固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉及功能性大豆蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及豆粉及大豆蛋白，特别是涉及一种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的 豆粉及蛋白的方法；属于食品加工技术领域。
【背景技术】
[0002] 我国人均资源相当匮乏，巨大的人口总量和物质需求与生态环境的有限承载能力 和脆弱性之间的矛盾日益尖锐，且中国人口在急速老龄化。人口老龄化和不合理膳食等原 因可能导致老年性骨质疏松、糖尿病及其它相关疾病高发，特别是更年期妇女面临的形势 更为严峻。由于雌性激素分泌水平下降，处于更年期和绝经后的妇女很容易并发其他的一 些疾病，如乳腺癌、更年期忧郁症。因此，针对中老年特别是更年期和绝经后妇女，合理补充 植物蛋白和植物雌激素来实现健康保健和疾病的防治尤为重要。
[0003] 大豆蛋白作为食品配料广泛用于各类体系中。在国际市场上，美国有2500余种食 品需要添加大豆蛋白，日本每年消耗大豆蛋白达60余万吨。相对于蛋白质的加工功能特 性，人们对食品蛋白的营养和特殊功能性要求逐渐迫切。目前，大豆蛋白食品由于其在慢性 疾病的预防作用，作为健康食品在欧美市场上正以10%的速度增长，种类增加到了万余种。 对于特殊人群的不同需要应该开发特定的功能性蛋白产品，如更年期妇女需要食品蛋白质 具有如减肥、降血脂、预防糖尿病、预防更年期综合症和骨质疏松的特殊功能。
[0004] 大豆除了含有丰富的植物蛋白，也含有大量具有生物活性的多酚。异黄酮作为大 豆中存在的活性成分，表现较强的抗氧化活性、抗真菌活性，抗肿瘤、改善心血管功能、提高 机体免疫力，有效预防和减轻骨质疏松、妇女更年期综合症等多种疾病的活性。普遍认为， 食品中的异黄酮主要以糖苷的形式存在，几乎不能为人体细胞所吸收，生物利用率较低，只 有在人体消化酶（特别是0 -葡萄糖苷酶）作用下转化为苷元形式才能被吸收，表现出较 高的生物活性。近些年发现，大豆组织在遭遇外界刺激或感染病菌后合成并积累的植物抗 毒素，对人体同样具有多重生物学功效，如抗氧化、抗炎、抗癌等，在功能食品和膳食补充剂 领域有着广阔的应用前景。异戊烯基异黄酮（Glyceollins)作为大豆在生物或非生物因素 诱导下累积形成的植物抗毒素之一，表现了强大的生物活性功能，抗癌、降脂、降血压等功 能。研宄发现，食品级的酱油曲霉等真菌可以诱导异黄酮转化为更高活性的Glyceollin。 此领域的基础研宄及产品开发逐渐成为热点问题。
[0005] 在特殊人群专用保健食品开发方面，强化大豆蛋白中的生物活性成分含量是行之 有效的方法之一。从国际食品业的发展趋势看，功能性大豆蛋白食品即将成为21世纪促进 人类健康的基本保健食品和主流食品。富含生物活性苷元型异黄酮和Glyceollins的豆 粉及大豆蛋白的开发将满足中老年特殊人群对功能性食品的强大市场需求。富含苷元及 Glyceollins的大豆所表现出的抗肿瘤、改善心血管疾病及预防骨质疏松的活性在一定程 度上与大豆中的多酚-蛋白质相互作用有关，而目前并未存在Glyceollins与蛋白质相互 作用的蛋白产品的研宄。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种固体发酵法制备 富含苷元型异黄酮及Glyceollins的功能性大豆粉及蛋白的方法。
[0007] 本发明针对目前专用蛋白配料应用面窄的现状，从营养性质出发，拟利用固态发 酵等生物转化技术，通过合理的设计，将大豆中糖苷型异黄酮转化为具有更高生物活性的 苷元型异黄酮和Glyceollins，制备富含异黄酮苷元和Glyceollins的豆粉及大豆蛋白配 料。
[0008] 本发明目的通过如下技术方案实现：
[0009] -种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的豆粉的方法：将米曲霉孢子悬浮液接种于 已浸泡6~12h，去皮、损伤的大豆中；得到染菌的大豆；将染菌的大豆置于培养皿中，封口 膜密封，20~30°C暗箱中进行固态发酵3~5d，冻干、粉碎，得到富含大豆抗毒素的豆粉。 [0010] 优选地，所述曲霉孢子悬浮液按国标SB/T10815 - 1999《孢子数测定法》方法制 备。
[0011] 优选地，所述接种是以个作为孢子数单位，将1. 〇~4.OmL孢子数分别为IX107~ 5X107个、1X10 8~5X10 8个和1X10 9~5X10 9个的米曲霉孢子悬浮液分别接种于4~ l〇g大豆中。
[0012] 一种固体发酵法制备富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法：将所述富含大豆 抗毒素的豆粉用正己烷进行脱脂，即可得到富含大豆抗毒素的脱脂豆粉；
[0013] 将所得脱脂豆粉过筛，分别以g和mL作为质量和体积的单位，将脱脂豆粉按 1:10~1:15的料液比分散于去离子水中，用氢氧化钠调节料液的pH值至8. 0~9. 0,室温 搅拌50~60min，离心后收集上清液；将上清液用盐酸调pH至4. 5~5. 0,静置30~40min 后，离心，所得沉淀用湿重7~10倍去离子水重新分散，调节其pH至中性后，即得富含大豆 抗毒素的功能性大豆蛋白。
[0014] 优选地，所述脱脂是分别以g和mL作为质量和体积的单位，将富含大豆抗毒素的 豆粉与正己烷按照1:10~1:15混合。
[0015] 优选地，所述盐酸和氢氧化钠的浓度为1. 0~2. 0mol/L。
[0016] 优选地，所述离心的转速都为6000~8000rpm/min;离心的时间都为10~20min。
[0017] 优选地，所述过筛为过60目筛。
[0018] 应用本发明方法，所得的3d发酵豆粉中糖苷大部分转化为苷元，且Glyceollins 得到了最大富集；通过碱溶酸沉所提取得到的大豆蛋白中蛋白得率多56. 13%，糖苷含量 降低，苷元及Glyceollins含量显著增加。
[0019] 相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
[0020] 1)现有技术多采用外源添加异黄酮及其转化酶等技术实现异黄酮的生物转化和 异黄酮在大豆蛋白中的富集，存在需要用有机溶剂以及乳化剂等不安全因素；本发明通过 微生物转化技术生产富含植物抗毒素的功能蛋白配料，不仅能克服大豆分离蛋白未形成生 产能力的局限，而且工艺条件温和，不需要加入有机溶剂和乳化剂等化学成分，安全性好。
[0021] 2)本发明以高异黄酮大豆种子为主要原料，通过利用具有较高生物转化活性的米 曲霉对大豆进行侵染，在固体发酵过程中实现糖苷型异黄酮向具有更高生物活性的苷元型 异黄酮及Glyceollins的转化和积累，明确大豆种子固体发酵工艺，实现Glyceollins的积 累。
[0022] 3)本发明利用生物转化理念获得具有良好生物适用性的高苷元型异黄酮及 Glyceollins功能性大豆豆粉及蛋白配料，建立低成本的大豆加工新技术，开发功能性保健 食品。
【附图说明】
[0023] 图1为六种大豆异黄酮混标的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0024] 为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的发明，但实施 例不构成对本发明保护范围的限定。
[0025] 本发明中蛋白含量采用GB/T5009. 5 - 03凯氏定氮法测定，用于计算蛋白提取率。
[0026] 本发明获得的豆粉及蛋白样品中异黄酮含量采用液相色谱法测定，液相色谱测定 条件及计算方法参考国标GB/T23788 -2009,其中，Glyceollins(Glys)的含量以大豆苷元 标品进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)。
[0027] 实施例1
[0028] 未损伤组：取6g大豆种子，用70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后 用无菌水25°C浸泡12h，去皮。将1. 5mL孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个）加入大 豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 - 30瓣，封口膜密封，25°C 暗箱培养，所得发酵豆子冻干备用。
[0029] 损伤组：取大豆种子，用70 %的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后用无 菌水25°C浸泡12h，去皮，并用手术刀在豆子表面各划3次进行损伤处理。
[0030] 将1.5mL孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107)加入损伤后的大豆中，用无菌勺 子混匀。将已染菌的6g大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封口膜密封，25°C暗箱培养3d， 所得发酵豆子冻干、粉碎、备用。以未接种大豆种子（〇)作为空白对照。
[0031] 获得的豆粉样品（损伤组和未损伤组）中异黄酮含量采用液相色谱法测定，液相 色谱测定条件及计算方法参考国标GB/T23788 - 2009,具体是根据附图1中3种糖苷型和 3种苷元型异黄酮的出峰时间，结合国标GB/T23788 -2009,对实施例1中各种样品中6种 异黄酮及Glyceollins的含量进行计算，其中，Glyceollins(Glys)的含量以大豆苷元标品 进行当量计算，单位为大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)，经计算，测试结果如表1。
[0032] 表1实施例1中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)变化
[0033] CN104905162A 说明书 4/7 页
[0034] 由表1可知，损伤处理组中的总异黄酮糖苷和总苷元含量分别为224. 67mg/kg 和892. 51mg/kg，而未损伤处理组中总异黄酮糖苷和总苷元含量则分别为852. 96mg/kg 和309. 05mg/kg，损伤对发酵大豆中Glyceollins的生成量有显著的影响，损伤处理的发 酵大豆中Glyceollins的含量是未损伤发酵大豆中的4倍。损伤作为大豆中苷元转化 为植物抗毒素的诱导子之一，由于菌种等因素的影响，其与微生物诱导子结合对发酵生成 Glyceollins的研宄结果不同，在米曲霉侵染的条件下，损伤不仅能促进大豆中异黄酮糖苷 转化为苷元，还能大大促进Glyceollins的积累。
[0035] 实施例2
[0036] 取6g大豆种子，用质量浓度70%的酒精浸洗2min，接着用无菌水浸洗3次，最后 用无菌水25°C浸泡12h，去皮，损伤。将1.5mL孢子悬浮液（米曲霉孢子数为1X107个） 加入损伤后的大豆中，用无菌勺子混匀。将已染菌的大豆置于培养皿中，每皿25 -30瓣，封 口膜密封，25°C暗箱分别培养0d、ld、3d、5d，所得发酵豆子冻干、粉碎、备用。以未接种大豆 (〇)作为空白对照。测试方法同实施例1，测试结果见表2。
[0037] 表2实施例2中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)变化
[