；Ludlow,J.W.FASEB J.7,866(1993)；Moran,E.FASEB J.7,880(1993)；Vousden,K.FASEB J.7,872(1993))。
本发明人已经展示植物联体病毒的有效复制需要病毒RepA蛋白中一个LXCXE氨基酸基序的完整性；而RepA能在酵母中与人类Rb家族的成员相互作用(Xie,Q.,Suárez-López,P.和Gutiérrez,C.EMBO J.14,4073(1995))。已经有报道植物D型细胞周期蛋白中也存在LXCXE基序(Soni,R.,Camichael,J.P.,Shah,Z.H.和Murray,J.A.H.Plant Cell7,85-103(1995))。
本发明人第一次鉴定了植物Rb蛋白的特征序列及相应的编码多核苷酸的特征序列，分离了所述的蛋白和核酸，特别是鉴定了将植物Rb蛋白序列与已知的动物Rb蛋白序列区分开来的序列。本发明人测定了一段来自玉米的已知DNA序列编码的植物的Rb植物蛋白，这个序列下文称为ZmRbl。本发明人已经证明ZmRbl在酵母中与RepA相互作用，其中RepA是一种植物联体病毒蛋白，包含对其功能来说必不可少的LXCXE基序。本发明人进一步确认在编码ZmRbl或人类Rb家族的一个成员p130的质粒转染的植物细胞中，联体病毒的DNA复制被削弱了。
本发明人的研究工作明显地表明，植物和动物细胞可能在生长控制上共用基本相似的策略，因此预期人类及植物的Rb蛋白(如ZmRbl)将可以使用在特别是植物的治疗、诊断、生长控制或研究中，而许多这类植物蛋白将能相似地用于动物。
本发明的第一方面提供了成视网膜细胞瘤蛋白在控制植物和/或植物病毒生长中的用途。本发明具体地提供了在植物细胞中控制病毒的感染和/或生长的方法，其中所述病毒的正常复制需要在它的一个蛋白上，具体地说如在病毒RepA蛋白上LXCXE氨基酸基序的完整性。具体的这样控制的病毒是联体病毒。
使用这类蛋白进行控制的一个优选方法涉及或是通过直接施用，或是通过将编码用于这类蛋白表达的DNA或RNA导入需要治疗的植物细胞，将这类蛋白施用于植物细胞。通过过量表达成视网膜细胞瘤蛋白、或表达与所述病毒的LXCXE基序相互作用但不影响细胞正常功能的Rb蛋白或肽片段，有可能抑制正常的病毒生长并由此产生由这个细胞影响到周围细胞的感染。
另一方面，通过以含有所述DNA或RNA转录必需的启动子的载体形式，将反义DNA或RNA导入植物细胞，有可能利用人们所熟知的反义机制抑制Rb蛋白的表达，并由此抑制S期。这样的植物能在其它方面用于复制DNA或RNA达到很高的水平，如在酵母中中的水平。对于那些精于该技术领域的人来说，将反义DNA导入细胞的方法是很熟悉的如见“Principles of gene manipulation-An introduction to GeneticEngineering(1994)R.W.Old和S.B.Primrose；Oxford-BlackwellScientific Pubilcations第5版，第398页。
本发明的第二方面提供了DNA或cRNA(mRNA)形式的编码表达植物特有的Rb蛋白的核酸。这种核酸的特征在于具有与动物Rb蛋白的核酸不同的一个或更多的特征区域，如本文SEQ ID No.1的碱基31-2079所示。
所述DNA或RNA的序列可以含有如SEQ ID No.1中密码子核苷酸中的简并置换，其中在RNA上，T为U。最优选的DNA或RNA能在严谨性低的条件下与具有SEQ ID No.1的多核苷酸杂交，最好能在严谨性高的条件下产生杂交。
“严谨性低的条件”和“严谨性高的条件”的表达方式为本技术领域的熟练技术人员所理解，但可以方便地例如参阅US5202257第9-10栏。如果进行一些修饰，产生表达具有不同氨基酸的蛋白，最好是SEQ ID No.1中相应氨基酸的同类氨基酸，则所述修饰就称为保守的置换。这类置换被熟悉本技术领域的人所熟知，如见US5380712，并且只有当所述蛋白具有成视网膜细胞瘤蛋白的活性时，才会考虑这种置换。
优选的DNA或cRNA编码一种下述的植物Rb蛋白，它具有A和B袋(pocket)亚域，与人类Rb蛋白相比，特别是与p130相比，具有30％到75％的同源性，更优选的具有50％到64％的同源性。特别是，这样编码的植物Rb蛋白有人类Rb蛋白上保守的C706氨基酸。袋A和袋B之间的间隔序列与动物Rb蛋白相比不是保守的，最好与动物Rb蛋白中发现的同一区域相比只有低于50％的同源性。首选的这样编码的蛋白与本文所附序列表的SEQ ID No.2有80％或更高的同源性，更优选有90％或更高的同源性，最优选有95％或更高的同源性。本发明具体提供的是SEQ IDNo.1碱基31-2079或整个SEQ ID No.1的重组DNA，或是编码用于玉米cDNA克隆的相应RNA，其中所述cDNA克隆编码SEQ ID No.2的ZmRhl。
本发明的第三方面提供由第二方面的重组DNA或RNA表达的蛋白、由这类DNA或RNA得来的新型蛋白、以及采取诱变方法，如使用PCR诱变引物由天然存在的DNA或RNA得来的蛋白。
本发明的第四方面提供了含有本发明有义或反义的重组DNA或RNA的载体、细胞、植物和动物。
第一方面的一个特别优选的应用提供了一种控制细胞或病毒生长的方法，包括将本发明第二或第三方面的DNA、RNA或蛋白施用于所述细胞。这种施用在蛋白质的情况下可以是直接的，或可以包括间接方式，如以电穿孔法向植物种子细胞导入DNA，或将能表达或过量表达的抑制细胞或病毒生长的本发明蛋白或其片段的载体转化入细胞中。
另一方面，这种方法使用一种能产生本发明cDNA的反义RNA的表达载体。
所述植物蛋白及其核酸的另一个具体特征包括序列上相应于SEQID No.2的氨基酸1-90的N端区域序列和相应于SEQ ID No.1的碱基31-300的核苷酸序列。这些序列的特征在于具有少于150个单位和少于450个单位，而动物的这些序列有多于300个氨基酸和多于900对碱基。
将参考下面非限制性实施例进一步地说明本发明。根据这些实施例，那些熟悉本技术领域的人会想到在本发明所附的权利要求书范围内的其它实施方案。
附1．分图A显示了本文所述ZmRbl蛋白和人类成视网膜细胞瘤蛋白的相对长度。分图B显示了ZmRbl的袋A和袋B的氨基酸序列与非洲爪蟾属、鸡、大鼠以及三种人类蛋白(Rb、p107、p130)的氨基酸序列的序列对比。
图2．此图是WDV病毒和由WDV得来的pWori载体的主要特征图谱，图中还标明了为确定病毒在植物细胞中的复制需要的LXCXE基序所使用的缺失及突变位置。
实施例1DNA和蛋白表达克隆的分离基本按照Soni等人(1995)所述的方法，通过研磨事先冻存在液氮中的玉米根部和成熟叶片，分离总RNA。通过与一个随机引发的32P标记的PstI内部片段(1.4kb)进行杂交，鉴定主要和次要的p75ZmRblmRNA。
随后与设计与p130在玉米同源物的一段已知EST序列互补的5’标记寡核苷酸进行杂交，筛选在1ZAPⅡ(Stratagene)中的部分玉米cDNA库(106pfu)。这些寡核苷酸序列为5’-AATAGACACATCGATCAA/G(M.m，核苷酸位置4111-1438)和5’-GTAATGATACCAACATGG(M.3c，核苷酸位置1606-1590)(Isogen Biosciences)。
在第二轮筛选之后，通过采用ExAssit辅助噬菌体(Stratagene)按照厂家介绍的方法进行体内切割，分离阳性克隆中的pBluescript SK-(pBS)噬菌粒。用SequenaseTM试剂盒(USB)进行DNA测序。
编码p75ZmRbl的mRNA的5′端是采用RACE-PCR的方法确认的。在寡聚dT纤维素(Amersham)上进行色谱分离，纯化poly-A+mRNA。用寡核苷酸DraⅠ35(5′-GATTTAAAATCAAGCTCC，核苷酸位置113-96)作为引物合成第一条链。于90℃变性3分钟后，用RNase处理去除RNA，将cDNA回收并用末端转移酶和dATP在5′末端加尾。然后使用引物DraⅠ35和Stratagene cDNA合成试剂盒的接头-引物(50bp)扩增一个PCR片段。
根据限制性分析，如此产生的一个阳性克隆包含一段大约4kb的插入片段，该片段在包含于所用表达序列标记(Expressed Sequence Tag)中的区域的3′和5′都扩展了。对应于最长的cDNA插入片段(3747bp)的核苷酸序列示于SEQ ID No.1。这段ZmRbl cDNA包含一个单独的可读框，能编码一个683氨基酸残基大小的蛋白(预测的Mr为75247，p75ZmRbl)，在可读框的后面是一个1646碱基对的3′-非翻译区。在哺乳类Rb cDNA中也发现相似长度的非翻译区(Lee,W.-L.等，Science235,1394(1987)；Bemards,R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,6474(1989))。Northern分析显示，从玉米根部分生组织和成熟叶片得到的细胞都含有一段主要信息(major message)，长约2.7±0.2kb。此外，还出现了一段约3.7±2kb的次要信息(minor message)。在其他物种中已经检测到不均一的转录产物(Destr*e,O.H.J.等，Dev.Biol.153,141(1992))。
通过删除pWori上大部分编码WDV蛋白的序列构建质粒pWoriΔΔ(Sanz和Gutierrez，未发表)。通过在pBS载体中ZmRbl cDNA的上游插入CaMV 35S启动子(得自pWDV3:35SGUS)，构建质粒p35S.Rbl。通过将完整的人类p130编码序列而不是ZmRbl序列导入p35S.Rbl，构建质粒p35S.130。通过用WDV RepA和RepB的可读框的编码序列替代p35S.Rbl质粒上的ZmRbl，构建质粒p35.A+B(见Soni,R.和Murray,J.A.H.Anal.Biochem.218,474-476(1994))。
在核苷酸位置31的甲硫氨酸密码子周围的序列包含一个共有翻译起点(Kozak,M.J.Mol.Biol.196,947(1987))。为确定所述cDNA是否包含全长ZmRbl编码区，使用从靠近推定的起始密码子AUG的一个区域得到的一段寡核苷酸，用RACE-PCR的方法扩增mRNA的5′端，产生一个大约150碱基对的片段。结果与包含完整编码区的ZmRbl cDNA克隆是一致的。
ZmRbl蛋白包含与在所有Rb家族成员中存在的“袋”的A亚域和B亚域同源的区段。这些亚域被一个非保守间隔区分开。ZmRbl还含有不保守的N端域和C端域。总的说来，ZmRbl与Rb家族的成员享有约28％到50％的氨基酸同一性(约50％的氨基酸相似性)(Hannon,G.J.,Demetrick,D.和Beach,D.Genes Dev7,2378(1993)；Cobrinik,D.,Whyte,P.,Peeper,D.S.,Jacks,T.和Weinberg,R.A.出处同上，第2392页(1993).Ewen,M.E.,Xing,Y.Lawrence,J.B.和Livingston,D.M.Cell66,1155(1991))(Lee W.L.等，Science235,1394(1987)；Bemard等Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,6974(1989))，与A亚域和B亚域表现出最高的同源性(约50％-64％)。有趣的是，对于人类Rb的功能来说至关重要的氨基酸C706(Kaye,F.J.,Kratzke R.A.,Gerster,J.L.和Horowitz,J.M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,6922(1990))在玉米p75ZmRbl中也是保守的。
注561-577氨基酸包含一个脯基酸丰富的结构域。
ZmRbl包含被细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)磷酸化的16个共有位点，即SP或TP，而且亚域A5′尾的一个位点和C末端区上的几个位点是磷酸化的潜在位点。一组优选的核酸编码这些位点中的一个或多个改变或缺失的蛋白，使得蛋白对磷酸化的抗性更强，并进而更不容易发挥功能，如与E2F等等结合。这可以用PCR进行的诱变方法轻易实现。实施例2体内活性小麦矮联体病毒(WDV)的复制依赖于病毒RepA蛋白的完整的LXCXE基序。这个基序在酵母中能介导与人类Rb家族的一个成员p130的相互作用。因此，本发明人使用酵母双杂种系统(Fields,S和Song,O.Nature340,245-246(1989))研究了p75ZmRbl能否与WDV RepA复合。用编码融合蛋白GAL4BD-RepA的质粒及编码不同的GAL4AD融合蛋白的质粒共转化酵母细胞。GAL4AD-p75ZmRbl融合物也能与GAL4BD-RepA复合，使得受体酵母细胞在缺乏组氨酸的环境下生长。这种相互作用比使用人类p130蛋白的相互作用要稍稍强一些。RepA在一定程度上也能结合N端截短形式的p75ZmRbl。使用WDV RepA上的一个点突变(E198K)评价LXCXE基序在RepA-p75ZmRbl相互作用中的作用，我们在前面表明，该点突变破坏WDV RepA与人类p130之间的相互作用。ZmRbl与编码融合物GAL4BD-RepA(E198K)的质粒的共转化表明，RepA和p75ZmRbl之间的相互作用是通过LXCXE基序发生的。
在这一方面，WDV RepA的E198K突变体的行为与动物病毒癌蛋白的类似点突变体的行为相似(Moran,E.,Zerler,B.,Harrison,T.M.和Mathews,M.B.Mol.Cell Biol.6,3470(1986)；Cherington,V.等，出处同上，第1380页(1988)；Lillie,J.W.,Lowenstein,P.M.,Green,M.R.和Green,M.Cell50,1091(1987)；DeCarpio,J.A.等，出处同上，第275页(1988))。
玉米p75ZmRbl与WDV RepA在酵母双杂种系统(Fields等)中的相互作用，依赖于由包含DNA结合域(GAL4BD)和激活域(GAL4AD)的两个独立的GAL融合蛋白重建功能性GAL4活性的能力。用两种质粒共转化酵母HF7C细胞，一种是表达GAL4BD-RepA或GAL4BD-RepA(E198K)融合物的质粒，另一种是表达单独的GAL4AD(Vec)或与人类p130、玉米p75(p75ZmRbl)或缺失了N端69个氨基酸的p75(p75ZmRbl-DN)融合的GAL4AD的质粒。根据左上角显示的分类，将细胞在含或不含组氨酸的平板上划线。细胞在缺乏组氨酸时生长的能力决定于融合蛋白相互作用时GAL4活性的功能性重建，因为这触发由GAL4效应元件控制的HIS3基因的表达。这些酵母共转化体的生长特征与b-半乳糖苷酶的活性水平相关。
双杂种分析的步骤如Xie等人(1995)所述。GAL4AD-ZmRbl融合物构建于pGAD424载体中。实施例3体内活性联体病毒DNA的复制需要细胞DNA复制机构和其他S期特异性因子(Davies,J.W.和Stanley,J.Trends Genet.5,77(1989)；Lazarowitz,S.Crit.Rev.Plant Sci.11,327(1992))。与这种需要相一致的是，联体病毒的感染表现为将非增殖细胞驱入S期，如增殖细胞核抗原(PCNA)的积累所示，PCNA是通常不存在于分化细胞细胞核中的蛋白(Nagar,S.,Pedersen,T.J.,Carrick,K.M.,Hanley-Bowdoin,L.和Robertson,D.PlantCell7,705(1995))。本发明人发现的有效的WDV DNA复制需要RepA上一个LXCXE基序以及Rb在植物中的同源物的发现支持这样一个模型病毒RepA蛋白对植物Rb的结合促使受感染的细胞不适当地进入S期,正如在动物细胞中一样。因此，研究ZmRbl功能的一个方法是在携带ZmRbl序列的质粒转染的细胞中测定联体病毒DNA的复制，其中该ZmRbl序列处于在植物细胞中有功能的启动子控制之下，该方法是与以前在人类细胞上使用的方法(Uzvolgi,E.等.,Cell Growth Diff2,297(1991))相似。在用表达p75ZmRbl或人类p130的质粒转染的小麦细胞中，当由WDV启动子或CaMV35S启动子指导的WDV复制蛋白的表达衰减时，新复制的病毒质粒DNA的积累被削弱。
由于WDV DNA的复制需要一个S期的细胞环境，p75ZmRbl和人类p130对病毒DNA复制的干扰有力地证明了成视网膜细胞瘤蛋白在植物Gl/S期转换中的作用。植物Rb同源物的存在暗示，尽管植物和动物细胞在远古时分叉，但它们在细胞周期控制上使用相似的，至少是部分相似的调控蛋白和途径。
另外两个证据支持这个模型。第一，在苜蓿细胞中已经鉴定了一个基因，它编码一种蛋白，这种蛋白特异性地辅助出芽酵母cdc28突变体的Gl/S转变，而不是G2/M转变(Hirt,H.,Páy,A.,Bgre,L.,Meskiene,I.和Heberle-Bors,E.Plant J.4,6l(1993))。第二，已经从拟南芥属中分离得到D型细胞周期蛋白的植物同源物，而且这种同源物象其哺乳类相关物一样包含LXCXE基序。与CDK4和CDK6的植物形式一致，植物D型细胞周期蛋白可能通过控制Rb样蛋白的磷酸化状态，调控通过Gl期的通道。
在动物细胞中，已经发现Rb家族与肿瘤抑制以及分化和发育控制有关。这样，p75ZmRbl也可能在其他水平上在植物细胞周期中发挥关键调控作用。植物细胞中Rb同源物的存在产生的一个关键问题是，Rb途径的破坏是否会与在动物中一样导致易生肿瘤的条件。在这一方面，本发明人注意到，根癌农杆菌和毛根农杆菌的Ti质粒编码的VirB4蛋白都含有LXCXE基序。尽管VirB4蛋白在肿瘤诱导中是必需的(Hookas,P.J.J.和Beijersbergen,A.G.M.Annu.Rev.Phytopathol.32,157(1994))，但在该邻近序列中其LXCXE基序的功能还有待研究。在被感染的植物中，联体病毒的感染并不伴随着肿瘤发生，但在一些例子中观察到了enaction的异常生长(G.Dafalla和B.Gronenbom，个人通讯)。
如下使用p75ZmRbl和人类p130在培养的小麦细胞中抑制小麦矮联体病毒(WDV)DNA的复制。A．按照标明的，用质粒pWori(0.5g)单独感染小麦细胞，用对照质粒pBS(10g)或p35S.Rbl(10g)感染小麦细胞，其中pWori(Xie等，1995)是一个复制型WDV基质粒，编码病毒DNA复制所需的WDV蛋白，p35S.Rbl编码在CaMV35S控制之下的ZmRbl序列。转染后一天和两天分离纯化总DNA，在琼脂糖凝胶电泳中分级分离等量DNA并用溴化乙锭染色，用Southern杂交法鉴别病毒pWoriDNA。质粒DNA全部代表新复制的质粒DNA，因为它完全抗DpnⅠ消化，而对MboⅠ敏感。请注意，MboⅠ消化样品的泳动距离约比未消化样品的泳动距离长一半。B．为测定人类p130对WDV DNA复制的影响，用pWori(0.5g)和质粒pBS(对照)、p35S.Rbl或p35S.p130(每种10g)共转染小麦细胞。转染后两天，分析测试质粒的复制，并用溴化乙锭染色法和Southem杂交法如A部分所述进行检测。C．为测定在病毒蛋白的表达由CaMV35S启动子指导时，ZmRbl或人类p130对WDV DNA复制的影响，使用了测试质粒pWoriΔΔ(该质粒不编码有功能的WDV复制蛋白，但当这些蛋白由一个不同的质粒(即pWori)提供时，该质粒能够复制)。按照标明的，用pWoriΔΔ(0.25g)、pWori(0.25g)、p35S.A+B(6g)、p35SRbl(10g)和/或p35S.130(10g)共转染小麦细胞。转染后36小时分析测试质粒(pWoriΔΔ)的复制，并用溴化乙锭染色法和Southern杂交法如A部分所述进行检测。用质粒pWori(M1)和pWoriΔΔ(M2；SanzGutiérrez，未发表)各100pg作为标记物。用粒子轰击法转染小麦细胞的悬浮培养，并如(Xie等，1995)所述分析病毒DNA复制，只是DNA提取方法如(Soni和Murray.Arnal.Biochem.218,474-476(1995))修改。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)姓名CRISTANTO GUTIERREZ ARMENTA(A)姓名QI XIE(A)姓名ANDRES PELAYO SANZ-BURGOS(A)姓名PAULA SUAREZ-LOPEZ(B)街道CSIC-UAM,UNIVERSIDAD AUTONOMA,CANTOBLANCO(C)城市马德里(E)国家西班牙(F)邮政编码(ZIP):28049(ⅱ)发明名称植物蛋白(ⅲ)序列数2(ⅳ)计算机可读形式(A)媒介软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,#1.30版本(EPO)(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度3747碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假设否(ⅳ)反义否(ⅵ)原始来源(A)玉米(ⅸ)特征(A)关键字CDS(B)位置31..2079(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.1:GAATTCGGCA CGAGCAAAGG TCTGATTGAT ATG GAA TGT TTC CAG TCA AAT TTG 54Met Glu Cys Phe Gln Ser Asn Leu1 5GAA AAA ATG GAG AAA CTA TGT AAT TCT AAT AGC TGT AAA GGG GAG CTT 102Glu Lys Met Glu Lys Leu Cys Asn Ser Asn Ser Cys Lys Gly Glu Leu10 15 20GAT TTT AAA TCA ATT TTG ATC AAT AAT GAT TAT ATT CCC TAT GAT GAG 150Asp Phe Lye Ser Ile Leu Ila Aan Asn Asp Tyr Ile Pro Tyr Asp Glu25 30 35 40AAC TCG ACG GGG GAT TCC ACC AAT TTA GGA CAT TCA AAG TGT GCC TTT 198Asn Ser Thr Gly Asp Ser Thr Ash Leu Gly His Ser Lys Cys Ala Phe45 50 55GAA ACA TTG GCA TCT CCC ACA AAG ACA ATA AAG AAC ATG CTG ACT GTT 246Glu Thr Leu Ala Ser Pro Thr Lys Thr Ile Lys Asn Met Leu Thr Val60 65 70CCT AGT TCT CCT TTG TCA CCA GCC ACC GGT GGT TCA GTC AAG ATT GTG 294Pro Ser Ser Pro Leu Ser Pro Ala Thr Gly Gly Ser Val Lys Ile Val75 80 85CAA ATG ACA CCA GTA ACT TCT GCC ATG ACG ACA GCT AAG TGG CTT CGT 342Gln Met Thr Pro Val Thr Ser Ala Met Thr Thr Ala Lys Trp Leu Arg90 95 100GAG GTG ATA TCT TCA TTG CCA GAT AAG CCT TCA TCT AAG CTT CAG CAG 390Glu Val Ile Ser Ser Leu Pro Asp Lys Pro Ser Ser Lys Leu Gln Gln105 110 115 120TTT CTG TCA TCA TGC GAT AGG GAT TTG ACA AAT GCT GTC ACA GAA AGG 438Phe Leu Ser Ser Cys Asp Arg Asp Leu Thr Asn Ala Val Thr Glu Arg125 130 135GTC AGC ATA GTT TTG GAA GCA ATT TTT CCA ACC AAA TCT TCT GCC AAT 486Val Ser Ile Val Leu Glu Ala Ile Phe Pro Thr Lys Ser Ser Ala Asn140 145 150CGG GGT GTA TCG TTA GGT CTC AAT TGT GCA AAT GCC TTT GAC ATT CCG 534Arg Gly Val Ser Leu Gly Leu Asn Cys Ala Asn Ala Phe Asp Ile Pro155 160 165TGG GCA GAA GCC AGA AAA GTG GAG GCT TCC AAG TTG TAC TAT AGG GTA 582Trp Ala Glu Ala Arg Lys Val Glu Ala Ser Lye Leu Tyr Tyr Arg Val170 175 180TTA GAG GCA ATC TGC AGA GCG GAG TTA CAA AAC AGC AAT GTA AAT AAT 630Leu Glu Ala Ile Cys Arg Ala Glu Leu Gln Asn Ser Asn Val Asn Asn185 190 195 200CTA ACT CCA TTG CTG TCA AAT GAG CGT TTC CAC CGA TGT TTG ATT GCA 678Leu Thr Pro Leu Leu Ser Asn Glu Arg Phe His Arg Cys Leu Ile Ala205 210 215TGT TCA GCG GAC TTA GTA TTG GCG ACA CAT AAG ACA GTC ATC ATG ATG 726Cys Ser Ala Asp Leu val Leu Ala Thr His Lys Thr Val Ile Met Met220 225 230TTT CCT GCT GTT CTT GAG AGT ACC GGT CTA ACT GCA TTT GAT TTG AGC 774Phe pro Ala Val Leu Glu Ser Thr Gly Leu Thr Ala Phe Asp Leu Ser235 240 245AAA ATA ATT GAG AAC TTT GTG AGA CAT GAA GAG ACC CTC CCA AGA GAA 822Lys Ile Ile Glu Asn Phe Val Arg His Glu Glu Thr Leu Pro Arg Glu250 255 260TTG AAA AGG CAC CTA AAT TCC TTA GAA GAA CAG CTT TTG GAA AGC ATG 870Leu Lys Arg His Leu Asn Ser Leu Glu Glu Gln Leu Leu Glu Ser Met265 270 275 280GCA TGG GAG AAA GGT TCA TCA TTG TAT AAC TCA CTG ATT GTT GCC AGG 918Ala Trp Glu Lys Gly Ser Ser Leu Tyr Asn Ser Leu Ile Val Ala Arg285 290 295CCA TCT GTT GCT TCA GAA ATA AAC CGC CTT GGT CTT TTG GCT GAA CCA 966Pro Ser Val Ala Ser Glu Ile Asn Arg Leu Gly Leu Leu Ala Glu Pro300 305 310ATG CCA TCT CTT GAT GAC TTA GTG TCA AGG CAG AAT GTT CGT ATC GAG 1014Met Pro Ser Leu Asp Asp Leu Val Ser Arg Gln Asn Val Arg Ile Glu315 320 325GGC TTG CCT GCT ACA CCA TCT AAA AAA CGT GCT GCT GGT CCA GAT GAC 1062Gly Leu Pro Ala Thr Pro Ser Lys Lys Arg Ala Ala Gly Pro Asp Asp330 335 340AAC GCT GAT CCT CGA TCA CCA AAG AGA TCG TGC AAT GAA TCT AGG AAC 1110Asn Ala Asp Pro Arg Ser Pro Lys Arg Ser Cys Asn Glu Ser Arg Asn345 350 355 360ACA GTA GTA GAG CGC AAT TTG CAG ACA CCT CCA CCC AAG CAA AGC CAC 1158Thr Val Val Glu Arg Asn Leu Gln Thr Pro Pro Pro Lys Gln Ser His365 370 375ATG GTG TCA ACT AGT TTG AAA GCA AAA TGC CAT CCA CTC CAG TCC ACA 1206Met Val Ser Thr Ser Leu Lys Ala Lys Cys His Pro Leu Gln Ser Thr380 385 390TTT GCA AGT CCA ACT GTC TGT AAT CCT GTT GGT GGG AAT GAA AAA TGT 1254Phe Ala Ser Pro Thr Val Cys Asn Pro Val Gly Gly Asn Glu Lys Cys395 400 405GCT GAC GTG ACA ATT CAT ATA TTC TTT TCC AAG ATT CTG AAG TTG GCT 1302Ala Asp Val Thr Ile His Ile Phe Phe Ser Lys Ile Leu Lye Leu Ala410 415 420GCT ATT AGA ATA AGA AAC TTG TGC GAA AGG GTT CAA TGT GTG GAA CAG 1350Ala Ile Arg Ile Arg Asn Leu Cys Glu Arg Val Gln Cys Val Glu Gln425 430 435 440ACA GAG CGT GTC TAT AAT GTC TTC AAG CAG ATT CTT GAG CAA CAG ACA 1398Thr Glu Arg Val Tyr Asn Val Phe Lys Gln Ile Leu Glu Gln Gln Thr445 450 455ACA TTA TTT TTT AAT AGA CAC ATC GAT CAA CTT ATC CTT TGC TGT CTT 1446Thr Leu Phe Phe Asn Arg Hie Ile Asp Gln Leu Ile Leu Cys Cys Leu460 465 470TAT GGT GTT GCA AAG GTT TGT CAA TTA GAA CTC ACA TTC AGG GAG ATA 1494Tyr Gly Val Ala Lys Val Cys Gln Leu Glu Leu Thr Phe Arg Glu Ile475 480 485CTC AAC AAT TAC AAA AGA GAA GCA CAA TGC AAG CCA GAA GTT TTT TCA 1542Leu Asn Asn Tyr Lys Arg Glu Ala Gln Cys Lys Pro Glu Val Phe Ser490 495 500AGT ATC TAT ATT GGG AGT ACG AAC CGT AAT GGG GTA TTA GTA TCG CGC 1590Ser Ile Tyr Ile Gly Ser Thr Asn Arg Asn Gly Val Leu Val Ser Arg505 510 515 520CAT GTT GGT ATC ATT ACT TTT TAC AAT GAG GTA TTT GTT CCA GCA GCG 1638His Val Gly Ile Ile Thr Phe Tyr Asn Glu Val Phe val Pro Ala Ala525 530 535AAG CCT TTC CTG GTG TCA CTA ATA TCA TCT GGT ACT CAT CCA GAA GAC 1686Lys Pro Phe Leu Val Ser Leu Ile Ser Ser Gly Thr His Pro Glu Asp540 545 550AAG AAG AAT GCT AGT GGC CAA ATT CCT GGA TCA CCC AAG CCA TCT CCT 1734Lys Lys Asn Ala Ser Gly Gln Ile Pro Gly Ser Pro Lys Pro Ser Pro555 560 565TTC CCA AAT TTA CCA GAT ATG TCC CCG AAG AAA GTT TCA GCA TCT CAT 1782Phe Pro Asn Leu Pro Asp Met Ser Pro Lys Lys Val Ser Ala Ser His570 575 580AAT GTA TAT GTG TCT CCT TTG CGG CAA ACC AAG TTG GAT CTA CTG CTG 1830Asn Val Tyr Val Ser Pro Leu Arg Gln Thr Lys Leu Asp Leu Leu Leu585 590 595 600TCA CCA AGT TCC AGG AGT TTT TAT GCA TGC ATT GGT GAA GGC ACC CAT 1878Ser Pro Ser Ser Arg Ser Phe Tyr Ala Cys Ile Gly Glu Gly Thr His605 610 615GCT TAT CAG AGC CCA TCT AAG GAT TTG GCT GCT ATA AAT AGC CGC CTA 1926Ala Tyr Gln Ser Pro Ser Lys Asp Leu Ala Ala Ile Asn Ser Arg Leu620 625 630AAT TAT AAT GGC AGG AAA GTA AAC AGT CGA TTA AAT TTC GAC ATG GTG 1974Asn Tyr Asn Gly Arg Lys Val Asn Ser Arg Leu Asn Phe Asp Met Val635 640 645AGT GAC TCA GTG GTA GCC GGC AGT CTG GGC CAG ATA AAT GGT GGT TCT 2022Ser Asp Ser Val Val Ala Gly Ser Leu Gly Gln Ile Asn Gly Gly Ser650 655 660ACC TCG GAT CCT GCA GCT GCA TIT AGC CCC CTT TCA AAG AAG AGA GAG 2070Thr Ser Asp Pro Ala Ala Ala Phe Ser Pro Leu Ser Lys Lys Arg Glu665 670 675 680ACA GAT ACT TGATCAATTA TAAATGGTGG CCTCTCTCGT ATATAGCTCA 2119Thr Asp ThrCAGATCCGTG CTCCGTAGCA GTCTATTCTT CTGAATAAGT GGATTAACTG GAGCGATTTA 2179ACTGTACATG TATGTGTTAG TGAGAAGCAG CAGTTTTTAG GCAGCAAACT GTTTCAAGTT 2239AGCTTTTGAG CTATCACCAT TTCTCTGCTG ATTGAACATA TCCGCTGTGT AGAGTGCTAA 2299TGAATCTTTA GTTTTCATTG GGCTGACATA ACAAATCTTT ATCCTAGTTG GCTGGTTGTT 2359GGGAGGCATT CATCAGGGTT ATATTTGGTT GTCAAAAAGT ACTGTACTTA ATTCACATCT 2419TTCACATTTT TCACTAGCAA TAGCAGCCCC AAATTGCTTT CCTGACTAGG AACATATTCT 2479TTACAGGTAT AAGCATGCCA ACTCTAAACT ATATGAATCC TTTTTATATT CTCATTTTTA 2539AGTACTTCTC TGTTTCTGCT ACTTTTGTAC TGTATATTTC CAGCTTCTCC ATCAGACTGA 2599TGATCCCATA TTCAGTGTGC TGCAAGTGAT TTGACCATAT GTGGCTTATC CTTCAGGTAT 2659GTCTCATGTT GTGACTTCAT TGCTGATTGC TTTTGTAATG GTACTGTTGA GTTCATTTCT 2719GGTTACAATC AGCCTTTACT GCTTTATATT GTTCTACTAA TTTTGGCTTG CACAGCCAGG 2779ACGATTGGTT TTCTGCATCA ATCAATCTTT TTTAGGACAA GATATTTTTG TATGCTACAC 2839TTCCCAAATT GCAATTAATC CAGAAGTCTA CCTTGTTTTA TTCTATTAGT TCTCAGCAAC 2899AGTGAATGAA TATGAATCAG TCATGCTGAT AGATGTTCAT CTGGTTATTC CAAACAATCT 2959GACATCGCAT CTCTTTCTGC AAGTGAGATG AAGAAAACCT GAAATGCTAT CACCATTTAA 3019AACATTGGCT TCTGGAAGTT CAGGTGATTA GCAGGAGACG TTCTGACATT GCCATTGACA 3079TGTACGGTAG TGATGGCAGG AGACGTTCTT AAACAGCAGC TGCTCCTTCA GCTTGTAATG 3139TCTGATTGTA TTGACCAAGA GCATCCACCT TGCCTTATGG TACTAACTGA ATGAGCTGGT 3199GACGCTGACT CATCTGCATA ATGGCAGATG CTTAACCATC TTTAGGAGCT CATGTCATGA 3259TTCCAGCTGC ACCGTGTCAA ATGTGAAGGC CCTGCAAGGC TTTCCAGGCC GCAGGAATCC 3319TGCTTGCTTC TTGAAGATAC ATATGGTGCC ACCTAAATAA AAGCTGTTTC TGGTTATGTC 3379TGTCCTTGAC ATGTCAACAG ATTAGTGTTG GGTTGCAGTC ATGTGGTGTT TAAGTCTTGG 3439AGAAGGCGAG AAGTCATTGC TGCCAGCATT GTGATCGTCA GGCACAGAAG TACTCAAAAG 3499TGAGAGCTAC TTGTTGCGAG CAAACGGAGG GCGATATAGG TTGATAGCCA ATTTCAGTTC 3559TCTATATACA AGCAGCGGAT TTTGTTTAGA GTTAGCTTTT GAGATGCATC ATTTCTTTCA 3619CATCTGATTC TGTGTGTTGT AACTCGGAGT CGCGTAGAAG TTAGAATGCT AACTGACCTT 3679AATTTTCACC GAATAATTTG CTAGCGTTTT TCAGTATGAA ATCCTTGTCT TAAAAAAAAA 3739AAAAAAAA 3747(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度683个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列详细描述SEQ ID NO.2:Met Glu Cys Phe Gln Ser Aen Leu Glu Lys Met Glu Lys Leu Cys Asn1 5 10 15Ser Asn Ser Cys Lys Gly Glu Leu Asp Phe Lys Ser Ils Leu Ile Asn20 25 30Asn Asp Tyr lle Pro Tyr Asp Glu Asn Ser Thr Gly Asp Ser Thr Asn35 40 45Leu Gly His Ser Lys Cys Ala Phe Glu Thr Leu Ala Ser Pro Thr Lys50 55 60Thr Ile Lys Asn Met Leu Thr Val Pro Ser Ser Pro Leu Ser Pro Ala65 70 75 80Thr Gly Gly Ser Val Lys Ile Val Gln Met Thr Pro Val Thr Ser Ala85 90 95Met Thr Thr Ala Lys Trp Leu Arg Glu Val Ile Ser Ser Leu Pro Asp150 105 110Lys Pro Ser Ser Lys Leu Gln Gln Phe Leu Ser Ser Cys Asp Arg Asp115 120 125Leu Thr Asn Ala Val Thr Glu Arg Val Ser Ile Val Leu Glu Ala Ile130 135 140Phs Pro Thr Lys Ser Ser Ala Asn Arg Gly Val Ser Leu Gly Leu Asn145 150 155 160Cys Ala Asn Ala Phe Asp Ile Pro Trp Ala Glu Ala Arg Lys Val Glu165 170 175Ala Ser Lys Leu Tyr Tyr Arg Val Leu Glu Ala Ile Cys Arg Ala Glu150 185 190Leu Gln Asn Ser Asn Val Asn Asn Leu Thr Pro Leu Leu Ser Asn Glu195 200 205Arg Phe His Arg Cys Leu Ile Ala Cys Ser Ala Asp Leu Val Leu Ala210 21S 220Thr His Lys Thr Val Ile Met Met Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Thr225 230 235 240Gly Leu Thr Ala Phe Asp Leu Ser Lys Ile Ile Glu Asn Phe Val Arg245 250 255His Glu Glu Thr Leu Pro Arg Glu Leu Lys Arg His Leu Asn Ser Leu260 265 270Glu Glu Gln Leu Leu Glu Ser Met Ala Trp Glu Lys Gly Ser Ser Leu275 280 285Tyr Asn Ser Leu Ile Val Ala Arg Pro Ser Val Ala Ser Glu Ile Asn390 295 300Arg Leu Gly Leu Leu Ala Glu Pro Met Pro Ser Leu Asp Asp Leu Val305 310 315 320Ser Arg Gln Asn Val Arg Ile Glu Gly Leu Pro Ala Thr Pro Ser Lys325 330 335Lys Arg Ala Ala Gly Pro Asp Asp Asn Ala Asp Pro Arg Ser Pro Lys340 345 350Arg Ser Cys Asn Glu Ser Arg Asn Thr Val Val Glu Arg Asn Leu Gln355 360 365Thr Pro pro Pro Lys Gln Ser His Met Val Ser Thr Ser Leu Lys Ala370 375 380Lys Cys His Pro Leu Gln Ser Thr Phe Ala Ser Pro Thr Val Cys Asn385 390 395 400Pro Val Gly Gly Asn Glu Lys Cys Ala Asp Val Thr Ile Hie Ile Phe405 410 415Phe Ser Lys Ile Leu Lys Leu Ala Ala Ile Arg Ile Arg Asn Leu Cys420 425 430Glu Arg Val Gln Cys Val Glu Gln Thr Glu Arg Val Tyr Asn Val Phe435 440 445Lys Gln Ile Leu Glu Gln Gln Thr Thr Leu Phe Phe Asn Arg His Ile450 455 460Asp Gln Leu Ile Leu Cys Cys Leu Tyr Gly Val Ala Lys Val Cys Gln465 470 475 480Leu Glu Leu Thr Phe Arg Glu Ile Leu Asn Asn Tyr Lys Arg Glu Ala485 490 495Gln Cys Lys Pro Glu Val Phe Ser Ser Ils Tyr Ile Gly Ser Thr Asn500 505 510Arg Asn Gly Val Leu Val Ser Arg His Val Gly Ile Ile Thr Phe Tyr515 520 525Asn Glu Val Phs Val Pro Ala Ala Lys Pro Phe Leu Val Ser Leu Ile530 535 540Ser Ser Gly Thr His Pro Glu Asp Lys Lys Asn Ala Ser Gly Gln Ile545 550 555 560Pro Gly Ser Pro Lys Pro Ser Pro Phe Pro Asn Leu Pro Asp Met Ser565 570 575Pro Lys Lys Val Ser Ala Ser His Asn Val Tyr Val Ser Pro Leu Arg560 585 590Gln Thr Lys Leu Asp Leu Leu Leu Ser Pro Ser Ser Arg Ser Phe Tyr595 600 605Ala Cys Ile Gly Glu Gly Thr His Ala Tyr Gln Ser Pro Ser Lys Asp610 615 620Leu Ala Ala Ile Asn Ser Arg Leu Asn Tyr Asn Gly Arg Lys Val Asn625 630 635 640Ser Arg Leu Asn Phe Asp Met Val Ser Asp Ser Val Val Ala Gly Ser645 650 655Leu Gly Gln Ile Asn Gly Gly Ser Thr Ser Asp Pro Ala Ala Ala Phe660 665 670Ser Pro Leu Ser Lys Lys Arg Glu Thr Asp Thr675 680
关于微生物保藏的信息说明书第6页中参考的微生物保藏在下面的机构中西班牙典型培养物保藏中心(CECT)Departamento de MicrobiologiaFaculatad de Ciencias Biologicas46100 BURJASOT(Valencia)西班牙保藏标志pBS.Rbl保藏日期1996年6月序号4699该信息反映在申请所附的PCE/RO/134表中。
权利要求
1．成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白在控制植物细胞和植物病毒的生长和/或复制中的用途。
2．如权利要求1要求保护的用途，其特征在于所述病毒的正常复制需要在它的一种蛋白中LXCXE氨基酸基序的完整性。
3．如权利要求要求保护的用途，其中所述的病毒是一种联体病毒。
4．按照权利要求1的用途，其特征在于所述病毒结合成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白，以释放一种转录因子。
5．控制植物细胞或该细胞内的植物病毒生长和/或复制的方法，包括提高或降低该植物细胞内成视网膜细胞瘤蛋白的水平和/或活性。
6．如权利要求5要求保护的方法，其特征在于通过直接应用来提高蛋白的水平。
7．如权利要求5要求保护的方法，其特征在于通过向需要处理的植物细胞内导入编码用于所述蛋白表达的DNA或RNA，提高蛋白水平。
8．如权利要求5、6或7要求保护的的方法，其中所述蛋白过量表达。
9．控制植物细胞或植物病毒的生长和/或复制的方法，包括表达与该病毒的LXCXE基序相互作用但不影响所述细胞正常功能的Rb蛋白或肽片段，以便抑制细胞生长或正常的病毒生长。
10．编码用于Rb蛋白表达的重组核酸，其中所述Rb蛋白具有一个或多个动物Rb蛋白没有的植物Rb蛋白的特征。
11．如权利要求10要求保护的核酸，其特征在于包含一个或多个不同于已知动物Rb蛋白核酸的特征区域。
12．DNA或cRNA形式的重组核酸，它编码一种其A袋亚域和B袋亚域的序列与人类Rb蛋白有30％到75％同源性的植物Rb蛋白。
13．如权利要求12要求保护的核酸，其中所述核酸的序列与p130Rb成视网膜细胞瘤蛋白有30％到75％的同源性。
14．如权利要求12或13要求保护的核酸，其特征在于它与动物或p130Rb成视网膜细胞瘤蛋白有50％-64％的同源性。
15．如权利要求12-14中任何一项所要求保护的核酸，编码人类Rb的C706氨基酸。
16．如权利要求12-15中任何一项所要求保护的的核酸，其中所述A袋和B袋之间的间隔序列与动物Rb蛋白相比为不保守的。
17．如权利要求16要求保护的的核酸，其中所述间隔序列与动物成视网膜细胞瘤蛋白中的同一区有低于50％的同源性。
18．如权利要求12-17中任何一项所要求保护的核酸，其与SEQNO.2的核酸有80％或更高的同源性。
19．如权利要求18要求保护的核酸，其中所述的同源性为90％或更高。
20．重组DNA，包含相应于SEQ ID NO.1碱基31-2079的序列。
21．重组DNA，包含对应于SEQ ID NO.1的序列或编码玉米cDNA克隆的相应RNA的序列，所述玉米cDNA克隆编码SEQ ID NO.21的ZmRbl。
22．由权利要求12-21中任何一项所要求保护的重组DNA或RNA编码的蛋白、或由这样的DNA或RNA得来的新型蛋白、或从采用诱变方法改变天然存在的DNA或RNA得来的蛋白。
23．如权利要求22要求保护的蛋白，其中所述的诱变方法包括使用诱变PCR引物的诱变。
24．编码植物成视网膜细胞瘤蛋白的基因的反义DNA或RNA，所述的基因具有如权利要求10-21中任何一项所要求保护的核酸序列。
25．载体、细胞、植物或动物，包含如权利要求12-22中任何一项所要求保护的DNA或RNA。
26．控制植物细胞或植物病毒的生长和/或繁殖的方法，包括通过向该细胞导入成视网膜细胞瘤蛋白的反义DNA或RNA来降低所述细胞内植物成视网膜细胞瘤蛋白的水平。
27．编码如权利要求22要求保护的蛋白的cDNA。
28．核酸，其编码的蛋白在一个或多个这些位点改变或缺失，使得所述蛋白对磷酸化的抗性更强，并由此影响蛋白的功能性，如结合E2F或类似功能性。
29．如权利要求28所述核酸编码的蛋白。
全文摘要
本发明基于编码成视网膜细胞瘤蛋白的植物细胞DNA序列。这一发现基于植物成视网膜细胞瘤蛋白作为可能的细胞周期、细胞生长和植物细胞分化的调节物的结构和功能性质。为此，要求保护成视网膜细胞瘤蛋白或其编码DNA序列在植物细胞、植物和/或细胞病毒的生长控制中的用途，以及要求保护通过基于植物成视网膜细胞瘤蛋白的控制途径的操作而修饰的载体、细胞、植物或动物或动物细胞。
文档编号C12N15/29GK1227605SQ97197141
公开日1999年9月1日 申请日期1997年6月12日 优先权日1996年6月13日
发明者C·古迪尔雷扎门塔, Q·谢, A·佩拉约桑兹－布尔戈斯, P·苏尔雷兹洛佩兹 申请人:康斯乔最高科学研究公司