专利名称：连续发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由D-山梨糖醇生产2-酮-L-古洛糖酸(2-KGA)的连续发酵工艺。2-KGA是生产抗坏血酸(维生素C)的重要的中间体。
由D-山梨糖醇生产2-KGA的工艺是已知的。例如，EP 0 518 136 A2公开了一种应用了混合微生物培养物的发酵工艺，其中D-山梨糖醇由一种属于葡糖杆菌属(Gluconobacter)或醋杆菌属(Acetobacter)的微生物，例如弱氧化葡糖杆菌(Gluconobacter suboxydans)IFO 3291，氧化为L-山梨糖，接下来L-山梨糖在用微生物菌种DSM 4025(也已知为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)DSM 4025)发酵中转化为2-KGA。在这一工艺中，两种微生物至少在整个培养阶段的部分阶段中共同存在于发酵培养基中。然而，我们发现在EP 0 518 136 A2所公开的工艺以连续的方式进行时，产量是不令人满意的。
本发明的一个目的在于提供一种由D-山梨糖醇生产2-KGA或2-KGA的一种盐的有效工艺，此工艺可以提高产量，减少由于不必要的副产物、二氧化碳和细胞团的形成而造成的损失，并可以不间断地长时间进行，即连续进行。
据此，本发明提供了一种经过用微生物发酵连续地由D-山梨糖醇生产2-KGA或2-KGA的一种盐的工艺，其中，一种包含D-山梨糖醇的营养培养基在第一个发酵容器中与一种能够将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的微生物一同温育，之后将所得到的包含L-山梨糖的发酵培养液转移至第二个发酵容器，在其中与能够转化L-山梨糖至2-KGA的一种微生物一同温育。
能够将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的微生物的实例是葡糖杆菌属或醋杆菌属的微生物，例如弱氧化葡糖杆菌IFO 3130、IFO 3255、IFO 3256、IFO 3257、IFO 3258、IFO 3289、IFO 3290和IFO 3291；弗氏葡糖杆菌(Gluconobacter gluconicus)IFO 3171、IFO 3285和IFO 3286；Gluconobacter rubiginosus IFO 3244；微白葡糖杆菌(Gluconobacter albidus)IFO 3251和IFO 3253；Gluconobacter industrius IFO 3261；蜡状葡糖杆菌(Gluconobacter cerinus)IFO 3262、IFO 3263、IFO 3265、IFO 3266、IFO 3267和IFO 3270；Gluconobacter diacetonicus IFO 3273；Gluconobacter roseus IFO 3990；醋化蜡杆菌赛尔兰亚种(Acetobacter aceti subsp.orleans)IFO 3259；醋化醋杆菌醋亚种(Acetobacter aceti subsp.aceti)IFO 3281；液化醋杆菌(Acetobacter liquefaciens)IFO 12257、IFO 12258和IFO 12388；和木醋杆菌(Acetobacter aceti subsp.xylinum)IFO 3288、IFO 13693、IFO13772和IFO 13773。
优选的微生物是弱氧化葡糖杆菌IFO 3255、3256、3258、3290和3291、Gluconobacter gluconicus IFO 3285和蜡状葡糖杆菌IFO 3267。最优选的微生物是弱氧化葡糖杆菌IFO 3291。
以上所命名的这些微生物保藏于日本大阪发酵研究所(The Institute ofFermentation Osaka，Japan)(IFO)公共微生物保藏中心(培养物收集)，并且可以应任何人的要求在偿付费用后提供。
用于转化L-山梨糖至2-KGA的优选的微生物是氧化葡糖杆菌DSM4025。这一菌种已于1987年3月17日，基于布达佩思条约中的条款，以DSM No.4025的编号保藏于德国Gottingen市的德意志微生物保藏中心(现位于Braunschweig)。保藏人是东方科学仪器进出口公司(TheOriental Scientific Instruments Import and Export Corporation)代表中国科学院微生物研究所，三里河路52号，北京，中华人民共和国。有效的保藏人是该研究所，其完整地址是中国科学院微生物研究所，海淀，中关村，北京100080，中华人民共和国。
对于适合在本发明的工艺中应用的微生物进行培养的营养培养基，尽管没有施加特殊的限制，但是含水的营养培养基可以包含碳源和氮源。可以为微生物利用的其它无机盐、小量的其它营养物等，可以用于有益的微生物的培养。常用的使微生物更好生长的多种营养原料也可以适当地包含在培养基中。
除本发明所述的工艺中用作初始原料的D-山梨糖醇之外，其它碳源物质也可以在营养培养基中存在，例如甘油、D-葡萄糖、D-甘露糖醇、D-果糖、D-阿糖醇等。
多种有机和无机的物质也可以在上述工艺中用作氮源，例如肉膏、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐等。硫酸镁、磷酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等可以作为无机物质应用。
这些营养的混合比例和每种成分的量可以随着所用微生物的属性而变化，初始原料D-山梨糖醇的量、将要接种的微生物中的一种相对于其它几种微生物的量以及接种的时间和其它温育条件可以根据个体情况的特殊性选择或决定。
第一个发酵容器所含培养基中初始原料D-山梨糖醇的合适浓度在任何情况下均取决于所用微生物的属性等方面。在一种优选的实施方案中，第一个发酵容器所含培养基中D-山梨糖醇的浓度是从约10克/升至约400克/升，更优选的是从约150克/升至350克/升。第一个发酵容器中生产的L-山梨糖在加入到第二个发酵容器的发酵培养液中的浓度，优选的是从约5克/升至约200克/升，更优选的是从约60克/升至180克/升。
发酵(培养)的进一步条件也可以根据所应用的特定微生物的种属特性变化。为了最有效地生产目的产物，培养基的组成当然可以根据个体情况的特殊性选择或决定。第一个发酵容器中合适的培养温度从约12至约38℃，优选的为从约18至约32℃，第二个发酵容器中合适的培养温度为从约20至约33℃。第一个发酵容器中培养基合适的pH值为从约2.0至约9.0，优选的为从约3.0至约7.0。第二个发酵容器中培养基合适的pH值为从约5.0至约9.0，优选的为从约6.0至约8.0。
在本发明工艺更进一步的一个优选的方面中，发酵以溶氧浓度为从约0.1至约200％空气饱和度下进行，第一个发酵容器中，优选地从约5至约100％空气饱和度；第二个发酵容器中，优选地从约8至约80％空气饱和度。
此外，发酵优选地以气流中氧浓度为从约0.1至约100％进行，第一个发酵容器中，优选地从约15至约100％，第二个发酵容器中，优选地从约19至约100％；气流速率在第一个发酵容器中，从约0.01至约1.2体积/体积/分钟(气体体积每反应器体积每分钟)，在第二个发酵容器中，从约0.03至约0.85体积/体积/分钟。
也优选以下面优选条件进行发酵，在第一个发酵容器中液流的稀释率为约0.02至约0.5小时-1，更优选约0.06至约0.3小时-1。在第二个发酵容器中液流的稀释率优选为约0.03至约0.25小时-1。
虽然根据本发明，发酵可以在正常压力下进行，即约1巴，但是一般优选在提高的压力下进行，例如至少3巴的压力，最优选至少5巴。
本发明的工艺的一个特别优选的实施方案中，从第一个发酵容器得来的发酵培养液在转移至第二个发酵容器之前经过灭菌。这可以通过在转移至第二个发酵容器前在第一个发酵容器中加热发酵培养液到约35至约121℃的温度，优选地从45至80℃而实现，或者通过在发酵培养液已经从第一个发酵容器中移出(流出)之后，在导入第二个发酵容器之前，即从第一个至第二个发酵容器的转移过程中，进行加热至同样的温度而实现。
本发明的工艺的一个更进一步的特别优选的实施方案中，包含D-山梨糖醇的营养培养基加入至第一个发酵容器的速率高于包含L-山梨糖的发酵培养液从第一个发酵容器转移至第二个发酵容器的速率，同时，一部分包含所产生的L-山梨糖的发酵培养液从第一个发酵容器流出至一个单独的容器，这样使第一个发酵容器中发酵培养液的体积保持基本恒定。
本发明的工艺的另一个特别优选的实施方案中，在发酵过程中向第二个发酵容器加入营养培养基。根据从第一个发酵容器供给发酵培养液的速率和从第二个发酵容器流出的发酵培养液的速率，调节向第二个发酵容器供给营养培养基的速率，以使第二个发酵容器中的工作体积基本保持恒定。供给第二个发酵容器的营养培养基除了不包含山梨糖醇外，适当的基本上是与在第一个发酵容器中应用的营养培养基相同。在一种优选的实施方案中，就其营养成分及其浓度而言具有不同组成成分的营养培养基从独立的储存容器中以可变的速率供给第二个发酵容器，以为发酵培养液中微生物的生长建立最佳条件。
为优化本工艺的产量，可以在整个工艺的每一个步骤中应用多于一个发酵容器来进行发酵。例如，转化D-山梨糖醇至L-山梨糖的发酵和/或转化L-山梨糖至2-KGA的发酵可以在两个或更多的以连续或平行的顺序排列的发酵容器中进行。
适当地，在每个发酵容器中的微生物部分或完全地通过自知的方法固定化，例如通过化学结合法，比如共价或离子键结合；通过与聚合物交联的方法；或者，使细胞固定位置的物理方法，比如吸附结合、基质包埋、微胶囊包埋；或者应用膜反应器；或这些固定方法的联合使用。在一种优选的实施方案中，微生物的固定是将细胞粘附至多孔有机载体例如聚合物如纤维素；或者无机载体，例如矿物质如皂土或滑石、陶瓷或玻璃珠。
为了维持培养基的pH在最适合酶活性的值，在培养过程中任何合适的酸性或碱性试剂均可以以适当的量在适当的时间加入至培养基中。通过在培养开始时在培养基中初始性混入适当的缓冲液或缓冲试剂，也可以达到同样的目的。
这样在第二个发酵容器中所产生的2-酮-L-古洛糖酸可以以自已知的传统方法分离和纯化，并且如果相应的金属离子在发酵(营养)培养基中存在，它可以以盐的形式得到分离，例如钠盐、钾盐、钙盐、铵盐等；这是当钠盐、钾盐、钙盐、铵盐等无机盐存在的情况。该盐可以以自知的传统方法转化为游离的酸。
本发明进一步由以下实施例加以说明，其中的百分比基于重量/体积的比。
实施例1种子培养物的制备(a)制备用于第一个发酵容器的一种含水种子培养基，包含10％D-山梨糖醇、0.006％酵母浸膏粉、0.02％七水硫酸镁、1％玉米浆、0.03％磷酸二氢钾和0.06％碳酸钙。
将一个接种环量的弱氧化葡糖杆菌IFO 3291转移至置于1升摇瓶中的300毫升种子培养基。该摇瓶在28℃振荡温育2天。
(b)制备用于第二个发酵容器的一种含水种子培养基，包含4％L-山梨糖、0.5％尿素、0.05％甘油酯、0.25％七水硫酸镁、1.75％玉米浆、5％酵母浸膏粉和1.5％碳酸钙。将五个接种环量的氧化葡糖杆菌DSM 4025转移至置于1升摇瓶中的300毫升种子培养基。该摇瓶在28℃振荡温育3天。
实施例2装配一种如
图1所示的生物反应器系统。该系统包括两个发酵容器(反应器13.001(第一个发酵容器)和反应器13.002(第二个发酵容器))，用于储存营养溶液的储存瓶11.001、11.004和11.005，用于储存7.5M氢氧化钠溶液的储存瓶11.006和11.007，用于收集2-KGA和来自反应器13.001(第一个发酵容器)的过量发酵培养液的收集瓶11.002和11.003，用于加热发酵培养液的循环16.001，以及泵24.001、24.002、24.003、24.004、24.005、24.006、24.007和24.008。
储存瓶11.001装盛一种含有11.5％D-山梨糖醇、1％玉米浆粉、0.006％七水硫酸镁、0.03％磷酸二氢钾和0.06％碳酸钙的水溶液。
储存瓶11.004装盛一种含有20％玉米浆粉、0.03％七水硫酸镁、0.03％磷酸二氢钾和0.06％碳酸钙的水溶液。
储存瓶11.005，装盛一种含有1％酵母浸膏粉、0.03％七水硫酸镁、0.03％磷酸二氢钾和0.06％碳酸钙的水溶液。
发酵容器均装配有气体供给设备和一个搅拌器。在两个发酵容器(13.001和13.002)的搅拌柄上均装有一个旋转吊篮。该旋转吊篮中装满了球状多孔陶瓷载体原料，其平均颗粒直径约3.5毫米，平均孔直径约100微米(Ceramtec AG，Marktredwitz，德国)。
实施例3实施例2中描述的生物反应器系统，参照图1，以如下的连续步骤进行操作1.所有反应器、泵、管路和仪器的组件的装配。
2.合适的隔离物中进行20分钟121℃高压灭菌。
3.连续操作中所用的培养基的制备，将培养基成分按重量加入至储存瓶并高压灭菌(121℃，20分钟)。
4.在无菌条件下连接反应器、碱瓶、储存瓶和收集瓶。
5.用600毫升实施例1(a)中所描述的种子培养基在无菌条件下灌注反应器13.001(总容积2升)。pH＝6.8，温度＝18℃，溶氧(DO)浓度＝2％空气，总压力(P总)＝1.1巴，氧分压PO2＝0.6巴。
6.主要由于山梨糖醇向山梨糖的转化而产生的氧的消耗和CO2的释放，升高反应器的搅拌器速度，直到使溶氧浓度保持恒定的值2％。当山梨糖醇基本上已经消耗，溶氧浓度由于微生物消耗氧的减少而增加。这就引发了下一步骤7.开启泵24.001以151毫升/小时供给营养液。
8.用450毫升实施例1(b)中所描述的种子培养基在无菌条件下灌注反应器13.002(总容积2升)。pH＝7.0，温度＝28℃，溶氧浓度＝10％空气，P总＝1.1巴，PO2＝0.52巴。
9.开启泵24.002以从反应器13.001向反应器13.002以33毫升/小时转移培养液，开启泵24.004(1.8毫升/小时)和泵24.005(2毫升/小时)以供给附加的营养。剩余的山梨糖培养液转移至收集瓶11.003。包含2-酮-L-古洛糖酸的培养液收集至瓶11.002。
10.山梨糖醇、山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸的浓度的分析由高效液相色谱实现。
最终，本工艺在固定相连续地在以下纵观中所给出的条件下进行操作
表1反应器13.001中的工艺条件用7.5M的NaOH控制pH山梨糖醇总浓度(进料口)113.1克/千克(119.9克/升
D稀释率OD光密度(660纳米下)CCD计数细胞密度气流速率气流体积每反应器体积每分钟V反应器反应器的工作体积表2反应器13.002中的工艺条件用7.5M的NaOH控制pHC6单糖总浓度(进料口)85.6克/千克(90.7克/升)
整个系统山梨糖醇总浓度(反应器13.001)113.1克/千克(119.9克/升)反应器13.001和反应器13.002之间发酵培养液稀释系数0.82表3反应器13.001和反应器13.002总结性结果
权利要求
1.一种用微生物发酵由D-山梨糖醇连续生产2-酮-L-古洛糖酸或其盐的工艺，其特征在于，一种包含D-山梨糖醇的营养培养基在第一个发酵容器中与一种能够将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的微生物温育，之后将所得到的包含L-山梨糖的发酵培养液转移至第二个发酵容器中与一种能够转化L-山梨糖成为2-酮-L-古洛糖酸的微生物温育。
2.根据权利要求1所述的工艺，其中，来自第一个发酵容器的发酵培养基在转移至第二个发酵容器之前经过灭菌。
3.根据权利要求2所述的工艺，其中，灭菌的实现是通过将发酵培养液在转移至第二个发酵容器之前在第一个发酵容器中加热至从约35至约121℃的温度，优选地从约45至80℃，或者通过在发酵培养液已经移出第一个发酵容器但在导入第二个发酵容器之前将其加热至同样温度。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的工艺，其中，包含D-山梨糖醇的营养培养基以高于包含L-山梨糖的发酵培养液从第一个发酵容器至第二个发酵容器的转移速率的速率加入到第一个发酵容器，而同时，包含所产生L-山梨糖的部分发酵培养液从第一个发酵容器灌注至一个独立的容器，这样以使第一个发酵容器中的发酵培养液的体积基本保持恒定。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的工艺，其中，在发酵过程中向第二个发酵容器加入营养培养基，根据从第一个发酵容器供给发酵培养液的速率和从第二个发酵容器流出的发酵培养液的速率，调节向第二个发酵容器供给营养培养基的速率，以使第二个发酵容器中的工作体积基本保持恒定。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的工艺，其中，能够转化D-山梨糖醇至L-山梨糖的微生物是葡糖杆菌或醋杆菌属的微生物，优选为弱氧化葡糖杆菌IFO 3291。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的工艺，其中，能够转化L-山梨糖至2-酮-L-古洛糖酸的微生物是氧化葡糖杆菌DSM 4025。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的工艺，其中，第一个发酵容器中的营养培养基中D-山梨糖醇的浓度是从约10克/升至约400克/升，优选从约150克/升至350克/升。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的工艺，其中，L-山梨糖在加入到第二个发酵容器的发酵培养液中的浓度是从约5克/升至约200克/升，优选从约60克/升至180克/升。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的工艺，其中，第一个发酵容器中的培养是在约12至约38℃的温度下进行，优选地温度为从约18至约32℃，第二个发酵容器中的温度为从约20至约33℃。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的工艺，其中，第一个发酵容器中的培养是在营养培养基的pH值为约2.0至约9.0下进行，优选的pH为约3.0至约7.0，第二个发酵容器中培养液的pH值为约5.0至约9.0，优选的pH为约6.0至约8.0。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的工艺，其中，发酵以溶氧浓度为从约0.1至约200％空气饱和度下进行，第一个发酵容器中，优选的从约5至约100％空气饱和度，第二个发酵容器中，优选的从约8至约80％空气饱和度。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的工艺，其中，发酵以气流中氧浓度为从约0.1至约100％进行，第一个发酵容器中，优选的从约15至约100％，第二个发酵容器中，优选的从约19至约100％。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的工艺，其中，在第一个发酵容器中以气流速率从约0.01至约1.2体积/体积/分钟进行发酵，在第二个发酵容器中以气流速率从约0.03至约0.85体积/体积/分钟进行发酵。
全文摘要
一种经过用微生物发酵连续地由D－山梨糖醇生产2－酮－L－古洛糖酸或其盐的生产工艺,其特征在于,一种包含D－山梨糖醇的营养培养基在第一个发酵容器中与一种能够将D－山梨糖醇转化为L－山梨糖的微生物温育,之后将所得到的包含L－山梨糖的发酵培养液转移至第二个发酵容器,在其中与能够转化L－山梨糖至2－酮－L－古洛糖酸的一种微生物温育。在本工艺的一种特别优选的实施方案中,从第一个发酵容器中得到的发酵培养液在转移至第二个发酵容器之前经灭菌处理。2－酮－L－古洛糖酸是一种生产维生素C的重要的中间体。
文档编号C12P7/60GK1257127SQ9911047
公开日2000年6月21日 申请日期1999年7月16日 优先权日1998年7月17日
发明者M·儒凯尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司