专利名称：通过裂解脱碱基位点的核酸产生可延伸的上游dna片断而鉴定核酸分子的方法
技术领域：
本发明涉及鉴定核酸分子的方法，所述方法包括裂解脱碱基位点的核酸从而产生可延伸的上游DNA片断。
WO 97／03210公开了使用识别经修饰碱基的DNA-糖基化酶直接检测靶核酸样品中已知和未知突变的方法。该方法一般包括联合使用正常的DNA前体核苷酸和一个或多个经修饰的前体核苷酸扩增靶核酸样品，其中经修饰的前体核苷酸替代了一个正常的前体核苷酸，而前者是DNA糖基化酶的底物。通过糖基化酶切下经修饰的碱基之后，裂解所得的脱碱基位点并分析裂解产物。该方法可以检测候选基因座中的突变。然而，WO 97／03210的方法具有某些局限性。例如，使用此方法，不检测序列相似性就不可能检测核酸分子之间的序列差异，因此就不能混合多个样品以同时进行分析。
ⅱ)利用所述的DNA糖基化酶切下经修饰的碱基以产生脱碱基位点；ⅲ)裂解脱碱基位点处的DNA以产生可被延伸的上游DNA片断；和ⅳ)在可使片断延伸的酶和模板核酸的存在下保温可延伸的上游片断并分析所得的片断。
本发明使用上述可延伸的上游DNA片断提供了新的，通用的和简单的方法，所述方法可鉴定核酸，并如下文所述具有优于现有方法的优点。
本发明方法的最重要的用途(但不是唯一的用途)之一是扫描或检查DNA片断(靶核酸)中是否存在突变。该方法实质上由下列步骤组成ⅰ)产生可延伸的上游DNA片断和ⅱ)随后使用这些片断分析一段DNA序列(如检测突变)。
优选所用经修饰碱基为尿嘧啶，次黄嘌呤或8-OH鸟嘌呤。
优选经修饰碱基得自经修饰的前体核苷酸，当其掺入DNA时即可产生所述经修饰碱基。
因此，优选的经修饰前体核苷酸是dUTP，dITP和8-OH dGTP，当其掺入DNA时即可分别产生糖基化酶底物碱基尿嘧啶，次黄嘌呤或8-OH鸟嘌呤。每个经修饰的前体核苷酸都是含有所述碱基和糖磷酸组成成分的碱基糖磷酸。DNA中的尿嘧啶由尿嘧啶DNA-糖基化酶(UDG)特异性识别并从DNA上释放。UDG也识别DNA中存在的其它尿嘧啶相关碱基。次黄嘌呤由烷基嘌呤DNA-糖基化酶(ADG)特异性识别并从DNA上释放。该酶也识别并释放DNA中存在的N3甲基腺嘌呤，N3甲基鸟嘌呤，O2甲基胞嘧啶和O2甲基胸腺嘧啶。8-OH鸟嘌呤由甲酰胺基-嘧啶DNA糖基化酶(FPG)特异性识别并从DNA上释放。该酶也识别并释放DNA中存在的开环嘌呤。胸腺嘧啶DNA糖基化酶识别并释放DNA中位于鸟嘌呤碱基对面的尿嘧啶和胸腺嘧啶。
本文所用的经修饰的前体核苷酸指的是一个或多个经修饰的核苷酸，可将该核苷酸掺入核酸以产生一个或多个可被DNA糖基化酶识别和切下的经修饰碱基。
导入经修饰碱基之后，用适当的DNA糖基化酶处理DNA产物，所述酶可识别并释放靶样品中存在的糖基化酶底物碱基，随后根据经修饰碱基的特性产生脱嘌呤或脱嘧啶(AP)位点。术语“AP位点”指的是DNA中已缺失或除去核苷酸的碱基组成成分，而具有DNA磷酸二酯骨架的脱氧核糖磷酸仍旧完好无损的位点。AP是脱嘌呤和／或脱嘧啶的缩写，具体取决于核糖环上结合的是嘌呤还是嘧啶碱基。AP位点也被称为脱碱基位点，为脱嘌呤和脱嘧啶位点的通称。
从核酸样品上释放糖基化酶底物碱基导致产生例如脱嘧啶位点(对尿嘧啶而言)和脱嘌呤位点(对次黄嘌呤和8-OH dG而言)。将所述位点通称为脱碱基位点。
实质上，裂解片断的3’末端必须具有羟基，必须不能以防止片断由所述3’末端开始延伸的方式保护紧接所述3’末端下游的DNA。产生的裂解片断的3’末端具有羟基，除去了防止片断由所述3’末端开始延伸的下游保护基，将衍生得到可延伸片断的DNA用作模板。
下文将要详细描述的是可以多种方式裂解脱碱基位点的DNA以产生所述的上游DNA片断。
例如，可通过选自用碱性溶液或其它化学物质处理，热处理和／或用酶处理的方式裂解脱碱基位点处的磷酸键。
根据本发明的一个实施方案，通过裂解脱碱基位点5’方向的DNA而产生上游片断使得上游片断的3’末端携有羟基。
本文中的术语“可延伸的片断”和“上游DNA片断”可以互换使用。
由于产生了3’-OH末端，因此在步骤ⅳ)之前无需进一步加工上游片断。
在高温下用碱性溶液(碱)处理或用如哌啶的化合物处理，或用特异性切割脱碱基位点的酶，如大肠杆菌内切核酸酶Ⅳ处理可以在5’方向上裂解脱碱基位点。
在此实施方案中，优选用5’AP内切核酸酶进行裂解。
根据另一个实施方案，通过裂解脱碱基位点5’方向的DNA，留下上游片断3’末端的磷酸基团并除去磷酸基团而产生上游片断，使得上游片断的3’末端携有羟基。
或者，用碱裂解或使用FPG的脱碱基内切核酸酶活性，接着除去3’磷酸。例如，可使用具有3’磷酸酶活性的酶，如T4多核苷酸激酶通过酶促方法除去3’磷酸基团。
根据另一个实施方案，通过裂解脱碱基位点3’方向的DNA，在上游片断3’末端产生脱氧核糖基磷酸，随后除去脱氧核糖基而产生上游片断使得3’末端留下羟基。
使用具有3’脱氧核糖磷酸二酯酶活性的酶，或使用FPG后接着使用3’磷酸酶即可达到上述目的。
在另一个实施方案中，除去了上游片断3’末端下游的5’脱氧核糖组成成分以使上游片断可在模板上延伸。
优选通过5’脱氧核糖磷酸二酯酶除去5’脱氧核糖组成成分。
仅用高温或3’AP内切核酸酶处理导致脱碱基位点3’方向的DNA完全裂解。
糖基化酶介导的裂解通过DNA糖基化酶在脱碱基位点处切割延伸的引物以随后释放经修饰的碱基，产生具有3’-OH或3’磷酸基团或脱氧核糖磷酸基团的3’末端。除了产生3’-OH末端的情况外，所有其它末端在延伸上游片断之前都需要进一步加工。
本发明方法中的糖基化酶介导的裂解指的是5’和3’裂解，包括随后在上游片断3’末端产生3’OH基团所必需的任何处理过程。
优选通过酶促扩增DNA而导入经修饰的碱基。
优选使用正常的DNA前体核苷酸和至少一个经修饰的前体核苷酸扩增DNA(本文也称之为靶核酸)。
DNA扩增过程中所用的前体核苷酸指的是在本文中被称作“正常的”DNA前体核苷酸的脱氧核糖核苷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP。
本文所用术语“扩增”指的是用于增加一个或多个核苷酸序列的拷贝数的任何体外过程。扩增靶核酸分子导致前体核苷酸掺入被扩增的DNA中。一般在聚合酶链反应(PCR)中使用适当的引物进行靶样品的扩增。在扩增过程中，使引物与靶核酸退火，并用DNA聚合酶使引物在用作模板的靶核酸上以5’至3’的方向延伸以合成新的DNA。使用侧翼引物(本文称之为起始引物，该引物与DNA分子的上链和下链退火)可以指数扩增由上引物和下引物定界的DNA区段。
扩增一般包括联合使用正常的DNA前体核苷酸和一个或多个经修饰的前体核苷酸扩增靶核酸，其中经修饰的前体核苷酸替代了一个正常的前体核苷酸的全部或部分。使用正常的DNA前体核苷酸扩增核酸导致4种正常的碱基G，A，T或C掺入DNA。使用经修饰的前体核苷酸替代一个正常的前体核苷酸来扩增核酸导致糖基化酶底物碱基掺入DNA以替代4种正常碱基G，A，T或C中的一个碱基。
靶核酸样品一般是DNA，然而，也可以使用RNA，但要通过逆转录将其转变为DNA后方可使用。
当经修饰的前体核苷酸替代了一个正常前体核苷酸的一部分时，经修饰的前体核苷酸与其正替代的正常前体核苷酸的比例应使扩增DNA的每条链中最好掺入一个经修饰的前体核苷酸。这样可以使扩增的DNA链与DNA糖基化酶和本文所述的脱碱基位点裂解剂接触之后能被裂解成两个片断。本文将这种裂解方法称为糖基化酶介导的裂解。如果经修饰的前体核苷酸与正常前体核苷酸的比例较高，就会在每条扩增的DNA链上产生一个以上的裂解位点。经修饰的前体核苷酸掺入扩增产物可在扩增产物中能被DNA糖基化酶识别的一个或多个位置处产生一个或多个经修饰的碱基。
在步骤ⅰ)所用的扩增反应中用经修饰的前体核苷酸替代所有正常的前体核苷酸允许糖基化酶介导裂解在扩增反应中被延伸的引物，裂解位置为延伸引物3’末端的第一个位置，该位置处的正常碱基被经修饰的碱基替代。因此，如果紧接引物杂交位置3’末端的模板序列是CTAG，经修饰的核苷酸前体是替代dTTP的dUTP的话，经修饰的碱基尿嘧啶(U)将会掺入与模板链上的A相对的位置。因此，在这种情况下，在扩增和糖基化酶介导的裂解之后，引物由3’末端的两个核苷酸(引物-GA3’)延伸。本文将在起始延伸和糖基化酶介导的裂解之后产生的延伸引物特别地称为如上所述的可延伸片断，而将延伸之前的引物称为起始引物。
可延伸片断延伸的3’末端序列可以酶促合成，该序列与特征为可用作其合成模板的核酸直接相关，因此，可延伸片断的3’末端与核酸互补。相应地，通过任何方法测定可延伸片断3’末端的特性即可鉴定衍生得到该片断的核酸。如果将起始引物置于与出现DNA序列变异(如多态性)或突变的基因座相邻的位置，使得掺入延伸引物的第一个经修饰的碱基位于突变基因座，在糖基化酶介导的裂解之后，起始引物将会根据突变基因座是否存在突变而延伸至不同的长度。随后，(必要时)处理可延伸片断以使它们可用作随后的延伸反应的引物。由于可延伸片断3’末端的序列根据突变基因座是否存在突变而有所不同，分析可延伸片断在随后使用模板核酸的延伸反应中的作用能力即可测定突变基因座是否存在突变。任何与可延伸片断完全或部分杂交的天然或酶促或化学合成的模板都能被设计和／或选择为能使可延伸片断用作欲被测定的引物的模板核酸。
当在扩增反应中，一部分正常的前体核苷酸被经修饰的前体核苷酸替代时，由于随着经修饰的前体核苷酸掺入位置的不同，不同分子的裂解位点不同，因此糖基化酶介导裂解扩增反应中延伸的引物会产生一组不同长度的可延伸片断。由从起始引物3’末端延伸的过程中经修饰的前体核苷酸掺入的位置可测定各个片断的长度。
使用前体核苷酸dATP，dCTP，dGTP，dTTP和少量经修饰的前体核苷酸dUTP来扩增靶核酸导致扩增的DNA中的胸腺嘧啶被尿嘧啶随机取代。在扩增过程中，尿嘧啶掺入新合成的DNA链，掺入位置与模板DNA链中的腺嘌呤残基互补。使用前体核苷酸dATP，dCTP，dGTP，dTTP和少量经修饰的前体核苷酸dITP来扩增靶核酸导致扩增的DNA中的鸟嘌呤优先被次黄嘌呤随机取代。在其它前体核苷酸不限的扩增过程中，次黄嘌呤掺入新合成的DNA链，掺入位置与模板DNA链中的胞嘧啶残基互补。使用前体核苷酸dATP，dCTP，dGTP，dTTP和少量经修饰的前体核苷酸8-OH dGTP来扩增靶核酸导致扩增的DNA中的鸟嘌呤优先被8-OH鸟嘌呤随机取代。在其它前体核苷酸不限的扩增过程中，8-OH鸟嘌呤掺入新合成的DNA链，掺入位置与模板DNA链中的胞嘧啶残基互补。
可分离扩增的DNA链以分开分析每条链。另外，可通过几种方法将分开的链固定化。固定化和／或分离DNA链的常用方法是使用生物素与链霉亲和素之间的相互作用，在该方法中，DNA一般含有生物素标记，而链霉亲和素与固体支持物结合。然而，本发明方法的多个步骤适用于能够固定化上游片断，携有上游片断的链，与携有上游片断的链互补的链，模板核酸，靶核酸和由糖基化酶介导裂解携有经修饰碱基的经扩增或延伸核酸所产生的产物的固定化方式。
可通过化学修饰核酸，或者通过如PCR的扩增技术导入经修饰的碱基。
用特定化合物处理DNA以修饰现存碱基使得它们能被特定的DNA糖基化酶识别的方法有好几种。例如，用如甲基亚硝基脲的烷化剂处理DNA产生了几个烷基化碱基，包括能被烷基嘌呤DNA-糖基化酶识别和切割的N3-甲基腺嘌呤和N3-甲基鸟嘌呤。用亚硫酸氢钠处理DNA导致DNA中的胞嘧啶残基脱氨基化，形成可被尿嘧啶DNA-糖基化酶识别和切割的尿嘧啶残基。用硫酸亚铁和EDTA处理DNA导致DNA中的鸟嘌呤残基氧化形成能被甲酰胺基-嘧啶DNA糖基化酶识别和切割的8-OH鸟嘌呤。
因此，通过化学方法可将核酸或实际上将步骤ⅲ)中产生的可延伸的上游片断中存在的碱基转变为经修饰的碱基。使用亚硫酸氢钠可轻易地将部分或全部胞嘧啶残基转变为尿嘧啶，从而使扩增的样品对胞嘧啶转变位点处的尿嘧啶DNA-糖基化酶裂解敏感。如果合成的上引物或下引物含有5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，此时，引物对尿嘧啶DNA-糖基化酶介导的裂解具有抗性，因为相对于胞嘧啶而言，5-甲基胞嘧啶的脱氨基化速率较低，产生的是胸腺嘧啶而不是尿嘧啶残基。
在用适当的DNA糖基化酶处理之前，可用外切核酸酶Ⅰ处理双链DNA。该处理可以消化不用的引物和任何非特异性的单链DNA扩增产物，从而改善信号与噪声的比例。
当经修饰的前体核苷酸是dUTP时，经修饰的碱基尿嘧啶将在扩增的靶核酸样品中的胸腺嘧啶位置处产生。在样品中添加尿嘧啶DNA-糖基化酶可从样品中释放尿嘧啶。当经修饰的前体核苷酸是dITP时，经修饰的碱基次黄嘌呤将在扩增的靶核酸样品中的鸟嘌呤位置处产生。在样品中添加烷基嘌呤DNA-糖基化酶可从样品中释放次黄嘌呤。当经修饰的前体核苷酸是8-OH dGTP时，经修饰的碱基8-OH鸟嘌呤将在扩增的靶核酸样品中的鸟嘌呤位置处产生。在样品中添加甲酰胺基-嘧啶DNA-糖基化酶可从样品中释放8-OH鸟嘌呤。
可适当标记酶促扩增反应中涉及的引物或一个或多个核苷酸。
可适当标记所用的起始引物。通过多种方法可以标记引物，所述方法包括在引物合成的过程中或之后在引物中添加放射性，荧光或可测配体。
在本发明的一个实施方案中，步骤ⅳ)中所用的酶是聚合酶，可在一个或多个核苷酸的存在下将该酶与可延伸的上游片断一起保温。
在该实施方案中，优选步骤ⅳ)中的一个或多个核苷酸是双脱氧核苷酸。步骤ⅳ)中的一个或多个核苷酸也可被标记。
可使用多种核酸聚合酶在模板核酸上延伸可延伸片断的3’末端。文献中描述了很多可在模板DNA上延伸引物3’末端的聚合酶。例如，可使用分离自噬菌体和嗜中温和嗜热细菌的DNA聚合酶。
在引物延伸的过程中，包括T7 DNA聚合酶的几种DNA聚合酶掺入双脱氧终止核苷酸以及正常的前体核苷酸。一般使用嗜热细菌的DNA聚合酶通过引物重复地循环式延伸来扩增核酸。步骤ⅲ)中产生的上游DNA片断可用作所有核酸聚合酶的引物，所述聚合酶能延伸标准的核酸引物。
在任何延伸反应中，使用经标记的前体核苷酸或双脱氧终止核苷酸便于检测延伸的可延伸片断。根据电泳迁移率进行大小分离之后，直接的DNA染色法，如银染或溴化乙锭染色便于检测所有的延伸产物。
可延伸片断在随后的使用模板核酸和正常或双脱氧终止核苷酸(一旦掺入可阻止引物在模板上进一步延伸的核苷酸)的延伸反应中作用的能力在电泳凝胶上产生了一系列梯状分布的片断，籍此可以测定扩增的靶核酸的一条或两条链中所有经修饰的前体核苷酸的位置。通过与扩增分子的已知DNA序列进行比较，可以判断序列变异或突变的存在导致裂解片断的出现或消失。对片断进行的大小分析可以测定靶核酸样品中突变的精确位置和序列。因此，如果所发生的序列变异产生了另一个经修饰的前体核苷酸掺入位点，那么，分析梯状的裂解产物时会观察到另一个裂解片断。如果所发生的序列变异使得另一个经修饰的前体核苷酸掺入位点丢失，那么，分析梯状的裂解产物时就不会观察到相应的裂解片断。
此时选择的模板应是原始完整的或是经糖基化酶裂解的扩增核酸。当使用经糖基化酶裂解的扩增核酸时，应对其进行加工以除去可延伸片断下游残留的组成成分，所述成分可阻止核酸聚合酶延伸可延伸片断。具体地说，可处理模板DNA以除去残留的5’脱氧核糖组成成分。通过将模板DNA与5’脱氧核糖磷酸二酯酶，如大肠杆菌RecJ内切核酸酶或甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶一起保温即可达到上述目的。其它与可延伸片断完全或部分杂交的天然或酶促或化学合成的模板核酸也能被设计和／或选择为能测定可延伸片断用作引物之能力的模板核酸。
可延伸片断在随后的使用模板核酸和未经标记和经标记的正常或双脱氧终止核苷酸组合的延伸反应中的作用能力可以检测序列变异和突变。使用碱基配对特性不同于经修饰的前体核苷酸的经标记的双脱氧终止核苷酸，和碱基配对特性同于经修饰的前体核苷酸的未经标记的双脱氧终止核苷酸，在衍生得到可延伸片断的，序列变异为杂合的模板核酸上延伸可延伸片断可检测变异或突变的基因座而不能检测非变异的基因座。本发明的此方面特别有利，因为仅检测序列变异可以进行高物料流通量的突变扫描和检测，并根据其序列变异进行指纹分析。
希望突变或多态性为杂合的任何靶DNA的扩增可产生4种不同的双链体DNA，即(例如DNA序列X位的G至A突变)，1／4是X位具有GC碱基对的同源双链体，1／4是X位具有AT碱基对的同源双链体，1／4是X位具有GT碱基对的异源双链体，1／4是X位具有AC碱基对的异源双链体。类似地，通过变性和重新退火两个携有序列差异的同源双链体DNA可容易地产生异源双链体DNA。
因此，通过其在随后的使用模板核酸的延伸反应中用作引物的能力可以测定可延伸片断3’末端序列的特性。实质上，这种检测基于可延伸片断3’末端在选定条件下与选定模板杂交的能力。部分或完全杂交之后，可使用核酸聚合酶和核酸前体或本文所述的选定前体核苷酸组合延伸可延伸片断。希望有多种可能的方式选择模板分子。无论如何，可延伸片断的延伸可以测定其是否与选定模板分子杂交，因此，对可延伸片断3’末端之序列特性的检测是在此基础上进行的，因为该3’序列是原始靶核酸序列的指示。
通常，选择的模板分子的部分或全部序列应与上游片断互补。可使用核酸聚合酶和核酸前体或其组合或双脱氧终止核苷酸或正常核酸前体和双脱氧终止核苷酸的组合，在模板分子上将上游片断延伸一个或多个核苷酸。
通过使用所述可延伸的DNA片断进行扩增反应即可完成步骤ⅳ)的延伸。
或者，除了使用所述可延伸的DNA片断外，还使用引物进行扩增反应即可完成步骤ⅳ)的延伸。
在模板核酸上，联合使用可在模板拷贝上延伸的第二个侧翼引物重复延伸上游片断即可扩增模板核酸。通过电泳分辨之后，经标准的核酸染色法，如溴化乙锭染色可容易地检测上述扩增产物。
或者，选择的模板分子应使得用上游片断为模板可延伸该模板分子，并且是在与上游片断3’末端杂交的基础上延伸。
可根据其在5’核酸酶试验中的作用能力分析上游片断。在通过具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶延伸上游片断的过程中，5’至3’核酸酶活性降解下游报道分子，该分子与同所述上游片断相同的模板链退火。
另一种可能性是在含有报道分子和淬灭标记的合成模板上延伸上游片断，然后裂解所得的双链DNA，从淬灭标记上释放报道分子从而检测信号。一般通过识别双链DNA分子的酶进行上述裂解。所述酶一般是限制性酶。
另外，上游片断的3’末端序列可以在其与其它核酸分子杂交的基础上进行测定。
另一种可能性是可在其过滤和／或沉淀特性的基础上检测使用上游片断延伸或扩增的产物。
当分析步骤ⅳ)(其中在延伸反应中使用的是上游片断)中的核苷酸延伸和掺入时，重要的是需证实所观察到的任何延伸都是由上游片断的延伸特别地引起的，而不是由起始扩增过程中未使用的起始引物的延伸引起的，如果步骤ⅰ)中使用了该引物，那么在该方法的前几个步骤中，通过非特异性打断或破坏DNA可能产生的非特异性上游片断即可延伸。为了消除这一“噪声”，在进行糖基化酶介导的处理之前，可用单链特异性的DNA核酸酶，例如外切核酸酶Ⅰ处理DNA，该酶可降解未被使用的引物和非特异性的单链DNA，随后可被热灭活。可用能在任何预先存在的AP位点切割DNA和引物的3’AP内切核酸酶／裂合酶处理DNA，所述位点可特异性产生或通过破坏DNA而产生。随后从反应中除去3’AP内切核酸酶／裂合酶。由于内切核酸酶／裂合酶在3’方向进行切割，所得的污染上游片断不可延伸，不会干扰随后产生的上游片断的延伸。除了这些处理外，可进行对照反应以检查非特异性延伸。因此，在该方法的步骤ⅲ)中，用3’AP内切核酸酶／裂合酶可切割AP位点，从而产生不能延伸的上游片断。然而，如果在随后的步骤ⅳ)中观察到核苷酸的延伸和掺入，那么可测定该过程中所得非特异性延伸的水平。
类似地，重要的是确保步骤ⅳ)中经标记或未经标记的核苷酸的掺入是由步骤ⅳ)中提供的那些核苷酸的掺入引起的，而不是由步骤ⅳ)之前的那些步骤中提供的核苷酸引起的。当反应涉及双脱氧核苷酸的掺入时，这显得尤为重要。在脱碱基位点裂解DNA并产生上游片断之前或之后，可用如虾碱性磷酸酶的磷酸酶处理反应，该酶可消化反应中存在的所有未掺入的核苷酸，而且随后可被热灭活。
在本发明的另一个实施方案中，步骤ⅳ)中所用的酶是连接酶，可在报道寡核苷酸的存在下将该酶与可延伸的上游片断一起保温。
报道寡核苷酸可以是部分简并的。
可特别地使用本发明的方法检测已知或未知的突变和检测基因组中的差异和相似性。下文将进一步阐明本发明的这些方面。
本发明的方法一方面提供了以简单易行的方式产生随机引物的方法。实质上，将经修饰的碱基导入扩增的DNA产物，接着进行糖基化酶介导的裂解，再对裂解产物进行处理使得它们能被核酸聚合酶延伸即提供了一种快速产生随机引物的方法。随后，在随机扩增靶核酸时使用这种引物，即可延伸的上游片断可以扩增得自靶核酸的不连续的DNA分子，从而可根据扩增产物的相似性和差异来鉴定核酸。由于所述引物实质上源自所述靶核酸，尤其是源自其3’末端，它们是随后随机扩增分析所述靶核酸的较好引物，扩增也更具特异性。在随机扩增核酸的过程中产生了很多不连续的DNA产物。根据大小可将不连续的DNA产物与其它产物分开。本发明的方法可由完全或部分分离的产物产生引物。在允许固定化分离的产物的随机扩增核酸的过程中使用起始引物可以分离延伸至糖基化酶介导之裂解的第一个位点的上和下引物。所述上游片断的3’末端源自靶核酸，因此可更加特异性地扩增靶核酸或相关核酸。所述上游片断的3’末端可短可长。本文中短的3，末端指的是1至3个核苷酸，而长的3’末端指的是大于3个核苷酸。所述上游片断中较长的3’末端更加合乎需要，因为它们可以以较高的特异性扩增靶核酸序列。通过比较大小可以选择所产生的具有较长3’末端的上游片断。或者，可设计起始扩增引物使得它们能促进与蛋白质的结合，所述结合可保护起始延伸引物3’末端的一段区域。因此，由于蛋白质的保护作用，该区域可以抵抗糖基化酶介导的裂解，包含这种引物设计和蛋白质可以产生具有较长3’末端的上游片断。
本发明的此实施方案提供了在无需预先知道核酸序列的情况下，快速而简单地产生核酸扩增所用的随机和特异性引物的方法。
应懂得使用任意选择的引物随机扩增核酸是已知可以检测基因组之间的相似性和差异的方法。这种随机扩增的基础是任意选择的引物与靶样品退火，接着进行多轮酶促扩增，籍此使用选定的基因组DNA或cDNA为模板来延伸引物。在该方法中使用这种引物可以扩增不连续的DNA分子。分析所述分子可研究不同样品之间的相似性和差异。一般选择很多不同的随机引物来研究基因组或cDNA，所述引物可以化学合成，可以假定该引物能在扩增过程中与靶核酸杂交而以随机的方式设计该引物。本发明的方法能够由靶核酸简单而快速地产生引物，随后使用该引物随机扩增相同或不同的靶核酸。
除了如上所述通过聚合酶反应进行延伸之外，也可通过连接另一个单链DNA分子来延伸步骤ⅳ)中的上游片断，这可以使延伸的上游片断的大小大于由糖基化酶介导的裂解产生的起始上游片断。本文将与上游片断连接的DNA分子称为报道寡核苷酸，其长度可以互不相同。上游片断与报道寡核苷酸的连接取决于两种DNA分子(上游片断和报道寡核苷酸)在邻接的位点与模板分子的退火以使上游片断和报道寡核苷酸的末端并列。这意味着上游片断的3’末端碱基与报道寡核苷酸的5，末端碱基并列。报道寡核苷酸一般是合成的寡核苷酸，但也可以是任何其它类型的DNA分子或RNA分子。
选择的模板分子的部分或全部序列应与上游片断和报道寡核苷酸互补。所选择的模板可以是原始完整的或是经糖基化酶裂解的扩增核酸。另外，模板还可以是单链DNA分子，如合成的寡核苷酸，模板的大小可以不同，但能与上游片断和报道寡核苷酸互补退火。模板DNA实际上可以是单链或双链。用作模板的双链DNA由模板链和互补链组成。双链DNA首先必须变性，然后再在上游片断和报道寡核苷酸的存在下重新退火。上游片断和报道寡核苷酸与互补链竞争与双链模板分子之模板链的退火。
可以使用多种DNA连接酶和RNA连接酶，通过在模板核酸上连接报道寡核苷酸来延伸可延伸片断的3’末端。可使用多种来源的DNA连接酶，包括分离自噬菌体(如T4 DNA连接酶)和嗜中温和嗜热细菌的DNA连接酶连接报道寡核苷酸与可延伸片断。可使用嗜热细菌的DNA连接酶重复地循环连接可延伸片断和报道寡核苷酸。
如上所述，本发明的方法包括产生具有3’羟基的上游片断，这是通过聚合酶由添加核苷酸来延伸分子和通过连接酶由连接报道寡核苷酸进行延伸的基本需求。除了上游片断上的3’羟基外，报道寡核苷酸也需要具有5’磷酸基团以进行连接。另外，必要时，连接还可以检测下游片断。下游片断是DNA链上裂解除去上游片断之后的残留物。这里，报道寡核苷酸需要具有3’羟基末端，下游片断需要具有5’末端磷酸基团。
因靶核酸中存在正常和突变的等位基因或因随机导入了经修饰的碱基，各个反应中的糖基化酶介导的裂解可产生几个不同的上游片断，因此，通过连接反应进行延伸除了含有几个不同的报道寡核苷酸和模板核酸外，还可含有几个不同的上游片断。另外，可同时鉴定几个不同的核酸，因为各个报道寡核苷酸和／或模板核酸可用于鉴定各个待研究的核酸。通过包括大小分析，杂交和扩增的几种方法中的任一种可检测延伸的上游片断。另外，可在聚合酶链反应中进一步扩增连接产生的DNA分子。
可标记报道寡核苷酸，上游片断或模板核酸。例如，除了生物素或地高辛配基标记外，还可使用荧光或放射性标记。报道寡核苷酸上的有用的标记是5’末端的放射性磷酸，即32p或33P。放射性磷酸可用作检测DNA所用的标记物，也可用作报道分子上必需的5’磷酸。报道寡核苷酸，上游片断或模板核酸上的生物素标记可用于直接地或通过杂交将延伸的上游片断固定化于固体支持物上。固定化与多个不同的连接延伸联合可用于产生很有效的和高物料流通量的DNA分子鉴定系统。
通过连接进行延伸的发明利用其鉴定正常上游片断混合物中的突变上游片断的能力，也可用于鉴定核酸中的未知序列变化。在连接反应中可使用部分简并的报道寡核苷酸。使用5’末端与正常等位基因互补的简并的报道寡核苷酸也可选择性连接因在突变位点裂解DNA分子而产生的上游片断。另外，本发明通过使用经设计可与各个CpG位点退火的完全互补的报道寡核苷酸，也可用于研究DNA片断中所有的CpG双核苷酸位点。任何所得连接产物的长度会显示出已突变的CpG位点。
优选通过杂交来检测步骤ⅳ)中所得的任何延伸片断。
本发明的方法有几个显著优于现有方法的优点，即a)可以检测核酸样品之间的相似性或差异，或相似性和差异。尤其是可以检测核酸中多个不同基因座的相似性或差异，或相似性和差异。尽管可以使用其它方法达到此目的，但本发明的方法具有单一方法的优点，即易于大规模地快速并简单地鉴定核酸分子。
b)应懂得核酸扩增是鉴定和检测核酸的常用方法。扩增取决于在扩增过程中延伸的引物的使用。另外，本发明的方法可以产生高特异性引物以用于扩增核酸，而无需预先知道任何有关核酸序列的信息。因此，本发明的方法具有很高的实用性，可通过分析从中产生的扩增产物来鉴定核酸。本发明中描述的用于鉴定核酸的扩增方法可以用在本发明之前不可能实现的方式鉴定核酸。
c)在本领域中，需要使检测候选基因座处的特定突变的方法简单化。本发明的方法提供了检测上述突变的简单方法。尤其是，可使用很多不同的分析方法，通过由核酸中的序列变异基因座产生的上游片断分析上述基因座，所述上游片断还可准确并简单地检测该基因座的序列变异。
d)本发明的方法提供了通过随机扩增鉴定核酸的再现性更好的方法，并且该方法较不容易出错。
本发明的方法通过检测DNA中C至T的转换也可用于分析DNA中的CpG含量。
通过分析在很多年的突变研究中获得的突变数据和突变谱，已鉴定出在其基因组DNA中含有5-甲基胞嘧啶的所有生物(如人)的确定的突变热点，即CpG双核苷酸处的突变。CpG双核苷酸是人细胞中的胞嘧啶甲基化位点，并且在基因组构成和基因表达中分别与很多结构和调节作用相关。DNA中的胞嘧啶一般对低但可测水平的脱氨基化敏感，从而形成尿嘧啶，如果不能被修复的话，该事件即可致突变。然而，通过5’位点的甲基化，胞嘧啶环对自发的脱氨基化甚至更加敏感，因此，5-甲基胞嘧啶残基脱氨基化形成胸腺嘧啶。脱氨基化之后，CpG双核苷酸变为TpG双核苷酸。因此，由于5-甲基胞嘧啶仅在CpG出现，此位点突变的主要原因是5-甲基胞嘧啶的脱氨基化，突变的CpG序列在DNA中以TpG双核苷酸序列出现，这是典型的C至T转换突变。由于在人基因研究中已阐明CpG是突变热点，因此，快速筛选以加强检测待测DNA片断中CpG双核苷酸处的突变是十分有利的。
为了加强检测CpG序列的突变，在扩增靶DNA，接着裂解产生上游片断之后可进行下列步骤之一。
在聚合酶，双脱氧TTP(ddTTP)，经标记的双脱氧CTP(ddCTP)和作为模板的野生型DNA的存在下进行步骤ⅳ)，通过掺入双脱氧核苷酸来延伸上游片断，但在掺入经标记的ddCTP之后，只有C突变为T的位点，包括CpG突变为TpG的位点能被标记。由于ddCTP是链终止核苷酸，DNA在此位点上不再延伸。因此，DNA可在突变的CpG序列上延伸，也可被标记和检测。
在聚合酶，作为模板的野生型DNA，dTTP和经标记的双脱氧GTP(ddGTP)的存在下进行步骤ⅳ)，通过掺入dTMP来延伸上游片断，但在掺入经标记的ddGTP之后，只有T后面接着G的位点，即TpG序列能被标记。由于ddGTP是链终止核苷酸，DNA在此位点上不再延伸。因此，DNA可在所有TpG序列上延伸，也可被标记和检测。由于TpG双核苷酸天然存在于DNA中并能由CpG脱氨基化产生，野生型DNA会显示出特征性的带模式(一般仅可以看见几条带)。标记可以是例如以实质上已知的方式标记的放射性33p，荧光或生物素。
在聚合酶，dUTP，dGTP，dATP，经标记的dCTP和作为模板的野生型DNA的存在下进行步骤ⅳ)，通过掺入脱氧核苷酸而延伸上游片断，上游片断被标记。随后通过尿嘧啶DNA糖基化酶和脱碱基位点裂解剂裂解延伸的上游片断，仅有在突变位点处裂解产生的上游片断能被延伸和标记。该方法可以检测产生T掺入位点的所有突变，包括CpG位点的C至T突变。该方法的优点是步骤ⅳ)利用了脱氧核苷酸的掺入，它比通过所有聚合酶掺入双脱氧核苷酸更加有效。
另外，在杂合样品中，突变的CpG会产生T／G错配(或在导入经修饰的核苷酸dUTP之后产生U／G错配)。可使用胸腺嘧啶DNA糖基化酶特异性地裂解突变的CpG序列中的T／G或U／G错配。
图2图示了实施例1中描述的本发明的方法。
图3图示了实施例2中描述的本发明的方法，其中在产生上游可延伸片断之后的线性扩增反应中使用经标记的ddTTP。
图4图示了实施例2中描述的本发明的方法，其中在产生上游可延伸片断之后的线性扩增反应中使用经标记的ddCTP。
图5图示了实施例3中描述的本发明的方法。
图6A-6D图示了实施例3中，经电泳，放射自显影和分析了放射自显影之后得到的延伸产物。
图7A-7D图示了实施例4中对上游片断进行的连接反应和所得连接产物。
图1显示了5’至3’方向的单链DNA。显示了两个碱基，即碱基1和碱基3的位置。碱基2已被除去，其位置上现存的是AP位点。垂直线表示与该碱基结合的核糖链，带有含P之圆圈的斜线指的是连接各个核糖的磷酸二酯键。箭头表示可在AP位点的5’方向或3’方向切割DNA。
如果在AP位点的3’方向，即位置Z处裂解DNA，上游片断(含有碱基1)的3’末端具有脱氧核糖磷酸组成成分(以C图表示)。通过用3’AP内切核酸酶／裂合酶处理或如上文所述用热处理即可在AP位点的3’方向裂解DNA。
也可以两种不同的方式在AP位点的5’方向，即X和Y位切割AP位点。X位的裂解导致上游片断3’末端出现羟基(以A图表示)。通过如上文所述用5’AP内切核酸酶处理可以在X位进行裂解。Y位的裂解导致上游片断3’末端出现磷酸基团(以B图表示)。通过如上文所述用热和碱处理可以在Y位进行裂解。
通过下列实施例可以进一步阐明本发明。实施本发明的模式图2图示了靶核酸和上引物及下引物(引物含有标准碱基G，A，T和C)。通过于37℃，与1单位T4多核苷酸激酶(可购自New EnglandBiolabs)，70mM Tris-HCl(pH7．6)，10mM MgCl2，5mM二硫苏糖醇和1μCiγ32p ATP(3000Ci／mmol)保温30分钟即可末端标记6pmol下引物。在总体积为19μl的含有靶核酸，0．2mM dATP，dCTP，dGTP和dUTP，6pmol32p标记的下引物和未经标记的上引物的反应混合物中通过PCR扩增靶核酸样品。然后在反应混合物上覆盖等体积的矿物油，进行热启动PCR，即将反应混合物加热至94℃达5分钟，然后加入1单位的Taq聚合酶(可购自Promega)(总体积为20μl)。在热循环仪中进行30轮变性，退火和延伸循环。然后用外切核酸酶Ⅰ(可购自Amersham LifeSciences)处理含有扩增的靶核酸的反应混合物以消化在扩增步骤中未延伸的引物，并用虾碱性磷酸酶(SAP)(可购自Boehringer Mannheim)消化在扩增步骤中未掺入的dNTP。通过于37℃，将10μl PCR反应产物与0．5单位外切核酸酶Ⅰ和1单位SAP保温30分钟即可达到上述目的。随后通过于80℃保温反应15分钟以热灭活ExoI和SAP。
然后加入尿嘧啶DNA-糖基化酶(可购自New England Biolabs)(0．5单位)，于37℃再保温30分钟。用尿嘧啶DNA-糖基化酶处理之后，通过加入NaOH至终浓度为0．05M并于95℃将混合物加热15分钟即可完全裂解扩增产物中产生的脱碱基位点。然后加入10％体积3M醋酸钠和2倍体积的乙醇以沉淀经消化的DNA，将沉淀物重新悬浮于5μl水中，然后用0．5单位T4多核苷酸激酶(PNK)处理经消化的DNA即可除去3’末端的磷酸基团。
然后使用上述裂解反应的产物进行线性扩增反应，所需片断是经标记的上游可延伸片断，在该反应中，通过在总体积为10μl的循环反应中使用热稳定性DNA聚合酶来延伸上游可延伸片断。该反应的模板是扩增的靶核酸(RYR1基因的952至1044)，由于预先用ExoⅠ处理过，所述模板中不含引物。
在样品中加入等体积的甲酰胺上样染料(90％甲酰胺，0．025％溴酚蓝，0．025％二甲苯腈蓝)，然后加热至85℃达5分钟。将样品上样至20％变性(7M尿素)聚丙烯酰胺凝胶，于60W电泳3至4小时以对延伸产物进行大小分析。电泳之后，通过于-70℃将凝胶直接暴露于X-射线照相胶片12小时进行放射自显影。
分析放射自显影，其中下引物被标记，显示出长度为93个核苷酸的产物。如果在上述方法中未包括T4多核苷酸激酶处理或线性扩增反应即观察不到该产物。
图3和4图示了靶核酸和上引物及下引物(引物含有标准碱基G，A，T和C)。在总体积为19μl的含有靶核酸，0．2mM dATP，dCTP，dGTP和0．19mM dTTP和0．01mM dUTP，和6pmol上和下引物的反应混合物中通过PCR扩增靶核酸样品。然后在反应混合物上覆盖等体积的矿物油，进行热启动PCR，即将反应混合物加热至94℃达5分钟，然后加入1单位的Taq聚合酶(总体积为20μl)。在热循环仪中进行30轮变性，退火和延伸循环。然后用外切核酸酶Ⅰ处理含有扩增的靶核酸的反应混合物以消化在扩增步骤中未延伸的引物，并用虾碱性磷酸酶(SAP)消化在扩增步骤中未掺入的dNTP。通过于37℃，将10μl PCR反应产物与0．5单位外切核酸酶Ⅰ和1单位SAP保温30分钟即可达到上述目的。随后通过于80℃保温反应15分钟以热灭活ExoI和SAP。
然后加入尿嘧啶DNA-糖基化酶(0．5单位)，于37℃再保温30分钟。用尿嘧啶DNA-糖基化酶处理之后，通过加入NaOH至终浓度为0．05M并于95℃将混合物加热15分钟即可完全裂解扩增产物中产生的脱碱基位点。然后加入10％体积3M醋酸钠和2倍体积的乙醇以沉淀经消化的DNA，将沉淀物重新悬浮于5μl水中，然后用0．5单位T4多核苷酸激酶处理经消化的DNA即可除去3’末端的磷酸基团。
然后使用上述裂解反应的产物，即多种可延伸的上游片断即可进行线性扩增反应，在该反应中，通过在总体积为10μl的循环反应中使用热稳定性DNA聚合酶(即热测序酶(可购自Amersham Life Sciences))来延伸上游片断。该反应的模板是正常cDNA的扩增片断(RYR1基因的952至1224)，由于预先用ExoⅠ处理过，所述模板中不含未经标记的引物。在1mM 3种双脱氧终止核苷酸(ddNTP)和0．02mM33p-标记的ddNTP的存在下进行延伸反应。
在样品中加入等体积的甲酰胺上样染料(90％甲酰胺，0．025％溴酚蓝，0．025％二甲苯腈蓝)，然后加热至85℃达5分钟。将样品上样至6％变性(7M尿素)聚丙烯酰胺凝胶，于60W电泳3至4小时以对延伸产物进行大小分析。电泳之后，通过于-70℃将凝胶直接暴露于X-射线照相胶片12小时进行放射自显影。
分析放射自显影，其中ddTTP是经标记的ddNTP(图3)，显示出对应于从引物5’末端至dUMP掺入位点这段距离的经标记片断序列梯(仅显示出下链的延伸)。这些位点对应于DNA的野生型T模式。当使用突变的靶核酸产生延伸引物时，在带的T模式中观察到另一条带(203个核苷酸)。分析ddCTP被标记的放射自显影(图4)，当上游片断源自经扩增的正常靶核酸时，未显示出经标记的带，然而，当使用经扩增的突变靶核酸时，放射自显影分析仅显示出一条带。经标记片断的大小对当于下引物的5’末端和突变位点之间的距离(即203个核苷酸)，从而阐明该个体之RYR1基因第1021位G至A突变的存在。
图5图示了靶核酸和上引物及下引物(引物含有标准碱基G，A，T和C)。在总体积为19μl的含有靶核酸，0．2mM dATP，dCTP，dGTP和dUTP，和6pmol上和下引物的反应混合物中通过PCR扩增靶核酸样品。然后在反应混合物上覆盖等体积的矿物油，进行热启动PCR，即将反应混合物加热至94℃达5分钟，然后加入1单位的Taq聚合酶(总体积为20μl)。在热循环仪中进行30轮变性，退火和延伸循环。然后用外切核酸酶Ⅰ(ExoI)处理含有扩增的靶核酸的反应混合物以消化在扩增步骤中未延伸的引物，并用虾碱性磷酸酶(SAP)消化在扩增步骤中未掺入的dNTP。通过于37℃，将20μl PCR反应产物与0．5单位ExoI和1单位SAP保温30分钟即可达到上述目的。随后通过于80℃保温反应15分钟以热灭活ExoⅠ和SAP。然后加入尿嘧啶DNA-糖基化酶(0．5单位)和内切核酸酶Ⅳ(1单位)，于37℃再保温30分钟以完全切下扩增的DNA中存在的所有尿嘧啶并完全裂解所得的脱碱基位点。该裂解导致上游片断的3’末端具有3’羟基，通过DNA聚合酶的作用可以进行延伸。
然后在反应混合物(10μl)中进行延伸反应，该混合物中含有上述裂解反应的产物，即可延伸的上游片断(2μl裂解反应，约1pmol可延伸片断)和100fmol合成模板寡核苷酸，0．2mM dATP，dTTP和dGTP，0．02mM dCTP，1μCi α32pdCTP，6pmol反向引物和1单位Taq DNA聚合酶。反应为40轮变性，退火和延伸循环。
在样品中加入等体积的甲酰胺上样染料(90％甲酰胺，0．025％溴酚蓝，0．025％二甲苯腈蓝)，然后加热至85℃达5分钟。将样品上样至变性(7M尿素)聚丙烯酰胺凝胶，于60W电泳3至4小时以对延伸产物进行大小分析。电泳之后，通过于-20℃将凝胶直接暴露于X-射线照相胶片12小时进行放射自显影。
分析正常组织的DNA，在使用上述上引物和下引物，经糖基化酶介导的裂解之后产生了37个核苷酸的可延伸片断(图5)。类似地，分析肿瘤组织的DNA，导致产生32个核苷酸的可延伸片断(图5)。分析正常组织的DNA之后，使用模板寡核苷酸1的放射自显影显示出66个核苷酸长的带(图6A)。当在上述分析中使用模板寡核苷酸2时观察不到此带(图6B)。分析肿瘤组织的DNA之后，使用模板寡核苷酸2的放射自显影显示出66个核苷酸长的带(图6C)。当在上述分析中使用模板寡核苷酸1时观察不到此带(图6D)。因此，根据上游片断在突变的模板寡核苷酸上延伸的能力可测定Ki-ras基因之密码子12处突变的存在，反过来，如果上游片断不能在正常模板寡核苷酸上延伸，则可确定缺乏突变。
使用γ32PATP和T4多核苷酸激酶5’末端标记报道寡核苷酸1和2(图7)(分别与Ki-ras基因的核苷酸6397至6406(5’TCCAACTACC3’No．1(SEQ ID NO．28))和核苷酸6402至6411(5’CCAGCTCCAA3’，No．2(SEQ ID NO．30)互补)。这样可以标记所得的连接片断，也可为报道寡核苷酸提供任何可能的连接都需要的5’末端磷酸。
然后使用上述裂解反应的产物，即可延伸的上游片断(5μl裂解反应，约2pmol可延伸片断)，4pmol经标记的报道寡核苷酸和2pmol模板寡核苷酸1或2(分别为5’GGTAGTTGG AGCTGGTGGCG3’(SEQ IDNo．27)(核苷酸6397至6416)或5’TTGGAGCTGGTGGCGTAGGC3’(SEQ ID No．31)(核苷酸6402至6421))(图7)和1单位T4 DNA连接酶进行连接反应(16℃，60分钟)，在该反应中，通过在20μl反应中连接报道寡核苷酸可以在长度上延伸上游片断。
在样品中加入等体积的甲酰胺上样染料(90％甲酰胺，0．025％溴酚蓝，0．025％二甲苯腈蓝)，然后加热至85℃达5分钟。将样品上样至变性(7M尿素)聚丙烯酰胺凝胶，于60W电泳3至4小时以对延伸产物进行大小分析。电泳之后，通过于-20℃将凝胶直接暴露于X-射线照相胶片12小时进行放射自显影。
分析正常组织的DNA，在使用上述上引物和下引物，经糖基化酶介导的裂解之后产生了37个核苷酸的可延伸片断(图5)。类似地，分析肿瘤组织的DNA，结果产生32个核苷酸的可延伸片断(图5)。分析正常组织的DNA，使用报道寡核苷酸1和模板寡核苷酸1的放射自显影显示出47个核苷酸长的带(图7A)。当在上述分析中使用报道寡核苷酸2时观察不到此带(图7B)。分析肿瘤组织的DNA，使用报道寡核苷酸2和模板寡核苷酸2的放射自显影显示出42个核苷酸长的带(图7C)。当在上述分析中使用报道寡核苷酸1时观察不到此带(图7D)。因此，通过42个核苷酸长的带的存在可测定Ki-ras基因之密码子12处突变的存在，而通过47个核苷酸长的带的存在可测定正常等位基因的存在。含有正常和肿瘤DNA的样品产生了42和47个核苷酸长的带。
再次进行上述分析，但在该分析中用32p标记下引物的5’末端。这需要将未经标记的ATP用作磷酸供体以使报道寡核苷酸磷酸化。结果与上述的类似，即42个核苷酸长的带表示突变的Ki-ras基因(密码子12)的存在，而47个核苷酸长的带表示Ki-ras基因之密码子12处不存在突变。另外，还在连接反应中使用最初由正常或突变样品扩增的Ki-ras基因片断为模板进行上述分析。使用正常的经扩增产物替代模板寡核苷酸1，而使用突变的经扩增产物替代模板寡核苷酸2。所观察到的结果与上述相同。
如上所述，本发明的方法有很多优于已知方法，尤其是WO97／03210中所述方法的优点。在WO97／03210中，糖基化酶介导的裂解(可使用多种方法进行该裂解，所述裂解可产生多种不同的3’末端)之后，所得DNA片断无需经加工即可直接进行分析。在本发明中，糖基化酶介导的裂解步骤之后紧接着能延伸由糖基化酶介导的裂解产生的3’末端的步骤。
本发明的主要优点(现有的方法不可能实现的)是本发明可以检测核酸分子之间的序列差异，如突变和多态性而无需检测序列相似性。如上所述，用WO97／03210的方法不可能检测核酸分子之间的序列差异而同时无需检测序列相似性。这是WO97／03210的方法的局限性，因为多个样品不能被混合以同时进行分析。本发明还可以同时分析多个基因或基因区段。另外，本发明还可以在无需预先知道核酸序列的情况下产生核酸扩增所需的特异性引物。而已知方法无法做到这一点。另外，本发明还可以以独特的方式由核酸产生特异性引物，随后通过聚合酶延伸检测该引物以测定所述引物3’末端的序列特性。
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)名称FORBAIRT(trading as BioResearch Ireland)(B)STREETGlasnevin(C)CITYDublin9(E)COUNTRYIreland(F)POSTAL CODE(ZIP)None(A)名称UNIVERSITY COLLEGE CORK(B)STREETCollege Road(C)CITYCork(E)COUNTRYIreland(F)POSTAL CODE(ZIP)None(A)名称McCARTHY，Thomas Valentine(B)STREETVista Villa，Montenotte(C)CITYCork(E)COUNTRYIreland(F)POSTAL CODE(ZIP)None(A)名称VAUGHAN，Patrick Martin(B)STREET175 West Avenue，Parkgate，Frankfield(C)CITYCork(E)COUNTRYIreland(F)POSTAL CODE(ZIP)None(ii)发明名称通过裂解脱碱基位点的核酸产生可延伸的上游DNA片段而鉴定核酸分子的方法(ⅲ)序列数32(ⅳ)计算机可机读形式(A)介质类型软盘(B)计算机可兼容IBMPC(C)操作系统PC-DOS／MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1．0，Version#1．30(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度93个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅵ)原始来源(F)组织类型骨骼肌
(ⅹⅰ)SEQ ID NO1的序列描述TCCAAGGAGA AGCTGGATGT GGCCCCCAAG CGGGATGTGGAGGGCATGGG CCCCCCTGAG 60ATCAAGTACG GGGAGTCACT GTGCTTCGTG CAG 93(2)SEQ ID NO2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度93个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由PCR扩增产生的DNA″(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)SEQ ID NO2的序列描述TCCAAGGAGA AGCTGGATGT GGCCCCCAAG CGGGAUGUGGAGGGCAUGGG CCCCCCUGAG 60AUCAAGUACG GGGAGUCACU GUGCUUCGUG CAG 93(2)SEQ ID NO3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度93个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由PCR扩增产生的DNA″(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)SEQ ID NO3的序列描述CTGCACGAAG CACAGTGACT CCCCGUACUU GAUCUCAGGGGGGCCCAUGC CCUCCACAUC 60CCGCUUGGGG GCCACAUCCA GCUUCUCCUUGGA 93(2)SEQ ID NO4的资料(ⅰ)序列特征
(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由糖基化酶介导裂解产生并具有一个3′磷酸基的DNA″(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)SEQ ID NO4的序列描述CTGCACGAAG CACAGTGACT CCCCG 25(2)SEQ ID NO5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由糖基化酶介导裂解产生并具有一个
3′羟基的DNA″(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)SEQ ID NO5的序列描述CTGCACGAAG CACAGTGACT CCCCG 25(2)SEQ ID NO6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度93个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由糖基化酶介导裂解接着由上游片段延伸产生的DNA″(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无
(ⅹⅰ)SEQ ID NO6的序列描述CTGCACGAAG CACAGTGACT CCCCGTACTT GATCTCAGGGGGGCCCATGC CCTCCACATC 60CCGCTTGGGG GCCACATCCA GCTTCTCCTT GGA 93(2)SEQ ID NO7的资料(ⅰ)序列特征(A)长度273个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅵ)原始来源(F)组织类型骨骼肌(ⅹⅰ)SEQ ID NO7的序列描述
TCCAAGGAGA AGCTGGATGT GGCCCCCAAG CGGGATGTGGAGGGCATGGG CCCCCCTGAG 60ATCAAGTACG GGGAGTCACT GTGCTTCGTG CAGCATGTGGCCTCAGGACT GTGGCTCACC120TATGCCGCTC CAGACCCCAA GGCCCTGCGG CTCGGCGTGCTCAAGAAGAA GGCCATGCTG180CACCAGGAGG GCCACATGGA CGACGCACTG TCGCTGACCCGCTGCCAGCA GGAGGAGTCC240CAGGCCGCCC GCATGATCCA CAGCACCAAT GGC 273(2)SEQ ID NO8的资料(ⅰ)序列特征(A)长度273个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅵ)原始来源(F)组织类型骨骼肌
(ⅹⅰ)SEQ ID NO8的序列描述TCCAAGGAGA AGCTGGATGT GGCCCCCAAG CGGGATGTGGAGGGCATGGG CCCCCCTGAG 60ATCAAGTACA GGGAGTCACT GTGCTTCGTG CAGCATGTGGCCTCAGGACT GTGGCTCACC120TATGCCGCTC CAGACCCCAA GGCCCTGCGG CTCGGCGTGCTCAAGAAGAA GGCCATGCTG180CACCAGGAGG GCCACATGGA CGACGCACTG TCGCTGACCCGCTGCCAGCA GGAGGAGTCC240CAGGCCGCCC GCATGATCCA CAGCACCAAT GGC 273(2)SEQ ID NO9的资料(ⅰ)序列特征(A)长度196个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由糖基化酶介导裂解接着由上游片段延伸产生的DNA，该DNA具有3′氢原子″
(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅸ)特征(A)名称／关键词修饰碱基(B)位置196(D)其它资料／修饰碱基=其它／Note=″双脱氧T″(ⅹⅰ)SEQ ID NO9的序列描述GCCATTGGTG CTGTGGATCA TGCGGGCGGC CTGGGACTCCTCCTGCTGGC AGCGGGTCAG 60CGACAGTGCG TCGTCCATGT GGCCCTCCTG GTGCAGCATGGCCTTCTTCT TGAGCACGCC120GAGCCGCAGG GCCTTGGGGT CTGGAGCGGC ATAGGTGAGCCACAGTCCTG AGGCCACATG180CTGCACGAAG CACAGT196(2)SEQ ID NO10的资料(ⅰ)序列特征
(A)长度200个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由糖基化酶介导裂解接着由上游片段延伸产生的DNA，该DNA具有3′氢原子″(ⅲ)假设无(ⅸ)特征(A)名称／关键词修饰碱基(B)位置200(D)其它资料／修饰碱基=其它／NOte=″双脱氧T″(ⅹⅰ)SEQ ID NO10的序列描述GCCATTGGTG CTGTGGATCA TGCGGGCGGC CTGGGACTCCTCCTGCTGGC AGCGGGTCAG 60CGACAGTGCG TCGTCCATGT GGCCCTCCTG GTGCAGCATGGCCTTCTTCT TGAGCACGCC120GAGCCGCAGG GCCTTGGGGT CTGGAGCGGC ATAGGTGAGCCACAGTCCTG AGGCCACATG180
CTGCACGAAG CACAGTGACT200(2)SEQ ID NO11的资料(ⅰ)序列特征(A)长度204个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由糖基化酶介导裂解接着由上游片段延伸产生的DNA，该DNA具有3′氢原子″(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅸ)特征(A)名称／关键词修饰碱基(B)位置204(D)其它资料／NOte=″双脱氧T″(ⅹⅰ)SEQ ID NO11的序列描述GCCATTGGTG CTGTGGATCA TGCGGGCGGC CTGGGACTCCTCCTGCTGGC AGCGGGTCAG 60CGACAGTGCG TCGTCCATGT GGCCCTCCTG GTGCAGCATGGCCTTCTTCT TGAGCACGCC120GAGCCGCAGG GCCTTGGGGT CTGGAGCGGC ATAGGTGAGCCACAGTCCTG AGGCCACATG180CTGCACGAAG CACAGTGACT CCCT 204(2)SEQ ID NO12的资料(ⅰ)序列特征(A)长度206个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由糖基化酶介导裂解接着由上游片段延伸产生的DNA，该DNA具有3′氢原子″(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅸ)特征(A)名称／关键词修饰碱基(B)位置206
(D)其它资料／NOte=″双脱氧T″(ⅹⅰ)SEQ ID NO12的序列描述GCCATTGGTG CTGTGGATCA TGCGGGCGGC CTGGGACTCCTCCTGCTGGC AGCGGGTCAG 60CGACAGTGCG TCGTCCATGT GGCCCTCCTG GTGCAGCATGGCCTTCTTCT TGAGCACGCC120GAGCCGCAGG GCCTTGGGGT CTGGAGCGGC ATAGGTGAGCCACAGTCCTG AGGCCACATG180CTGCACGAAG CACAGTGACT CCCCGT 206(2)SEQ ID NO13的资料(ⅰ)序列特征(A)长度209个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由糖基化酶介导裂解接着由上游片段延伸产生的DNA，该DNA具有3′氢原子″(ⅲ)假设无
(ⅳ)反义无(ⅸ)特征(A)名称／关键词修饰碱基(B)位置209(D)其它资料／修饰碱基=其它／NOte=″双脱氧T″(ⅹⅰ)SEQ ID NO13的序列描述GCCATTGGTG CTGTGGATCA TGCGGGCGGC CTGGGACTCCTCCTGCTGGC AGCGGGTCAG 60CGACAGTGCG TCGTCCATGT GGCCCTCCTG GTGCAGCATGGCCTTCTTCT TGAGCACGCC120GAGCCGCAGG GCCTTGGGGT CTGGAGCGGC ATAGGTGAGCCACAGTCCTG AGGCCACATG180CTGCACGAAG CACAGTGACT CCCCGTACT 209(2)SEQ ID NO14的资料(ⅰ)序列特征(A)长度204个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由糖基化酶介导裂解接着由上游片段延伸产生的DNA，该DNA具有3′氢原子″(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅸ)特征(A)名称／关键词修饰碱基(B)位置204(D)其它资料／修饰碱基=其它／NOte=″双脱氧C″(ⅹⅰ)SEQ ID NO14的序列描述GCCATTGGTG CTGTGGATCA TGCGGGCGGC CTGGGACTCCTCCTGCTGGC AGCGGGTCAG 60CGACAGTGCG TCGTCCATGT GGCCCTCCTG GTGCAGCATGGCCTTCTTCT TGAGCACGCC120GAGCCGCAGG GCCTTGGGGT CTGGAGCGGC ATAGGTGAGCCACAGTCCTG AGGCCACATG180CTGCACGAAG CACAGTGACT CCCC 204
(2)SEQ ID NO15的资料(ⅰ)序列特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅵ)原始来源(A)生物体人(ⅹⅰ)SEQ ID NO15的序列描述AACTTGTGGT AGTTGGAGCT GGTGGCGTAG GCAAGAGTGCCTTGACGATA CAGC 54(2)SEQ ID NO16的资料(ⅰ)序列特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸
(A)描述／desc=″由基因组DNA的PCR扩增产生的″(ⅹⅰ)SEQ ID NO16的序列描述AACTTGTGGT AGTTGGAGCT GGUGGCGUAG GCAAGAGUGCCUUGACGAUA CAGC 54(2)SEQ ID NO17的资料(ⅰ)序列特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由基因组DNA的PCR扩增产生的″(ⅹⅰ)SEQ ID NO17的序列描述GCTGTATCGT CAAGGCACTC TTGCCTACGC CACCAGCUCCAACUACCACA AGUU 54(2)SEQ ID NO18的资料
(ⅰ)序列特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由基因组DNA的PCR扩增产生的″(ⅹⅰ)SEQ ID NO18的序列描述AACTTGTGGT AGTTGGAGCT GAUGGCGUAG GCAAGAGUGCCUUGACGAUA CAGC 54(2)SEQ ID NO19的资料(ⅰ)序列特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由PCR扩增产生的″
(ⅹⅰ)SEQ ID NO19的序列描述GCTGTATCGT CAAGGCACTC TTGCCTACGC CAUCAGCUCCAACUACCACA AGUU 54(2)SEQ ID NO20的资料(ⅰ)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由经PCR扩增的DNA的糖基化酶介导裂解产生的″(ⅹⅰ)SEQ ID NO20的序列描述GCTGTATCGT CAAGGCACTC TTGCCTACGC CACCAGC 37(2)SEQ ID NO21的资料(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由经PCR扩增的DNA的糖基化酶介导裂解产生的″(ⅹⅰ)SEQ ID NO21的序列描述GCTGTATCGT CAAGGCACTC TTGCCTACGC CA 32(2)SEQ ID NO22的资料(ⅰ)序列特征(A)长度66个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″合成的寡核苷酸″(ⅹⅰ)SEQ ID NO22的序列描述
GCTGTAAACG ACGGCCAGTT TCATGCAGGG CTGGAGTCGTAGGCAAGAGT GCCTTGACGA 60TACAGC66(2)SEQ ID NO23的资料(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″合成的寡核苷酸″(ⅹⅰ)SEQ ID NO23的序列描述GCTGTAAACG ACGGCCAGTT TCAT24(2)SEQ ID NO24的资料(ⅰ)序列特征(A)长度66个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由引物延伸产生的″(ⅹⅰ)SEQ ID NO24的序列描述GCTGTATCGT CAAGGCACTC TTGCCTACGC CACCAGCCCTGCATGAAACT GGCCGTCGTT 60TACAGC66(2)SEQ ID NO25的资料(ⅰ)序列特征(A)长度66个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″合成的寡核苷酸″(ⅹⅰ)SEQ ID NO25的序列描述
GCTGTAAACG ACGGCCAGTT TCATGCAGGA TCCATGGCGTAGGCAAGAGT GCCTTGACGA 60TACAGC66(2)SEQ ID NO26的资料(ⅰ)序列特征(A)长度66个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由引物延伸产生的″(ⅹⅰ)SEQ ID NO26的序列描述GCTGTATCGT CAAGGCACTC TTGCCTACGC CATGGATCCTGCATGAAACT GGCCGTCGTT 60TACAGC66(2)SEQ ID NO27的资料(ⅰ)序列特征
(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″合成的寡核苷酸″(ⅹⅰ)SEQ ID NO27的序列描述GGTAGTTGGA GCTGGTGGCG 20(2)SEQ ID NO28的资料(ⅰ)序列特征(A)长度10个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″合成的寡核苷酸″(ⅹⅰ)SEQ ID NO28的序列描述TCCAACTACC10(2)SEQ ID NO29的资料(ⅰ)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″由两个DNA分子的连接产生的″(ⅹⅰ)SEQ ID NO29的序列描述GCTGTATCGT CAAGGCACTC TTGCCTACGC CACCAGCTCCAACTACC 47(2)SEQ ID NO30的资料(ⅰ)序列特征(A)长度10个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形
(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″合成的寡核苷酸″(ⅹⅰ)SEQ ID NO30的序列描述CCAGCTCCAA10(2)SEQ ID NO31的资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／desc=″合成的寡核苷酸″(ⅹⅰ)SEQ ID NO31的序列描述TTGGAGCTGG TGGCGTAGGC 20(2)SEQ ID NO32的资料
(ⅰ)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型其它核酸(A)描述／dese=″由两个DNA分子的连接产生的″(ⅹⅰ)SEQ ID NO32的序列描述GCTGTATCGT CAAGGCACTC TTGCCTACGC CACCAGCTCC AA4权利要求
1．鉴定核酸分子的方法，所述方法包括下列步骤ⅰ)将可用作DNA糖基化酶之底物的经修饰碱基导入DNA分子；ⅱ)利用所述DNA糖基化酶切下经修饰的碱基以产生脱碱基位点；ⅲ)裂解脱碱基位点处的DNA以产生可被延伸的上游DNA片断；和ⅳ)在可使片断延伸的酶和模板核酸的存在下保温可延伸上游片断并分析所得片断。
2．权利要求1的方法，其中通过在脱碱基位点的5’方向裂解DNA产生上游片断，使得上游片断的3’末端携有羟基。
3．权利要求2的方法，其中用5’AP内切核酸酶进行裂解。
4．权利要求1的方法，其中通过裂解脱碱基位点5’方向，留下上游片断3’末端的磷酸基团并除去磷酸基团而产生上游片断，使得上游片断的3’末端携有羟基。
5．权利要求1的方法，其中通过裂解脱碱基位点3’方向，在上游片断3’末端产生脱氧核糖磷酸基团，随后除去脱氧核糖基团而产生上游片断，使得上游片断的3’末端留下羟基。
6．上述任一权利要求的方法，其中除去了位于上游片断3’末端下游的5’脱氧核糖组成成分，使得上游片断可在模板上延伸。
7．权利要求6的方法，其中通过5’脱氧核糖磷酸二酯酶除去5’脱氧核糖组成成分。
8．上述任一权利要求的方法，其中通过酶促扩增DNA导入经修饰的碱基。
9．权利要求8的方法，其中通过分离扩增链以分开分析各个链。
10．权利要求8或9的方法，其中标记了参与酶促扩增的引物或一个或多个核苷酸。
11．上述任一权利要求的方法，其中酶是聚合酶。
12．权利要求11的方法，其中在一个或多个核苷酸的存在下将可延伸的上游片断与聚合酶保温。
13．权利要求12的方法，其中步骤ⅳ)中的一个或多个核苷酸是双脱氧核苷酸。
14．权利要求12或13的方法，其中步骤ⅳ)中的一个或多个核苷酸被标记。
15．权利要求11-14中任一项的方法，其中通过使用所述可延伸的DNA片断进行扩增反应可实现步骤ⅳ)中的延伸。
16．权利要求11-15中任一项的方法，其中通过使用所述可延伸的DNA片断和引物进行扩增反应可实现步骤ⅳ)中的延伸。
17．权利要求1-10中任一项的方法，其中酶是连接酶。
18．权利要求17的方法，其中在报道寡核苷酸的存在下将可延伸的上游片断与连接酶保温。
19．权利要求18的方法，其中报道寡核苷酸是部分简并的。
20．上述任一权利要求的方法，其中通过杂交检测步骤ⅳ)中所产生的任何可延伸片断。
21．上述任一权利要求的方法可用于检测已知或未知的突变。
22．权利要求1的方法可用于基本上按上文所述鉴定核酸分子。
23．权利要求1-20中任一项的方法，其中该方法可通过检测DNA中C至T的转换来分析DNA的CpG含量。
24．权利要求1的方法可用于基本上按上文所述鉴定核酸分子。
全文摘要
鉴定核酸分子的方法,其包括步骤i)将可用作DNA糖基化酶之底物的经修饰碱基导入DNA分子;ii)利用所述的DNA糖基化酶切下经修饰的碱基以产生脱碱基位点:iii)裂解脱碱基位点处的DNA以产生可被延伸的上游DNA片断;和iv)在可使片断延伸的酶,如聚合酶或连接酶和模板核酸的存在下保温可延伸的上游片断并分析所得的片断。本发明使用上述可延伸的上游DNA片断提供了新的,多用途的和简单的方法,所述方法可以鉴定核酸并且具有优于现存方法的优点。本发明方法的最重要用途之一(但不是唯一的用途)是扫描或检查DNA片断(靶核酸)中是否存在突变。
文档编号C12N15/09GK1291240SQ98813981
公开日2001年4月11日 申请日期1998年4月22日 优先权日1998年4月22日
发明者托马斯·瓦伦丁·麦卡锡, 帕特里克·马丁·沃恩 申请人:爱尔兰公司(爱尔兰生物研究), 爱尔兰科克国立大学科克学院