专利名称：一种分离差异表达基因的方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，具体的讲是一种分离差异表达基因的方法。
目前，在确认和比较差异表达基因研究方面，已有一些相关方法报道。Welsh等(Welsh J et al.Nucleic Acids Res,20:4965-4970,1992)发表了RNA指纹分析法，用同一个20mer的随机引物分别进行反转录和PCR。Liang和Pardee(Liang P,Pardee AB.Science,257:967-971,1992)报道了mRNA差别显示技术，用3’端T11VN引物进行cDNA第一条链的合成，并用3’端相应T11VN引物和5’端10mer随机引物进行PCR扩增。这两种方法，均需要经测序胶分离同位素标记的PCR扩增产物，并用放射自显影来识别50-100条小于500碱基对(bp)的扩增带。这两种方法相对操作繁琐，实验过程中接触放射性同位素，且假阳性率过高。
随后，很多研究者在mRNA差别显示技术的基础上，通过优化反应条件形成了一系列的改进方法，使分离克隆差异表达基因的研究工作日趋完善。Sokolov等(SokolovBP,Prockop DJ.Nucleic Acids Res,22:4009-4015,1994)报道了一种快速、简单的mRNA差别显示方法，用6mer随机引物对mRNA进行反转录cDNA合成，其cDNA需用核糖核酸酶(RNase)消化残留的信使核糖核酸(mRNA)，随后以2-3个10-13mer随机引物进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳分离扩增的cDNA带。该方法需要大量mRNA，且需要RNase H处理cDNA库中残留的mRNA，实验操作复杂。
本发明的目的是提出一种新的分离差异表达基因的方法，该方法为分子生物学实验室新基因的分离提供了一种有效的工具，本发明的主要特点是假阳性率低，避免使用同位素，实验步骤简单，能克隆到大于500bp的差异表达cDNA。
本发明将对应细胞群体的总体核糖核酸(总RNA)，用一组6碱基(6mer)的随机引物进行反转录(RT)合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，随后选用单一、序列确定的10-12碱基的随机引物(10-12mer)进行聚合酶链反应(PCR)，在分离差异表达基因时，使用琼脂糖凝胶电泳，避免了使用同位素，能在紫外光下直接观察电泳结果，同时切除差异表达cDNA带。随后，进行再扩增、克隆、Northern杂交鉴定和测序。
本发明的具体实施方式
包含下列各步骤(1)常规方法提取2个或2个以上相对应细胞群体的总RNA；(2)将总RNA用一组6mer随机引物进行反转录合成cDNA，随后将该cDNA选用单一、序列确定随机引物(10-12mer)进行RT-PCR；(3)琼脂糖凝胶电泳分离差异表达的cDNA片段；(4)将差异表达的cDNA片段PCR再扩增，并直接克隆至pCRⅡ克隆载体；(5)使用Northern杂交鉴定差异表达的cDNA片段的特异性并测序进行同源性比较。
如上述步骤(2)中的反转录反应，依次加入下列各组分，在其反应体系中，含0.10-0.25μg/μL总RNA,5μM 6mer随机引物，1mM dNTP,20U RNase抑制剂，10U AMV反转录酶和其1x反应缓冲液。应用DNA扩增仪(PE-2400型)进行反转录反应合成cDNA，其反应条件为25℃,8分钟；42℃,30分钟；随后，95℃处理5分钟。
如上述步骤(2)中的RT-PCR反应，依次加入下列各组分，在其RT-PCR反应体系中，含1-2μL上述反转录反应产物(cDNA),2μM 10-12mer单一随机引物，0.8mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反应缓冲液。应用DNA扩增仪(PE-2400型)进行RT-PCR反应，其反应条件为94℃,5分钟。94℃,15秒；37℃,30秒；72℃,30秒。重复上述过程共35个循环。之后，72℃,5分钟。
如上述步骤(3)中PCR扩增产物在含0.5μg/mL溴化乙锭的1-2％琼脂糖凝胶上，电泳分离差异表达的cDNA。
如上述步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳分离得到的差异表达的cDNA片段的PCR再扩增反应，依次加入下列各组分，其反应体系中含1ng/μL差异表达cDNA,1μM 10mer相应随机引物，0.2mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反应缓冲液。应用DNA扩增仪(PE-2400型)进行PCR反应，其反应条件为94℃,5分钟。94℃,15秒；42℃,30秒；72℃,30秒。重复上述过程共35个循环。之后，72℃,5分钟。该再扩增反应产物，按照Invitrogen公司的克隆试剂盒说明直接克隆至pCRⅡ克隆载体，并用EcoRⅠ酶切鉴定重组子。
如上述步骤(5)中Northern杂交分析，首先，分别将相对应细胞群体的10-30μg总RNA经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，然后，转移至尼龙膜(Amersham公司)。用α-[32]P-dCTP(福瑞公司)经随机引物法标记差异表达的cDNA片段作为探针。然后，将该尼龙膜封入含预杂交液的塑料袋中预杂交，预杂交液含50％去离子甲酰胺，10％硫酸葡聚糖，1％SDS和1M NaCl。42℃下预杂交4小时后，直接将该标记探针加入塑料袋中至少杂交12小时。最后，根据杂交膜上所测同位素的放射活性，于-20℃放射自显影。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的表达量作为内对照。Northern杂交结果用Image Master VDS影像分析摄录系统(Pharmacia公司)照相并用其软件进行图像扫描分析，以积分光密度值(IOD)显示杂交信号的相对强度。
经Northern杂交分析证实是差异表达的阳性克隆，用AutoReadTM测序盒(Pharmacia公司)从克隆片段两端双向测序，所得测序结果采用BLAST SEARCH与DNA数据库(GenBank、EMBL、DDBJ和PDB)进行同源性比较。
本发明适用于动物或植物、细胞系或组织，是一种适用范围广的分离差异表达基因的方法。
本发明在分离差异表达cDNA带时，使用琼脂糖凝胶电泳，避免了使用同位素，这样减少了放射性物质的污染及其对人体的损害，同时实验费用亦相对降低。并可以在紫外光下直接观察电泳结果。利用本发明提供的方法，我们已克隆到2个与细胞癌变相关的新基因。因此，本发明具有设备简单、价格低廉、操作方便与分离和克隆效率高的特点。
本发明突出的实质性特点可从下述实施例得以体现，但是它们并不是对本发明作任何限制。
实例1．总RNA提取采用异硫氰酸胍酸酚法，提取R6#13-8和T2细胞的总RNA。具体操作步骤如下(1)用400μl异硫氰酸胍裂解液裂解5×106个细胞(R6#13-8或T2)，加入40μl 2M pH4.0的醋酸钠，混匀；(2)加入440μl水饱和酚，混匀；(3)加入80μl氯仿-异戊醇(49∶1)，混匀；(4)冰浴15分钟后，于4℃、14000转，离心15分钟，移上层水相(约450μl)于另一离心管中；(5)加入100μl氯仿-异戊醇(49∶1)，混匀；(6)于4℃、14000转离心10分钟后，将上层水相移入另一离心管中；(7)加入500μl异丙醇，混匀，使RNA沉淀，于-20℃保存至少2个小时；(8)于4℃、14000转离心20-30分钟，弃去上清液，尽量去净异丙醇；(9)加入0.3mL 75％的酒精漂洗RNA沉淀两次，去净酒精，自然干燥10分钟；(10)加入20μl由DEPC处理过的水，于65℃保温10分钟，溶解总RNA。
结果T2细胞得到126.17微克总RNA,R6#13-8细胞得到126.17微克总RNA。
图1是1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图示，其检测总RNA的完整性，可见R6#13-8和T2的总RNA完整，28S条带是18S条带的二倍。测定R6#13-8和T2总RNA的OD.260/OD.280比值分别为1.96和1.99。
实例2．用琼脂糖凝胶电泳分离差异表达的cDNA片段首先，分别将R#13-8和T2的总RNA反转录成cDNA。其20μL反转录反应体系中，依次加入下列个组份，含5μg总RNA,5μM 6mer随机引物(Sangon公司)，1mMdNTP,20U RNase抑制剂，10U AMV反转录酶和其1x反应缓冲液(Promega公司)。使用DNA扩增仪PE-2400型进行反转录反应，其反应条件为25℃,8分钟；42℃,30分钟。95℃处理5分钟。随后，将上述反转录成的cDNA进行RT-PCR反应。其25μL RT-PCR反应体系中，依次加入下列个组份，含1μL上述反转录产物(cDNA),2μM 10mer或12mer单一随机引物(N1-N12,Gibco公司；S450-S470,Sangon公司)，0.8mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反应缓冲液(天津医药生物工程公司)。使用DNA扩增仪PE-2400型进行RT-PCR反应，其反应条件为94℃,5分钟。94℃,15秒；37℃,30秒；72℃,30秒。上述过程共重复35个循环。之后，72℃,5分钟。最后，取10μL上述RT-PCR扩增产物在含0.5μg/mL溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶上电泳分离差异表达的cDNA片段。在紫外光下观察，并切下差异表达的cDNA带。
结果发现使用一组6mer随机引物进行cDNA合成，选用33个单一、确定随机引物(10或12mer)分别进行RT-PCR，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离T2(T)和R6#13-8(R)差异表达的cDNA。由电泳结果可知，R6#13-8和T2之间无差异带的引物20个，有差异带的引物3个，电泳带浅或无的引物有10个。有带的引物PCR扩增所显示的电泳带数介于1-11条之间，共获得90多条清晰、可辨的电泳带，长度为300bp-3000bp。发现3个差异表达的cDNA片段是#6、#7和#8(图2箭头所示)，2个片段(#6和#8)在R6#13-8中高表达，1个片段(#7)在T2中高表达。
实例3．差异表达cDNA的再扩增及克隆将上述实例2中分离得到的3个差异表达cDNA片段#6、#7和#8，进行PCR再扩增。依次加入下列各组份，其25μ LPCR反应体系中，含20ng差异表达的cDNA,1μM10mer相应随机引物，0.2mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反应缓冲液。其反应条件与上述实例2中RT-PCR的反应条件相同。PCR再扩增结果用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定差异片段#6、#7和#8的特异性(见图3a箭头所指)，#6为800bp、#7为1600bp和#8为900bp。然后，分别将#6和#8 PCR再扩增产物直接克隆至pCRⅡ克隆载体(Invitrogen公司)，并以EcoRⅠ酶切鉴定，酶切片段大小与预期结果一致如图3b所示，M为DNA分子量标准λDNA/EcoRⅠ+HindⅢmarker)。
实例4．Northern杂交结果分析及同源性比较从琼脂糖凝胶中分离得到的差异表达的cDNA带，要经过Northern杂交确定其特异性，排除假阳性。首先，分别将R6#13-8和T2的20μg总RNA经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳后，转移至尼龙膜(Amersham公司)。随后，以差异表达片段#6和#8为摸板，用α-[32]P-dCTP(福瑞公司)经随机引物法标记探针。最后，分别用#6和#8的标记探针，与上述尼龙膜进行预杂交和杂交。预杂交液含50％去离子甲酰胺，10％硫酸葡聚糖，1％SDS和1M NaCl。42℃预杂交4小时后，分别直接加入#6和#8的标记探针至少杂交12小时。杂交反应之后，根据杂交膜上所测同位素的放射活性，于-20℃放射自显影1-14天。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的表达量作为内对照。Northern杂交结果用Image Master VDS影像分析摄录系统(Pharmacia公司)照相并用其软件进行图像扫描分析，以积分光密度值(IOD)显示杂交信号的相对强度。
用Northern杂交分析差异片段#6和#8的特异性。其中分别以差异cDNA#6和#8为模板探针，与T2和R6#13-8的总RNA杂交，箭头所指为杂交信号的位置。结果发现#6和#8的杂交信号与RT-PCR结果一致，均在R6#13-8中高表达。#6的杂交信号是2条带，其两个转录子#6-1为4300bp,#6-2为2900bp。#8的杂交信号是1条带，转录子大小为900bp(图4a)。Northern杂交结果图像扫描分析见图4b，将图4a从上到下扫描，横坐标为从图4a上端到杂交信号的相对距离；纵坐标以IOD值表示杂交信号的相对强度，粗线代表R6#13-8，细线代表T2。杂交信号强度(IOD)的定量分析，参照GAPDH内对照，当GAPDH杂交信号在R6#13-8和T2中相同时，差异转录子在R6#13-8中的表达量，#6-1是T2中的1.8倍，#6-2是T2中的4.0倍，#8是T2中的1.8倍。
在R6#13-8中高表达的2个克隆片段#6和#8，分别用AutoreadTM测序盒从克隆片段的两端双向测序。经DNA数据库(GenBank、EMBL、DDBJ和PDB)国际联网查询，得知与已知序列无同源性，推测为2个与细胞癌变相关的新基因。
权利要求
1．一种分离差异表达基因的方法，其特征在于它包含下列各步骤(1)常规提取2个或2个以上相对应细胞群体的总RNA；(2)将总RNA用一组6碱基随机引物进行反转录合成cDNA，随后，用该cDNA选用单一、10-12碱基的序列确定随机引物进行RT-PCR；(3)琼脂糖凝胶电泳分离差异表达的cDNA片段；(4)将差异表达的cDNA片段PCR再扩增，并直接克隆至pCRⅡ克隆载体；(5)使用Northern杂交鉴定差异表达cDNA片段的特异性并测序进行同源性比较。
2．如权利要求书1所述的分离差异表达基因的方法，其特征在于所述的反转录反应，依次加入下列各组分，在其反应体系中，含0.10-0.25μg/μL总RNA,5μM 6mer随机引物，1mM dNTP,20U RNase抑制剂，10U AMV反转录酶和其1x反应缓冲液；应用DNA扩增仪(PE-2400型)进行反转录反应合成cDNA，其反应条件为25℃,8分钟；42℃,30分钟；随后，95℃处理5分钟；所述的RT-PCR反应，依次加入下列各组分，在其RT-PCR反应体系中，含1-2μL上述反转录反应产物(cDNA),2μM 10-12mer单一随机引物，0.8mM dNTP,1.5mM MgCl,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反应缓冲液；应用DNA扩增仪(PE-2400型)进行RT-PCR反应，其反应条件为94℃,5分钟。94℃,15秒；37℃,30秒；72℃,30秒；重复上述过程共35个循环；之后，72℃,5分钟；所述的RT-PCR反应的扩增产物在含0.5μg/mL溴化乙锭的1-2％琼脂糖凝胶上，电泳分离差异表达的cDNA片段；所述的琼脂糖凝胶电泳分离得到的差异表达的cDNA片段，其PCR再扩增反应依次加入下列各组分，其反应体系中含1ng/μL DNA,1μM 10mer相应随机引物，0.2mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反应缓冲液；应用DNA扩增仪(PE-2400型)进行PCR反应，其反应条件为94℃,5分钟；94℃,15秒；42℃,30秒；72℃,30秒；重复上述过程共35个循环；之后，72℃,5分钟。
3．一种分离差异表达基因的方法，其特征在于它的优选条件为其反转录反应体系中含总RNA为0.25μg/μL；其RT-PCR反应体系中，含1μL反转录反应产物(cDNA)；RT-PCR反应的扩增产物在含0.5μg/mL溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶上，电泳分离差异表达的cDNA片段。
4．如权利要求书1或2所述的分离差异表达基因的方法，其特征在于所述的进行比较的2个或2个以上相对应细胞群体的细胞适于各种生物的细胞。
全文摘要
本发明涉及分离差异表达基因的方法。本方法首先将对应细胞群体的总体核糖核酸(总RNA),用一组6碱基(6mer)的随机引物进行反转录(RT)合成互补脱氧核糖核酸(cDNA),随后选用单一、序列确定的10—12碱基的随机引物(10－12mer)进行聚合酶链反应(PCR),在分离差异表达基因时,用琼脂糖凝胶电泳,避免了使用同位素,能在紫外光下直接观察电泳结果,同时切除差异表达的cDNA带。随后,进行再扩增、克隆、Northern杂交鉴定和测序。本发明适用于所有生物的2个或2个以上相对应细胞群体,是一种简单、快速和经济的基因分离方法。
文档编号C12N15/10GK1225391SQ99100349
公开日1999年8月11日 申请日期1999年1月25日 优先权日1999年1月25日
发明者郑坚瑜, 陈晶, 鲍云鹤, 肖文鸾 申请人:南开大学