专利名称：人神经系统特异表达基因的制作方法
神经系统是一个高度复杂和精细的系统。作为生物长期进化的产物，以人脑为中枢的神经系统是人类的感觉、学习、记忆、思维、情感等行为的基础，而且通过和内分泌等系统的相互作用，对各种组织细胞基因表达的调节都具有重要的影响。因此，人从胚胎发育到成长、衰老的整个生命过程中脑组织都起到十分重要的功能。从基因水平阐明神经系统的功能及其机制，不但是神经科学的重要研究课题，而且也是分子生物学、信息科学等学科非常关注的研究领域。神经分子生物学作为神经科学研究的重要组成部分，随着现代生物学的方法引入，在分子水平上回答了许多神经发育的重要问题，如神经元的诱导和分化、轴突的生长和定向、神经和肌肉的连接等。这些进展不仅加深了我们对神经发育的过程及其机制了解，而且使我们对某些疾病的发病机制有了进一步认识并提供了可能的治疗方案。已经发现许多重大疾病的发生是由于维持神经发育的基因发生变化而造成的。克隆与神经重要生理功能及神经系统疾病相关基因对于认识神经系统的生理，病理过程，寻找新的针对神经系统疾病的药物有重要的意义。
本发明的内容是应用基因组信息学原理、聚合酶链式反应(PCR)、cDNA文库筛选、分子克隆、DNA序列测定技术，克隆神经系统特异表达基因BL1，并用Northern杂交及原位杂交技术进行了组织与细胞表达分析。
该基因达到的技术指标为1.人BLI全长cDNA为2543bp，其阅读框架为1299bp，编码433个氨基酸，其全长cDNA和编码氨基酸见图1与图2。
2.人BL1基因仅在成人与胎儿神经系统表达。在小鼠中存在BLI的同源基因，也主要在神经系统表达(见图3与图4)。原位杂交显示其在大脑皮层、海马、齿状回、小脑颗粒细胞层、脑干多个与运动相关的核团如面神经核及脊髓前角运动神经元表达。
3.将编码BL1蛋白胞外3个免疫球蛋白结构域的cDNA片段和编码BL1胞内区46个氨基酸的cDNA片段，分别克隆到pET-30a+原核表达载体和5’端具有编码26kDa二氢叶酸脱氢酶cDNA序列的pET-30a+-DHFR原核表达载体中，IPTG诱导后获得了高效表达。通过亲和层析，得到了纯化的上述蛋白。
本项发明的优点一般来说，在某种组织器官特异表达的基因对于维持这种组织器官的功能有重要作用。我们所克隆新基因BL1编码的神经系统特异表达的神经粘附分子，对于中枢神经发育及功能维持也应有重要作用。该基因的克隆，表达谱分析及原核表达为进一步的功能研究，包括今后在疾病诊断与治疗上的应用奠定了基础。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
图1BLlcDNA的核苷酸序列图2BLcDNA的全编码区与氨基酸序列
图3BL1cDNA的全序列分析示意4BL1基因在七种胎儿组织中表达的Northern杂交分析1.骨骼肌；2.肾；3.脾；4.肺；5肝；6心；7.脑。
图5.BL1基因在八种成人组织中表达的Northern杂交分析1.心；2.脑；3.胎盘；4.肺；5.肝；6.骨骼肌；7肾；8胰。
图6BL1在50种组织中表达的斑点杂交分析A.poly A+RNAs和对照在阳性电荷尼龙膜上的组织类型和位置。
B.用BL1 cDNA探针与50种组织poly A+RNAs的杂交结果。
图7BL1基因在八种成年小鼠组织中表达的Northern杂交分析1.心；2.脑；3.胎盘；4.肺；5.肝；6.骨骼肌；7.肾；8.胰。
图8BLIcRNA探针与成年鼠中枢神经系统组织切片杂交结果A.小脑颗粒细胞层；B.面神经核；C.脊髓前角运动神经元。
实施例1:cDNA文库的筛选与序列测定神经发育过程中，生长锥经常伸到其它轴突的表面，形成轴突束或簇。束化的过程具有高度的选择性，某些生长锥表现出对特异轴突束的选择性亲和。Beaten path基因在果蝇神经发育时控制神经元轴突的去束化。Beaten path基因突变的果蝇胚胎中运动神经元不能去束化并绕过它的靶位置。最初，Fambrough和Goodman克隆果蝇Beaten path基因时在其产物Beat中没有找到已知的结构域。我们利用TBLASTN程序通过对EST数据库的查询，找到几个EST(人T32071，T08949，鼠AA155245)与Beat具有一定程度的相似性，进一步分析发现相似的位置为一个免疫球蛋白结构域，并与许多神经粘附分子的免疫球蛋白结构域同源。
利用ESTT32071查询Unigene发现了一个让人兴奋的结果，在Unigene Hs.6164中的22个EST都只在中枢神经系统表达(一般认为在Unigene的同一记录下的所有EST代表同一基因)。由于许多神经特异表达的粘附分子已被证明与神经发育和功能维持有密切关系，估计T32071等EST属于一个有类似功能的基因，我们将这一基因命名为BL1(Beat-Like1)。
通过引物步移的方法测定克隆192716(克隆192716为Unigene Hs.6164下ESTH3850来源的克隆，我们从IMAGE公司得到)的全序列。用EcoRI和SmaI双酶切克隆192716，得到插入序列的5′端215bp片段，用其作探针筛选用随机引物构建的成人脑cDNA文库(载体为λgtll)，得到5个阳性单克隆。用λgtll的测序引物PCR扩增得到cDNA插入片断，通过酶切图谱分析，选取克隆编号为DC和DD的两个克隆测序。将PCR扩增得到的cDNA插入片断克隆进pGEM-Teasy载体中，用ABI377自动测序仪测序。将192716和DC克隆的序列拼接得到的一条2.5kb的cDNA序列，命名为BL1(beat-like1)，对BL1的序列测定和拼接见图3。
实施例2应用生物信息学技术分析出该基因具有权利3所述的结构域用BL1A cDNA推测的氨基酸序列BL1A比较Pfam蛋白家族数据库，发现在其中部具有三个免疫球蛋白结构域(分别位于氨基酸残基77-147，180-246，282-336)。用SignalP V1.1(http∥www.cbs.dtu.dk/service/signalP)分析得知1-24氨基酸为典型的信号肽。比较TMBASE发现有2个较明显的穿膜区(位于氨基酸残基7-24，366-387)，由于第一个穿膜区为信号肽位置，所以成熟的BL1在细胞膜上应该只穿膜一次。根据分析结果，该基因编码一新的神经粘附分子实施例3应用Northern杂交、RNA点杂交及原位杂交技术进行了人与小鼠的组织表达谱分析通过查询Unigene发现所有EST都在中枢神经系统中表达，利用Northern杂交和斑点杂交分析BL1的组织表达。提取7月胎儿骨骼肌、肾、脾、肺、肝、心和脑等组织的总RNA。用甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性。RNA经紫外分光光度计测定浓度后，每种RNA取30μg通过甲醛变性凝胶电泳分离并转移、固定至尼龙膜上。用引物12772(5’-caccaactgcgatgattagg-3’，936bp-955bp)和引物12773(5’-ctctccaaatctactcttcc-3’，2161bp-2143bp)PCR扩增192716克隆而得到1226bp的片段，以此为探针与固定有7种胎儿组织RNA的膜杂交。发现只在脑组织中能检测到约2.5kb和3.5kb的两条区带。探针同上，与购自Clontech公司的多组织膜(MTNTM)杂交，在检测的8种成人组织发现BL1mRNA只在脑组织中表达，并且也存在2.5kb和3.5kb的两个转录本(图4与图5)。
1)为了进一步验证BL1中枢神经系统表达的特异性，我们使用Clontech公司HumanRNA Master BlotTM(Cat.No.7770-1)检测了43种成人组织，7种胎儿组织，结果显示BL1只在中枢神经系统的组织中检测到信号(图6)。值得注意的是，在小脑组织中BL1的表达明显高于其它组织。为了解小鼠中是否存在BL1的同源基因，用BL1SmaI酶切片段与载有8种成年小鼠组织的多组织膜进行Northern杂交分析，发现小鼠中存在BL1的同源基因，其亦为中枢神经系统表达为主，存在2.5kb和3.5kb两个转录本，3.5kb的转录本为脑特异表达(图7)。
2)用引物BJ033a-1P(5’-agacagtttgctttgggattg-3’，1722bp-1702bp)与12772扩增192716克隆，而后用XbaI酶切，回收287bp片段(1435-1722)，与SmaI和XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)载体连接，转化DH5α感受态大肠杆菌。提取质粒，酶切鉴定阳性克隆，并进一步测序鉴定。体外转录UTP标记的RNA探针按Boehringer Mannheim体外转录试剂盒操作手册进行。用该探针与成年小鼠的中枢神经系统切片行组织原位杂交分析发现，BL1基因在大脑皮层、海马、齿状回、小脑颗粒细胞层、脑干多个与运动相关的核团如面神经核及脊髓前角运动神经元表达(图8)。
实施例4BL1的原核表达将编码BL1胞外3个免疫球蛋白结构域的cDNA片段(212bp-1155bp，314aa)克隆到pET-30a+原核表达载体中，将编码BL1胞内区46个氨基酸的cDNA片段(1298bp-1720bp)克隆到本室构建的5’端具有编码26kDa二氢叶酸脱氢酶cDNA序列的pET-30a+-DHFR原核表达载体中，IPTG诱导后皆获得了高效表达。通过亲和层析，得到了纯化的上述蛋白。
权利要求
1，本发明涉及一神经系统特异表达的基因BL1，其特征在于互补脱氧核糖核酸(cDNA)全长2543bp，含一个1299bp的完整开放阅读框，编码433个氨基酸，分子量为47.1kD的蛋白质。
2，根据权利1要求所述之神经系统特异表达的基因BL1，其特征在于所编码蛋白1-24氨基酸为典型的信号肽，中部具有三个免疫球蛋白结构域(分别位于氨基酸残基77-147，180-246,282-336)，366-387氨基酸为穿膜区，为一新的神经粘附分子。
3，根据权利1要求所述之神经系统特异表达的基因BL1，其特征在于在神经系统特异表达，在海马、小脑颗粒细胞、脊髓前角运动神经元高表达。
4，根据权利要求1、2、3所述之神经系统特异表达的基因BL1，其特征在于可用于神经系统疾病的基因诊断、基因治疗和药物治疗，也可用于筛选药物。
全文摘要
本发明涉及一个新的人神经系统特异表达基因(BL1),包括互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列和编码蛋白质的氨基酸序列。该基因编码一新的神经粘附分子,神经系统特异表达,在维持神经系统的生理功能及某些神经系统疾病的发生过程中可能具有重要的作用。
文档编号C12N15/12GK1242376SQ99111018
公开日2000年1月26日 申请日期1999年7月27日 优先权日1999年7月27日
发明者张伯勤, 袁建刚, 周严, 杜光伟 申请人:中国医学科学院基础医学研究所