一种饲料添加剂产品的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种饲料添加剂产品，重量份数组成如下：植物乳杆菌混合菌粉15?30,花椒粉1?2，黄芪萃取物3?5，大豆多肽3?5，枯草芽孢杆菌粉5?15,灵芝菌固体发酵培养物3?8。本发明通过科学复配，将枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、灵芝菌实现了有机组合，强化了益生菌组分在其中的含量，特别是灵芝菌培养中添加了中药成分，本发明产品可以有效降低抗生素类药物在饲养动物中的使用量，提高动物肉制品的安全性，提高动物的饲料利用效率，增强动物的免疫力，提高饲养效益。CGMCC NO.1176320151130CGMCC No.940520140702CGMCC No.601220120416
【专利说明】
一种饲料添加剂产品
技术领域：
[0001] 本发明属于饲料领域，尤其涉及饲料添加剂。
【背景技术】：
[0002] 为了预防和治疗动物疾病，常使用过量抗生素产品来确保动物健康，但过量抗生 素的使用常导致动物肉制品及其产物的品质下降和抗生素耐性增强，通过食物链的传递导 致人类健康也受到抗生素问题的严重影响。源自自然界的一些天然物质不仅具有良好的营 养特性，同时还具有抗病毒、消炎、抗氧化、调节机体免疫功能等作用，具有广阔的应用前 景。
[0003] 大豆多肽易消化吸收性，促进能量代谢，从而显现出抗肥胖作用;促过度疲劳恢复 精神、体力的效果;增加肌肉的耐力，促进肌红蛋白恢复;有低抗原、低过敏性等作用；
[0004] 灵芝[Ganoderema lucidum(Leyss ex Fr. )karst]，又称灵芝草，属担子菌亚门、 多孔菌目、灵芝科、灵芝属。历代的医典把灵芝归位于"上上药"，其排位在人参之前。《神农 本草经》、《本草纲目》记载，灵芝可明目、补肝气、安神、益精、益心气、益脾气、益肺气、益肾 气、通九窍、耳聪、目明、利关节、利尿、养颜美容，是上好的滋补佳品。灵芝多糖能促进蛋白 质、核酸的合成，对血清、肝脏及骨髓细胞蛋白质或核酸的更新、合成有促进作用，它是灵芝 扶正固本的主要有效成分之一。灵芝多糖主要存在于灵芝真菌子实体、菌核、菌丝体或发酵 液中；存在于灵芝中的灵芝酸有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、毒杀肿瘤细胞的 功用，是灵芝的主要有效成分之一。
[0005] 复合植物提取物饲料添加剂专利号为201210143338.3,发明公开了一种复合植物 提取物饲料添加剂，本发明属于饲料领域，特别涉及饲料添加剂。本发明饲料添加剂组成 为:牛膝多糖，紫苏提取物，酵母细胞壁提取物，枯草芽孢杆菌冻干菌粉，低聚果糖;枯草芽 孢杆菌为CGMCC6012,上述比例为质量百分比。本发明产品可以有效降低抗生素类药物在饲 养动物中的使用数量，提高饲养动物的免疫力，提高动物肉制品的安全性，提高动物的饲料 利用效率，减少常规饲养中抗生素及药品的使用，增强动物的抵抗能力，提高饲养效益。
[0006] 如何有效开发以天然植物或真菌获得绿色饲料添加剂产品对饲料添加剂行业发 展具有重要意义。
【发明内容】
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[0007] 本发明提供一种营养饲料添加剂产品；
[0008] 重量份数组成如下：
[0009] 植物乳杆菌混合菌粉15-30，花椒粉1-2，黄芪萃取物3-5，大豆多肽3-5，枯草芽孢 杆菌粉5-15,灵芝菌固体发酵培养物3-8。
[0010] 植物乳杆菌混合菌粉中两种菌份数组成为:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2-5份，植 物乳杆菌CGMCC 11763菌粉5-8份；
[0011] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)为CGMCC6012。
[0012] 灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下：
[0013] 斜面菌种活化培养:将保藏的灵芝斜面菌种转接到斜面培养基上，22-28Γ培养 96-120小时左右，至菌丝长满斜面即可;最佳培养温度25°C。
[0014] 1.液体一级种子培养:将上述灵芝斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的 500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床80-180转/分，22-28°C培养96-130小时左右;旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25 °C为宜。
[0015] 2.液体二级种子培养:将一级摇瓶种子以5-20 %接种量接入装有100毫升培养基 的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件:旋转式摇床80-180转/分，22-28°C培养96-130小时左右;合适接种量为10%，旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25°C为宜。
[0016] 3.固体发酵培养:将二级摇瓶种子以5-10%接种量接入装有灭菌后固体发酵培养 基的500L固体发酵罐中，培养条件：装料量50 %，培养温度20-27 °C，湿度75-90 %，通风量 0.3-1.0(V/V)，培养时间15-40天。每隔3-10天开启搅拌10分钟。采用SGF固体发酵罐。
[0017] 4.发酵培养结束，选择流化床等多种干燥方法，将物料干燥到水分含量在7 %以 下。对固体发酵物料进行粉碎。
[0018] 本发明固体发酵培养基的碳源主要选择麸皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯 (粉碎后）等常用原料，氮源可以选择花生饼粉、蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、酵母粉 等;需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁。
[0019] 在上述固体发酵培养基中添加有质量比为2-6%切粒粉碎后的黄芪。
[0020] 所述黄芪萃取物制备方法如下：
[0021] 黄芪粉碎，过40-50目筛后，添加黄芪3-6倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度30-45°C，2-4小时后调整温度为55-60°C 1-2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取 后的黄芪残渣中添加75-85 °C热水，热水添加量为黄芪残渣重量的2-4倍，处理时间30-50分 钟，连续提取2-3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物;将上述乙醇提取物和 热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得黄芪提取物。
[0022]所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CGMCC6012,冻干菌粉中活菌数量为4-8X108 个/g。所述复合饲料添加剂由以下方法制得：
[0023]植物乳杆菌混合菌粉，花椒粉，黄芪萃取物，大豆多肽，枯草芽孢杆菌粉，灵芝菌固 体发酵培养物组分按照比例混合得到饲料添加剂。
[0024] 大豆多肽采用市售大豆多肽产品，分子量在500Da~700Da之间。
[0025] 生产用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌种，该菌株已经于2012年4月16日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，（邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.6012。
[0026] 本发明中植物乳杆菌CGMCC 9405菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆 状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢;在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致 密，形态为圆形，边缘较整齐。
[0027] 理化特征为:过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验( + )，运动性(-)，发酵产气 (_)，亚硝酸盐还原(_)，发酵产气(_)，产硫化氢气体(_)，pH4.0MRS培养基中生长(+ )。
[0028] 本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育：
[0029]原始出发菌种-试管活化-硫酸二乙酯(DES)诱变-亚硝基胍(NTG)诱变-等离 子体诱变4平板初筛-摇瓶复筛4传代稳定性试验。
[0030]本发明所采用的出发菌株在MRS葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/L/d， 当培养基pH为3.5时几乎停止生长，对亚硝酸钠的分解速率为0.34mg/h/kg白菜。出发菌株 为李政采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。
[0031]为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用DES和NTG 技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发 酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验， 评价其遗传稳定性。
[0032]植物乳杆菌tlj-2014遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都 比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把植物乳杆菌tlj-2014作为选育得到的目的菌 株。
[0033] 经验证发现:该诱变菌株的乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发 酵后乳酸浓度达到95g/L;能够在pH为1.80的条件下存活。降解亚硝酸盐速度快，分解能力 达到9.8mg/h/kg(自然发酵过程亚硝酸盐积累的速率大约为1. lmg/h/kg)，能够耐1%胆盐。 [0034]因此采用该菌种生产泡菜，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在5mg/kg以下，远低于 国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
[0035] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) tlj-2014，该菌株已于2014 年7月2 日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101)，保藏号为CGMCC N0.9405。
[0036] 1. DES诱变选育
[0037] 1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L 一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 月旨，葡萄糖20g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于对数生 长前期。
[0038] 2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0039] 3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
[0040] 4)取32mL pH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL 三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1 % (v/v)。
[0041 ] 5)在37°C摇床中150rpm反应30min，取lmL混合液，加入0 · 5mL 25 %Na2S2〇3溶液中 止反应。
[0042] 6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡 萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37°C培养2~3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株 转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养 基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。
[0043] 7)在37°C培养2~3天后，挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培 养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆菌L1。 [0044] 2.亚硝基胍诱变
[0045] 1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L1 一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 月旨)培养基(葡萄糖浓度为60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于 对数生长前期。
[0046] 2)取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0047] 3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
[0048] 4)取10mL菌悬液转移至lOOmL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0049] 5)在37°C下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水 洗涤数次，中止反应。
[0050] 6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡 萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37°C培养2~3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株 转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养 基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。
[0051 ] 7)挑选菌株方法:挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上 生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合以上条件的菌落。
[0052] 3.摇瓶复筛
[0053] 1)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL培养基MRS (无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为l〇〇g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养15h左右，使菌 体处于对数生长中期。
[0054] 2)分别取5mL菌液，接入装有50mL碳酸钙筛选液体培养基(含250g/L葡萄糖的碳酸 钙MRS培养基)平皿中、pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS液体培养基(低pH值改性MRS培养基）和 亚硝酸钠液体筛选培养基（单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基）上（注:采用 250mL三角瓶）。200印!11，37°(：培养3-4天，每天分别检测碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产 生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速 率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体 培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。
[0055] 3)选择兼具高L-乳酸产生速率、耐受低pH(该菌种仅能在最低为pHl. 8的培养基中 生长)和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为L2菌。
[0056] 4.遗传稳定性试验
[0057] 将L2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情 况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说 明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)tlj-2014。
[0058] 5.5L发酵罐试验
[0059] 1)取斜面上的植物乳杆菌L2-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂）（葡萄糖浓度 为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。
[0060] 2)将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵 罐中。接种量为10%，37°(：下100印111培养8小时，对数前期溶氧控制10%(通气0.5171^11)，后 期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌L2的乳酸产量达到95g/L。这样的产乳酸速率 利于泡菜的快速发酵。
[0061 ] 3)将对数期的菌种接入装有3L pH为1.8的LPHMRS液体培养基(初始葡萄糖为50g/ L)的5L发酵罐中。接种量为10%，37°C下lOOrprn培养8小时，对数前期溶氧控制10 % (通气 0.5L/min)，后期厌氧，整个过程用0.5mol/L的氢氧化钠将发酵液pH控制在1.8，总培养时间 为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌L2的生物量为2.5g/L，说明植物乳杆菌L2能够在 pHl.8的环境中生存。
[0062] 4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸 钠的改性MRS筛选培养基）的5L发酵罐中。接种量为10 %，37 °C下1 OOrpm培养8小时，对数前 期溶氧控制10% (通气〇.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L 的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌L2对亚硝酸钠的降解 速率。结果发现:在该条件下，L2对亚硝酸钠的降解速率可以达到563mg/h/L。
[0063] 5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行 加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，L2菌对亚硝酸 钠的分解速率为9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于5mg/kg，远低于国家标 准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
[0064] 发明所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.11763,保 藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编： 100101。。
[0065] 植物乳杆菌益生特性如下：
[0066]本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC N0.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件 下存活，在1%胆盐培养4小时后仍处于存活状态;植物乳杆菌CGMCC N0.11763降解亚硝酸 盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓 度在4.8mg/kg以下；CGMCC N0.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76%。 CGMCC N0 · 11763黏附能力测定的自凝集率为95 · 71 %。
[0067] CGMCC N0.11763对胆固醇降解能力研究和测定：
[0068] 取lml CGMCC N0.11763母液接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基（胆固醇含量 0. 1mg/ml，pH 6.2)中，37°C的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入lmL无菌水的MRS 胆固醇培养基为对照，取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各lml，9000r/min，4°C下 离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为:取各上清液 0 . lml于相应的试管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸 1. 〇ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值）。每一处理3个重复，以同样方法制 作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率，结果见表1。可知，CGMCC NO. 11763 对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76%。
[0069]表1对胆固醇的降解情况
[0071] CGMCC N0 · 11763菌株的耐胆盐试验：
[0072] 取CGMCCN0.11763菌液lmL接种菌种于含有不同胆盐（含量梯度为0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、1%)的1011^]\?5液体培养基(？!1=6.4)，置于37°(：下分别培养0、2、411， 每个处理3个重复。各取lml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释 液于MRS中涂布，于37°C生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平 板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1 %处理4h后菌的生长量依然达到 0· 59±0·92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。
[0073] 表2耐胆盐能力检测[(土s) X 107cfu/ml]
[0074]
[0075] 0611〇：从).11763菌株的耐酸试验
[0076] 取CGMCC腸.11763母液按11111接种菌种于不同口!1值化!1梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的10mL MRS液体培养基，置于37 °C下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取lml 样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37°C生化 培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说 明该菌具有很强的耐酸能力。
[0077]表3 耐酸能力检测[(土s) X 107cfu/ml]
[0078]
[0079] CGMCC NO.11763菌株的黏附能力测定
[0080] 培养CGMCC NO. 11763(MRS液体培养基）、大肠杆菌DH5a(LB液体培养基)24h得发酵 液，分别置于3000r/min、4°C下离心10min，收集菌泥，分别用pH = 7.0的无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4°C下离心 lOmin，收集菌体）。自凝集率（％ :用无菌的roS将菌泥CGMCC NO. 11763制成在波长600nm处 的吸光值为0.4 ±0.1 (A 0)的悬浮菌液及菌悬液，静置24h后测定吸光值A 24,自凝集率 (%)公式为(A 0-A 24)/A 0。；他凝集率（％):将CGMCC如.11763和大肠杆菌0耶€[的悬菌 液调节成在波长600nm处的吸光值为0.6±0.1 (A 0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光 值A 24,他凝集率（％ )公式为(A 0 -A 24)/A 0。测定结果见表4,可知CGMCC N0.11763的自 凝集率为95.71 %，有很强的黏附能力。
[0081 ]表4黏附能力表
[0082] 菌株生理特性
[0083] 所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.11763,保藏地 址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。 [0084]该菌株特点如下:在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛， 不产芽孢;在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
[0085] 理化特征为:过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验( + )，运动性(-)，发酵产气 (_)，亚硝酸盐还原(_)，发酵产气(_)，产硫化氢气体(_)，pH4.0MRS培养基中生长(+ )。经过 生理生化鉴定为为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)，命名为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)XH〇
[0086] 菌株能够在57°C下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。
[0087] 本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆维吾尔族老乡家中酸奶中分离得到， 采集时间2015年6月2日。
[0088] 5L发酵罐试验
[0089] (1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC N0.11763-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 脂）（葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处 于对数生长中期。
[0090] (2)将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵 罐中。接种量为10%，37°(：下100印111培养8小时，对数前期溶氧控制10%(通气0.5171^11)，后 期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌CGMCC N0.11763的乳酸产量达到110g/L。这样 的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。
[0091] (4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝 酸钠的改性MRS筛选培养基）的5L发酵罐中。接种量为10 %，37°C下lOOrprn培养8小时，对数 前期溶氧控制10% (通气〇.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加 20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCC N0.11763 对亚硝酸钠的降解速率。结果发现:在该条件下，XH对亚硝酸钠的降解速率可以达到653mg/ h/L〇
[0092] (5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行 加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，XH菌对亚硝酸 钠的分解速率为10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于4.8mg/kg，远低于国家 标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
[0093] 有益效果：
[0094] 枯草芽孢杆菌:具有如下功能：1.耗氧产酸，调节肠道微生态平衡，达到预防腹泻、 下痢等疾病;2.分泌多种酶类，提高饲料消化利用率;3.产生多种营养素，参与机体新陈代 谢;4.提高动物免疫力。本发明黄芪进行粉碎破壁处理，使黄芪中功能因子实现全价溶出和 高效提取利用，分别采用有机溶剂和热水实现其中不同功效成分的有效提取，特别是控制 温度分段提取更是有效提高了黄芪提取物的提取效率和质量。
[0095] 本发明通过科学复配，将枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、灵芝菌实现了有机组合，强 化了益生菌组分在其中的含量，特别是灵芝菌培养中添加了中药成分，本发明产品可以有 效降低抗生素类药物在饲养动物中的使用量，提高动物肉制品的安全性，提高动物的饲料 利用效率，增强动物的免疫力，提高饲养效益。
[0096] 具体实施方法：
[0097] 本发明中灵芝菌培养物生产过程如下：
[0098] (1)斜面菌种活化培养：
[0099] (2)液体一级种子培养：
[0100] (3)液体二级种子培养：
[0101] (4)固体发酵培养：
[0102] (5)发酵培养结束，选择流化床等多种干燥方法，将物料干燥到水分含量在7%以 下。对固体发酵物料进行粉碎。
[0103] 本发明所用灵芝菌种购于中国工业微生物菌种保藏中心，菌号CICC14080。
[0104] 本发明中斜面培养基组成可以为PDA斜面培养基或其他合适培养基。
[0105]本发明固体发酵培养基的碳源主要选择麸皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯 (粉碎后）等常用原料，氮源可以选择花生饼粉、蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、酵母粉 等;需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁。
[0106] 在发酵培养基中还添加有质量比为2-6 %粉碎后过40-50目的花椒；
[0107] 本发明中液体发酵种子培养基组成:淀粉2-3 %，蔗糖3-5 %，葡萄糖1-3 %，蛋白胨 0.5%，脱脂大豆蛋白粉2-3 %，磷酸二氢钾0.13-0.2%，硫酸镁0.1-0.15 %，维生素 h 2PPm，PH6-7。
[0108] 本发明中灵芝培养方法适合同属其它菌种通过发酵法进行大规模发酵培养。
[0109] 菌种诱变
[0110] 采取紫外诱变方法：以CICC10023为出发菌株，制成菌悬液，涂布于培养基平皿上， 紫外照射90s后37 °C培养箱中培养。
[0111] 菌种筛选
[0112]从90s平皿上挑30个长得强壮的单菌落，接种于斜面上，37°C培养箱中，培养24小 时，0--4Γ冷藏保存；以原始菌种作为对照，采用常规选育条件，羧甲基纤维素钠作为碳源 和蛋白水解圈方法筛选产纤维素酶和蛋白酶强的菌株，筛选获得产纤维素酶和蛋白酶强的 菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ll，此菌株产纤维素酶能力比原始菌株提高了 25%，产蛋白酶能力比原始菌株提高了 52%。将该菌种在中国普通微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No 6012。
[0113] 本产品所用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌种，该菌株已经于2012年4月16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，（邮编100101)，保藏编号为CGMCC N〇6012。
[0114] 通过实验研究表明：本发明产品具有良好的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、等致 病菌的特性。采用杯碟法对灵芝饲料添加剂产品的抑菌效果进行了研究，试验采用饲料添 加剂的10倍水浸提液进行研究。实验结果见表1，结果表明本发明产品具有抑制致病菌生长 的良好特性。
[0115] 表1饲料添加剂产品的抑菌效果
[0117] 本发明产品的性能稳定，使用安全，与其它饲料添加剂均无配合禁忌。本发明产品 在饲料中的添加量为1-2%，它完全可以替代抗生素药物，且无残留，不污染环境。饲用后， 可显著增强动物机体的免疫力和抗病力，促进生长，提高日增重和饲料转化率，并有抗应 激、抗氧化效果；同时对肠道细菌性疾病有较强的预防作用。据试验，饲用本发明饲料添加 剂的水产品，品质得到改善，符合动物性食品的绿色化生产要求，社会效益和经济效益十分 显著。
[0118] 本发明产品以生物发酵法生产的中国传统食用菌为原料，产品质量稳定可控，产 品在体内无残留、无环境污染、无抗药性，而且可以提高免疫力、具有强的抑菌作用，能够提 高养殖效益。产品完全符合绿色饲料添加剂的要求。
[0119] 由于灵芝具有较高的营养价值和抑菌功能，能够增强动物的免疫力，而且无残留， 对环境无污染。通过生物发酵技术生产灵芝并将其加工为饲料添加剂，完全符合当今饲料 添加剂的发展方向，是一种绿色饲料添加剂。
[0120]实施例1(饲料添加剂产品）
[0121] 本发明提供一种营养饲料添加剂产品，100公斤。
[0122] 重量份数组成如下：
[0123] 植物乳杆菌混合菌粉20，花椒粉1，黄芪萃取物3，大豆多肽5，枯草芽孢杆菌粉15， 灵芝菌固体发酵培养物3。
[0124] 植物乳杆菌混合菌粉中两种菌份数组成为:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份，植物 乳杆菌061〇： 11763菌粉8份；
[0125] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)为CGMCC6012。
[0126] 灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下：
[0127] 斜面菌种活化培养:将保藏的灵芝斜面菌种转接到斜面培养基上，26°C培养120小 时左右，至菌丝长满斜面即可;最佳培养温度25°C。
[0128] 1.液体一级种子培养:将上述灵芝斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的 500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件:旋转式摇床120转/分，25 °C培养120小时左 右;旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25 °C为宜。
[0129] 2.液体二级种子培养:将一级摇瓶种子以10 %接种量接入装有100_升培养基的 500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件:旋转式摇床120转/分，25 °C培养96小时左右； 合适接种量为10%，旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25°C为宜。
[0130] 3.固体发酵培养:将二级摇瓶种子以8%接种量接入装有灭菌后固体发酵培养基 的500L固体发酵罐中，培养条件:装料量50 %，培养温度25°C，湿度85 %，通风量0.6 (V/V)， 培养时间30天。每隔6天开启搅拌10分钟。采用SGF固体发酵罐。
[0131 ] 4.发酵培养结束，选择流化床等多种干燥方法，将物料干燥到水分含量在7 %以 下。对固体发酵物料进行粉碎。
[0132]本发明固体发酵培养基的碳源主要选择麸皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯 (粉碎后）等常用原料，氮源可以选择花生饼粉、蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、酵母粉 等;需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁。
[0133] 在上述固体发酵培养基中添加有质量比为2-6%切粒粉碎后的黄芪。
[0134] 所述黄芪萃取物制备方法如下：
[0135] 所述黄芪萃取物制备方法如下：
[0136] 黄芪粉碎，过40-50目筛后，添加黄芪5倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度45°C，2 小时后调整温度为60°C2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的黄芪残渣 中添加80-85 °C热水，热水添加量为黄芪残渣重量的3倍，处理时间50分钟，连续提取3次，将 提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物;将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎， 过60目筛，即得黄芪提取物。
[0137] 所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CGMCC6012,冻干菌粉中活菌数量为4-8X108 个/g。所述复合饲料添加剂由以下方法制得：
[0138] 植物乳杆菌混合菌粉，花椒粉，黄芪萃取物，大豆多肽，枯草芽孢杆菌粉，灵芝菌固 体发酵培养物组分按照比例混合得到饲料添加剂。
[0139] 大豆多肽采用市售大豆多肽产品，分子量在500Da~700Da之间。
[0140] 实施例2
[0141] 本发明提供一种营养饲料添加剂产品，100公斤。
[0142] 重量份数组成如下：
[0143] 植物乳杆菌混合菌粉30，花椒粉1，黄芪萃取物3，大豆多肽5，枯草芽孢杆菌粉10， 灵芝菌固体发酵培养物5。
[0144] 植物乳杆菌混合菌粉中两种菌份数组成为:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份，植物 乳杆菌061〇： 11763菌粉6份；
[0145] 实施例4
[0146] 本发明提供一种营养饲料添加剂产品，100公斤。
[0147] 重量份数组成如下：
[0148] 植物乳杆菌混合菌粉20，花椒粉1，黄芪萃取物3，大豆多肽5，枯草芽孢杆菌粉5，灵 芝菌固体发酵培养物4。
[0149] 植物乳杆菌混合菌粉中两种菌份数组成为:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份，植物 乳杆菌061〇： 11763菌粉5份；
[0150] 产品使用效果
[0151] 本发明例1饲料添加剂在断奶仔猪中的使用效果试验
[0152] 试验方法：
[0153] 试验动物选择宁夏某饲料有限公司下属养殖场平均体重为(7.16 ± 0.15)kg的健 康断奶仔猪120头，经统计分析体重差异不显著。采用单因子随机化设计，将120头健康断奶 仔猪，按公母各半，分成2组(对照组和试验组），每组6个重复，每个重复10头猪。试验组添加 实施例1制得的本发明产品，对照组不添加本发明产品。连续饲喂30天，与对照组相比，使用 发明饲料添加剂可获得如下效果：
[0155] 试验结果表明，在断奶仔猪日粮中添加本产品，仔猪的日增重比对照组有较大提 高;料肉比有明显降低;腹泻率降低显著。
[0156] 本发明例1饲料添加剂在哺乳母猪中的使用效果试验
[0157] 在宁夏某饲料有限公司下属猪场进行了为期21天的饲喂试验。试验采用单因素对 比设计，随机选取30头健康的、产仔头数与出生均重相近的、胎次均为2或3胎的哺乳母猪， 随机分为2组（即试验组和对照组），每组15个重复。其中：试验组日粮添加由实施例2制备得 的本产品，对照组不添加本发明产品。记录仔猪断奶重、腹泻率、死亡率。
[0159]试验表明本发明产品可改善母猪和仔猪机体免疫能力，减少抗生素用量，增加养 殖质量和效益。
【主权项】
1. 一种饲料添加剂产品，重量份数组成如下：植物乳杆菌混合菌粉15-30,花椒粉1-2， 黄芪萃取物3-5，大豆多肽3-5，枯草芽孢杆菌粉5-15，灵芝菌固体发酵培养物3-8。2. 根据权利要求1所述饲料添加剂产品，其特征在于所述植物乳杆菌混合菌粉中两种 菌份数组成为:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2-5份，植物乳杆菌CGMCC 11763菌粉5-8份。3. 根据权利要求1所述饲料添加剂产品，其特征在于所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)SCGMCC6012。4. 根据权利要求1所述饲料添加剂产品，其特征在于所述灵芝菌固体发酵培养基中添 加有质量比为2-6 %切粒粉碎后的黄芪。5. 根据权利要求1所述饲料添加剂产品，其特征在于所述黄芪萃取物制备方法如下： 黄芪粉碎，过40-50目筛后，添加黄芪3-6倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度30-45°C， 2-4小时后调整温度为55-60°Cl-2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的 黄芪残渣中添加75-85°C热水，热水添加量为黄芪残渣重量的2-4倍，处理时间30-50分钟， 连续提取2-3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物;将上述乙醇提取物和热 水提取物合并粉碎，过60目筛，即得黄芪提取物。6. 根据权利要求1所述饲料添加剂产品，其特征在于，营养饲料添加剂产品重量份数组 成如下:植物乳杆菌混合菌粉30，花椒粉1，黄芪萃取物3，大豆多肽5，枯草芽孢杆菌粉10，灵 芝菌固体发酵培养物5。7. 根据权利要求6所述饲料添加剂产品，其特征在于所述植物乳杆菌混合菌粉中两种 菌份数组成为:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份，植物乳杆菌CGMCC 11763菌粉6份。8. 根据权利要求1-7任一所述饲料添加剂产品的制备方法，植物乳杆菌混合菌粉，花椒 粉，黄芪萃取物，大豆多肽，枯草芽孢杆菌粉，灵芝菌固体发酵培养物组分按照比例混合得 到饲料添加剂。
【文档编号】A23K10/12GK105901286SQ201610245090
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】邵素英
【申请人】邵素英