专利名称：：利用白细胞分化抗原(cd)基因芯片的检测疾病的方法
技术领域：
：本发明涉及利用白细胞分化抗原(CD)基因芯片检测疾病的方法，主要用于血液病的诊断和监测、器官移植的配型等。生物学已经进入了基因组时代，美国人类基因组计划和中国人类基因组计划预计到2005年，即可获得人类完整的基因(十万个左右)序列。但是基因定位和序列的获得仅仅是这些基因的具体的解剖学定位，要认识这些基因组的生物学功能，则必需对基因组表达的组合模型进行动态研究。因此DNA芯片(基因芯片)技术在几年前便应运而生了。DNA芯片技术并非是将所有的人体基因绘制成图，而是找出人群之间、个体发育、疾病发展先后等基因之间的种种区别点，对独特的基因组合方式进行辨认。用现阶段所有分子生物学技术需要十年才能破译的遗传密码，则可以用少数DNA芯片在短时间内就可以达到。DNA芯片技术是一种高度集成的DNA检测技术。首先采用专用自动化设备将几千甚至几万个已知DNA寡核苷酸探针或全序列基因探针排列在玻片或硅片上，然后将待检测样本中的所有DNA成分与芯片探针杂交，有相对应的靶DNA就会出现相应的杂交信号。理论上可以做到一次实验检测细胞或组织内所有基因或可以表达的基因。因此这种技术对胚胎发育控制的研究、疾病发生发展的研究、以及生理病理的研究提供了最佳的研究手段。1995年10月斯坦福大学第一篇成熟的DNA芯片检测技术发表在SCIENCE杂志上(SchenaM，etalScience1995，270467)，并成功地检测了酵母菌的全部cDNA，和1046个人类基因的检测(SchenaM，etalProcNatlAcadUSA1996，9310614-619)。1998年美国由NIH、NHGRI、NCBI、NCI、NINDS、BEIP、DCRT等国立研究成立了DNA微芯片开发计划(μAP)(http//www.nhgri.nih.gov/dir/1cg/15k/html)，该项目拟利用DNA芯片技术进行mRNA表达模型的比较研究，其目标是开发一种含有所有mRNA表达基因的DNA芯片并进行定量研究。DNA芯片技术的设想可以追溯到90年代初，美国Affymetrix公司首先开始这方面的研究(http//www.affymetrix.com)。由于这项技术的广泛的应用前景以及巨大的经济效益，目前美国的斯坦福大学、美国橡树岭国家实验室、Incyte商业公司和Hyseq公司、德国的自动化公司(http//www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/～autom)、都在进行全力研究，竞争市场份额。国内也有单位开始跟进了DNA芯片的研究。虽然有人预测大约几年后才会有真正实用的DNA芯片上市，然而谁开始得早，谁就会赢得主动权。由于该技术需要高精度的DNA探针点样设备或光刻合成设备和专用的激光扫描检测装置，尚未普及应用。另一个重要的原因是，检测的样本必需是含有DNA的细胞或组织，而在临床上这恰恰又是难以获得的材料，因此该技术至今还未应用到临床上。本发明的目的是提供一种利用白细胞分化抗原(CD)基因芯片检测疾病的方法。为了达到上述目的本发明采取下列措施利用白细胞分化抗原DNA芯片检测疾病的方法，它是收集近172个用于白细胞免疫分型的CD抗原的基因，并制成相应的DNA寡核苷酸探针，每个探针的长度依据杂交动力学数据设定在20～60个碱基左右，这些寡核苷酸探针在合成时进行5’末端活性基团以及活性基团与探针之间的连接臂合成标记，利用三维DNA点样装置将白细胞分化抗原探针按一定规律排列在载体玻片或硅片上，经过固定和相关处理后可以进行杂交检测，杂交之前必须进行被检测mRNA(信使核糖核酸)进行分离、纯化以及互补DNA链的合成和荧光分子标记，或者利用三明治式共用第二探针进行靶分子的显示，杂交时，将被标记的cDNA分子与DNA芯片共同孵育杂交，应用芯片专用扫描仪、共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜进行杂交信号的检测，根据各个探针位点的荧光信号的强弱，与已有的标准基因表达模型或自身基因表达模型进行比较，提供这些基因表达的信息，供临床医师或研究人员分析。本发明的优点临床上，细菌、病毒的检测以及血液病诊断与监测以及白细胞配型是DNA芯片应用的最具潜力的方面。本发明利用我们组装的DNA排列设备(已申请中国专利)和现有的激光扫描仪，开发可以用于白血病诊断、监测等白血病相关基因和基因表达的DNA芯片技术。根据白细胞及正常骨髓容易得到的特点，建立一种高效、快速、并行的白血病染色体易位、断裂、缺失的检测、MDR1、MRP和LRP等与白血病个体化治疗相关的基因、以及180余种用于白血病诊断、分型的白细胞分化抗原、MPO、TCR和免疫球蛋白基因的表达情况，提高诊断效率和诊断准确性、降低检测成本、缩短诊断时间。同时作为白血病临床个体化治疗的重要参考资料，提高临床用药的准确性，降低检测和治疗成本。除此之外，白细胞表面抗原的检测还可用于器官移植的免疫配型。下面结合附图和实施例作详细说明附图是白血病分化抗原DNA芯片检测和分析示意图。本发明总结和分析了至目前为止用于血液病临床诊断、病情监测中所使用的各种细胞免疫表型的免疫分子，以及这些免疫分子相关的蛋白质基因的序列，根据DNA序列特异性识别的原理设计这些免疫分子的DNA探针。该实用新型收集近200个左右用于白细胞免疫分型的CD抗原(Clustersofdifferentiationantigens)的DNA寡核苷酸片断，每个探针依据杂交动力学数据，其长度设定在20～60个碱基左右。这些寡核苷酸探针在合成时进行5’端活性基团标记以及活性基团与探针之间的连接臂。在DNA芯片制备时，利用我们已组装的三维DNA点样装置将白细胞分化抗原探针按一定规律排列在载体玻片或硅片上，经过固定和相关处理后可以进行下列杂交检测。杂交之前必须进行被检测DNA的标记。标记拟采取直接标记法如将荧光物质标记的核苷酸类似物合成进DNA分子，或者利用三明治式共用第二探针进行靶分子的显示。可通过专用激光芯片扫描仪或共聚焦激光扫描显微镜进行检测。杂交时，将被标记的cDNA分子与DNA芯片共同孵育杂交。应用芯片专用扫描仪、共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜进行杂交信号的检测。根据各个探针位点的荧光信号的强弱，与已有的标准基因表达模型或自身基因表达模型进行比较，提供这些基因表达的信息，供临床医师或研究人员分析。根据DNA序列特异性识别的原理设计这些白细胞分化抗原免疫分子的DNA探针。该实用新型收集近172个左右用于白细胞免疫分型的CD抗原的DNA寡核苷酸片断，每个探针依据杂交动力学数据，其长度设定在20～60个碱基左右。为了DNA探针能有效地固定在玻片上，通常在DNA探针合成后进行DNA探针5’末端活性基团的标记，这些活性基团有氨基、疏基等，固定DNA的玻片也需进行活化处理。通常进行活化处理使之表面带有醛基或氨基，可以与DNA探针形成共价健。在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用无氨基污染的消毒双蒸水稀释至10～100pmol/μl和等量5XSSC(标准氯化纳柠檬酸钠杂交液)混合，进行点样。在进行杂交时，先将合成的已知序列DNA探针固定在芯片的相应位置，然后将待检DNA样本进行荧光标记，再与DNA芯片杂交，因此可以同时检测成千上万个基因。这种方法是一种反向杂交技术。杂交信号检测可以通过专用激光芯片扫描仪或共聚焦激光扫描显微镜进行检测。扫描获得的图像，用芯片图像专用分析软件分析每个基因的杂交信号的强弱，从而获得该基因芯片的基因表达模型。实施例1．探针的遴选被选用的白细胞分化抗原分子都是被证明有不同程度的临床价值，这些蛋白质大多是位于白血病细胞或白细胞表面，可以被相应的抗体所识别，对这些抗原物质的识别对于临床上白血病的诊断以及在临床病程的监控都有重要的价值。本发明遴选所有已被证实有临床价值的白细胞分化抗原的mRNA或相应的cDNA作为探针序列的来源。这些探针的长度一般是在25～60个碱基左右。这些基因探针序列如下(不含各种阴性、阳性和空白对照基因探针)。2．寡核苷酸探针5′活性基团标记包括氨基、巯基的标记，以及活性基团与DNA分子之间的适宜的碳链长度等，这些间隔的连接臂将增加探针与玻片表面的距离，有利于探针与被检测DNA的杂交体的形成。固定DNA的玻片也需进行活化处理。通常进行活化处理使之表面带有醛基或氨基，可以与DNA探针形成共价健。3．DNA探针排列和芯片制作在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用无氨基污染的消毒双蒸水稀释至10～10pmol/μl和等量5XSSC(标准氯化纳柠檬酸钠杂交液)混合，进行点样。完成DNA探针的合成之后，启动DNA点样装置，在芯片制作控制程序的控制下进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传遇到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针至清洗装置清洗、干燥，进行下一轮DNA探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。4．检测在检测时，首先进行被检测DNA样本的抽提、纯化，然后作逆转录，DNA荧物质标记，再进行目标DNA与芯片探针杂交。在进行杂交时，先将合成的已知序列DNA探针固定在芯片的相应位置，然后将待检DNA样本进行荧光标记，再与DNA芯片杂交，因此可以同时检测成千上万个基因。这种方法是一种反向杂交技术。杂交信号检测可以通过专用激光芯片扫描仪或共聚焦激光扫描显微镜进行检测。扫描获得的图像，用芯片图像专用分析软件分析每个基因的杂交信号的强弱，从而获得该基因芯片的基因表达模型。5．结果解释该DNA芯片的检测目的主要是比较这些基因1表达的情况，以及所有基因表达组合的变化，同时比较某一次检测2与标准检测3基因表达的差异，如用于血液病的诊断、器官移植的配型；或者病人在经过治疗后基因表达的变化(图示)(病情监测)。所以测试结果的判断，主要依据①与正常基因表达模型的比较，即是将检测的结果与众多已知表达模型比较，以便了解该检测的基因表达模型是属于何中类型；②与病人自身的比较，观察病人的基因表达模型的改变方向。从而取得这些基因表达的资料信息，为临床医生服务。权利要求1．一种利用白细胞分化抗原DNA芯片检测疾病的方法，其特征在于收集近172个用于白细胞免疫分型的CD抗原的基因，并制成相应的DNA寡核苷酸探针，每个探针的长度依据杂交动力学数据设定在20～60个碱基，这些寡核苷酸探针在合成时进行5’末端活性基团以及活性基团与探针之间的连接臂合成标记，利用三维DNA点样装置将白细胞分化抗原探针按一定规律排列在载体玻片或硅片上，经过固定和相关处理后进行杂交检测，杂交之前必须进行被检测mRNA(信使核糖核酸)进行分离、纯化以及互补DNA链的合成和荧光分子标记，或者利用三明治式共用第二探针进行靶分子的显示，杂交时，将被标记的cDNA分子与DNA芯片共同孵育杂交，应用芯片专用扫描仪、共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜进行杂交信号的检测，根据各个探针位点的荧光信号的强弱，与已有的标准基因表达模型或自身基因表达模型进行比较，提供这些基因表达的信息，供临床医师或研究人员分析。2．根据权利要求1所述的一种利用白细胞分化抗原基因芯片检测疾病的方法，其特征在于所说的172个用于白细胞免疫分型的CD抗原的基因为<tablesnum="001"><table>编号名称标记连接臂探针序列(5’→3’)1CD1a5’-NH2--(CH2)6-GGTTCTGGGACTTTTAAATTCAAAT2CD1b5’-NH2--(CH2)6-GCTCAATTGTTTTGGCAATAATAGT3CD1c5’-NH2--(CH2)6-AAGATGTATGTACACAGGCAAGTGA4CD1d5’-NH2--(CH2)6-AATGCTGACGAGACATGGTATCT5CD1e5’-NH2--(CH2)6-CTAATGCTGACGAGACATGGTATCT6CD25’-NH2--(CH2)6-CGAGCACAGAAATCTTAGAGATTTC7CD3d5’-NH2--(CH2)6-ATACAAGGACAAAGAATCTACCGTG8CD3e5’-NH2--(CH2)6-ACTACTGGAGCAAGAATAGAAAGGC</table></tables>全文摘要本发明公开了一种利用白细胞分化抗原DNA芯片检测疾病的方法,它是收集近172个用于白细胞免疫分型的CD抗原的基因,并制成相应的DNA寡核苷酸探针,利用三维DNA点样装置将白细胞分化抗原探针按一定现律排列在载体玻片或硅片上,经过固定和相关处理后可以进行杂交检测,应用芯片专用扫描仪、共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜进行杂交信号的检测,根据各个探针位点的荧光信号的强弱进行比较,本发明的优点提高诊断效率和诊断准确性、降低检测成本、缩短诊断时间。文档编号C12Q1/68GK1284568SQ9911079公开日2001年2月21日申请日期1999年8月13日优先权日1999年8月13日发明者杨梦甦,缪金明申请人:杨梦甦