专利名称：抗病性转基因植物的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及赋予植物抗病性的方法和材料。更具体地说，本发明涉及含有赋予抗病性，特别是抗传染性病原体如病毒的异源核酸的转基因植物。本发明还涉及制备这些转基因植物的方法和材料。
栽培植物的传染病造成全世界的食品、饲料和纤维大量减产。这些疾病的控制主要建立在培养实践上，包括除去受感染的碎屑、消灭杂草宿主(使用除草剂)、防止载体传染(使用杀虫剂)、寻找无病原体原料(种子或无性繁殖体)和培育抗病性。大规模治疗被病毒感染的植物的方法不存在。因此，疾病的控制依赖于预防或延迟感染形成的方法。
上述疾病控制方法中，因为培育抗病性对培育者不需要附加劳动或费用，因此它通常是最经济且切实可行的方法之一。而且，控制抗病性不需要使用除草剂或杀虫剂消灭杂草宿主和昆虫载体。因此，宿主抗性是用于控制植物疾病中对环境最安全且持久的方法之一。不幸的是，在许多植物-病毒体系中，抗性不易获得并且不能使用传统植物育种策略获得。然而，在分子生物学和基因工程中的最新进展已证实，将新型抗病因子整合到之前从未存在的植物-病毒体系中是有帮助的。
背景技术：
转基因植物的开发已证实是一种防止植物遭受病毒病的有价值的策略。例如，Stubbs,G等人的美国专利US5723750描述了表达编码不同病毒种群的野生型和经过修饰的外壳蛋白的基因的转基因植物。已显示这些转基因植物具有不同水平的抗相应病毒感染抗性。不幸的是，编码外壳蛋白的异源基因的表达不赋予广谱抗病毒感染抗性并对其它传染试剂引起的病理无效。
植物抗致病传染性的重要机理为过敏反应(“HR”)。在该HR期间，对病原体的识别诱导快速细胞死亡过程，该过程导致围绕感染部位形成死细胞区(坏死)。该HR病灶据信抑制病原体进一步扩散并产生激活宿主防御机理的信号，并且在许多情况下诱导长期系统性的抗广谱病原体的抗性(Ross,1961)。(在本说明书后面提供了参考书目。)这种系统抗性的诱导被称为系统获得抗性(SAR)并伴随几种病理相关(PR)的蛋白质的合成速度增加和水杨酸(SA)的累积增加(Malamy等人，1990；Metraux等人，1990；Ward等人，1991)。
还描述了在感染植物中诱导该HR的方法。例如，Lam,E.等人的US5629470描述了一种通过用细菌视蛋白(bO)基因转化植物细胞提供具有对一种或多种植物病原体的致病性攻击的抗性增强的高等植物的方法。
鉴于传染病对农业生产的巨大经济影响，因此一直存在对产生致病传染抗性的转基因植物的需要。
发明概述根据本发明，已发现，用黄瓜花叶病毒属的2b基因或其活性片段稳定转化的转基因植物具有对致病感染因子如病毒的系统抗性。由该基因编码的该蛋白质激活宿主植物中强的抗病性反应。
本发明另一方面涉及用黄瓜花叶病毒属2b基因或其活性片段稳定转化的转基因植物的种子和繁殖部分。本发明还提供了将黄瓜花叶病毒属2b基因引入植物的方法和载体。
附图简述
图1描述了来自质粒pTMV-t2b和pPVX-t2b的嵌合病毒RNA转录物的结构特征和基因组结构。
图2为显示该2b基因对致病相关蛋白质在用携带该2b基因的烟草花叶病毒感染的烟草植物叶中表达的影响的Northern印迹杂交。
发明详述黄瓜花叶病毒(CMV)属于称为黄瓜花叶病毒的病毒属，该属还包括番茄无子病毒(TAV)。黄瓜花叶病毒属含有编码以下5个基因的三联单链RNA基因组1a、2a、2b、3a和外壳蛋白。该2b基因的鉴定和功能分析已描述在以前出版物中(Ding等人，1994；1995；1996)。已证实，这些黄瓜花叶病毒属编码的该2b基因对系统性病毒扩散和毒力确定都是重要的。在SEQ ID NO.1中提供了该2b基因的核糖核苷酸序列。
已公开了，当该2b基因由黄瓜花叶病毒属的基因组单独地表达时，当受到致病病毒感染时它在许多植物种中激活强的抗性反应。这些反应包括诱导致病相关蛋白质并形成消除侵入病原体的坏死斑。因此，一方面，本发明涉及用可操纵地与启动子连接的黄瓜花叶病毒属2b基因或其活性片段稳定地转化的转基因植物，当所述植物被致病生物体感染时该启动子能够影响所述基因在所述植物中表达。用于生产抗病性植物的黄瓜花叶病毒属2b基因优选为SEQ IDNO.1的核酸在严格条件下与其杂交的基因。
在一相关方面，本发明提供了使植物抗传染性病原体引起的疾病的方法，该方法包括用操纵地与植物活性启动子连接的黄瓜花叶病毒属2b基因或其活性片段稳定地转化该植物，当所述植物被致病生物体感染时该启动子能够实现所述基因在所述植物中表达。在另一方面，本发明提供了含有可操纵地与植物活性启动子连接的黄瓜花叶病毒属2b基因或其活性片段的表达载体。
突变分析已证实，该2b基因引起该抗性反应。已显示该基因中的点突变使其失去功能并废止该基因激活该抗性反应的能力。此外，尽管可以在不失活情况下将编码这4个C-端氨基酸的密码子除去，但是已发现该基因的C-端26个氨基酸和45个氨基酸序列对其抗病功能是必不可少的。将编码番茄无子病毒2b基因的C-端26个氨基酸和C-端45个氨基酸的密码子转移到无活性黄瓜花叶病毒2b基因的相应区域不能产生活性嵌合基因；因此，该蛋白质的N-端部分还显示含有一个或多个对抗性激活必不可少的结构域。进一步的常规基因图谱实验将证实该2b基因的活性结构域。因此，本发明涉及含有该2b基因活性片段的转基因植物和载体。
可以使用常规载体和步骤将该2b基因或其活性片段(下文的“2b基因”)引入植物。通常，这些技术涉及将该2b基因插入含有用于转录和翻译插入的编码序列和一个或多个便于选择转化细胞或植物的标记序列所必需的元件的表达载体中。
在本领域中已知大量植物活性的启动子，并且可以将它们用于实现本发明公开的核酸序列的表达。可以使用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒的nos启动子或35S启动子；然而，组成型表达可能对转基因植物有害。因此，优选可诱导的启动子，特别是病原体可诱导的启动子，如致病相关蛋白质启动子。
一旦将该2b基因克隆到表达载体中，可以使用常规转化步骤将其导入植物细胞中。术语“植物细胞”意指包含来自包括未分化组织如愈伤组织和悬浮培养物、以及植物种子、花粉或植物胚的植物的任意细胞。适宜转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织、原生质体、下胚轴、子叶、角质鳞片、苗端、根、未成熟胚、花粉和花药。
用于转化植物的一种技术是通过将这些植物的组织与用含有本发明的2b基因的载体转化的细菌接种物接触。通常该步骤涉及用细菌悬浮液接种植物组织并在没有抗生素的再生培养基上在25-28℃下将该组织培养48-72小时。
可以优选使用来自农杆菌属的细菌转化植物细胞。这些细菌的适宜种包括根癌农杆菌和毛根农杆菌。由于根癌农杆菌(例如菌株LBA4404或EHA105)的众所周知的转化植物的能力，因此它特别有用。
用本发明的核酸转化植物细胞的另一方法涉及将惰性或生物活性颗粒推入植物细胞中。该技术公开在授予Sanford等人的美国专利US4945050、5036006和5100792中，将它们加入本文作为参考。通常，该步骤涉及在有效地穿透细胞外表面并掺入其内部的条件下将惰性或生物活性颗粒推入细胞中。当使用惰性颗粒时，可以通过用含有2b基因的载体包被该颗粒将该载体导入该细胞中。还可以将生物活性颗粒(例如干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自含有经寻找待引入的DNA)推入植物细胞组织中。
转化植物细胞的另一方法是电穿孔法。该方法涉及将原生质体和所需DNA混合并通过电脉冲在细胞膜上形成孔，从而将该DNA引入这些细胞中，因此转化这些细胞。该方法目前具有高的再现性并且已通过该方法将不同基因引入单子叶植物，特别是水稻中(Toriyama等人，1988,Shimamoto等人，1989和Rhodes等人，1988)。
一种与电穿孔法相似的方法，它是将所需基因和原生质体混合并用聚乙二醇(“PEG”)处理该混合物，从而将该基因引入这些原生质体中。该方法与电穿孔法的不同之处在于使用PEG代替电脉冲(ZhangW.等人，1988,Datta等人，1990和Christou等人，1991)。
其它方法包括1)用核酸培养种子或胚(Topfer R.等人，1989,Ledoux等人，1974)、2)花粉管处理(Luo等人，1988)、3)脂质体法(Caboche,1990)和4)显微注射法(Neuhaus G.等人，1987)。
可以使用由经过转化的植物细胞再生植物的已知方法制备本发明的转基因植物。通常，可以将外植体、愈伤组织或悬浮培养物暴露于适宜化学环境(例如细胞分裂素和生长素)中，这样该新生长的细胞可以分化并产生胚，然后这些胚再生成根和茎。
在单子叶植物("monocots")和双子叶植物("dicots")中，如玉米、小麦、水稻、粟、燕麦、大麦、高粱、向日葵、甘薯、苜蓿、甜菜、芥子、番茄、胡椒、大豆、烟草、甜瓜、南瓜、马铃薯、花生、豌豆、棉花或可可中，该2b基因在增强对致病病原体的抗性中都是有用的。
通过以下实施例进一步描述本发明，但不将其限制本发明。
实施例实施例1(载体构建)
近年来已开发出几个基于植物RNA病毒的有效植物表达系统。将基于烟草花叶病毒(TMV)(US5589367)和马铃薯病毒X(PVX；Chapman等人，1992)的载体用于表达黄瓜花叶病毒属的2b基因的这些工作。图1显示了构建的嵌合病毒(TMV-t2b和PVX-t2b)的结构特征。通过使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)由pQCD2qt(Ding等人，1996)PCR扩增TAV ORF 2b编码序列(RNA2中核苷酸2447-2734)制备TAV(SEQ ID NO.1，编码95个氨基酸)的2b基因的编码序列。将该序列插入TMV和PVX基因组中各自外壳蛋白(CP)基因的上游。在称为pTMV-30B的TMV载体的PmeI位点平端克隆该PCR片段，从而获得TMV-t2b(图1)。在TMV-t2b中的TAV插入片段作为AgeⅠ-XhoⅠ片段被切下(参见图1)，并且该片段被末端补平并克隆成ClaⅠ-消化且末端补平的pPC2S(基于马铃薯病毒X的表达载体(Chapman等人，1992))，从而生产PVX-t2b。通过非依赖性启动子(图1中箭头标记为1和3)控制该2b基因表达，这些启动子仅被TMV或PVX编码的各自RNA依赖型RNA聚合酶识别。
使用TMV或PVX的2b表达衍生物(TMV-t2b和PVX-t2b)感染植物，并将该2b基因的功能作用表示为野生型和其2b表达衍生物之间在诱导植物反应中的差异。
实施例2(在烟草Samsun中的抗性)TMV-t2b在Samsun(nn)烟草植物中诱导典型的过敏反应(HR)。如所述(Chapman等人，1992)在有帽模拟物(NEB)的情况下使用T7RNA聚合酶(Promega)在体外将质粒pTMV-30B、pPC2S及其衍生物线性化并转录。加帽RNA转录物经机械接种到茂盛生长的烟草Samsun(nn)的叶上。将这些植物在Conviron生长室(24℃恒定，75％湿度和16小时光照/8小时黑暗)中培养。在接种约4天后在所接种的叶上出现局部坏死斑，一直进行观察(5周)，植物的剩余部分没有症状。通过Northern印迹分析没有检测出病毒RNA在未接种叶上部累积，因此进一步证实了TMV-t2b没有扩散到Samsun(nn)植物系统。而且，用于致病相关(PR)蛋白质1(PR-1)、PR-3和PR-5的mRNA的转录在接种叶中经过诱导。参见图2，为用TMV-t2b或TMV攻击的植物叶的Northern印迹。使用PR-1a cDNA作为探针(通过由基于Comelissen,B.J.等人公开的序列的烟草植物的PCR扩增获得(1987))进行Northern印迹杂交。第5天(道1)、第7天(道2)、第10天(道3)和第13天(道4)从植物提取的所有RNA显示PR-1的表达增加。道5和6用野生型TMV感染；然而，道5的烟草基因型为nn，而道6的为NN。
这些结果显示出，Samsun(nn)烟草植物对TMV-t2b有抗性，并且通过TMV-t2b的攻击接种诱导HR的形态学标记(局部坏死斑)和分子标记(PR蛋白质诱导)都表达在这些植物中。
已知，烟草Samsun(nn)不含对TMV特异性的抗性基因，并且这在本研究中得到证实当单独用载体TMV-30B感染时，这些烟草植物形成系统性花叶症状并且观察不到PR基因的诱导。因此，得出结论烟草植物对TMV-t2b攻击的抗性反应是由于来自TMV基因组的TAV 2b基因的顺式表达。
实施例3(证明2b基因引起抗性)构建两个TMV-t2b突变体，各含有点突变以破坏读框2b。预期TMV-tΔ2b1(SEQ ID NO.2)不翻译感染植物中的任意2b蛋白质。然而，在用TMV-tΔ2b2(SEQ ID NO.3)感染的植物中，希望表达失去C-端52个氨基酸残基的截短的2b蛋白质。在经过接种的叶中TMV-tΔ2b1和TMV-tΔ2b2都不诱导局部坏死斑，也不诱导PR蛋白质的mRNA的转录。因此，TAV 2b蛋白质起抗性反应激活剂的作用。插入的TAV核苷酸序列本身在引起HR中不起作用。此外，看出TAV 2b蛋白质的C-端52氨基酸序列对该活性(参见下面)是必不可少的。
实施例4(抗性激活结构域的测定)
通过黄瓜花叶病毒(CMV)的Q菌株编码的2b基因(SEQ ID NO.4)经过相似改造以由TMV基因组表达。系统性感染Samsun烟草植物的称为TMV-q2b的衍生物在接种叶上不诱导坏死斑，也不诱导用于PR蛋白质的mRNA的转录。这说明，与TAV 2b蛋白质相反，该CMV2b蛋白质对抗性激活无活性。
为了定位对抗性激活重要的结构域，将TMV-t2b编码的TAV 2b蛋白质逐渐从C-端被CMV 2b蛋白质的结构等价的区域所替换。传染性测定显示，替换TAV 2b蛋白质的C-端4个氨基酸保留其HR触发活性。但是，TAV 2b蛋白质的C端替换26个或45个氨基酸，其触发HR的能力消失。这说明，尽管在不失去活性的情况下可以将编码4个C-端氨基酸的密码子除去，但是TAB 2b蛋白质的C-端26个氨基酸对在烟草植物中的抗性激活是必不可少的。将编码番茄无子病毒2b基因的C-端26个氨基酸和C-端45个氨基酸的密码子转移到无活性黄瓜花叶病毒2b基因的相应区域不产生活性嵌合基因；因此，该蛋白质的N-端部分也显示含有一个或多个对抗性激活必不可少的结构域。
实施例5(在其它植物种中的抗性)因为Nicotiana benthamiana和Physalis floridana植物与该Samsun烟草的相似之处在于它们都对TMV敏感，并且被感染的植物不产生HR。感染性测定显示，用TMV-t2b的攻击接种在Nicotianabenthamiana和Physalis floridana植物的接种叶中都诱导典型局部坏死斑，同时植物未感染部分保持无症状。这些结果暗示，TAV 2b基因还能够激活这些植物种对TMV的抗性。TAV 2b基因能够在2个属的三个不同植物种中激活对TMV的抗性的事实暗示，它在广泛宿主种中起相似作用。
实施例6(对马铃薯病毒X的抗性)Samsun(nn)和Xanthi-nc(NN)烟草(N.tabacum)植物对马铃薯病毒X(PVX)和来自以PVX为基础的载体(pPC2S)的RNA转录物都完全敏感(Chapman等人，1992)。但是，用PVX-t2b转录物接种在两种烟草品种的叶中都诱导HR。通过PVX-t2b感染诱导的坏死斑与通过TMV-t2b在Samsun(nn)植物上诱导的大致相同。此外，Northern印迹分析显示，在用PVX-t2b攻击的植物中还诱导PR基因的转录，但在用PVX或单独用PVX载体攻击的植物中不诱导PR基因的转录。因此，来自PVX基因组的TAV 2b基因顺式表达还能够在不含对PVX特异的抗性基因的烟草植物中触发抗性反应。
TMV和PVX是不同病毒属的不同植物RNA病毒，这两个病毒的编码蛋白质具有最小序列相似性。因此，不太可能TAV 2b基因的抗性激活需要与由两个病毒载体编码的任意蛋白质特异性相互作用。这些结果暗示了一种可能性，TAV 2b基因将可以激活对广泛植物病原体的抗性机理。
野生型TAV(Ding等人，1994)和CMV/TAV嵌合CMV-qt(Ding等人，1996)都编码TAV 2b基因，它在被感染的植物中以高水平表达(Shi等人，1997)。以前还显示，用于该工作的所有三个植物种对TAV和CMV-qt完全敏感(Ding等人，1996)。这暗示，这些植物种不含识别TAV 2b基因的抗性基因。该结果说明，TAV 2b基因的抗性激活活性在这些植物种中不是组成型的，它可能需要例如用某些毒性病原体(例如TMV和PVX)感染的诱导事件。这种属性将该TAV 2b基因与已知通过植物病原体编码的无毒性基因区别开来。
参考文献Caboche(1990).植物生理学79:173-176Chapman,S.,Kavanagh,T.和Baulcombe,D.(1992)作为植物中基因表达载体的马铃薯病毒X植物杂志，2,549-557Christou等人(1991)生物/技术9:957-962Cornelissen,B.J.等人(1987)从PR-1组编码致病相关蛋白质的烟草基因的结构核酸研究，15,6799-6811Datta等人(1990)生物/技术8:736-740Ding,SW.、Anderson,BJ.、Haase,HR.和Symons,RH.(1994)由黄瓜花叶病毒基因组编码的新型重叠基因病毒学，198,593-601Ding,SW.、Li,W X.和Symons,RH.(1995)由植物RNA病毒编码的天然存在的杂交基因促进病毒长距离移动EMBO J.,14,5762-5772Ding,SW.、Shi,BJ.、Li,WX.和Symons,RH.(1996)种间杂交RNA病毒比任一亲本病毒的毒性大得多Proc.Nat＇l Acad.Sci.USA,93,7470-7474Ludoux等人，(1974)自然，249:17-21Kumagai,MH.、Turpen,TH.、Weinezettl,N.、Della-CioppaG.、Turpen,AM.、Donson,J.、Hilf,ME.、Grantham,GL.、Dawson,WO.、Chow,TP.、Piatak,M.和Grill,LK.(1993)在转染植物中通过RNA病毒载体快速、高水平地表达生物活性畸变天花粉蛋白Proc.Nat′l Acad.Sci.USA,90,427-430Malamy,J.、Henning,J.和Klessig,D.F.(1992)在对烟草花叶病毒感染的抗性反应期间水杨酸和其共轭物的温度依赖性诱导植物细胞，4,359-366Metraux,J.P、Singer,H.、Rayals,J.、Ward,E.、Wyss-Benz,M.、Gaudin,J.、Raschdorf,K.、Schmid,E.、Blum,W.和Inverardi,B.(1990)在黄瓜中在系统获得性抗性出现时水扬酸增加科学，250,1004-1006Rhodes等人，(1981)科学，240,204-207Ross,A.F.(1961)通过在植物中局部病毒感染诱导的系统获得性抗性病毒学,14,340-358Shi,BJ.、Ding,SW.和Symons,RH.(1997)由黄瓜花叶病毒属编码的重叠基因的体内表达普通病毒学杂志，78,237-241Shimamoto等人，(1989)自然，338:274-277Topfer R.等人，(1989)植物细胞，1,133-139Toriyama等人，(1988)生物/技术6:1072-1074Ward,E.R.、Uknes,S.J.、Williams,S.C.、Dincher,S.S.、Widerhold,D.L.、Alexander,D.C.、Ahl-Goy,P.、Metraux,J-P.和Ryals,J.A.(1991)响应诱导系统获得性抗性的试剂的协同基因活性植物细胞，3,1085-1094Zhang W.等人，(1988)遗传学理论和应用，76,835-840
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人丁守伟(ⅱ)发明名称抗病性转基因植物(ⅲ)序列数4(ⅳ)通信地址(A)收信人Rothwell,Figg,Ernst & Kurz(B)街道555 Thirteenth Street,N.W.,Suite 701 East(C)城市华盛顿(D)州DC(E)国家美国(F)邮编20004(ⅴ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0,Version #1.30(ⅵ)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(ⅷ)律师/代理人信息(A)姓名Figg,Edward A.
(B)登记号27195(C)索引/摘要号2248-108(ⅸ)通讯信息(A)电话202-783-6040(B)传真202-783-6031(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度328个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假设无(ⅳ)反义否(ⅵ)原始来源(A)生物体番茄无子病毒(ⅶ)即时来源(B)克隆pTMV-30B(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ACCGTTAAGA AGAAGAAGAA TGGCAAGCAT CGAGATCCCT CTACACGAGA TCATTCGAAA 60GTTGGAACGG ATGAATCAAA AGAAACAAGC ACAGAGGAAA CGACACAAAC TGAACCGCAA 120GGAGCGGGGT CACAAAAGTC CAAGTGAACA AAGGCGATCG GAGTTATGGC ACGCGCGTCA 180AGTTGAACTT TCTGCCATTA ATTCCGATAA TTCTTCAGAT GAGGGTACCA CTCTGTGTCG 240CTTTGACACA TTTGGTTCCA AGTCTGATGC TATTTGTGAT CGCTCTGACT GGTGTCTCGA 300TCAATGATTT CCGACCCTTC GTCGTCCG 328(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度328个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核酸
(A)说明/desc=“合成DNA”(ⅲ)假设无(ⅳ)反义否(ⅵ)原始来源(A)生物体番茄无子病毒(ⅶ)即时来源(B)克隆pTAVd2b1(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:ACCGTTAAGA AGAAGTAGAA TGTAAAGCAT CGAGATCCCT CTACACGAGA TCATTCGAAA 60GTTGGAACGG ATGAATCAAA AGAAACAAGC ACAGAGGAAA CGACACAAAC TGAACCGCAA 120GGAGCGGGGT CACAAAAGTC CAAGTGAACA AAGGCGATCG GAGTTATGGC ACGCGCGTCA 180AGTTGAACTT TCTGCCATTA ATTCCGATAA TTCTTCAGAT GAGGGTACCA CTCTGTGTCG 240CTTTGACACA TTTGGTTCCA AGTCTGATGC TATTTGTGAT CGCTCTGACT GGTGTCTCGA 300TCAATGATTT CCGACCCTTC GTCGTCCG 328(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度328个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核酸(A)说明/desc=“合成DNA”(ⅲ)假设无(ⅳ)反义否(ⅵ)原始来源(A)生物体番茄无子病毒(ⅶ)即时来源
(B)克隆pTAVd2b2(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ACCGTTAAGA AGAAGTAGAA TGTAAAGCAT CGAGATCCCT CTACACGAGA TCATTCGAAA 60GTTGGAACGG ATGAATCAAA AGAAACAAGC ACAGAGGAAA CGACACAAAC TGAACCGCAA 120GGAGCGGGGT CACAAAAGTC CAAGTGAATA AAGGTGATCG GAGTTATGGC ACGCGCGTCA 180AGTTGAACTT TCTGCCATTA ATTCCGATAA TTCTTCAGAT GAGGGTACCA CTCTGTGTCG 240CTTTGACACA TTTGGTTCCA AGTCTGATGC TATTTGTGAT CGCTCTGACT GGTGTCTCGA 300TCAATGATTT CCGACCCTTC GTCGTCCG 328(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度504个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假设无(ⅳ)反义否(ⅵ)原始来源(A)生物体黄瓜花叶病毒(ⅶ)即时来源(B)克隆pCMV2b(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GATCCATGGA TGTGTTGACA GTAGTGGTGT CGACCGCCGA CCTCCACTTA GCCAATTTGC 60AGGAGGTGAA ACGTCGAAGA CGAAGGTCTC ACGTCAGAAA CCGGCGAGCG AGGGGTTACA 120AAAGTCCCAG CGAGAGAGCG CGATCTATAG CGAGACTTTT CCAGATGTTA CCATTCCACG 180GAGTAGATCC CGTGGATTGG TTTCCTGATG TCGTTCGCTC TCCGTCCGTT ACCAGCCTTG 240TTTCTTATGA ATCTTTTGAT GATACTGATT GGTTTGCTGG TAACGAATGG GCCGAAGGGT 300CGTTTTGATT TCCGACCCTT CGTCGTCCGA AGACGTTAAA CTACGCTCTC TTTATTGCGA 360GTGCTGAGTT GGTAGTTTGC TCTAAACTAT CTGAAGTCGC TAAATCCATT ACTGGTTGCG 420AACGGGTTGT CCATCCAGCT TACGGCTAAA ATGGTCAGTC ATGCCCCAAA GGCATGCCGA 480CACCCTACAG GGTTGTCGAG GTAC 50权利要求
1．一种用可操纵地与启动子连接的黄瓜花叶病毒属2b基因或其活性片段稳定转化的转基因植物，当所述植物被致病生物体感染时该启动子能够实现所述基因在所述植物中的表达。
2．权利要求1的转基因植物，其中所述黄瓜花叶病毒属2b基因为SEQ ID NO.1的核酸在严格条件下与其杂交的基因。
3．权利要求1的转基因植物，其中所述黄瓜花叶病毒属2b基因基本上具有SEQ ID NO.1的序列。
4．权利要求1的转基因植物，其中所述植物用所述黄瓜花叶病毒属2b基因的活性片段稳定转化。
5．权利要求4的转基因植物，其中所述片段包括编码黄瓜花叶病毒属2b基因所编码的蛋白质的至少26个C-端氨基酸的核酸序列。
6．权利要求4的转基因植物，其中所述片段包括编码黄瓜花叶病毒属2b基因所编码的蛋白质的至少45个C-端氨基酸的核酸序列。
7．权利要求4的转基因植物，其中所述片段不含编码黄瓜花叶病毒属2b基因所编码的蛋白质的4个C-端氨基酸的氨基酸。
8．权利要求1的转基因植物，其中所述2b基因的表达是由病原体诱导的启动子控制的。
9．权利要求8的转基因植物，其中病原体诱导的启动子为PR蛋白质基因启动子。
10．一种赋予植物抗感染性病原体引起的疾病的抗性的方法，包括用可操纵地与启动子连接的黄瓜花叶病毒属2b基因或其活性片段稳定地转化植物，当所述植物被致病生物体感染时该启动子能够实现所述基因在所述植物中的表达。
11．权利要求10的方法，其中所述黄瓜花叶病毒属2b基因为SEQID NO.1的核酸在严格条件下与其杂交的基因。
12.权利要求10的方法，其中所述黄瓜花叶病毒属2b基因基本上具有SEQ ID NO.1的序列。
13．权利要求10的方法，其中所述植物用所述黄瓜花叶病毒属2b基因的活性片段稳定转化。
14．权利要求13的方法，其中所述片段包括编码黄瓜花叶病毒属2b基因所编码的蛋白质的至少26个C-端氨基酸的核酸序列。
15．权利要求13的方法，其中所述片段包括编码黄瓜花叶病毒属2b基因所编码的蛋白质的至少45个C-端氨基酸的核酸序列。
16．权利要求13的方法，其中所述片段不含编码黄瓜花叶病毒属2b基因所编码的蛋白质的4个C-端氨基酸的氨基酸。
17．权利要求10的方法，其中所述2b基因的表达是由病原体诱导的启动子控制的。
18．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的转基因植物的种子。
19．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的转基因植物的繁殖部分。
20．权利要求1的转基因植物，为玉米、小麦、水稻、粟、燕麦、大麦、高粱、向日葵、甘薯、苜蓿、甜菜、芥子、番茄、胡椒、大豆、烟草、甜瓜、南瓜、马铃薯、花生、豌豆、棉花或可可。
21．一种表达载体，含有可操纵地与植物活性启动子连接的黄瓜花叶病毒属2b基因或其活性片段。
22．权利要求21的表达载体，其中黄瓜花叶病毒属2b基因或其活性片段的表达是由病原体诱导的启动子控制的。
23．权利要求22的表达载体，其中所述病原体诱导的启动子为PR蛋白质基因启动子。
全文摘要
用黄瓜花叶病毒属2b基因或其活性片段转化的转基因植物表现出对感染性病原体如病毒引起的疾病的抗性。该2b基因的表达引起过敏反应活化并在不能对某些病原体有该反应的植物中表达致病性相关蛋白质。用包含可操纵地与植物活性启动子连接的黄瓜花叶病毒属2b基因的表达载体转化各类植物使这些植物能抗致病性感染。
文档编号C12N15/82GK1301308SQ9881416
公开日2001年6月27日 申请日期1998年5月12日 优先权日1998年5月12日
发明者丁守伟 申请人:分子农业生物学院