专利名称：一株突变的人乙型肝炎病毒株及其应用的制作方法
在整个申请中，各种参考文献在括号内给出。这些出版物的公开内容作为本发明的参考文献在此全文引入，来更全面地描述本发明所属领域的现状。
HCC是最常见的人肝癌之一，尤其是在亚洲，每年占全世界新发现病例的70％。它通常由作为慢性肝病的并发症----肝硬化引起。HCC病人的临床表现是非特异性的症状，它们仅在癌症晚期出现。
慢性肝病的一个主要原因是乙型肝炎病毒感染，乙型肝炎病毒在1963年首次被发现是一种非胃肠道传播的人类病毒，HCC的血清学未定的致病原因中最为常见的是慢性乙型肝炎病毒感染。尽管乙型肝炎病毒并不显示完整的病毒致癌基因的特征，但其参与HCC的发展可归结为它与宿主肝细胞相互作用的各个方面。这包括最小病毒蛋白---X的混杂的转录活性，这种活性提高了许多细胞靶基因包括原癌基因的表达水平。在另一方面，在HCC病人中经常发现整合在宿主染色体中的病毒DNA。主要表面抗原也表现出在HCC的发展中起积极的作用。这种蛋白被用作检测乙型肝炎病毒携带者的主要检测标记。最具抗原性的决定簇是一个跨越23个氨基酸残基的高保守区域，它位于主要表面抗原的124至147位氨基酸位置。此小区被命名为群特异性决定簇“a”，它在乙型肝炎病毒基因组的所有亚型和分离株中均被发现。其抗原特性似乎来自其假设的双环结构，疫苗诱导的中和抗体就结合该结构。
我们的流行病学数据表明，在多数HCC病人中已发现了野生型主要表面抗原。而且，观察表明，来自HCC病人的几种主要表面抗原的变异体可能参与HCC的致病。直接测序分析表明，63个HCC病人中有24个(约38％)在主要表面抗原的“a”决定簇处携带有各种突变。当将野生型和变异体病例合并时，在位于主要表面抗原的“a”决定簇的第一个环的133位氨基酸残基处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的变异病毒的比例，在63个来自东南亚的HCC病人中高达12.7％，并存在于5个当地病例中。然而，在随机人群(多于100例)中的乙型肝炎病毒携带者仅2％发现有同样的突变。基于145位氨基酸残基变异(变甘氨酸为精氨酸)病毒的出现率为8％的事实，133位氨基酸残基变异体的意义在于突变率被进一步提高了。145位氨基酸残基的变异率在随机人群的乙型肝炎病毒携带者中保持恒定，众所周知该变异是一种疫苗诱导的突变体，位于“a”决定簇的第二个环。
虽然在HCC病人中的主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的变异乙型肝炎病毒株比在疫苗接种后诱导的在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个突变的突变病毒可能有不同程度的增加，但此病毒株有着与后者相似的特征，即它们都具有稳定性，已经报道了这些病毒株垂直传播的病例，尽管使用了有效的乙型肝炎病毒预防和乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)。
在HCC中主要表面抗原的“a”决定簇中带有突变的变异人乙型肝炎病毒的出现值得重视。在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个取代物的突变病毒的高比例尤其值得注意，因为它可能指出了与HCC致病的密切相关性。这种相关性将因而急切需要开发特殊的检测系统以及有效的预防性和治疗性疫苗以及抗病毒试剂。测定这种突变病毒的核苷酸序列组成了达到这些目标的第1步，并且一定会为上述诊断和治疗方案的开发提供帮助。
发明简述本发明提供一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒分离株，其所组成的病毒基因组已于1997年12月15日在欧洲细胞培养物保藏中心保藏，登记号为P97121501、P97121502和P97121503。
本发明进一步提供编码如下一种多肽的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
本发明进一步提供一种制备多肽的方法和获得纯化形式多肽以便回收纯化形式多肽的方法，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
本发明进一步提供一种至少为15个核苷酸的寡核苷酸，所说寡核苷酸能够特异性地仅与乙型肝炎病毒的突变病毒株的序列杂交。
本发明进一步提供一种获得针对多肽的抗体的方法以及所制备的抗体。
本发明还提供上面鉴定的核酸、多肽、肽、或抗体的应用，用来测定被试者是否感染了上面鉴定的病毒株。
本发明还提供上面鉴定的核酸、多肽、肽、或抗体的应用，用来测定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质。
本发明还提供一种用来预防和治疗肝细胞癌的疫苗，以及一种用来治疗或预防上面鉴定的乙型肝炎病毒突变株感染的疫苗。
本发明还提供一种用来鉴定能够治疗或预防肝细胞癌的化合物的方法，以及含有这种化合物的组合物。
本发明还提供一种用来鉴定能够治疗或预防上面鉴定的突变株感染的化合物的方法，以及含有这种化合物的组合物。
图2同一乙型肝炎病毒基因组的克隆和序列测定策略。
图3从HCC分离、在主要表面抗原的133位氨基酸处带有一个变蛋氨酸为苏氨酸的突变的人乙型肝炎病毒的完整序列(SEQ ID NO1)。该突变在551-553号核酸处显示。
图4由图3的核苷酸序列推导的DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图5由图3的核苷酸序列推导的大表面抗原的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。突变氨基酸残基(变蛋氨酸为苏氨酸)的号码为307。
图6由图3的核苷酸序列推导的核心蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
图7由图3的核苷酸序列推导的反式激活蛋白X的氨基酸序列(SEQ IDNO5)。
图8相应于DNA聚合酶编码区的起始位点的寡核苷酸序列，位于病毒基因组的2307，并与编码链匹配(有义寡核苷酸)(SEQ ID NO6)。
图9相应于病毒核苷酸序列的250位置并与互补链匹配的寡核苷酸序列(反义寡核苷酸)(SEQ ID NO7)。
图10相应于病毒核苷酸序列的250位置并与编码链匹配的寡核苷酸序列(有义寡核苷酸)(SEQ ID NO8)。
图11相应于DNA聚合酶编码区的终止密码子的寡核苷酸序列，位于病毒基因组的1623，并与互补链匹配(反义寡核苷酸)(SEQ ID NO9)。
图12相应于病毒基因组的1420位置并与编码链匹配的寡核苷酸序列(有义寡核苷酸)(SEQ ID NO10)。
图13相应于病毒基因组的2340位置并与互补链匹配的寡核苷酸序列(反义寡核苷酸)(SEQ ID NO11)。
发明详述在本发明的整个申请书中，所提到的特殊核苷酸是核酸的编码链上的核苷酸。下面的标准缩写在整个申请书中被用来表示特殊的核苷酸C＝胞嘧啶 A＝腺嘌呤T＝胸嘧啶 G＝鸟嘌呤本发明提供一种从肝细胞癌(HCC)分离的人乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列，该病毒在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)，所说的核苷酸序列由3215个核苷酸组成(图3)，编码示于图4-7的4个重叠的病毒蛋白。
本发明提供4种主要病毒蛋白的氨基酸序列，它们包括DNA聚合酶、大/中/主要表面抗原、核心抗原和反式激活蛋白X。这些蛋白可用重组技术制备，并用于开发多克隆或单克隆抗体。
本发明还提供一种人乙型肝炎病毒诊断系统，该系统使用上面介绍的核苷酸或蛋白序列或抗体，特异性地用于诊断位于主要表面抗原的133位氨基酸残基处的突变(变蛋氨酸为苏氨酸)。
本发明提供一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的人乙型肝炎病毒分离株，其所组成的病毒基因组已经保藏，登记号为P97121501、P97121502和P97121503。
本发明还提供编码如下一种多肽的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。在一个特殊的实施方案中，该多肽由被命名为SEQ ID NO1的核酸序列的155至835位核苷酸编码，具体地说，在位置551-553含有核苷酸“ATG”，取代原来的“AC6”。
分离核酸可以是DNA或RNA，尤其是cDNA或基因组DNA。
在另一个实施方案中，多肽具有与被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上相同的氨基酸序列。
本发明还提供编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽由含有SEQ ID NO1的527至595位核苷酸的核酸分子编码。
本发明还提供编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明进一步提供一种载体，该载体含有编码一种多肽并与RNA转录启动子操纵连接的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
本发明进一步提供一种载体，该载体含有编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽由含有SEQ ID NO1的527至595位核苷酸的核酸分子编码。
具体地说，上述载体含有病毒DNA。
本发明还提供一种制备多肽或肽的宿主载体系统，该系统在一种合适的宿主中含有上面鉴定的载体。
本发明还提供一种制备多肽的方法，该方法包括在允许多肽或肽产生的合适条件下培养上述宿主载体系统，并回收这样产生的多肽或肽。
本发明还提供一种获得纯化形式的多肽或肽的方法，该方法包括(a)将任何上述载体导入一种合适的宿主细胞；(b)培养所产生的宿主细胞，来产生该多肽；(c)回收步骤(b)中产生的多肽；并(d)纯化这样回收的多肽。
本发明还提供一种纯化的多肽，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。具体地说，可使用上面的方法获得纯化的多肽或肽。
本发明提供一种纯化的肽，其中该肽具有包含被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明还提供一种至少为15个核苷酸的寡核苷酸，它能特异性地与一种核酸分子内的独特核苷酸序列杂交，其中所说核酸分子编码一种多肽，该多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；并且该寡核苷酸不能与编码野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的核酸分子内的任何核苷酸序列杂交。在一个实施方案中，该寡核苷酸包含SEQ ID NO1的527至595位核苷酸。
本发明还提供一种能刺激或增强针对该多肽的抗体产生的组合物。
本发明还提供一种获得针对一种多肽的抗体的方法，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，并且这种抗体不能针对野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原，该方法包括(a)获取纯化形式的多肽；(b)免疫一种能够产生针对纯化多肽的抗体的生物；(c)收集所产生的抗体；(d)在能够形成一种复合物的条件下将产生的抗体与纯化多肽混合；并(e)确定能够与纯化多肽形成一种复合物的抗体，从而获得针对该多肽的抗体。在一个特殊实施方案中，多肽由被命名为SEQ ID NO1的核酸序列的155至835位核苷酸编码。在另一个实施方案中，多肽具有与被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上相同的氨基酸序列。
可以从生物如兔或小鼠中获得这些抗体。
本发明还提供获得针对一种肽的抗体的方法，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列，该方法包括(a)获取纯化形式的肽；(b)免疫一种能够产生针对纯化.肽的抗体的生物；(c)收集所产生的抗体；(d)在能够形成一种复合物的条件下将产生的抗体与纯化肽混合；并(e)确定能够与纯化肽形成一种复合物的所产生抗体，从而获得针对该肽的抗体。
本发明还提供用上述方法获得的抗体，特别是单克隆抗体。
本发明还提供能够检测一种多肽的抗体，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，并且这种抗体不能检测野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原。
本发明进一步提供能够检测一种肽的抗体，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明提供编码一种多肽的核酸的应用，其中多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，用来检测被试者是否被一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒分离株感染，其中这种检测包括(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
在一个实施方案中，步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，其中步骤(b)的测定包括(i)在允许mRNA与寡核苷酸结合的条件下将mRNA与上述寡核苷酸接触，以形成一种复合物；(ii)分离这样形成的复合物；并(iii)鉴定分离复合物中的mRNA，从而测定mRNA是否为或来自编码该多肽的核酸。
在另一个实施方案中，步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，其中步骤(b)的测定包括(i)在合适条件下翻译mRNA，以获得氨基酸序列；(ii)将步骤(i)的氨基酸序列与上面介绍的分离核酸编码的氨基酸序列进行比较，从而测定核酸样品是否为或来自一种编码该多肽的核酸。
而且，可以这样进行步骤(b)的测定(i)扩增步骤(a)的样品中存在的核酸；并(ii)在所产生的扩增核酸中检测多肽的存在。
本发明还提供能识别一种多肽的抗体的应用，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，用来测定被试者是否被一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株感染，其中这种测定包括(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸分子，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与识别多肽的抗体结合，以便确定被试者是否受感染。
在上述应用中，分离核酸、寡核苷酸或抗体可用一种可检测的标记物标记。可检测标记物的例子包括放射性同位素、荧光素和酶。
在实施方案中，样品可包括血液、组织或血清。
本发明提供编码一种多肽的核酸的应用，其中多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，用来检测被试者是否具有肝细胞癌的易感体质，其中这种检测包括(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
在一个实施方案中，步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，其中步骤(b)的测定包括(i)在允许mRNA与寡核苷酸结合的条件下将mRNA与上述寡核苷酸接触，以形成一种复合物；(ii)分离这样形成的复合物；并(iii)鉴定分离复合物中的mRNA，从而测定mRNA是否为或来自编码该多肽的核酸。
在另一个实施方案中，步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，其中步骤(b)的测定包括(i)在合适条件下翻译mRNA，以获得氨基酸序列；(ii)将步骤(i)的氨基酸序列与编码一种多肽的分离核酸的氨基酸序列进行比较，其中所说多肽具有与被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上相同的氨基酸序列，从而测定核酸样品是否为或来自一种编码该多肽的核酸。
在另一个实施方案中，步骤(b)的测定包括(i)扩增步骤(a)的样品中存在的核酸；并(ii)在所产生的扩增核酸中检测多肽的存在。
本发明进一步提供能识别一种多肽的抗体的应用，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，用来测定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质，其中这种测定包括(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸分子，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与识别多肽的抗体结合，以便确定被试者是否感染。
在上述应用中，分离核酸、寡核苷酸或抗体可用一种可检测的标记物标记。可检测标记物的例子包括放射性同位素、荧光素和酶。
在实施方案中，样品可包括血液、组织或血清。
本发明还提供一种为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够治疗一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染，该方法包括(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够治疗该病毒株感染的化合物。
本发明还提供一种为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染，该方法包括(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够预防该病毒株感染的化合物。
本发明还提供一种为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够治疗肝细胞癌，该方法包括(a)在允许多肽与化合物之间结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够治疗该病毒株感染的化合物。。
本发明还提供一种为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够预防肝细胞癌，该方法包括(a)在允许多肽与化合物之间结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够预防该病毒株感染的化合物。。
本发明还提供包含用上面介绍的方法鉴定的化合物和一种药效载体的组合物，其中化合物的数量能够有效地治疗或预防该病毒株的感染。
本发明提供包含一种多肽或其衍生物以及一种可药用载体的组合物，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，并且这种多肽的数量能够有效地在被试者中刺激或增强抗体产生。
实际的有效数量将依赖于多肽的大小、多肽的生物降解性、多肽的生物活性以及多肽的生物利用性。如果多肽不被迅速降解、能够被生物利用并且活性高，有效数量就只需要较小的数量。有效数量对本领域的技术人员来说将是已知的，它也依赖于多肽的形式、多肽的大小以及多肽的生物活性。例如，佐剂的使用可减少所需的多肽数量。本领域的技术人员可进行常规的实验性活性试验来测定生物试验中的生物活性，并因而测定有效数量。
可药用的载体对本领域的技术人员来说是熟知的，它们包括但不限于0.01-0.1M、优选为O.05M的磷酸缓冲液或者0.8％的盐水。此外，这种可药用载体可以是水或非水的溶液、悬液和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水载体包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬液，包括盐水和缓冲介质。非胃肠道型载体包括氯化钠溶液、林格氏葡聚糖、葡聚糖和氯化钠、乳酸化的林格氏液或固定油。静脉载体包括流体和营养补充物、电解质补充物如以林格氏葡聚糖为基础的补充物等等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，举例如抗微生物剂、抗氧化剂、鏊合剂、惰性气体等等。
本发明还提供含有一种肽或其衍生物以及一种可药用载体的组合物，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列，并且这种肽的数量能够有效地在被试者中刺激或增强抗体产生。
本发明还提供包含按上述方法鉴定的化合物以及一种药效载体的组合物，其中化合物的数量能够有效地治疗或预防肝细胞癌。
本发明还提供包含按上述方法鉴定的化合物以及一种可药用载体的组合物，其中化合物的数量能够有效地治疗或预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。
本发明进一步提供上面鉴定的组合物用于治疗感染了一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的被试者的应用。
本发明还提供上面鉴定的组合物用于在被试者中预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株感染的应用。
本发明还提供上面介绍的组合物用于治疗或预防肝细胞癌的应用。
本发明还提供在来自被试者的体液中筛选一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的方法，包括(a)从被试者获得一种合适的体液样品；(b)在步骤(a)的样品中检测一种多肽的存在，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，以便在样品中筛选该病毒株。具体地说，其中体液包括血液、血清、或血液或血清的一种核酸样品。
本发明进一步提供一种治疗感染了此病毒株的被试者的方法。
本发明还提供一种在组织和体液中筛选此病毒株的方法。
本发明提供一种肝炎疫苗，该疫苗包含乙型肝炎病毒的一种突变形式的主要表面抗原，该多肽具有的氨基酸序列与乙型肝炎病毒的主要表面抗原的野生型氨基酸序列不同，其差异在于该多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
本发明还提供上述疫苗，进一步包含一种佐剂。
本发明在后面的实验细节章节中说明。这些章节用来协助理解本发明，而不是为了或者不应当被理解为以任何方式限制本发明以及在其之后列出的权利要求。实验细节在下面介绍的方法中，分离了在主要表面抗原的133位氨基酸处带有突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的人乙型肝炎病毒，并测定了其核苷酸序列。
血清样品(5194)获自一个63岁的华裔女性的表面抗原携带者病人，她在随后的活检中被证实为HCC病人。来自她的血清的乙型肝炎病毒在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)，如前面对“a”决定簇的测序分析所示。在本发明中，在测定其序列之前，首先抽提病毒DNA。
如下面实施例的介绍，在主要表面抗原的133位氨基酸处带有一个突变的来自HCC的这种乙型肝炎突变病毒的基因组由3215个核苷酸组成，这与相同亚型(adr)的野生型病毒的基因组长度相同。当与野生型病毒比较时，编码主要病毒蛋白的开放阅读框(ORFs)被发现位于相当的位置。突变乙型肝炎病毒基因组的位置1按照野生型的相应位置定义。
突变人类病毒基因组的不同ORFs的结构在图1中简要报告，它们的位置如下-DNA聚合酶基因从位置2307开始，在位置1623结束，因此它由2523个核苷酸组成，编码843个氨基酸残基；-大表面抗原基因从位置2848开始，在位置835结束，因此它由1203个核苷酸组成，编码400个氨基酸残基。该大表面抗原与中表面抗原和主要表面抗原重叠，后两者分别从位置3205和155开始。中表面抗原(由281个氨基酸残基组成)和主要表面抗原(由226个氨基酸残基组成)都在与大表面抗原相同的位置结束。
-核心抗原基因从位置1814开始，在位置2452结束，因此它由639个核苷酸组成，编码212个氨基酸残基。
-反式激活蛋白X基因从位置1374开始，在位置1838结束，因此它由465个核苷酸组成，编码154个氨基酸残基。
而且，序列分析已经证实，该突变乙型肝炎病毒属于adr亚型，其标志为在主要表面抗原的位置122和160分别为赖氨酸和精氨酸残基。与以前通过直接测序对“a”决定簇的分析一致，在主要表面抗原的133位氨基酸处发现了一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)。
与Genbank数据库中登录的野生型乙型肝炎病毒(登录号D16665)相比，该乙型肝炎病毒株的核苷酸序列的同一性为90.3％。本发明的乙型肝炎病毒的不同病毒蛋白与相应的野生型蛋白相比，DNA聚合酶(PIR-蛋白鉴定资源登录号S43491)、大表面抗原(PIR登录号JQ2107)、核心抗原(PIR登录号S43490)和反式激活蛋白X(PIR登录号S35529)的同一性分别为95.8％、97.5％、95.1％和94.8％。但与野生型相比，每个病毒蛋白都存在多个氨基酸取代物，这包括DNA聚合酶中的5个突变，大表面抗原中的5个突变(包括主要表面抗原起始密码子由蛋氨酸变为苏氨酸的改变)，核心抗原中的5个突变以及反式激活蛋白X中的4个突变。
从HCC分离并在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的本发明的人乙型肝炎病毒基因组，可以用作原料来设计对突变病毒基因组特异的寡核苷酸。这些寡核苷酸可用作原料来制备高特异性的诊断试剂，用于检测来自HCC并在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变的病毒。
在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的本发明的人乙型肝炎病毒基因组，可以用作原料来制备本发明的蛋白，这可通过标准的DNA重组技术表达携带相关编码区的载体来实现，其中所说载体能在一种宿主细胞如大肠杆菌中复制。
本发明的蛋白可用作原料来制备高特异性的诊断试剂，后者能够检测来自HCC并在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变的乙型肝炎病毒。使用已知方法，相同的这些蛋白可用于制备多克隆和单克隆抗体。
多克隆和单克隆抗体可用作原料来制备诊断试剂，用于高特异性检测来自HCC并在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒的抗原。
使用本发明的每种蛋白或带有氨基酸部分取代的蛋白的检测系统，和使用针对这种蛋白的多克隆或单克隆抗体的检测系统，都可用作能够检测来自HCC的人乙型肝炎病毒的高特异性诊断试剂，来在携带了乙型肝炎表面抗原并且可能处于发生HCC的高危病人中检出这种病毒。这些蛋白或针对这些蛋白的抗体可用作原料来开发针对这种病毒的预防性和治疗性疫苗。
众所周知，DNA中的一个或多个核苷酸可被其他核苷酸取代而产生相同的蛋白。本发明也涉及编码本发明所报告的蛋白的这种核苷酸改变。同样也众所周知，蛋白序列中的一个或多个氨基酸可被其他同类的氨基酸取代，产生氨基酸序列的类似物，氨基酸的同类物由它们的亲水特征或电荷来定义。涉及氨基酸取代、删除、或通过同构物(与蛋白氨基酸具有非常相似的结构和空间的修饰氨基酸)、添加的任何本发明的蛋白的类似物都可以使用，只要所产生的序列能够激发可识别来自HCC的在主要表面抗原的133位氨基酸突变处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒的抗体。
所用的分离方法是在200ul血清样品中加入400ul的消散缓冲液(Tris-Cl 10mM，pH7.4，EDTA 1mM，和十二烷基硫酸钠2％)和25ul的蛋白酶K(20mg/ml)，在65℃孵育3小时。然后用酚/氯仿抽提病毒DNA，并用乙醇沉淀。2.通过聚合酶链反应(PCR)扩增病毒DNA使用3套重叠的寡核苷酸通过聚合酶链反应(PCR)扩增本发明的病毒基因组，这些寡核苷酸根据野生型乙型肝炎病毒设计。包含了各种限制酶切位点来方便PCR产物的克隆。这些寡核苷酸的位置示于图2，并表示如下-Flag1(ATAAGCTTATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGA)(SEQ ID NO6)从DNA聚合酶的编码区的起始位点开始，该位点位于病毒核苷酸序列的位置2307，并且Flag1与编码链匹配(有义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的HindIII限制酶切位点。
-Xba3(GAGTCTAGACTCTGCGGTATTGTGA)(SEQ ID NO7)从XbaI的限制性内切酶位点开始，该位点位于病毒核苷酸序列的位置250，该寡核苷酸与互补链匹配(反义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的XbaI限制酶切位点。
-Xba5(GAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCT)(SEQ ID NO8)从XbaI的内切位点开始，与Xba3寡核苷酸在相同的位点，但它与编码链匹配(有义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的XbaI限制酶切位点。
-Common3(TGAGAATTCTCACGGTGGTCTCCATGCGACGT)(SEQ ID NO9)从DNA聚合酶的终止密码子开始，该位点位于病毒核苷酸序列的位置1623，与互补链匹配(反义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的EcoRI限制酶切位点。
-V11(TTTGTTTACGTCCCGT)(SEQ ID NO10)从X基因的起始位点附近开始，该位点位于病毒核苷酸序列的位置1420，与编码链匹配(有义寡核苷酸)。
-HindIIIADW3(CTAAGCTTAGTTTCCGGAAGTGTTGAT)(SEQ ID NO11)从DNA聚合酶切的起始位点附近开始，该位点位于位置2340，与互补链匹配(反义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的HindIII限制酶切位点。
以病毒DNA为模板，在DNA热循环仪(Perkin-Elmer，Cetus)上使用pfu聚合酶(Stratagene，USA)进行35个循环的PCR，每个循环包括94℃的变性温度1.5分钟，53℃的退火温度2分钟，72℃的延伸温度4分钟。使用下列组合的寡核苷酸Flag1/Xba3、Xba5/Common3和V11/HindIIIADW3分别产生1.2kb、1.4kb和1.1kb的扩增片段。3.病毒DNA扩增片段的克隆先用HindIII和XbaI对来自Flag1/Xba3的病毒DNA扩增片段(1.2kb)进行限制酶消化，然后克隆到用相同限制酶预先处理的BlueScript质粒中。采用XbaI和EcoRI对Xba5/Common3的PCR产物(1.4kb)进行类似的消化，然后克隆到用XbaI和EcoRI预先处理的BlueScript质粒中。另一方面，将带有V11和HindIII的扩增的DNA片段(1.1kb)直接克隆到ZeroBlunt质粒中，后者是InvitroGen(USA)开发来用于克隆平末端DNA片段的质粒。4.核苷酸序列的测定本发明报告的、从HCC分离的人乙型肝炎病毒的核苷酸序列在质粒DNA模板上通过链终止抑制剂进行测定，使用测序酶DNA测序试剂盒(UnitedStates Biochemical Corp)。为方便测序过程，按照野生型乙型肝炎病毒设计了各种内部寡核苷酸(从V1至V16)，它们的位置示于图2。
根据上述分析，测定了从HCC分离并在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒的全长核苷酸序列，如图3所示。所诱导的编码主要病毒蛋白的氨基酸序列示于图4-7乙型肝炎病毒DNA聚合酶(图4)、大表面抗原(包括中表面抗原和主要表面抗原)(图5)、核心抗原蛋白(图6)和反式激活蛋白X(图7)。
将本发明的病毒序列与GenBank数据库中获得的其他乙型肝炎病毒进行排列比较，就可指出特殊的序列差异，后者又可用来设计DNA探针。然后就可开发一种使用聚合酶链反应(PCR)的检测系统。这种PCR反应将包括寡核苷酸的组合，其中所说的寡核苷酸特异性地针对本发明的、在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的人乙型肝炎病毒，这样就允许高特异性地检测这些突变病毒DNA。简而言之，病毒DNA按本发明的介绍抽提，使用特殊寡核苷酸用上面介绍的相似循环条件进行PCR反应，在1％琼脂糖凝胶上回收PCR产物后，分析结果。
按照已知的免疫学方法，可以测定蛋白序列如图4-7的蛋白序列上的决定簇。对这些从HCC分离并在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变的人乙型肝炎病毒的特异决定簇的测定，将使我们可以使用已知的遗传工程方法合成肽、合成蛋白、制备特异针对这些决定簇的抗体、开发特异性诊断试剂、开发预防性和治疗性疫苗以及抗病毒试剂。
用于检测针对从HCC分离并在主要表面抗原的133位氨基酸处带有一个突变的乙型肝炎病毒的抗体的检测系统，可以使用聚乙烯微滴定板和夹心法来开发。简而言之，将50ul的浓度为5ug/ml的从HCC分离并在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变的人乙型肝炎病毒的肽分配于微滴定板的每个孔，并在室温下孵育过夜进行固定。相似的方法可用于纯化自宿主如大肠杆菌的’s’蛋白。微滴定板的孔用含有0.05％Tween20的生理盐水溶液洗涤5次。为进行过量包被，将100ul含有30％(v/v)的小牛血清和0.05％Tween20的NaCl缓冲液(CS缓冲液)分配于每个孔，在室温孵育30分钟后倾去。
为测定血清中对突变(位于主要表面抗原的133位氨基酸残基的变蛋氨酸为苏氨酸)乙型肝炎病毒特异的抗体，可以按如下方法进行初次反应，将50ul的CS缓冲液和10ul的血清样品分配于每个微板孔，在微板振荡器上在室温下孵温育1小时。完成初次反应后，微板孔按上面的介绍洗涤5次。
在第二反应中，将1 ng的辣根过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG单克隆抗体溶于50ul的牛血清，并分配于每个微板孔，在微板振荡器上在室温下温育1小时。完成后，孔用相同方式洗涤5次。在每个孔中加入过氧化氢(作为底物)和50ul的邻苯二胺溶液(作为显色剂)，在室温下孵育30分钟后，在每个孔中加入50ul的4M硫酸终止进一步的显色，并在490nm处读吸收值。
本发明使得可以检测突变的人乙型肝炎病毒，特别是在主要表面抗原的133位氨基酸残基处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的人乙型肝炎病毒。本发明还提供能够高特异性和敏感性地在感染早期或者当HCC可被治疗时，治愈HCC的发展的进行检测的检测系统。
此外，这些特征使我们能够在HCC的早期对病人进行精确的诊断，并且还可帮助高特异性地抑制突变的乙型肝炎病毒。
本发明的蛋白和它们的抗体可用于开发预防性和治疗性疫苗，以及免疫药物。这些突变病毒的结构基因的序列信息将有助于开发相关蛋白抗原和抗体的检测系统。
抗原-抗体复合物可用已知方法进行检测。特异性单克隆和多克隆抗体可通过用对从HCC分离的突变乙型肝炎病毒来说特异的肽或蛋白免疫动物如小鼠和兔来产生。抑制性抗病毒试剂可针对细胞培养物中或体内的这些蛋白和分子进行设计并靶向它们。
本发明以从HCC分离并在主要表面抗原的133位氨基酸处带有一个突变(变蛋氨酸为苏氨酸)的人乙型肝炎病毒基因组的研究为基础。本发明使得可以高特异性地检测这些来自HCC的突变乙型肝炎病毒，并提供材料如蛋白、多克隆和单克隆抗体用于开发这种检测系统。
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序列表(1)一般信息；(i)发明题目一株突变的人乙型肝炎病毒株及其应用(ii)序列数11(2)SEQ ID NO1信息；(图3)(i)序列特征(A)长度3215碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学环形(xi)序列描述SEQ ID NO1CTCCACAACA TTCCACCAAG CTCTGCTAGA TCCCAGGGTG AGGGGCCTAT ATTTTCCTGC 60TGGTGGCTCC AGTTCCGGAA CAGTAAACCC TGTTCCGACT ACTGCCTCTC CCATATCGTC 120AATCTTCTCG AGGACTGGGG ACCCTGCACC GAACATGGAG AACACAACAT CAGGATTCCT 180AGGACCCCTG CTCGTGTTAC AGGCGGGGTT TTTCTCGTTG ACAAGAATCC TCACAATACC 240GCAGAGTCTA GACTCTGGTG GACTTCTCTC AATTTTCTAG GGGGAGCACC CACGTGTTCC 300TGGCCAAAAT TCGCAGTCCC CAACCTCCAA TCACTCACCA ACCTCTTGTC CTCCAATTTG 360TCCTGGCTAT CGCTGGATGT GTCTGCGGCG TTTTATCATA TTCCTCTTCA TCCTGCTGCT 420ATGCCTCATC TTCTTGTTGG TTCTTCTGGA CTACCAAGGT ATGTTGCCCG TTTGTCCTCT 480ACTTCCAGGA ACATCAACCA CCAGCACGGG GCCATGCAAG ACCTGCACGA CTCCTGCTCA 540AGGAAACTCT ACGTTTCCCT CTTGTTGCTG TACAAAACCT TCGGACGGAA ACTGCACTTG 600TATTCCCATC CCATCATCCT GGGCTTTCGC AAGATTCCTA TGGGAGTGGG CCTCAGTCCG 660TTTCTCCTGG CTCAGTTTAC TAGTGCCATT TGTTCAGTGG TTCGTAGGGC TTTCCCCCAC 720TGTTTGGCTT TCAGTTATAT GGATGATGTG GTATTGGGGG CGAAGTCTGT ACAACATCTT 780GAGTCCCTTT TTACCTCTAT TACCAATTTT CTTTTGTCTT TGGGTATACA TTTAAACCCT 840AATAAAACCA AACGTTGGGG CTACTCCCTT AACTTCATGG GATATGTAAT TGGAAGTTGG 900GGTACTTTAC CGCAGGAACA TATTGTACTA AAACTCAAGC AATGTTTTCG AAAACTGCCT 960GTAAATAGAC CTATTGATTG GAAAGTATGT CAAAGAATTG TGGGTCTTTT GGGCTTTGCT 1020GCCCCTTTTA CACAATGTGG CTATCCTGCC TTGATGCCTT TATATGCATG TATACAATCT 1080AAGCAGGCTT TCACTTTCTC GCCAACTTAC AAGGCCTTTC TGTGTAAACA ATATCTGAAC 1140CTTTACCCCG TTGCCCGGCA ACGGTCCGGT CTCTGCCAAG TGTTTGCTGA CGCAACCCCC 1200ACTGGATGGG GCTTGGCCAT AGGCCATCAG CGCATGGCTG GAACCTTTCT GGCTCCTCTG 1260CCGATCCATA CTGCGGAACT CCTAGCAGCT TGTTTTGCTC GCAGCCGGTC TGGAGCAAAA 1320CTTATCGGAA CCGACAACTC TGTTGTCCTC TCTCGGAAAT ACACCTCCTT TCCATGGCTG 1380CTAGGGTGTG CTGCCAACTG GATCCTGCGC GGGACGTCCT TTGTCTACGT CCCGTCGGCG 1440CTGAATCCCG CGGACGACCC GTCTCGGGGC CGTTTGGGGC TCTACCGTCC CCTTCTTCAT 1500CTGCCGTTCC GGCCGACCAC GGGGCGCACC TCTCTTTACG CGGTCTCCCC GTATGTGCCT 1560TCTCATCTGC CGGACCGTGT GCACTTCGCT TCACCTCTGC ACGTCGCATG GAGACCACCG 1620TGAACGCACG CCAGGTCTTG CCCAAGGTCT TATATAAGAG GACTCTTGGA CTCTCAGCAA 1680TGTCAACGAC CGACCTTGAG GCATACTTCA AAGACTGTGT GTTTAAAGAC TGGGAGGAGT 1740TGGGGGAGGA GATTAGGTTA AAGATTTATG TACTAGGAGG CTGTAGGCAT AAATTGGTCT 1800GTTCACCAGC ACCATGCAAC TTTTTCTCCT CTGCCTAATC ATCTCATGTT CATGTCCTAC 1860TGTTCAAGCC TCCAAGCTGT GCCTTGGGTG GCTTTGGGAC ATGGACATTG ACCCGTATAA 1920AGAATTTGGA GCATCTGCTG AGTTACTCTC TTTTTTGCCT TCTGACTTCT TTCCGTCTAT 1980TCGAGATCTC CTCGACACCG CCTCTGCTCT GTATCGGGAG GCCTTAGAGT CTCCGGAACA 2040TTGTTCGCCT CACCATACAG CACTCAGGCA AGCTATTTTG TGTTGGGGTG AGTTGATGAA 2100TCTGGCCACC TGGGTGGGAA GTAATTTGGA AGATCCAGCA TCCAGGGAAT TAGTAGTCAG 2160CTATGTCAAC GTTAATATGG GCCTAAAACT CAGACAAATA TTGTGGTTTC ACATTTCCTG 2220TCTTACTTTT GGAAGAGAAA CTGTTCTTGA GTACTTGGTA TCTTTTGGAG TGTGGATTCG 2280CACTCCTACC GCTTACAGAC CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGGAAACTAC 2340TGTTGTTAGA CGACGAGGCA GGTCCCCTAG AAGAAGAACT CCCTCGCCTC GCAGACGAAG 2400GTCTCAATCG CCGCGTCGCA GAAGATCTCA ATCTCGGGAA TCTCAACGTT AGTATTCCTT 2460GGACTCATAA GGTGGGAAAC TTTACTGGGC TTTATTCTTC TACTGTACCT GTCTTTAATC 2520CCGAGTGGCA AATTCCTTCC TTTCCTCACA TTCATTTACA AGAGGACATT ATTAATAGAT 2580GTCAACAATA TGTGGGCCCT CTTACAGTTA ATGAAAAAAG AAGATTAAAA TTAATTATGC 2640CTGCTAGGTT TTATCCTAAC CTTACTAAAT ATTTGCCCTT AGACAAAGGC ATTAAACCGT 2700ATTATCCTGA ACATGCAGTT AATCATTACT TCAAAACTAG GCATTATTTA CATACTCTGT 2760GGAAGGCTGG CATTCTATAT AAGAGAGAAA CTACACGCAG CGCCTCATTT TGTGGGTCAC 2820CATATTCTTG GGAACAAGAG CTACAGCATG GGAGGTTGGT CTTCCAAACC TCGACAAGGC 2880ATGGGGAGCA ATCTTGCTGT TCCCAATCCT CTGGGATTCT TTCCCGATCA CCAGTTGGAC 2940CCTGCGTTCG GAGCCAACTC AAACAATCCA GATTGGGACT TCAACCCCAA CAAGGATCAC 3000TGGCCAGAGG CAAATCAGGT AGGAGTGGGA GCATTCGGGC CAGGGTTCAC CCCACCACAC 3060GGCGGTCTTT TGGGGGGGAG CCCTCAGGCT CAGGGCATAT TGACAACAGT GCCAGCAGCA 3120CCTCCTCCTG CCTCCACCAA TCGGCAGTCA GGAAGACAGC CTACTCCCAT CTCTCCACCT 3180CTAAGAGACA GTCATCCTCA GGCCACGCAG TGGAA 3215(2)SEQ ID NO2信息(图4)(i)序列特征(A)长度843个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp1 5 10 15Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly20 25 30Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val35 40 45Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser50 55 60Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Ile Pro Ser Phe Pro65 70 75 80His Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys Gln Gln Tyr Val85 90 95Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro100 105 110Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Leu Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly115 120 125Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Ala Val Asn His Tyr Phe Lys Thr130 135 140Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg145 150 155 160Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu165 170 175Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr Ser Thr Arg His180 185 190Gly Asp Glu Ser Cys Cys Ser Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser195 200 205Pro Val Gly Pro Cys Val Arg Ser Gln Leu Lys Gln Ser Arg Leu Gly210 215 220Leu Gln Pro Gln Gln Gly Ser Leu Ala Arg Gly Lys Ser Gly Arg Ser225 230 235 240Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val His Pro Thr Thr Arg Arg Ser Phe Gly245 250 255Gly Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Ile Asp Asn Ser Ala Ser Ser Thr260 265 270Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Thr Ala Tyr Ser His275 280 285Leu Ser Thr Ser Lys Arg Gln Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu290 295 300His Asn Ile Pro Pro Ser Ser Ala Arg Ser Gln Gly Glu Gly Pro Ile305 310 315 320Phe Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp325 330 335Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys340 345 350Thr Glu His Gly Glu His Asn Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg355 360 365Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala370 375 380Glu Ser Arg Leu Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro385 390 395 400Thr Cys Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr405 410 415Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala420 425 430Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu435 440 445Val Gly Ser Ser Gly Leu Pro Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Thr450 455 460Ser Arg Asn Ile Asn His Gln His Gly Ala Met Gln Asp Leu His Asp465 470 475 480Ser Cys Ser Arg Lys Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr485 490 495Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe500 505 510Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln515 520 525Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys530 535 540Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val545 550 555 560Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ser Ile Thr Asn Phe Leu Leu Ser565 570 575Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser580 585 590Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln595 600 605Glu His Ile Val Leu Lys Leu Lys Gln Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val610 615 620Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu625 630 635 640Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro645 650 655Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr660 665 670Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala675 680 685Arg Gln Arg Ser Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr690 695 700Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Ala Gly Thr Phe Leu705 710 715 720Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala725 730 735Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val Val740 745 750Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala755 760 765Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu770 775 780Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Tyr Arg Pro785 790 795 800Leu Leu His Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr805 810 815Ala Val Ser Pro Tyr Va1 Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe820 825 830Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro835 840(2)SEQ ID NO3信息(图5)(i)序列特征(A)长度400个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly 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NO9信息(图11)(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(xi)序列描述SEQ ID NO9TGAGAATTCT CACGGTGGTC TCCATGCGAC GT(2)SEQ ID NO10信息(图12)(i)序列特征(A)长度16碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(xi)序列描述SEQ ID NO10TTTGTTTACG TCCCGT(2)SEQ ID NO11信息(图13)(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(xi)序列描述SEQ ID NO11ATAAGCTTAT GCCCCTATCT TATCAACACT TCCGGA
权利要求
1.一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒分离株，其所组成的病毒基因组已于1997年12月15日在欧洲细胞培养物保藏中心保藏，登记号为P97121501、P97121502和P97121503。
2.编码如下一种多肽的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
3.权利要求2的分离核酸，其中所说多肽由被命名为SEQ ID NO1的核酸序列155至835位核苷酸编码。
4.权利要求3的分离核酸，在位置551-553含有核苷酸“ACG”。
5.权利要求2的分离核酸，其中核酸是DNA。
6.权利要求2的分离核酸，其中核酸是RNA。
7.权利要求5的分离核酸，其中核酸是cDNA。
8.权利要求5的分离核酸，其中核酸是基因组DNA。
9.权利要求2的分离核酸，其中多肽具有与被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上相同的氨基酸序列。
10.编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽由含有SEQ ID NO1的527至595位核苷酸的核酸分子编码。
11.编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。
12.如下一种载体，该载体含有编码一种多肽并与RNA转录启动子操纵连接的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
13.含有编码一种肽的分离核酸的载体，其中所说的肽由含有SEQ ID NO1的527至595位核苷酸的核酸分子编码。
14.权利要求12或13的载体，其中载体含有病毒DNA。
15.用于制备多肽的宿主载体系统，该系统在一种合适的宿主中含有权利要求12的载体。
16.用于制备多肽的宿主载体系统，该系统在一种合适的宿主中含有权利要求13的载体。
17.一种制备多肽的方法，该方法包括在允许多肽产生的合适条件下生成权利要求15的宿主载体系统，并回收这样产生的多肽。
18.一种制备肽的方法，该方法包括在允许多肽产生的合适条件下生成权利要求16的宿主载体系统，并回收这样产生的多肽。
19.一种获得纯化形式的多肽的方法，该方法包括(a)将权利要求12的载体导入一种合适的宿主细胞；(b)培养所产生的宿主细胞，来产生该多肽；(c)回收步骤(b)中产生的多肽；并(d)纯化这样回收的多肽。
20.一种获得纯化形式的肽的方法，该方法包括(a)将权利要求13的载体导入一种合适的宿主细胞；(b)培养所产生的宿主细胞，来产生该多肽；(c)回收步骤(b)中产生的多肽；并(d)纯化这样回收的多肽。
21.一种纯化的多肽，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
22.用权利要求19的方法获得的一种纯化的多肽。
23.一种纯化的肽，其中该肽具有包含被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。
24.用权利要求20的方法获得的一种纯化的肽。
25.一种至少为15个核苷酸的寡核苷酸，它能特异性地与一种核酸分子内的独特核苷酸序列杂交，其中所说核酸分子编码一种多肽，该多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；并且该寡核苷酸不能与编码野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的核酸分子内的任何核苷酸序列杂交。
26.权利要求25的寡核苷酸，它包含SEQ ID NO1的527至595位核苷酸。
27.获得针对一种多肽的抗体的方法，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，并且这种抗体不能针对野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原，该方法包括(a)获取纯化形式的多肽；(b)免疫一种能够产生针对纯化多肽的抗体的生物；(c)收集所产生的抗体；(d)在能够形成一种复合物的条件下将产生的抗体与纯化多肽结合；(e)确定能够与纯化多肽形成一种复合物的所产生抗体，从而获得针对该多肽的抗体。
28.权利要求27的方法，其中多肽由被命名为SEQ ID NO1的核酸序列的155至835位核苷酸编码。
29.权利要求27的方法，其中多肽具有与被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上相同的氨基酸序列。
30.权利要求27的方法，其中生物包括兔或小鼠。
31.获得针对一种肽的抗体的方法，其中所说的肽具有包含被命名为SEQID NO3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列，该方法包括(a)获取纯化形式的肽；(b)免疫一种能够产生针对纯化肽的抗体的生物；(c)收集所产生的抗体；(d)在能够形成一种复合物的条件下将产生的抗体与纯化肽结合；并(e)确定能够与纯化肽形成一种复合物的抗体，从而获得针对该肽的抗体。
32.权利要求31的方法，其中生物包括兔或小鼠。
33.权利要求27或31中获得的抗体。
34.权利要求33的抗体的单克隆抗体。
35.能够检测一种多肽的抗体，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，并且这种抗体不能检测野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原。
36.能够检测一种肽的抗体，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO.3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。
37.编码一种多肽的核酸的应用，其中多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，用来检测被试者是否被一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株感染，其中这种检测包括(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
38.权利要求37的应用，其中步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，其中步骤(b)的测定包括(i)在允许mRNA与寡核苷酸结合的条件下将mRNA与权利要求25的寡核苷酸接触，以形成一种复合物；(ii)分离这样形成的复合物；并(iii)鉴定分离复合物中的mRNA，从而测定mRNA是否为或来自编码该多肽的核酸。
39.权利要求37的应用，其中步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，其中步骤(b)的测定包括(i)在合适条件下翻译mRNA，以获得氨基酸序列；并(ii)将步骤(i)的氨基酸序列与权利要求9的分离核酸编码的氨基酸序列进行比较，从而测定核酸样品是否为或来自一种编码该多肽的核酸。
40.权利要求37的应用，其中步骤(b)的测定包括(i)扩增存在于步骤(a)的样品中的核酸；并(ii)在所产生的扩增核酸中检测多肽的存在。
41.能够识别一种多肽的抗体的应用，所说多肽是一种乙型肝炎病毒株的突变主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，用来测定被试者是否被一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株感染，其中这种测定包括(a)从被试者中获得一种合适的样品；并(b)测定步骤(a)的样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与权利要求35或36的抗体结合，以便确定被试者是否被感染。
42.权利要求37、38或41的应用，其中分离核酸、寡核苷酸或抗体用一种可检测的标记物标记。
43.权利要求42的应用，其中可检测标记物是放射性同位素、荧光素或酶。
44.权利要求37的应用，其中样品包括血液、组织或血清。
45.编码一种多肽的核酸的应用，其中多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，用来检测被试者是否具有肝细胞癌的易感体质，其中这种检测包括(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
46.权利要求45的应用，其中步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，其中步骤(b)的测定包括(i)在允许mRNA与寡核苷酸结合的条件下将mRNA与权利要求25的寡核苷酸接触，以形成一种复合物；(ii)分离这样形成的复合物；并(iii)鉴定分离复合物中的mRNA，从而测定mRNA是否为或来自编码该多肽的核酸。
47.权利要求45的应用，其中步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，其中步骤(b)的测定包括(i)在合适条件下翻译mRNA，以获得氨基酸序列；(ii)将步骤(i)的氨基酸序列与权利要求9的分离核酸的氨基酸序列进行比较，从而测定核酸样品是否为或来自一种编码该多肽的核酸。
48.权利要求45的应用，其中步骤(b)的测定包括(i)扩增步骤(a)的样品中存在的核酸；并(ii)在所产生的扩增核酸中检测多肽的存在。
49.能识别一种多肽的抗体的应用，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，用来测定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质，其中这种测定包括(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸分子，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与权利要求35或36的抗体结合，以便确定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质。
50.权利要求46、47或49的应用，其中分离核酸、寡核苷酸或抗体用一种可检测的标记物标记。
51.权利要求50的应用，其中可检测标记物是放射性同位素、荧光素或酶。
52.权利要求45的应用，其中样品包括血液、组织或血清。
53.为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够治疗一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染，该方法包括(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够治疗该病毒株感染的化合物。
54.为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染，该方法包括(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够预防该病毒株感染的化合物。
55.为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够治疗肝细胞癌，该方法包括(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够治疗肝细胞癌的化合物。
56.为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够预防肝细胞癌，该方法包括(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够预防该病毒株感染的化合物。
57.包含一种多肽或其衍生物以及一种可接受的药用载体的组合物，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，并且这种多肽衍生物的数量能够有效地在被试者中刺激或增强抗体产生。
58.含有一种肽或其衍生物以及一种可接受的药用载体的组合物，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列，并且这种肽衍生物的数量能够有效地在被试者中刺激或增强抗体产生。
59.包含按权利要求55的方法鉴定的化合物以及一种有效的药用载体的组合物，其中化合物的数量能够有效治疗肝细胞癌。
60.包含按权利要求56的方法鉴定的化合物以及一种有效的药用载体的组合物，其中化合物的数量能够有效预防肝细胞癌。
61.包含按权利要求53的方法鉴定的化合物以及一种有效的药用载体的组合物，其中化合物的数量能够有效地治疗一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。
62.包含按权利要求54的方法鉴定的化合物以及一种有效的药用载体的组合物，其中化合物的数量能够有效地预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。
63.权利要求57或58的组合物的应用，用于治疗感染了一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的被试者。
64.权利要求61的组合物的应用，用于治疗感染了一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的被试者。
65.权利要求57或58的组合物的应用，用于在被试者中预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。
66.权利要求62的组合物的应用，用于在被试者中预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。
67.权利要求57或58的组合物用于治疗患有肝细胞癌的被试者的应用。
68.权利要求59的组合物用于治疗患有肝细胞癌的被试者的应用。
69.权利要求57或59的组合物用于在被试者中预防肝细胞癌的应用。
70.权利要求60的组合物用于在被试者中预防肝细胞癌的应用。
71.在来自被试者的体液中筛选一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒株的方法，包括(a)从被试者获得一种合适的体液样品；(b)在步骤(a)的样品中检测一种多肽的存在，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸，以便在样品中筛选该病毒株。
72.权利要求71的方法，其中体液包括血液、血清、或血液或血清的一种核酸样品。
73.一种肝炎疫苗，该疫苗包含乙型肝炎病毒株的一种突变形式的主要表面抗原，该多肽具有的氨基酸序列与乙型肝炎病毒的主要表面抗原的野生型氨基酸序列不同，其差异在于该多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。
74.权利要求73的疫苗，进一步包含一种佐剂。
全文摘要
本发明提供一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原－‘S’－133 Oon株(变蛋氨酸为苏氨酸)的乙型肝炎病毒分离株,其所组成的病毒基因组已于1997年12月15日在欧洲细胞培养物保藏中心保藏,登记号为P97121501、P97121502和P97121503。本发明还提供编码如下一种多肽的分离核酸,其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原,所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同,其差异在于所说多肽在位置133的氨基酸是苏氨酸而不是蛋氨酸。本发明还提供编码如下一种肽的分离核酸及其纯化的肽,其中所说的肽由含有SEQ ID NO:1的527至595核苷酸的核酸分子编码。本发明还提供使用所公开的分离核酸和肽的各种方法。本发明进一步提供所公开的分离核酸、多肽和肽以及抗体的各种应用。
文档编号C12N15/51GK1322251SQ9881420
公开日2001年11月14日 申请日期1998年6月19日 优先权日1998年6月19日
发明者温崇仁, 林玉娇, 赵奕, 陈维宁 申请人:新加坡共和国政府