专利名称：根据人呼吸道胰蛋白酶基因多态性分析体质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种方法，通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性，预测对某些特定疾病发病易感的体质，预测治疗方法对患有这类疾病病人的疗效，或者预测治疗的预后。
背景技术：
最近，有关基因的研究不仅在由于单个基因的缺失或突变引起的遗传疾病方面取得了进展，而且在由牵涉到几个遗传诱因和环境因子引起的多因素疾病方面也取得了进展。因此，缺失或点突变和与多因素疾病有关的同种型，以及不影响实际氨基酸翻译序列的遗传成分(内含子或启动子)的进一步突变，已被考虑是这类疾病的危险因素。
发明效果对骨密度与维生素D受体内含子的基因多态性之间相互关系的认识，作为骨病领域内的现有技术已被发表(Morvison.N.A等，自然，367284-287，1994)。对于循环器官已报道，血管紧张肽转化酶的I型(插入型)和D型(缺失型)基因多态性与心肌梗塞的发作相关联(Cambien.F等，自然359641-644，1992)，血管紧张素原的M235T氨基酸取代，以及G-6A启动子区的多态性与原发性高血压的发病相关联(Inoue I等，临床诊应杂志，991786-1797，1997)。而且，在神经系统方面已报道痴呆症的发病与apoE蛋白的同种型之间有关联。在癌症相关的领域，对于谷胱甘肽S-转移酶的基因多态性与癌症发病之间的关系已进行了许多研究。对于呼吸系统疾病，已报导哮喘的发作或病理状态与血管紧张肽转化酶的基因多态性有关(Benessiano，J等，变态反应与临床免疫学杂志99)1(53-57，1997)。
而且，注意力已投向作为不同病人对治疗药物敏感性差异原因之一的遗传背景，并且甚至希望通过医学部位提供定向性，例如借助于对基因多态性的诊断，根据单个病人对药物的敏感性选择治疗方法。有人认为，根据基因多态性，通过选择可预期药物效果的病人组，在药物开发研究的临床试验中是有效的(Kleyz K.W.等，科学，2811820-1821，1998)。有关血管紧张肽转化酶〔ACE(血管紧张肽转化酶)〕内含子的基因多态性和ACE抑制剂作用的效果(Yoshide，H.等，临床研究杂志，962162-2161，1995)，以及有关β2-肾上腺素能受体的基因多态性和β-激动剂对哮喘作用的报告(Liggert.S.B.Am.J.Respir.Crit.Care Med.156.(4Pt2)S 156-162，1997)等，已被引证作为有关药物敏感性和基因多态性的常规性报告。
另一方面，已经从患有慢性呼吸道疾病的病人痰中纯化出与本发明有关的人呼吸道胰蛋白酶样酶(日本来审定专利出版物No.7-067640和Yasuoka，S.等美国呼吸道细胞分子生物学杂志16300-308，1997)，并且已经将它的氨基酸序列和cDNA序列弄清楚(日本未审定专利出版物No.8-89246和Yameoke，K.等，生物化学杂志，273(19)11895-11901，1998)。对于这种酶所具有的活性，已在体外进行了一些研究。因为这种酶对某些细胞因子的产生具有促进作用，例如对从包括与粘液纤毛运动有关的人支气管上皮细胞系产生的IL-8或GM-CSF有促进作用，所以考虑此酶可能与呼吸道炎症病理状态相关联(Terao，Norike等，日本呼吸学协会，1998)。因为此酶具有例如对血纤维蛋白原水解的酶性，以及对血纤维蛋白溶酶原激活剂(尿液酶前体)的激活作用(Yoshinaga，Junko等，关于在病理生理学及治疗中的蛋白酶和抑制剂的学术会议，1998)，所以设想此酶可能通过在呼吸道粘膜表面形成血纤维蛋白，或者在慢性呼吸道疾病中修复其病理状态而具有抗炎症作用，并且还考虑此酶可能与癌症转移有关等等。对于此酶在体内与生理功能或病理状态的关系还没有被充分阐明，并且关于基因，对于没有相应于实际被翻译的氨基酸序列的基因成分(内含子或启动子)还完全不了解。另外，关于人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性是否存在与疾病的关系，或者基因多态性与疾病的关系，迄今尚未进行过研究。
另外，借助于基因分析，通过对疾病相关体质的预测，可以提供关于预测特殊疾病发作，治疗预后，适当治疗和给药方法的选择等等的许多信息。因此，许多医生和病人都希望进行这种预测，并且可能进一步预防疾病的发作和及早治疗。所以有人认为，这种预测与降低对于今后的医疗护理成为必不可少的医疗护理费用有关。
但是，要找出与疾病有关的基因，并建立对它的分析方法是非常困难的，并且如上面所述，几乎没有可用于识别与疾病关系的基因分析法的实例。因此，强烈地希望发展基因分析技术，用于使多种疾病相关的体质成为可预测的。
另一方面，目前尚未阐明人呼吸道胰蛋白酶样酶与什么疾病有关。
发明内容
作为考虑到现有技术存在的问题而进行深入研究的结果，本发明者设计了一个引物，用于基因扩增在人呼吸道中特异表达的人呼吸道胰蛋白酶样酶基因组上的内含子成分，新确定了所扩增基因片段的末端和在外显子/内含子边缘部分新确定DNA序列的DNA序列，发现在扩增的基因片段和新确定的DNA序列中存在基因多态性，并且还进一步通过分析基因多态性，首先发现人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因型与各个病人的疾病有关，从而获得了本发明。
也就是说，本发明的目的是提供一种方法，用于通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性，预测对特殊疾病发病易感人的体质，或者预测治疗对病人的效果或治疗的预后。
进而本发明是一种用于通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性，来诊断粘液纤毛生物防御系统中异常性的方法，以及一种用于预测对某些疾病发病易感个人的体质，预测治疗对病人的效果或治疗预后的方法。
而且，本发明是一种含有人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子的部分或全部碱基序列的基因片段。
附图简述
图1显示含有一个基因内含子区的DNA片段琼脂糖凝胶电泳图谱，此基因是由基因扩增获得，它编码人呼吸道胰蛋白酶样酶的成熟蛋白质。可观察到，泳道1和5是标志物(从上面开始是10kb，7kb，5kb，4kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb和1kb)，泳道2是由引物A1(序列号7)和A2(序列号8)扩增的约6kb的DNA片段，泳道3是由引物B1(序列号9)和B2(序列号10)扩增的约1.5kb的DNA片段，以及泳道4是由引物C1(序列号11)和C2(序列号12)扩增的约3.4kb DNA片段。
图2显示含有一个基因内含子区的DNA片段琼脂糖凝胶电泳图谱，此基因是由基因扩增获得，它编码人呼吸道胰蛋白酶样酶的前体肽。可观察到，泳道1和4是标志物(从上面开始是10kb，7kb，5kb，4kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb和1kb)，泳道2是由引物D1(序列号13)和D2(序列号14)扩增的大约5.5kb的DNA片段，泳道3是由引物E1(序列号15)和E2(序列号16)扩增的大约5kb的DNA片段。
图3图解说明在人呼吸道胰蛋白酶样酶基因组上内含子A，B和C的相对位置，并显示由TaqI检测的内含子A，以及由MboI和BstUI检测的内含子C的基因多态性(RFLP)的琼脂糖凝胶电泳图谱。
实施本发明的最佳方式根据本发明，在此提供了一种方法，用于预测个人体质与特定疾病的关系，并提供了一个基因片段或DNA序列，用于对其进行基因分析。
将属于慢性阻塞性肺病(COPD)或粘液纤毛生物防御系统异常的呼吸系统疾病，肺癌，特别是肺气肿(PE)，鼻窦支气管综合征，弥散性全细支气管炎(diffuse panbronchiolitis，DPB)和支气管扩张(BE)，作为特定疾病的例证，用于通过本发明的方法判断对特定疾病发病易感的体质，对它的治疗效果或治疗预后作出预测性判断。
本发明将分析由检测一个或几个碱基突变分类的基因型和分析由检测一个或几个碱基突变分类的单倍型(haplotype)，作为分析人呼吸道胰蛋白酶样酶基因多态性的方法。
例如分析呼吸道胰蛋白酶样酶基因多态性的方法，是通过分析根据用限制性酶切割的限制性片段长度的多态性(RFLP)来实现。本发明对基因多态性的分析方法，甚至包括对通过应用人呼吸道胰蛋白酶样酶cDNA序列的DNA杂交可检测的基因多态性的分析方法。也就是说，此方法包括应用能够检测本发明公开的基因多态性的限制性酶切割基因组DNA，然后进行凝胶电泳，并转移至硝酸纤维素膜等材料上，随之用人呼吸道胰蛋白酶样酶cDNA作探针，分析人呼吸道胰蛋白酶样酶基因组的切割图谱。甚至可以借助于PCR，通过扩增DNA片段的方法进行分析，以便可包括基因多态性的部位，然后将此扩增的DNA片段转化成单链，并通过不同的电泳迁移率〔PCR-单链构象多态性(SSCP)〕等方法分析所形成的单链。而且，许多方法例如，错配PCR法，应用等位基因特异性寡核苷酸的PCR-等位基因特异性寡(ASO)法，通过应用寡探针实施退火而进行判断的方法，或者用于直接测定基因多态性部位碱基序列的精确定位测序法，都可被引证作为实施检测多态性可能部位的方法，并且甚至可以通过应用DNA芯片，将对基因多态性的分析方法应用于基因诊断。
内含子可被用作对基因多态性进行分析的部位，并且可将如下基因片段作为分析特定基因多态性部位的例证(a)一种基因片段，它含有可用由序列号7和序列号8表示的引物扩增的内含子区，(b)一种基因片段，它含有可用由序列号9和序列号10表示的引物扩增的内含子区，(c)一种基因片段，它含有可用由序列号11和序列号12表示的引物扩增的内含子区，(d)一种基因片段，它含有可用由序列号13和序列号14表示的引物扩增的内含子区，(e)一种基因片段，它含有可用由序列号15和序列号16表示的引物扩增的内含子区，(f)一种基因片段，它含有可用由序列号11和序列号12表示的引物扩增的内含子C，以及(g)一种基因片段，它含有可用由序列号7和序列号8表示的引物扩增的内含子A。
内含子C中的一个基因片段被例证作为分析基因多态性的部位，此片段含有在此可由限制性酶BstUI，MboI，MseI或FbaI识别的一个序列部分。在内含子A中的一部分也被例证作为分析基因多态性的部位，此部分含有可由限制性酶MboI，TagI或AfaI识别的一个序列部分，含有由序列号17表示的一个基因多态性部位，或者含有一个或几个它们的组合。基因型或单倍型的分类是通过分析这些部位来判断。
而且，本发明是一种含有人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子的部分或全部碱基的基因片段，如下基因片段被特别作为例证(a)一种基因片段，它含有可用由序列号7和序列号8表示的引物扩增的内含子区，(b)一种基因片段，它含有可用由序列号9和序列号10表示的引物扩增的内含子区，(c)一种基因片段，它含有可用由序列号11和序列号12表示的引物扩增的内含子区，(d)一种基因片段，它含有可用由序列号13和序列号14表示的引物扩增的内含子区，(e)一种基因片段，它含有可用由序列号15和序列号16表示的引物扩增的内含子区，(f)一种含有人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子的基因片段，包含由序列号1-序列号6所表示的碱基序列，或者是夹在这些碱基序列之间的基因片段，以及(g)人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子C的基因片段，包括由序列号17表示的碱基序列。
实施例下面将通过实施例对本发明作详细地说明，条件是不打算以这些实施例作为对本发明方法的限制，此方法是通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性来预测疾病相关的体质。
〔标准操作方法〕下面将阐述可用于本发明的，标准的DNA提取操作，基因扩增操作，限制性酶切操作和电泳操作。
(a)标准的DNA提取操作对用于本发明基因扩增的生物样品没有什么特殊限制，但是，血液细胞成分是适合的，因为此标本容易获得，其DNA容易提取。
1．将0.5ml全血(用2Na-EDTA抗凝)置于具有1.5ml容量的微量离心管中。
2．向此离心管内加入0.5ml溶剂，并轻轻拍打离心管几次。然后使离心管上下转动，使液体混匀。
(按照上面的步骤进行如下的混匀操作)
溶剂实例1×SSC此溶剂的制备通过10倍稀释用1升中含有175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠的10N NaOH调节至pH 7.0的20×SSC。
3．将此混合物离心(在4℃，10000g离心20秒钟)，然后小心移去上清液，而不要取出暗色的沉淀。
4．加入1ml溶剂，搅拌此混合物。
5．离心此混合物(在4℃，10000g，20秒钟)，然后移去上清液。
6．再重复一次步骤4和5。
7．加入酶反应液200μl和蛋白水解酶10μl并立即混匀。
酶反应液的实例0.04M DTT(二硫苏糖醇)与0.2M NaOAc(醋酸钠)和0.4％SDS的混合液。
蛋白水解酶液的实例10mg/ml的蛋白酶(蛋白酶K)8．在37℃将此混合液温育1小时(在温育过程中将混合液轻轻振摇混合2-3次)。
9．加入碘化纳溶液300ml，立即混匀。
10．加入异丙醇0.5ml，混匀直至可清晰地看到白色的线状DNA。
11．离心所形成的混合物(在室温下，10000g 10分钟)，然后缓慢地移去上清液。可通过将离心管倒置在滤纸上等方法，充分地除去遗留在管壁上的溶液。
12．加入1ml漂洗液(A)并立即混匀。充分地搅拌此混合液，以便能剥离管壁上的沉淀。
漂洗液(A)的实例70％乙醇。
13．将所形成的混合液离心(在室温下，10000g，5分钟)，然后移去上清液。
14．加入1ml漂洗液(B)，充分搅拌所形成的混合物，以便剥离管壁上的溶液。
漂洗液(B)的实例80％乙醇15．离心此混合物(在室温下，10000g，5分钟)，然后移去上清液。
16．将DNA沉淀作轻度真空干燥(干燥时间在3分钟之内，因为当过分使沉淀干燥时会使DNA不能充分溶解)。
(a)标准的基因扩增操作虽然已知有几种关于基因扩增法的原理，但是，在此将描述聚合酶链式反应法(PCR法)作为标准的方法。
反应液的组成50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH9.0，25℃)，0.1％Triton X-100，15mM MgCl2，2mM dNTPs，15μM正向引物，15μM反向引物，1mg/L基因组DNA，以及1单位Taq DNA聚合酶，总体积50μl。
反应循环在94℃1分钟，64℃1分钟和72℃1分钟作为一次循环。反应进行40次循环。
所用的引物是如下的C1(35个碱基)和C2(35个碱基)C15’-GGAGC CATCT TGTCT GGAAT GCTGT GTGCT GGAGT-3’C25’-CACAA TAAAC CAAAG CCGCC GTGAG TCTTC TTGTA-3’(c)标准的限制性酶切割操作用于MboI的反应液的组成10mM Tris-HCl(pH 7.4)，10mMMgCl2，100mM NaCl，10mM KCl，1mM DTT，和100μg/ml BSA(牛血清白蛋白)。
以每20μl反应液10单位的浓度加入MboI，在37℃温育3小时。
(b)标准的电泳操作用于电泳的缓冲液是0.5×TBE，但必须是5×TBE在1升中含有54g Tris碱，27.5g硼酸和1mM EDTA，并被调节至pH8.0。通过应用1％或3％琼脂糖凝胶〔应用Seakem GTA琼脂糖(FMC BioProducts)〕(含有溴化乙锭0.5μl/ml)，在电压100V进行电泳30分钟。然后用UV灯观测DNA电泳带。
〔实施例1〕获得含有人呼吸道胰蛋白酶样酶基因组上内含子的DNA片段并分析其碱基序列为了寻找人呼吸道成熟的胰蛋白酶样酶基因组上的内含子部位，参照几种胰蛋白酶相似酶的基因组外显子和内含子的组成，制备了几个引物，以便扩增人基因组DNA。通过引物A1(序列号7)和A2(序列号8)扩增了一个约6Kb的DNA片段(基因片段)，通过引物B1(序列号9)和B2(序列号10)扩增了一个约1.5Kb的DNA片段，通过引物C1(序列号11)和C2(序列号12)扩增了一个约3.4Kb的DNA片段。(图1)从凝胶上切取DNA片段并纯化，将各个片段插入TA克隆载体(由Invitrogen公司制备)。对其几个克隆测定了此插入DNA二侧(5’-端和3’-端)的碱基序列，发现存在与此引物序列邻接的人呼吸道胰蛋白酶样酶的cDNA序列，共有序列被发现在外显子-内含子5’-端和3’-端二侧边缘区与它邻接的序列，并且扩增的DNA片段是含有人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子区的DNA片段。
在编码人呼吸道胰蛋白酶-样酶成熟蛋白的基因区内，本发明已弄清楚的内含子序列，从5’侧开始，分别被称为内含子A，内含子B和内含子C(图3)。在已弄清楚的各个内含子的5’端和3’-端，其碱基序列由序列号1，2，3，4，5和6表示。至于内含子C，其整个碱基序列由序列号17表示。
另一方面为了进行基因扩增，对编码人呼吸道胰蛋白酶样酶前体肽的区域制备了几个引物。因此，显然约5.5Kb的DNA片段是由引物D1(序列号13)和D2(序列号14)扩增的，约5Kb的DNA片段是由引物E1(序列号15)和E2(序列号16)扩增的(图2)。认为这些基因片段含有这些内含子。
〔实施例2〕分析人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子的基因多态性为了研究在内含子A，B和C中是否存在基因多态性，从23个正常人的全血中提取了基因组DNA(按标准的操作方法)，并分别进行扩增，按照PCR法，用引物A1和A2扩增内含子A，用引物B1和B2扩增内含子B，以及用引用C1和C2扩增内含子C，以便用多种限制性酶比较其切割图谱。结果发现，在内含子A中，用限制性酶MboI，TaqI和AfaI观测到基因多态性。
相反，用限制性酶Tsp509I，AluI，NlaIII，MspI，BstUI，BfaI，HinPI，HaeIII，HindIII，SspI，PstI，EcoRI，SaII和EcoRV未观测到基因多态性。
在内含子B，用如下限制性酶都未观察到基因多态性Tsp509I，AluI，NlaIII，MspI，BstUI，BfaI，HinPI，HaeIII，MboI，AfaI，TaqI，MseI，ClaI，NsiI，EeoT14I，NdeI，PmlI，ApaLI，ApaI，KpnI，BsmI，HindIII，SspI和EcoRV。
在内含子C，发现用限制性酶MboI，BstUI，MseI和FbaI观测到基因多态性。相反，用下列限制性酶都未观测到基因多态性AluI，NlaIII，MspI，BfaI，HinPI，HaeIII，AfaI，TaqI，HindIII，SspI，Bg1II，EeoT14I，PvuII，PvuI，EcoRI，BamHI，EcoRV和KpnI。
当用MboI或BstUI切割含有内含子C的DNA片段时(此内含子是通过用C1和C2组合引物扩增的)用MboI的切割实验揭示，根据电泳，一条电泳带出现在1.3Kb时可被判断为基因型MM，一条电泳带出现在1.05Kb时可被判断为基因型mm，以及二条电泳带同时出现在1.3Kb和1.05Kb时可被判断为基因型Mm。另一方面，在用BstUI的情况下，一条电泳带出现在3.4Kb时可被判断为BB，二条电泳带同时出现在2.45Kb和0.95Kb时可被判断为bb以及三条电泳带同时出现时可被判断为Bb。
图3显示出通过TaqI检测的内含子A，以及通过MboI和BstUI检测的内含子C的基因多态性电泳图谱。而且，对内含子C测定了bm单倍型的全部碱基序列，此内含子C是来自从一例bbmm型正常人基因组通过PCR获得的DNA片段。(序列号17)。序列中用空心箭头指示出内含子C的碱基序列中通过BstUI和MboI检测的基因多态性部位。
对一例患有BBmm型BE病人的碱基序列测定发现，用BstUI不能切割Bm单倍型BstUI基因多态性部位的碱基序列，因为CGCG被转变成了ACCG。
〔实施例3〕通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的内含子基因多态性来分析疾病相关性体质关于统计学分析，应用统计分析软件Stat View 4.02(AbacusConcepts公司)，按照X-平方测定进行分析。
实施3-1通过基因型分类分析疾病相关的体质在实施例2公开的基因型中，研究了是否可以对内含子C中以MboI或BstUI检测的基因多态性，进行与人呼吸道胰蛋白酶样酶相关疾病的分类。被选作研究对象的疾病是弥散性全细支气管炎(DPB)，支气管扩张(BE)，肺气肿(PE)，以及支气管哮喘(BA)等呼吸系疾病。
通过选择106名正常人，29名弥散性全细支气管炎病人，38名支气管扩张病人，22名肺气肿病人，以及32名支气管哮喘病人，按照标准的操作方法，对每个人的基因型进行了判断。用MboI或BstUI作限制性酶。
每种基因型出现的人数和出现的频率，以及每种等位基因型的出现数目和出现频率显示在表1和表2中。表1 BstUI基因型 表2 MboI基因型 表1和表2显示，通过对上述基因型的判断，BB型的出现频率表现出较高的DPB，BE和PE可能性。也就是说，可以判定，拥有这些基因型的个人具有对DPB，BE和PE易感性体质。而且，当根据慢性阻塞性肺病(COPO)的分类，将DPB，BE和PE收集到患有这三种呼吸系疾病的病人组中时，得到了如下的结果BB型的出现频率统计学显著地高于正常人的出现频率(X-平方P值=0.04，X-平方值=4.2)。 列联表分析统计量三种疾病，BB／非BB 实施例3-2通过单倍型分类分析疾病相关的体质单倍型的出现频率对于106名正常人，29名弥散性全细支气管炎(DPB)病人，38名支气管扩张(BE)病人，22名肺气肿(PE)病人，和32名支气管哮喘(BA)病人，根据BstUI和MboI的二个基因多态性的组合，将单倍型出现的人数和出现的频率显示在下面的表中。作为对238人的研究结果，此表暗示，在日本人中几乎不存在bM单倍型，由于没有任何人具有Bb-MM，bb-MM和bb-Mm基因型。出现的人数(人) 出现的频率(％) 对于下面的分析，用统计学技术(X-平方法)可加快分析与呼吸系疾病的关联，假设日本人呼吸道基因单倍型的人胰蛋白酶样酶是BM，Bm和bm三种(当出现数是5以上时，将此X-平方P值用作随后P值(the following P Values)，并且在2×2表的情况下，包括4以下出现数的格式，将Fisher’s直接法P值表示为随后P值)．等位基因分类(1)对于日本人的三种单倍型进行了关于每种等位基因出现频率的研究，发现在属于COPD的三种呼吸系疾病组(DPB，BE和PE)与具有统计学显著差异的正常人(P=0.027)之间，存在出现频率分布的偏离。特别是，与正常人相比较，在属于COPD的三种呼吸系疾病组(DPB，BE和PE)中，Bm等位基因的出现频率较高。
在BE，DPB和PE中，对于每种疾病Bm等位基因的出现频率都较高。
相反，对于BA，Bm等位基因的出现频率较低。
列联表分析统计量三种疾病，等位基因 列联表分析统计量DPB，等位基因 列联表分析统计量BE，等位基因 列联表分析系数Cramer’s V值 列联表分析统计量PE，等位基因 列联表分析统计量BA，等位基因 等位基因分类(2)因为根据上面的描述，认为Bm等位基因与疾病的关联较强，所以对此基因型给予了特别的关注，分析了Bm型等位基因的数目与除了Bm型之外的等位基因数目的关系。
考虑到属于COPD的三种呼吸系疾病组(DPB，BE和PE)，当将患有此三种疾病的病人与正常人相比较时，在患有这三种呼吸系疾病的病人组，Bm等位基因的出现频率，比正常人的显著地较高，并且在分布偏离中统计学显著性差异被认可(P=0.0002)。通过上述比较显示出Bm型等位基因与属于COPD的三种呼吸系疾病(DPB，BE和PE)的发病相关联。
对于每种疾病，与正常人相比较，属于COPD的三种呼吸系疾病组(DPB，BE和PE)的任何一组都具有较高的出现频率(BEP-0．012，DPBP=0.0025，以及PEP=0.0052)。
另一方面，与正常人相比较，Bm型的出现频率显著地较低(P=0.049)。 列联表分析统计量三种疾病，Bm／非Bm 列联表分析统计量DPB，Bm／非Bm 列联表分析统计量BE，Bm／非Bm 列联表分析统计量PE，Bm／非Bm 列联表分析统计量BA，Bm／非Bm 个体分类(1)因为根据等位基因分类的分析结果，认为在三种单倍型中Bm型与这几种呼吸系疾病的关联特别深，所以特别注意到Bm型。对没有Bm型的个体，具有一个Bm型(异型)的个体，以及具有二个Bm型(同型)的个体，进行了分类和分析。
对于三种属于COPO的呼吸系疾病组(DPB，BE和PE)，基于在正常人与患有这三种呼吸系疾病的病人组比较中的Bm，观察到与单倍型分类Bm-0.1和Bm-2出现频率有关的显著分布差异(P=0.0093)。
对于每种疾病，观察到发生DPB和PE病人分布偏离的显著差异(DPBP=0.0024；和PEP=0.0069)。甚至对BE也存在可能性(P=0.089)。 列联表分析统计量三种疾病，Bm 列联表分析统计量DPB，Bm 列联表分析统计量BE，Bm 列联表分析统计量PE，Bm 个体分类(2)分析了是否具有Bm单倍型(Bm-0与Bm-1.2相比较)。
对于三种属于COPO的呼吸系疾病组(DPB，BE和PE)，将它与正常人比较时，在三种呼吸道疾病组中，具有Bm的个体出现频率较高，并观察到分布偏离的显著差异(P=0.039)．另一方面，反过来也一样，在BA中存在较多没有Bm单倍型的个体，并且注意到，当与正常人组相比较时，具有显著的分布偏离(P=0.037)。
列联表分析统计量三种疾病，Bm-0／Bm-1.2 列联表分析统计量BA，Bm-0／Bm-1.2 列联表分析统计量DPB，Bm-0／Bm-1.2 列联表分析统计量BE，Bm-0／Bm-1.2 列联表分析统计量PE，Bm-0／Bm-1.2 个体分类(3)而且，在具有作为同型的Bm单倍型(BBmm，Bm-2)的个体与没有单倍型(Bm-0.1)的个体之间，对出现频率进行了比较(Bm-0.1与Bm-2相比较)。对于三种属于COPD的呼吸系疾病组(DPB，BE和PE)，当将此三个呼吸系疾病组与正常人比较时，在具有作为同型的Bm单倍型(BBmm)的个体与没有Bm单倍型的个体之间，观察到出现频率的显著差异(P-0.021)，并且，具有Bm同型型(Bm-2)的全部6个人都受到了属于COPD的三种呼吸系疾病(DPE，BE和PE)中任何一种的侵袭。其中3个人受到DPB的侵袭，1个人受到BE的侵袭。在106名正常人和32名BA病人中，未发现具有Bm同型型(Bm-2)的人。
对于每种疾病，观察到患有DPB和PE的病人分布偏离的显著统计学差异(DPBP=0.0082，PEP=0.029)。
列联表分析统计量三种疾病，Bm-0.1／Bm-2 列联表分析统计量DPB，Bm-0．1／Bm-2 列联表分析统计量PE，Bm-0.1／Bm-2 列联表分析统计量BE，Bm-0.1／Bm-2 通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的内含子基因多态性，上述结果明确地显示，按照某种机制，Bm型单倍型与呼吸系疾病中的慢性呼吸道炎症相关联．而且还显示，在属于慢性阻塞性肺病(COPD)的三种疾病DPB，BE和PE与BA之间，人呼吸道胰蛋白酶样酶与这些疾病的关联是不同的。
因为具有某种基因多态性的个体都不会发生某些疾病，所以人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性不是例如所谓遗传病的决定性发病因素，并可确实地被认为是一个容易发病的因素。也就是说，当具有Bm单倍型的个体加上环境因素等，这些个体对呼吸系疾病如BE，PE和DPB的发病将是易感的。
从上述结果表明，通过应用人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性，可将与人呼吸道胰蛋白酶样酶相关联的疾病分类。对于人呼吸道胰蛋白酶样酶基因多态性的分析法，是一种可用于预测个人与人呼吸道胰蛋白酶样酶相关联疾病发病体质的手段，并可预测对这类疾病的治疗效果，预测其预后复发的可能性。
产业应用的可能性本发明提供了一种方法，通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性，确定个人的疾病相关性体质。因此，当借助于这种分析这类与人呼吸道胰蛋白酶样酶相关联的疾病可能鉴定时，可以设想，具有人呼吸道胰蛋白酶样酶的某种基因型的个体，对某些疾病是易感的。
也就是说，通过预测疾病发病的体质(具有对某些疾病易感性体质的个人)，可在早期阶段对个人提供关于治疗方法的信息，并且关系到早诊断和早治疗。即使在治疗之后也可估计这类疾病复发的可能性。也就是说，医生可对病人给予密切的关注，并通过预测治疗预后(对病人治疗后的医疗过程和复发的危险性)提供适当的指导。
而且，对人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性分析，有可能提供一种方法，用于确定将给予的药物效果，以及用于在药物开发研究中，对于与人呼吸道胰蛋白酶样酶相关联的病态，缩小对其给药有效的病人组。
如上述所述，早诊断，早治疗和指导适当的预防方法，以及治疗后的适当用药和适当随诊，都将关系到降低在当前造成难题的巨大医疗费用。
序列号1序列长度序列类型核酸链数双链拓扑结构线性序列种类核酸(基因组序列)序列特征内含子A 5’-末端序列30GTGAGGCCAC CACTACCTAC CCATCTGGGACACTCCGGTG GTGATGGATG GGTAGACCCT60ACAATTAGAA TAGACAGGTC ATGAAGACTGTGTTAATCTT ATCTGTCCAG TACTTCTGAC90CACCCTCTAC CCTAGGATTG AATTGAGCCAGTGGGAGATG GGATCCTAAC TTAACTCGGTGAAATAATTC AATGCAACTTTATTAAG TTACGTT序列号2序列长度序列类型核酸链数双链拓扑结构线性序列种类核酸(基因组序列)序列特征内含子A 3’-末端序列
30TAAACTCACT TGCCAGCTAT AATGCAGGAAATTTGAGTGA ACGGTCGATA TTACGTCCTT60ATATAGCAAG AGATGTGGAT CCAATAGTTCTATATCGTTC TCTACACCTA GGTTATCAAG90TAGATAGTGG TACAGGATGG CTAAGATGAAATCTATCACC ATGTCCTACC GATTCTACTT120TTATATATCT GAAATGTTCA CAAATTCCCTAATATATAGA CTTTACAAGT GTTTAAGGGA150ACTCATATAG CATGTTTCAT AATGTTTTAGTGAGTATATC GTACAAAGTA TTACAAAATC序列号3序列长度序列类型核酸链数双链拓扑结构线性序列种类核酸(基因组序列)序列特征内含子B5’-末端序列
30GTAAGTGTCT CGGAAAAAAA AATTAACAATCATTCACAGA GCCTTTTTTT TTAATTGTTA60AGAAATGTCT TATATTTGCT ATTAGGTAATTCTTTACAGA ATATAAACGA TAATCCATTA90TTTTTAAATT AGGAAACATC TGGAATAGGTAAAAATTTAA TCCTTTGTAG ACCTTATCCA120GTTTCTATTC TTCTACAGAC AGAACCATTCCAAAGATAAG AAGATGTCTG TCTTGGTAAG150TATATTCTGC TCAGCCCAAG CTCTGGCTACATATAAGACG AGTCGGGTTC GAGACCGATGCCCTGAGTCT CCTGGGACTCAGA GGA序列号4序列长度序列类型核酸链数双链拓扑结构线性序列种类核酸(基因组序列)序列特征内含子B 3’-末端序列
30TCCTCATCTA CTTGGGGAAT TTTGGCTGCGAGGAGTAGAT GAACCCCTTA AAACCGACGC60AAGAAACTCC AAAGTAAATC TTTAGAAGCCTTCTTTGAGG TTTCATTTAG AAATCTTCGG90TTCATTGTTA AATATGAAAT AATGTTTGGAAAGTAACAAT TTATACTTTA TTACAAACCT120GTACATTTAT TTCTTCTCAA ATTTATTATACATGTAAATA AAGAAGAGTT TAAATAATAT150GGGTCAATAA TGTACACATC TTGAAGTCCACCCAGTTATT ACATGTGTAG AACTTCAGGTTTTTTTTCCT GCTTTTATAA CAAACAGAAAAAAAGGA CGAAAATATT GTTTGTC序列号5序列长度序列类型核酸链数双链拓扑结构线性序列种类核酸(基因组序列)序列特征内含子C5’-末端序列
30GTAAGCTCAA GACAATCTCA TCCATGTCATCATTCGAGTT CTGTTAGAGT AGGTACAGTA60CATCCAAGAA GTGTATAAGC ACTTCCTAGTGTAGGTTCTT CACATATTCG TGAAGGATCA90ATGTGATAAT GTGATAGACA TAAGTGTAACTACACTATTA CACTATCTGT ATTCACATTG120AGTTACAATA CACAGCCCTG TTCCTCTAAATCAATGTTAT GTGTCGGGAC AAGGAGATTT序列号6序列长度序列类型核酸链数双链拓扑结构线性序列种类核酸(基因组序列)序列特征内含子C3’-末端序列
30GGAAATAGGC TGACTTTATT TGTATAATGACCTTTATCCG ACTGAAATAA ACATATTACT60ATGTGACTCC TTCCTCGACT GCCATAGAAATACACTGAGG AAGGAGCTGA CGGTATCTTT90TAAACTCCTT AATATTTTGG GTTTGTCTTTATTTGAGGAA TTATAAAACC CAAACAGAAA120GCACTTAAGT AATCAGTCAT TCTGTTTTTTCGTGAATTCA TTAGTCAGTA AGACAAAAAATACAGATGTC序列号7序列长度35序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征A1序列30AAGTCAGTCT GCGGCTCAAT AATGCCCACCACTGT序列号8序列长度35序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征A2序列30CTCATTCTTA GTTTAGGAAA TGTTGTGGAAATACC序列号9序列长度35序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征B1序列30ACCCAGAATA TTCCACCTGG CTCTACTGCTTATGT序列号10序列长度35序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征B2序列30CATTACTTAT TATTCTGACC TGTCCTTGCCTTAGC序列号11序列长度35序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征C1序列30GGAGCCATCT TGTCTGGAAT GCTGTGTGCTGGAGT序列号12序列长度35序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征C2序列30CACAATAAAC CAAAGCCGCC GTGAGTCTTCTTGTA序列号13序列长度序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征D1序列5’＞ TGT CGT CGC AGG GGT AGT GAT CCT GGC AGT CAC CA ＜3’序列号14序列长度序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征D2序列5’＞ TTC AAT TCT TCC ACT CAA AGT CCT GTA TTC CTG TG ＜3’序列号15序列长度序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征E1序列5’＞ TGA GGC AAG ATG GTA GTG GTG TGA GAG CGG ATG TT ＜3’序列号16序列长度序列类型核酸链数单链拓扑结构线性序列种类核酸(引物)序列特征E2序列5’＞ GGC CAG CTT CCC TCC TCA GCC TCA GTG CCT CCA AG ＜3’序列号17序列长度3234序列类型核酸链数双链拓扑结构线性序列种类核酸(基因组序列)序列特征内含子C序列
权利要求
1．一种方法，通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的多态性，预测个人对特定疾病发病易感性的体质，或者预测治疗对病人的效果或治疗后的预后。
2．权利要求1中所述的方法，其中分析基因多态性的方法包括分析通过检测一个或几个碱基突变而分类的基因型。
3．权利要求1中所述的方法，其中分析基因多态性的方法包括分析通过检测一个或几个碱基突变而分类的单倍型。
4．权利要求2或3中所述的方法，其中用于分析基因多态性的部位是内含子。
5．权利要求2或3中所述的方法，其中用于分析基因多态性的部位是如下任何一种基因片段(a)一种基因片段，它含有可用由序列号7和序列号8表示的引物扩增的内含子区，(b)一种基因片段，它含有可用由序列号9和序列号10表示的引物扩增的内含子区，(c)一种基因片段，它含有可用由序列号11和序列号12表示的引物扩增的内含子区，(d)一种基因片段，它含有可用由序列号13和序列号14表示的引物扩增的内含子区，(e)一种基因片段，它含有可用由序列号15和序列号16表示的引物扩增的内含子区。
6．权利要求2或3中所述的方法，其中用于分析基因多态性的部位是一种基因片段，它含有可用由序列号11和序列号12表示的引物扩增的内含子C。
7．权利要求2或3中所述的方法，其中用于分析基因多态性的部位是一种基因片段，它含有可用由序列号7和序列号8表示的引物扩增的内含子A。
8．权利要求6中所述的方法，其中用于分析内含子C中基因多态性的部位，是含有可被限制性酶BstUI，MboI，MseI或FbaI识别的一个序列部分的基因片段。
9．权利要求7中所述的方法，其中用于分析内含子A中基因多态性的部位，是含有可被限制性酶MboI，TaqI或AfaI识别的一个序列部分的基因片段。
10．权利要求2或3中所述的方法，其中用于分析基因多态性的部位，是由序列号17表示的一个或几个基因多态性部位的组合。
11．权利要求5-10中任何之一所述的方法，其中对基因多态性部位的分析方法，是通过以一种、二种或几种限制性酶切割根据基因型或单倍型分类判断的。
12．权利要求6，8或10中所述的方法，其中对内含子C中基因多态性部位的分析方法，是通过以限制性酶BstUI，MboI，MseI或FbaI切割根据基因型或单倍型分类判断的。
13．权利要求7或9中所述的方法，其中对内含子A中基因多态性部位的分析方法，是通过以限制性酶MboI，TaqI或AfaI切割根据基因型或单倍型分类判断的。
14．一种用于预测个人对特定疾病易感性体质，或者预测治疗对病人的效果或治疗预后的方法，它是通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性，对特定疾病的一种临床诊断法。
15．权利要求1或14中所述的方法，其中的特定疾病是呼吸系疾病。
16．权利要求15中所述的方法，其中的特定疾病是慢性阻塞性肺病。
17．权利要求15中所述的方法，其中的特定疾病是鼻窦支气管综合征。
18．权利要求15中所述的方法，其中的特定疾病是肺气肿。
19．权利要求15中所述的方法，其中的特定疾病是弥散性全细支气管炎。
20．权利要求15中所述的方法，其中的特定疾病是支气管扩张。
21．一种通过分析人呼吸道胰蛋白酶样酶的基因多态性诊断粘液纤毛生物防御系统的方法。
22．一种基因片段，含有人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子的部分或全部碱基序列。
23．如下基因片段中的任何一种(a)一种基因片段，它含有可用由序列号7和序列号8表示的引物扩增的内含子区，(b)一种基因片段，它含有可用由序列号9和序列号10表示的引物扩增的内含子区，(c)一种基因片段，它含有可用由序列号11和序列号12表示的引物扩增的内含子区，(d)一种基因片段，它含有可用由序列号13和序列号14表示的引物扩增的内含子区，(e)一种基因片段，它含有可用由序列号15和序列号16表示的引物扩增的内含子区。
24．人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子的一种基因片段，包含由序列号1-序列号6中任何之一表示的碱基序列，或者是夹在这些碱基序列之间的基因片段。
25．人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子的基因片段，包含由序列号1-序列号6中任何之一表示的碱基序列。
26．人呼吸道胰蛋白酶样酶内含子C的基因片段，包含由序列号17表示的碱基序列。
全文摘要
一种方法,根据人呼吸道胰蛋白酶基因多态性,预测个体对特定疾病的体质,治疗对病人的疗效或治疗后的预后,此特定疾病是例如呼吸系疾病,包括如慢性阻塞性肺病,鼻窦支气管综合征,肺气肿,弥散性细支气管炎和支气管扩张。
文档编号C12N9/76GK1285002SQ9881364
公开日2001年2月21日 申请日期1998年12月16日 优先权日1997年12月16日
发明者江口広志, 山冈一良, 益田贤一, 安冈劭 申请人:帝人株式会社