专利名称：人血管内皮抑素在巴斯德毕氏酵母中高效表达纯化的方法及在抗肿瘤血管增殖治疗中弹的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域，具体地说是人血管内皮抑素在巴斯德毕氏酵母中高效表达纯化的方法及在抗肿瘤血管增殖治疗中的应用。
据世界卫生组织的最新统计，肿瘤的发病率和死亡率继心管疾病、感染性疾病之后位居第三。实体肿瘤的临床治疗目前包括手术治疗、放疗、化疗和生物治疗。但以上治疗的非有效性是使肿瘤死亡率居高不下的主要原因。血管生成为实体肿瘤生长与转移的必要条件，丰富的新生血管为不断增殖的恶性细胞提供所需要的营养原料。抑制肿瘤的血管生成，“切断”肿瘤的营养供应从而达到限制肿瘤细胞生长和繁殖，最终以消除肿瘤，为治疗肿瘤提供一全新思路。血管内皮抑素(endostatin)即是近年来发现的具有上述特异抗瘤作用的最有效血管生成抑制因子之一。
运用DNA重组技术，开发研究重组人血管内皮抑素蛋白进行抗肿瘤血管生成虽然在国内外已起步研究，如美国哈佛大学医学院儿童医院Folkman实验室率先克隆了该基因，并尝试了在多个表达系统如大肠杆菌、杆状病毒，哺乳动物细胞表达该基因。公开号为CN1177005A的专利申请也公开了“一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的基因克隆方法及在抗肿瘤血管再生治疗中的应用”，其中也克隆了该基因，并在大肠杆菌中进行了表达，但因为杆状病毒、哺乳动物细胞的表达量偏低，以及该蛋白在大肠杆菌中的表达纯化过程中的部分失活，均限制了该蛋白的大量获取。
本发明的目的是提供一种能大量获得该蛋白的有效方法，为该重组蛋白抗体肿瘤的临床应用成为可能，即人血管内皮抑素在巴斯德毕氏酵母中高效表达纯化的方法及在抗肿瘤血管增殖治疗中的应用。
本发明的目的是这样实现的1、人血管内皮抑素(Human endostatin)的基因克隆及在巴斯德毕氏酵母中大量生产及纯化方法1)人血管内皮抑素基因的克隆及DNA序列分析人血管内皮抑素为胶原蛋白ⅩⅧNC1区域内C末端184氨基酸，其编码基因通过从健康胎肝组织提取总RNA，经RT-PCR获得，RT中以寡聚T和随机引物(Random primer)作为引物，以AMV为反转录酶42℃,1小时。PCR条件为95℃,5分钟；95℃,30秒，60℃,1分钟，72℃,1分钟；38个循环后，72℃,10分钟。PCR中两引物分别为5′GCC CAC ACC CGC GAC TTC3′和5′CTA CTT GGA GGCAGT CAT GAA GC 3′，PCR产物经纯化后克隆到PCR2.1(Invitrogen)中，经转化，挑选白菌落，小量抽提质粒后DNA序列测定；2)合成带限制性内切酶酶切位点的引物①5′CGG TGC GCA CAC AGC CACCGC GAC TTCC 3′,②5′GGA ATT CAC CAT GGC CCA CAG CCA CCG GGA C 3′,③5′GGA ATT CTT ACT ACT TGG AGG CAG TCA TG 3′以经DNA序列鉴定的阳性质粒为模板，分别以①、③和②、③为引物进行PCR扩增；以①、③为引物扩增出的片段经FspⅠ(TGC GCA)、EcoRⅠ(GA ATT C)双酶切后克隆到巴斯德毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9K(Invitrogen)的SnaBⅠ、EcoRⅠ位点；以②、③为引物扩增出的片段经EcoRⅠ酶切后克隆到胞内型表达载体pAO815的EcoRⅠ位点。经体外重组或体内抗生素筛选(G418)得到高效、稳定的表达酵母菌株；3)酵母菌株作为工程菌经发酵、纯化工艺的摸索得到重组人血管内皮抑素；4)将重组人血管内皮抑素加入到经VEGF诱生后的人毛细血管内皮细胞，培养2-3天后通过细胞计数，测量它们的毛细血管内皮细胞增殖抑制作用活性强度。
2、人血管内皮抑素作为重组基因工程药物在治疗实体肿瘤中的应用1)人血管内皮抑素蛋白按每公斤体重20mg肌肉注射接种Lewis肺癌细胞的小鼠，以测量抗肿瘤血管再生作用；2)重组人血管内皮抑素作为重组基因工程药物在实体肿瘤中的应用。
本发明的人血管内皮抑素基因通过RT-PCR方法获得。重组人血管内皮抑素蛋白通过在巴斯德毕氏酵母多拷贝表达系统表达，并经过亲和层折，离子交换树脂、分子筛等蛋白分离纯化技术获得。
本发明与现有技术比较具有如下独特优点重组人血管内皮抑素作为治疗肿瘤已展示了其独特的前景。动物实验及现有临床资料证明，血管内皮抑素抑制肿瘤活性，需要较大的量。如前所述，现有的方法均难以做到，从而大大限制了此因子在临床上的广泛应用，本发明最出的贡献即在于提供了一崭新的表达、纯化方法，使上述问题得以解决，从而该药的产业化成为可能。同时，本发明中所采用的基因克隆方法也为该基因的克隆提供又一途径。此外，重组人血管内皮抑素蛋白专一性作用用于增殖的毛细血管内皮细胞，对机体许多其它细胞不起作用，而实体肿瘤细胞增殖扩大必须伴随肿瘤内血管不断再生，肿瘤内再生的毛细血管内皮不断增殖，肿瘤内已有的毛细血管内皮细胞也不断增殖，所以重组人血管肉皮抑素蛋白专一性抑制这些不断增殖的内皮细胞，使肿瘤血管不能再生或抑制血管再生，肿瘤组织得不到足够的营养供应，也得不到血管内皮细胞增殖所带给肿瘤细胞的刺激，从而实体肿瘤产生萎缩，肿瘤细胞凋亡坏死。
本发明的另一特点是提供了治疗肿瘤的另一手段，即可从抑制实体肿瘤的血液营养供应来达到治疗的目的，并且这一疗法还可结合已有的许多针对肿瘤细胞的疗法(如放疗、化疗等)结合进行，从而抑制实体肿瘤血管再生和间接、直接杀死肿瘤细胞两种疗法同时进行治疗，这样能大大提高其疗效。
以下结合实施例对本发明作进一步的详述，但不限于实施例。
实施例1、用固相合成法人工合成两引物①:5′GCC CAC AGC CAC CGC GAC TTC 3′②:5′CTA CTT GGA GGC AGT CAT GAA GC 3′。
2、取健康人胎肝组织100mg，加入TRIZOL 1ml(GIBCO)，在小匀浆器中匀浆后，转入1.5ml Eppendorf管中，按GIBCO公司提供的方法抽提细胞总RNA，RNA溶于30μl(微升)DEPC水中。
3、RNA经1×TBE1％琼脂糖凝胶电泳电泳检测其完整性后，取RNA4μl,5×RT缓冲液4μl,10mM dNTPS 2μl,0.1M DTT 1μl，多聚T引物0.5μl，随机引物0.5μl,RNA酶抑制剂(20μ/μl)2μl,AMV(20μ/μl)1μl，重蒸水5μl，反应体系为20μl,42℃1小时后，95℃,5分钟。取反转录产物5μl 10×PCR缓冲液50μl，引物①1μl(100pmol/μl，引物②1μl(100pm ol/μl),10mM dNTPS 2μl,Taq DNA pol.1μl，重蒸水35μl，反应体系50μl,PCR条件为95℃,5分钟；95℃,30秒，60℃,1分钟，72℃,10分钟；38个循环后，95℃,10分钟。取5μl经1％琼脂糖凝胶电泳电泳检测PCR扩增产物后，余物电泳回收，并以Qiagen公司胶回收试剂盒回收，回收PCR产物溶于30μ重蒸水中。
4、取回收PCR产物6μl,5×连接缓冲液2μl,PCR2.1 1μl,T4DNA连接酶1μl，连接体系10μl；16℃连接3小时后，转化到大肠杆菌DH5α中，经X-gal IPTG筛选，挑选白色菌落，经小量抽提质粒DNA后，进行DNA序列测定(如图所示)。
5、合成带限制性内切物酶酶切位点的引物①:5′CGG TGG GCA CAC AGC CAC CGC GAC TTC C 3′；②:5′G GA ATT CAC CAT GGC CCA CAG CCA CCG CGA C 3′；③:5′GGA ATT CTT ACT ACt TGG AGG CAG TCA TG 3′；以经DNA序列测定的阳性质粒为模板，分别以①③和②③为引物进行PCR扩增；PCR产物电泳后回收。以①③为引物扩增出的片段经FspⅠ(TGC GCA)、EcoRⅠ(GA ATT C)双酶切后克隆到巴斯德毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9K(Invitrogen)的SnaBⅠ.EcoRⅠ位点，以②③为引物扩增出的片段经EcoRⅠ酶切后克隆到胞内型表达载体pAO815的EcoRⅠ位点。
6、胞内型多挎贝表达质粒的获得单挎贝的重组质粒经酶切鉴定方向后，以BamHⅠ+BglⅡ双酶切，电泳回收1.7Kb表达单位，；同时单挎贝的重组质粒以BamHⅠ单酶切，CIP处理后，同1.7Kb表达单位连接，获得两挎贝表达单位重组质粒，以此类推，获得多挎贝表达单位质粒。
7、胞内型多挎贝表达单位质粒及分泌型重组质粒10μg或以上，经SalⅠ酶切线性化，并经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收DNA,DNA经电转化至酵母菌株GS115中。
8、分泌型多挎贝表达菌株的体内筛选分泌型重组质粒的酵母菌株GS115在YPD含不同浓度的G418培养皿上筛选，G418的最终筛选浓度为4mg/ml。
9、高表达稳定菌株的筛选及保存经体外重组或体内抗生素筛选获得的胞内型、分泌型菌株经培养后裂胞或取上清经SDS-PAGE电泳检测不同菌株的表达水平。挑选最高表达的菌株保存以作为大规模发酵的菌种。
10、重组血管内皮抑素生物学活性的检测人毛细血管内皮细胞培养至6孔培养板上，细胞浓度为5×106/孔，每孔加入10ng VEGF诱导后加入2-10μg不同浓度的重组人血管内皮抑素，同时设立阴性对照，培养3天后通过细胞计数测量抑制抟细血管内皮细胞增殖的活性。
11、小鼠皮下接种肺癌长至100-200立方毫米时，将小鼠随机分成两组，一组作为对照，另一组分别皮下注射重组人血管内皮抑素蛋白，每天每公斤体重注射20mg，连续注射20天，以观察在动物体内抑制实体瘤生长的特性。
权利要求
1.一种人血管内皮抑素的基因克隆及用巴斯德毕氏酵母中大量生产纯化的方法，其特征在于1)人血管内皮抑素基因的克隆及DNA序列分析人血管内皮抑素为胶原蛋白ⅩⅧNC1区域内C末端184氨基酸肽段，编码此肽段基因通过从健康胎肝组织提取总RNA，经RT-PCR获得；2)人血管内皮抑素基因经DNA序列分析确证后，合成带限制性内切酶酶切位点引物后，经PCR扩增得到带适合限制性内切酶切位点的基因片段；3)片段经酶切后克隆到巴斯德毕氏酵母多挎贝表达载体中，经体外重组或体内经抗生素筛选得到高效、稳定表达酵母菌株；4)经发酵、纯化得到的重组人血管内皮抑素具有显著的体外抑制血管内皮细胞增殖和抑制小鼠肿瘤的增长活性作为治疗实体肿瘤的重组基因工程药物。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于RT中以寡聚T和随机引物(Random primer)作为引物，加入AMV42℃,1小时，PCR条件为95℃,5分钟；95℃,30秒，60℃,1分钟，72℃,1分钟℃；38个循环后，72℃,10分钟；PCR中两引物分别为5′GCC CAC AGC CGC GAC TTC 3′和5′CTA CTT GGA GGC AGT CAT GAA GC 3′,PCR产物经纯化后克隆到PCR21中，经转化，挑选白菌落，小量抽提质粒后DNA序列测定。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的合成带限制性内切酶酶切点引物为①5′CGG TGC GCA CAC AGC CAC CGC GAC TTCC 3′；②5′GGA ATT CACCAT GGC CCA CAG CCA CCG CGA C 3′；③5′GGA ATT CTT ACT ACT TGG AGG CAGTCA TG 3′，并以经DNA序列鉴定的阳性质粒为模板，分别以①、③和②、③为引物进行PCR扩增。
4.按权利要求1所述方法，其特征在于以①、③为引物扩增出的片段经FspⅠ、ECORⅠ双酶切后克隆到巴斯德毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ、EcoRⅠ位点；以②、③为引物扩增出的片段经EcoRⅠ酶切后克隆到胞内型表达载体pAO815的EcoRⅠ位点，经体外重组或体内抗生素筛选得到高效、稳定的表达酵母菌株；
5.按权利要求1或4所述的方法，其特征在于酵母菌株作为工程菌经发酵、纯化工艺的摸索得到重组人血管内皮抑素。
6.按权利要求5所述的方法，其特征在于将重组人血管内皮抑素加入到经VEGF诱生后的人毛细血管内皮细胞，培养2-3天后通过细胞计数，测量它们的毛细血管内皮细胞增殖抑制作用活性强度。
7.人血管内皮抑素作为重组基因工程药物在治疗实体肿瘤中的应用，其特征在于1)人血管内皮抑素蛋白按每公斤体重2mg肌肉注射接种Lewis肺癌细胞的小鼠，以测量的抗肿瘤血管再生作用；2)重组人血管内皮抑素作为重组基因工程药物在实体肿瘤中的应用。
全文摘要
本发明是一种人血管内皮抑素在巴斯德毕氏酵母中高效表达纯化的方法及在抗肿瘤血管增殖治疗中的应用。其特征在于:人血管内皮抑素为胶原蛋白ⅩⅧNC1区域内C末端184氨基酸肽段,从健康胎肝组织中提取总RNA,经RT－PCR得到人血管内皮抑素基因,并克隆到巴斯德毕氏酵母多挎贝表达载体中经筛选获得高效稳定表达的酵母菌株,可大量得到重组人血管内皮抑素蛋白。此蛋白能显著抑制血管内皮细胞的增殖和小鼠在体肿瘤的生长。本发明提供了一种崭新的方法,从而使该药的产业化成为可能。同时,该因子为治疗肿瘤提供了又一手段。
文档编号A61K38/17GK1307060SQ0011268
公开日2001年8月8日 申请日期2000年2月2日 优先权日2000年2月2日
发明者彭小忠, 徐林, 杨上川, 郭仁, 谢伯林, 张翔 申请人:昆明广博科技有限公司