专利名称：骨移植内固定内置入促进骨愈合修复骨缺损的天然衍生水牛角的角夹角胎的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种骨移植内固定内置入促进骨愈合修复骨缺损的天然衍生水牛角的角夹角胎，属于骨科的生物医用新材料。
现有的骨科手术，临床多采用不锈钢加工成骨折内固定的接骨板、钢钉、钢丝，需通过手术将断裂处进行固定，待骨折部位复原愈合后，再次通过手术将接骨板、钢钉取出，手术复杂，病人又痛苦，且影响骨之血循环，特别是较大的钢板和髓内钉，钢板下骨质发生松变、萎缩等；整形手术则多用硅胶等进行填充，填充材料既不能被吸收，又有一定副作用。促进或加速骨愈合、骨缺损修复，是近20多年来骨科学者研究的热门课题之一。Urist发现(1965年)骨形态发生蛋白(BMP)，诱导骨再生具有划时代意义。20年后(1986)Urist等用BMP充填指骨囊肿获得骨再生。此后，BMP的提取、纯化、克隆等呈现研究热点，现已达17种之多，但产量低、吸收快、价格高又无支撑作用。以骨诱导理论和骨传导理论或双重理论为基础展开研制生物的、非生物的或二者以上材料复合的外源性BMP等生长因子的载体，目前最佳材料为羟基磷石灰(HA)、磷酸三钙(TCP)或二者复合材料均获成功。但这类材料质脆、易断裂、易碎、脱出，难以雕刻所需形状等缺点。
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种能被人体吸收的生物材料，尤其是衍生水牛角，包括天然水牛角夹、衍生水牛角胎的生物医用新材料，它的组织成分与人骨所含成分比较接近，把它进行适当处理后，加工成不同几何形状和不同的厚度、粒度及任意需要的形状，根据不同的病例植入不同形状的角夹或角胎材料，使病人逐渐康复，这种材料长期保留体内无不良反应，无需二次手术取出。
上述目的是这样实现的骨移植内固定内置入促进骨愈合修复骨缺损的天然衍生水牛角的角夹角胎，是生物医用新材料，尤其是一种骨科组织修复、整形用的材料。水牛角的角夹，为水牛角的外层，又称水牛角鞘，呈灰黑色或黑色，主要成分是紧密排列的角蛋白，具有韧性大弹性模量高力学特性，不须经特殊物理和化学处理，有良好的化学稳定性和生物组织相容性，较强的机械性能，不降解吸收，不与宿主骨发生骨性结合，长期保留体内无不良反应，无需二次手术取出。可作为骨移植、内固定材料，加工成不同几何形状和不同的厚度、粒度及任意需要的形状，如接骨板、螺钉、角钉、角栓等，用于骨折内固定、髓内固定等，可长期体内留存，不需二次手术取出，无不良反应。角夹粉，不含骨形态发生蛋白(BMP)等生长因子诱导物质，可用于软组织缺陷的充填整形，如隆鼻、隆乳、面和胸部浅层软组织缺陷整形等。角胎，又名角腮，新鲜时呈鲜红色，结构呈海绵状或蜂窝状微孔，质坚，经脱脂、脱蛋白或降抗原处理，生物相容性好，化学稳定，可降解吸收，可与宿主骨发生骨性结合，有较强机械性能。角胎经特殊处理后，加工成不同几何形状和不同的厚度、粒度及任意需要的形状，如移植材料、圆柱状、长方柱、棱柱状等，除移植和充填各种骨缺损外，完全符合国内外学者提出的用作骨生长因子的载体，组织工程学种子细胞培养的基质材料和体内植入载体，还可用作移植各种复合材料的基底材料，也可制作角钉、角栓作骨折端、髓内一次性固定材料。角夹、角胎作为节段性骨缺损材料，其体积应<缺损骨，直径<缺损骨，中空、两端稍细台阶状的立方体三维结构。长管骨缺损的内固定，选用医用不锈钢丝作双“8”字固定，沿长骨纵轴张力侧和压力侧各一个，夹住移植材料，置钢丝在缺损骨两端适宜部位同一平面各钻1孔，用适当型号钢丝一条或两条贯穿成两个相对应的“8”字。长管骨缺损特别是大节段骨缺损骨移植时，移植物(最好用角胎圆柱体、棱柱体等)一定长度植入髓腔内；两个“8”字就夹住移植物，一方面增强固定的稳定性，一方面又使移植物与受体骨接触面积大，并相对提高内源性诸生长因子浓度，更有利促进骨缺损修复(称髓内植骨与髓外植骨相结合；髓内固定与髓外固定相结合；生物固定与机械固定相结合，即一次性。三结合固定术或复合骨移植术)。双“8”字内固定尽可能使两断端全面接触均等受压，必要时加用角胎块(片)充填(垫)。“8”字内固定如迂骨折段过长，“8”字身长固定不牢时，可在双“8”字之间外加钢丝环绕。“8”字内固定钢丝结一般应扭结在钻孔进出口处。双“8”字内固定钢丝张力应尽可能一致，不要一紧一松，受力不均容易发生受力大一侧“8”字被拉断，造成失败。
骨移植内固定内置入促进骨愈合修复骨缺损的天然衍生水牛角的角夹角胎，是骨科的生物医用新材料。有良好的化学稳定性和生物组织相容性，较强的机械性能。角夹不降解吸收，不与宿主骨发生骨性结合，长期保留体内无不良反应，无需二次手术取出。且该生物材料来源丰富，价格低廉，易于取得，不需特殊处理，使用操作简便易于掌握。角胎，作为一种生物组织比人工合成材料易于吸收替代，这是由于骨组织在不同种属动物间存在着高度同源性，植入受体后与自体骨移植一样，易于被宿骨主组织细胞接近而发生爬行替代，水牛角胎动物实验表明与宿主骨有高度组织亲和性和结合力。因此不会妨碍机体自身修复和改建成熟。
下面结合附图对本发明的实施例作进一步详述
图1为水牛角剖面示意2～图25为水牛角角夹、角胎产品的示意26～图29为长管骨骨缺损植骨示意30为嵌入菱形角板植骨(角夹或角胎)图31～图34为长管骨折角夹接骨板固定骨或斜形髓腔置入角夹或角胎柱、棒、栓等示意35～图37为指骨骨折、角夹钉紧紧插入髓腔示意38～图41为骨结核或囊肿病灶清除后腔洞内植入角夹和角胎粉、屑、柱、块等示意42～图43为脊柱结核病灶彻底清除后椎间植入角夹或角胎块，周围加角胎粒或角屑、角柱等示意44～图46为楔形截骨，用角胎板固定示意47为颅骨缺损成形示意48～图49为髋关节结核、病灶清除后植入角夹板加角胎柱、粉或角胎屑、粒融合关节示意50为用角夹肋、胸廊成形示意51为用角夹粉或屑隆乳示意52为用鼻状角夹隆鼻示意53～图60为长管骨骨折行双“8”字内固定示意61～图67为长管骨骨折髓内固定(髓内植入角胎或角夹钉或栓……)加不锈钢丝双“8”字内固定示意68～图74用不锈钢丝双“8”字内固定示意图(植入物植入缺损区和髓腔一定长度)图75为角夹植入动物体24周X线片，显示再生骨组织愈合良好，骨髓腔贯通，骨痂过度生长的膨大部分已不明显图76为术后24周对照组X线片显示，由于没有植入物，在尺骨的支持作用下从缺损两端有斜坡状骨组织延伸，从手术造成的陡峭缺损变成凹状缺损图77为术后24周，植入角夹被一层结缔组织包裹，其边缘有轻微被分解吸收的现象，但植入材料内部整齐的角蛋白纤维束仍完好如初图78为术后24周，扫描电镜观察可见植入物与再生的骨组织之间没有骨性愈合，有一条明显的界限，该界限即是结缔组织图79为植入物在骨髓腔中央不能被溶解吸收，因而被引导愈合的骨组织形成旁路骨髓腔图80为第一例病人术后40年X线片示右肱骨角夹柱(中空)移植缺损处，用不锈钢丝双“8”字内固定将角夹柱夹在两“8”字之间，植入角夹柱密度低，骨皮质增生图81为术后40年健侧X线片示骨质与患侧无异图82为术后40年X线片示患侧(正侧位)植入角夹柱密度低，骨质无异常改变，皮质骨增生、光滑。无骨萎缩、骨疏松等应力遮挡效应图83为第二位病人术前经X线片示股骨粉碎性闭合性骨折，游离骨片，似三角形图84为X线片示因游离骨片污染用形状、大小、厚度等相似角夹移植缺损处，钢板(6孔用4个螺钉)内固定三个月，有大量骨痂生长，角夹密度低图85术后16年X线片示移植角夹区，骨皮质光滑，髓腔贯通，角夹密度低，缺损区远端骨质有疏松，骨小梁粗细不均骨皮质薄等应力遮挡效应图86术后39年X线片示，同图85图87为第三例病人术前X线片示右股骨闭合性单纯骨折图88为角夹接骨板(4孔)及螺钉内固定肢体弯曲(术后10日发现经牵引纠正)图89术后5年X线片示(正侧位)骨折愈合良好，角夹接骨板及螺钉密度低图90术后7年X线片示患侧(右)与健侧(左)角夹接骨板及螺钉阴影较图89变淡，健侧与患侧骨质相同，无疏松等应力遮挡效应图91术后10年X线片示(患侧正侧位)角夹接骨板仍有阴影但无骨质疏松等图92为第四例病人术前X线片示左肱骨闭合性横断骨折图93用角夹接骨板、螺钉内固定术后2个月X线片示骨折处有大量骨痂，角夹接骨板及螺钉密度低图94术后1年X线片示骨痂增殖，角夹板及螺钉仍为阴影图95术后3年X线片示角夹板固定区皮质骨光滑髓腔贯通，骨膜增殖明显，骨皮质正常无疏松等情况图96为第五例病人左无名指第一节软骨囊肿术前X线片示部分皮质骨已外凸破坏图97囊肿填充水牛角夹屑500mg(干)，术后50天X线片示，角夹屑无降解吸收，密度低影图98术后2年X线片示原囊肿部位骨皮质已完全形成，且光滑，充填角夹屑阴影仍在。提示腔洞性骨缺损，用水牛角胎粒状、屑状或块状或复合状为宜图99术后3年X线片示，与图98同图100角胎动物试验，术后8周植入角胎已和再生的宿主骨紧密结合，植入角胎有明显被降解吸收的现象图101术后16周，植入角胎与宿主骨骨性结合牢固，肉眼可见植入角胎材料的缝隙中有小血管穿入图102术后24周，骨愈合良好，在愈合区域可见致密的皮质骨和较疏松的松质骨从上至下有序排列图103术后24周，在植入角胎(JT)引导下，愈合区域横切面可见良好的哈佛氏系统(H)，这是骨再生愈合最重要的特征标志图104术后24周，植入角胎(JT)由于破骨细胞的吸收，分解和搬运作用逐渐形成骨髓腔(Q)图105术后24周，X线片显示缺损部位骨管光滑，骨髓腔贯通图106未植入材料的对照组经24周后，虽有尺骨的支撑作用，仍为凹状缺损图107水牛角胎材料具有纵向板层中空结构，类似海绵状或蜂窝状，其微孔部分相互贯通，植入后有利于内源性BMP和各种生长因子的富集、传导、播散，有利于形成良好血运，有利于新生骨组织的附着、爬行和延伸图108～图109分别为0.5％甲硝唑处理的角夹粉植入28天和56天，肌袋内颗粒大小不一的角粉M被致密的肌肉细胞包围、相容良好，未见炎性细胞浸润和积液图110～图111为3％H2O2处理的角夹粉分别植入28天和56天，情形同图108图112左边为肌袋外的肌肉组织的细胞变小、致密，可见多量细胞核N，正常肌肉组织和肌袋之间有时会出现白色纤维组织构成的鞘膜P骨移植内固定内置入促进骨愈合修复骨缺损的天然衍生水牛角的角夹角胎，包括天然水牛角夹1、角胎2的生物医用材料，水牛角的角夹1，为水牛角的外层，又称水牛角鞘，呈灰黑色或黑色，主要成分是紧密排列的角蛋白，用清水或纯净水冲洗干净，晾干，分别加工成不同几何形状和不同的厚度、粒度及任意需要的形状。角胎2，又名角腮，新鲜时呈鲜红色，结构呈海绵状或蜂窝状微孔，质坚，将宰杀2小时内角胎2从水牛角夹1内剥离，用清水或纯净水冲洗干净，晾干，分别加工成不同几何形状和不同的厚度、粒度及任意需要的形状。放入1∶1的氯仿-甲醇液中脱脂10小时，再放入30％的过氧化氢(HO)部分脱蛋白48小时后，用蒸馏水洗净，再移入0.6mol/l盐酸中部分脱钙2分钟，用蒸馏水冲洗，在80℃烘干4小时备用。术前在蒸馏水中煮沸20分钟再用灭菌生理盐水漂洗。角夹1、角胎2作为节段性骨缺损材料，其体积应<缺损骨，直径<缺损骨，中空、两端稍细台阶状的立方体三维结构。长管骨缺损骨移植的内固定，选用医用不锈钢丝3作双“8”字固定，沿长骨纵轴张力侧和压力侧各一个，夹住移植材料(角夹或角胎)，置钢丝钻孔在缺损骨两端适宜部位同一平面各钻1孔，用适当型号钢丝一条或两条贯穿成两个相对应的“8”字。长管骨缺损特别是大节段骨缺损骨移植时，移植物(最好用角胎圆柱体、棱柱体等)一定长度植入髓腔内；两个“8”字就夹住移植物，一方面增强固定的稳定性，一方面又使移植物与受体骨接触面积大，并相对提高内源性诸生长因子浓度，更有利促进骨缺损修复(称髓内植骨与髓外植骨相结合；髓内固定与髓外固定相结合；生物固定与机械固定相结合，即一次性。三结合固定术或复合骨移植术)。双“8”字内固定尽可能使两断端全面接触均等受压，必要时加用角胎块(片)充填(垫)。“8”字内固定如迂骨折段过长，“8”字身长固定不牢时，可在双“8”字之间外加钢丝环绕。“8”字内固定钢丝结一般应扭结在钻孔进出口处。双“8”字内固定钢丝张力应尽可能一致，不要一紧一松，受力不均容易发生受力大一侧“8”字被拉断，造成失败。
对水牛角夹1的应用研究情况如下一、 动物实验将水牛角夹加工成直径1.5mm，长12mm两端稍细的中空圆柱体，在圆柱体的横向用0.7mm钻头钻孔2～4个，以利于组织固着、生长。用加压水冲洗直至完全洁净，然后用蒸馏水煮沸10分钟，冷却后置入0.5％甲硝唑溶液中保存，临用时取出用无菌生理盐水冲洗即用。以日本大耳白兔28只，体重1.8～2.2Kg，雌雄不限，其中实验组20只，对照组8只。动物左肢用常规方法脱毛、消毒、普鲁卡因1ml/只局麻。于桡骨中段隆起处纵行切口25mm，暴露桡骨，将桡骨连同骨膜造成节段状骨缺损10mm，将制备好的角夹材料嵌入缺损处，两端各插入骨髓腔中1mm，缝合切口。右肢不做手术作对照。对照组左肢截除10mm桡骨后缝合，右肢同样不手术作对照。术后肌注庆大霉素4万单位/只，连续三天。由于采用局麻，术后30分钟即能正常摄食、活动。术后4、8、16、24周分别处死3只动物，观察手术肢桡骨再生愈合的变化，进行X线正位摄片。分别对手术肢X线片，观察桡骨骨缺损处再生愈合的动态变化。
1.组织学与X线术后2～4周植入角夹被血肿、白色结缔组织包裹；X线片示角夹已有钙阴影，4周时骨钙阴影加深。术后8周手术肢骨组织从两端长入，从近端长入较远端更多；X线片示，皮质骨形成良好，再生骨组织与宿主骨已连成一体。术后16周植入角夹被骨组织完全覆盖，有几例植入角夹部位有骨痂过度生长现象。术后24周再生骨组织愈合良好，X线片显示皮质骨外表光滑，骨髓腔贯通，因骨痂过度生长的膨大部分已不明显(见图75)。对照组X线片显示由于植入缺损处角夹从缺损骨两端呈斜坡状骨组织延伸，从手术造成的陡峭缺损变成凹状缺损(见图76)24周经光镜和扫描电镜观察宿主骨与植入角夹没有骨性愈合，角夹被一层结缔组织包裹，其边缘有轻微被分解吸收的现象，但角夹内部整齐的角蛋白纤维束仍完好如初(见图77～78)。大体标本解剖显示，由于角夹植入在骨髓腔中央，不能被溶解吸收，因而被引导愈合的骨组织形成旁路骨髓腔(植入角夹未钻中空有关，见图79)。
2.生物力学水牛角夹本质是紧密排列的角蛋白(Keratin)，具有韧性大弹性模量高力学特性(见表1)。实验术后24周各取5只手术肢桡骨和对应的非手术肢桡骨做生物力学试验。检测项目为抗弯曲破断力，结果见表2。
表1 水牛角夹力学性能*(kg/cm2)力学项目水牛角夹力学项目水牛角抗拉强度 142.8-518.3 抗扭转强度 193.8-271抗压强度 1235.6-1273 抗剪切强度 535.9-685.8弹性模量 51064-51488 抗扭转弹性模量 13441-13888表2水牛角夹生物力学试验(抗弯曲破断力F，牛顿)检测标本 J1J2J3 J4J5平均手术侧829469 94.5 7582.9对照侧139 93121114 106 114.6手术侧/对照侧＝72.34％3.免疫学经对手术日本大耳白兔移植水牛角夹的免疫反应，体外特异性T淋巴细胞二次刺激转化试验，植入角夹后仅在3周、4周时T淋巴细胞转化率明显高于对照组(P＜0.01)，其余数周(2、8、16周)无明显差异。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测特异性抗体IgG，见表3。实验组动物产生的特异性抗体IgG稍高于对照组，但无显著性差异，说明抗体产生水平很低，无免疫排斥反应。
表3 植入水牛角夹后ELISA检测特异抗体IgG结果A450mm(X±S)days(n)*experiment controlt test**0 (20)0.27640.1217 (13)0.282±0.157 0.317±0.033 P＞0.0514 (13)0.245±0.073 0.184±0.011 P＞0.0521 (23)0.269±0.090 0.345±0.059 P＞0.0528 (23)0.238±0.096 0.168±0.045 P＞0.0556 (21)0.198±0.111 0.145±0.040 P＞0.05112(15)0.245±0.113 0.248±0.013 P＞0.05*检测动物数**实验组与对照组的t检验4.有机物水牛角夹氨基酸分析结果成年水牛角夹含有氨基酸17种，经煮沸20分钟后半数氨基酸含量有增加。见表4 表4.成年水牛角夹氨基酸分析*氨基酸名称 含量(W％) 氨基酸名称 含量(W％)**天门冬氨酸ASP 5.48 7.14 亮氨酸 LEU 6.248.48苏氨酸THR 3.73 3.49 酪氨酸 TyR 8.0911.96丝氨酸SER 6.43 6.48 苯丙氨酸PHe 2.573.59谷氨酸GLu 10.46 14.16 赖氨酸 LyS 2.541.99甘氨酸GLy 5.78 5.19 氨 NH 0.690.18丙氨酸ALA 2.99 3.98 组氨酸 HiS 0.690.64缬氨酸VAL 3.23 2.93 精氨酸 ARG 7.738.06蛋氨酸MET 0.59 1.00 脯氨酸 PRO ——3.23异亮氨酸 ILM 3.32 2.42 胱氨酸 CYS 0.665.35总量 76.22 90.26
注*采用日立835-50型氨基酸分析仪分析结果以重量百分比含量表示。
**牛角加热100℃，30分钟。
5.无机物水牛角夹无机成分检验结果见表5。含有无机元素共11种，其中生理元素有钙、磷、钾、硫、钠等，缺少氯；微量元素有镁、铁、锌、铜、锰、钡等6种，无有毒元素铅、镭等，其中微量元素铁、锌、铜及锰，有人研究注入一定浓度，可形成一系列有利于骨形成的酶，促进骨缺损修复。
表5水牛角夹无机成分样品名称样品名称样品名称S％ 1.94 Ca％ 0.13Cu ug/g 9.34P％ 0.078Mg％ 0.011 Mn ug/g 5.43K％ 0.026Fe％ 0.073 Ba ug/g 2.95Na％ 0.037Zn％ 0.0131.ICP-AES等离子发射光谱法二、水牛角夹临床应用病例临床应用共计19例，现例举5例。
例1，男24岁工人，1960年6月14日，因外伤右肱骨钢板内固定术后半年骨不连假关节，骨缺损2.5cm(咬去硬化部分)植入天然角夹，去污及一切杂质，煮沸灭菌30分钟(未作特殊处理)长2.3cm，呈圆柱状直径1.5cm，中空(孔径约1.5mm)，两端稍细(约2.5mm，各插入髓腔内0.4cm未计算在内)植入髓腔。在距两骨端约0.7cm处同一平面由外向内各钻一孔，用一条不锈钢丝贯穿成双“8”字形，将角夹、夹于两“8”字之间，扭紧钢丝，外用石膏鞘固定。术后32天X线示少量骨痂，58天中等量骨痂，119天患肢功能锻炼出院，逐渐恢复原工作，此后多次复查肢体功能正常，全身与局部均无不良反应，骨质及骨量均无特殊，但角夹不吸收，仍有阴影，骨皮质完好光滑，髓腔贯通观64岁健在，随访40年。(见例1，X线片示)例2，男，17岁，学生，1961年4月3日因房屋倒塌致伤左大腿，及时入院，X线示左股骨中下1/3处粉碎性骨折，于1961年4月7日行内固定，术中见股骨中段骨折两断间有1长8.0cm，宽0.3-1.0cm，厚0.2-0.3cm似三角形游离骨片术中不慎被污染，即改用形状、大小相似的角夹(未经特殊处理)煮沸消毒灭菌后，植入缺损区，钢板内固定外用单人字石膏固定。术后28天X线示，角夹影极低；111天骨折处有中等量骨痂，262天骨痂包绕角夹，皮质增厚，仍见4.0cm×1.5cm宽低密度影，但无脱钙、电解和排异征象。术后多次随访，X线复查(最长为39年)，肢体功能自如，无任何障碍，无发生变态等反应，X线示(患侧与健侧)，角夹影仍存在，但影淡，皮质骨完好，光滑髓腔贯通，无不良影响。与健侧相比骨质稍有疏松。(见例2，X线片示)例3，女，5岁，闭合性股骨单纯横断骨折。1989年11月，用角夹制成4孔接骨板(规格按原金属接骨板)、螺钉内固定，用1∶1000洁尔灭浸泡12小时。外加单髋人字石膏，术后顺利无并发症，但术后当天患肢有弯曲变形(接骨板硬度不够)经牵引纠正，术后24天带石膏托出院，术后6年、7年、10年随访，患侧与健侧X线示无骨质改变，无电解、脱钙等，双侧相同，一切功能正常，但角夹接骨板及螺钉影仍如初存在，自觉无任何不适，未发生变态反应等症。(见例3，X线片示)例4，男69岁，闭合性左肱骨中上段横断骨折及多根肋骨骨折，伤后7日即1995年9月19日用角夹接骨板(4孔)及角夹螺钉(用1∶1000洁尔灭浸泡12小时)内固定，外用小夹板固定，术后29天X线示有少量骨痂生长，83天有中等量骨痂生长，并有少许脱钙影像。94天始功能锻练，110天功能逐渐恢复。出院后8个月和2年分别随访功能正常，无变态反应性疾病发生，X线示角夹接骨板及螺钉密度较低，接骨板处有骨膜增生，健侧与患侧骨质良好无脱钙、电解等不良影响，自觉无异常不适。(见例4，X线片示)例5，女，38岁，左无名指软骨囊肿，经刮除用碘酒、酒精烧灼后，腔长约1.5cm，宽0.5cm，深约0.6cm，植入角夹屑500mg(干)，角夹屑术前用0.5％甲硝唑浸泡10小时。术后15天出院局部无明显炎性反应，全身无任何不适，随访2年，指功能正常，X线片示，植入角夹屑阴影仍存，无降解吸收，皮质骨完整。(见例5，X线片示)对水牛角胎2的实验研究情况如下水牛角胎套生于水牛角夹之内，又名角腮，新鲜时呈鲜红色，结构呈海绵状或蜂窝状微孔，质坚，将宰杀后2小时内角胎2从水牛角夹1内剥离，用清水或纯净水冲洗干净，晾干，将水牛角胎2加工成直径1.5mm，长12mm两端稍细的中空柱状，在圆柱体的横向用0.7mm钻头钻孔2～4个，用自来水和蒸馏水反复冲洗直至洁净后，放入1∶1的氯仿-甲醇液中脱脂10小时，再放入30％的过氧化氢(H2O2)部分脱蛋白48小时后，用蒸馏水洗净，再移入0.6mol/l盐酸中部分脱钙2分钟，用蒸馏水冲洗，在80℃烘干4小时备用。术前在蒸馏水中煮沸10分钟再用灭菌生理盐水漂洗备用，为A组使用。B组则不脱钙，其它同A组处理。同样以日本大耳白兔28只，体重1.8～2.2Kg，雌雄不限，其中实验组20只，对照组8只。动物左肢用常规方法脱毛、消毒、普鲁卡因1ml/只局麻。于桡骨中段隆起处纵行切口25mm，暴露桡骨，将桡骨连同骨膜造成节段状骨缺损10mm，将制备好的角胎材料嵌入缺损处，两端各插入骨髓腔中1mm，缝合切口。右肢不做手术作对照。对照组左肢截除10mm桡骨后缝合，右肢同样不手术作对照。术后肌注庆大霉素4万单位/只，连续三天。由于采用局麻，术后30分钟即能正常摄食、活动。术后4、8、16、24周分别处死3只动物，观察手术肢桡骨再生愈合的变化，进行X线正位摄片。分别对手术肢X线片，观察桡骨骨缺损处再生愈合的动态变化。
1.组织学与X线术后2周光镜及电镜观察A组和B组植入物被血肿包裹，少量结缔组织从缺损处两端向植入角胎上延伸，术后4周植入角胎被白色结缔组织包裹，新生骨组织从两端长入约2～3mm。术后8周骨组织从近端向远端长入多，但近端长入的较远端更多，与宿主骨紧密结合，植入角胎有明显被降解吸收的现象(见图100)。术后16周，植入角胎与宿主骨骨性结合牢固，肉眼可见植入角胎材料缝隙中有小血管穿入(见图101)。术后24周骨愈合良好，有4例与未手术肢对比几乎看不出植入的痕迹。在愈合区域可见致密的皮质骨和较疏松的松质骨从上至下有序排列(见图102)。愈合区域横截面可见良好的哈佛式系统，这是骨再生愈合最重要的特征标志(见图103)。植入角胎由于破骨细胞的吸收、分解和搬运作用逐渐形成骨髓腔(见图104)。X线片显示缺损部位骨管光滑，骨髓贯通(见图105)。未植入材料的对照组经24周后，虽有尺骨的支撑作用，仍为凹状缺损(见图106)。2.生物力学试验见6、表7表6 水牛角胎A组生物力学试验结果抗弯曲破断力F(N)*手术侧/检测编号 A1A2A3A4A5平均 对照侧手术侧 84.5 83.0 70.0 65.0 48.0 70.1 78.68％对照侧 67.5 88.0 89.0 96.0 105.0 89.1*牛顿表7水牛角胎B组生物力学试验结果抗弯曲破断力F(N)*手术侧/检测编号 B1B2B3B4B5平均 对照侧手术侧 70.0 46.0 91.0 50.0 115.0 74.4 83.78％对照侧 105.0 66.0 98.0 89.0 86.0 88.8*牛顿角胎A组植入材料脱蛋白及部分脱钙处理后，手术侧的平均抗弯曲破断力为70.1牛顿；对照侧为89.1牛顿，即手术侧的抗弯曲力学强度经24周达到未手术的78.68％。B组植入材料未经部分脱钙处理，其手术侧的平均抗弯曲破断力为74.40牛顿；对照侧为88.80牛顿，其平均抗弯曲破断力强于A组，即不脱钙组强于脱钙组。
3.免疫学检查见表8、表9
表8 植入水牛角胎A组的特异抗体IgG结果A450mm(X±S)days(n)*experiment control t test**0(20)0.276±0.1217(29)0.441±0.123 0.349±0.118 P＞0.0514(21)0.218±0.085 0.259±0.137 P＞0.0521(20)0.370±0.170 0.235±0.188 P＞0.0528(18)0.231±0.083 0.210±0.018 P＞0.0556(18)0.194±0.059 0.199±0.015 P＞0.05112(13)0.137±0.071 0.192±0.024 P＞0.05*检测动物数**实验组与对照组的t检验表9 植入水牛角胎B组的特异抗体IgG结果A450mm(X±S)days(n)*experiment control t test**0(20)0.276±0.1217(13)0.294±0.099 0.349±0.118 P＞0.0514(19)0.321±0.118 0.259±0.137 P＞0.0521(19)0.199±0.094 0.235±0.188 P＞0.0528(11)0.133±0.039 0.210±0.018 P＞0.0556(13)0.163±0.052 0.199±0.015 P＞0.05112(12) 0.164±0.035 0.192±0.024 P＞0.05*检测动物数**实验组与对照组的t检验角胎A组、B组的T淋巴细胞转化率与对照组无显著性差异(P＞0.05)，两组同一时间的转化率相比无显著性差异(P＞0.05)，转化率曲线是一条平稳的直线，和对照组很靠近，表明宿主对角胎A组、角胎B组无特异性细胞免疫反应产生。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测A、B两组特异性抗体IgG，见表3。角胎A组、角胎B组产生的特异性抗体水平很低，最高仅为0.441＋0.123。与对照组相比，除角胎B组28天有显著性差异，其余均无显著差异(P＞0.05)。说明宿主对角胎A组无特异性体液免疫反应，而对照角胎B组很弱且为暂时性。
4.水牛角胎的物理性状，见表10。
表10水牛角胎的物理性状物理性状 分析结果单位比表面积BET.S.A 0.35 m2/g总孔体积T.P.V0.0031m1/g平均孔径A.P.D355 A*测定仪器美国Merk公司ASAP 2000高速比表面积及孔隙率分析仪表10显示角胎具有纵向板层中空结构，类似海绵状或蜂窝状，即三维结构。植入宿主骨缺损处，有利于内源性各种生长因子的富集、传导、播散、体液和血液流动，有利于新生骨组织附着、爬行和延伸(见图107)。
5.水牛角胎A组处理与B组处理手术侧的生物力学试验结果的t检验，见表11。
表11水牛角胎A处理与B处理手术侧的生物力学试验结果的t检验组别 抗弯曲破断力F(N)*t检验(t0.01＝4.60，t0.05＝278)A组(n＝5) 70.10±14.90 t＝0.236 t＜t0.01p＞0.01B组(n＝5) 74.40±28.92 t＜t0.01p＞0.05*牛顿表11显示两组角胎材料的平均抗弯曲破断力经t检验没有有显著性差异。所以角胎材料临床应用时，不脱钙为宜。
6.角胎有机物与无机物检测，见表12、表13表12水牛角胎氨基酸分析氨基酸名称 含量(W％) 氨基酸名称 含量(W％)天门冬氨酸 ASP1.55 亮氨酸 LEU1.21苏氨酸 THR0.50 酪氨酸 TyR0.51丝氨酸 SER0.94 苯丙氨酸PHe0.42谷氨酸 GLu2.92 赖氨酸 LyS1.17甘氨酸 GLy5.95 氨 NH 0.24丙氨酸 ALA2.54 组氨酸 HiS0.21缬氨酸 VAL1.45 精氨酸 ARG2.45蛋氨酸 MET0.56 脯氨酸 PR01.63异亮氨 ILM 0.68 总 量 24.93注①分析仪日立835-50氨基酸分析仪②分析结果以重量百分比含量表示③进样量50微升角胎氨基酸分析结果，显示组成蛋白质的20种编码氨基酸有17种，总量24.93％。较角夹分析结果总量76.22％明显偏少。按照侧链在水溶液中的性质分为4类均有。即有非极性侧链氨基酸、非电离极性侧链氨基酸、酸性侧链氨基酸和碱性侧链氨基酸。
表13 水牛角胎无机成分样品名称 水牛角胎 样品名称 水牛角胎 样品名称 水牛角胎S％ 0.10Ca％20.17Cu ug/g225.4P％ 11.27 Mg％0.36 Mn ug/g13.72K％ 0.042 Fe％0.24 Ba ug/g52.4Na％ 0.48Zn％0.024
无机物分析结果，无机元素11种，其中有生理元素钙、磷、钾、硫和钠5种，微量元素有镁、铁、锰、锌和铜。其中钙、磷含量占99％左右，与人体骨无机结构相同，具备骨传导的基本条件；微量元素铁、锌、铜和锰，有人研究认为骨缺损处注入高浓度的这些微量元素，可形成一系列有利于骨形成的酶，促进骨缺损修复。
7.水牛角胎力学特性试验对水牛角胎用过氧化氢(H2O2)浸渍处理后做弹性模量和抗压强度的力学试验，用H2O2处理时间分别为0、24、48小时，其弹性模量分别14.08±2.99、12.58±3.96和12.19±6.47Gpa。经t检验结果表明弹性模量与对照组相比较，没有明显差异。抗压强度分别为91.01±16.76、55.05±15.48和53.09±11.83Mpa，经t检验结果表明抗压强度与对照组相比有极显著性差异。见表14、表15、表16、表17。
表14水牛角胎材料的弹性模量E弹性模量E弹性模量E弹性模量E对照组(MPa) 材料1组 (MPa) 材料2组 (Mpa)113430 1 21610 1 6380212980 2 12100 2 28870320580 3 7170 3 14870414320 4 13200 4 6780515630 5 14930 5 7510613290 6 13950 6 1200079420 7 10540 7 12550815580 8 8870 8 10140914580 9 12920 9 110201011000 1010480 10 11790
表15水牛角胎材料弹性模量E的t检验(n＝10)组别 处理时间 X±S(GPa) t检验(t0.05＝2.26)检验结论对照组0h14.08±2.99 材料1组和材料2组材料1组 24h12.58±3.96t1＝0.91，t1＜to.05，P1＞0.05的弹性模量与对照组材料2组 48h12.19±6.47t2＝0.37，t2＜t0.05，P2＞0.05相比没有显著性差异2.水牛角胎的抗压强度σbc不同处理组的水牛角胎受载后的最大破坏载荷和抗压强度值见表3。材料1组和材料2组与对照组的t检验见表4。
表16水牛角胎材料的抗压强度σbc对照组 截面积 最大载荷 抗压强度 材料1组 截面积 最大载荷 抗压强度 材料2组 截面积 最大载荷 抗压强度(dhr)(mm2)(N) (MPa)(24hr) (mm2) (N) (MPa)(48hr) (mm2) (N) (MPa)1 42.9 4097.095.51 62.4 1815.8 29.1 1 35.91568.8 43.72 39.4 3770.695.72 65.5 3327.4 50.8 2 43.82741.9 62.63 34.1 2942.886.33 67.2 2352.0 35.0 3 41.51660.0 40.04 36.9 347.0 94.24 53.3 2254.3 42.3 4 37.41664.3 44.55 35.4 3876.3109.5 5 49.0 4018.0 82.0 5 44.92155.2 48.06 43.5 2009.746.26 60.1 4219.0 70.2 6 44.02987.6 67.97 45.5 3285.172.27 51.8 3620.8 69.9 7 40.92449.9 59.98 39.6 3821.496.58 40.8 2252.2 55.2 8 40.92155.4 52.79 45.5 4313.494.89 36.0 2304.0 64.0 9 40.91468.3 35.910 42.0 4166.499.21033.9 1566.2 46.2 10 39.11767.3 45.211 38.5 3869.3100.5 1141.6 2254.7 54.2 11 38.32642.7 69.012 39.6 4019.4101.5 1254.0 3331.8 61.7 12 42.02843.3 67.7表17水牛角胎材料的抗压强度σbc的t检验组别 X±S(MPa) t检验(t0.01＝3.11)检验结论对照组 (n＝10)91.01±16.76 材料1组和材料2组材料1组(n＝10)55.05±15.48 t1＝5.46，t1＞t0.01，P1＜0.01 的抗压强度与对照组材料2组(n＝10)53.09±11.83 t2＝6.75，t2＞t0.01，P2＜0.01 相比有极显著性差异水牛角夹粉异体植入实验结果1.水牛角夹粉制作将水牛角夹锯成小块，洗净(除去一切杂质)，烘干，用植物样品粉碎机粉碎，其颗粒直径为0.08～0.8mm，角粉用两种方法处理A组用0.5％甲硝唑溶液浸泡1 2小时；B组用3％过氧化氢(H2O2)溶液浸泡12小时，然后分别移入灭菌生理盐水中漂洗。由于角粉分散，为便于植入，用少量动物明胶溶化后角夹粉拌入其中，80℃，4小时烘干，将其分割为100mg左右的小块备用。
2.植入手术按常规对试验动物(豚鼠)股部脱毛、消毒，用氯胺酮麻醉在股部脱毛处，切口深入肌肉间隙10mm造成肌肉穴袋，将制备好的A、B两组角夹粉块分别植入两组动物肌袋内，缝合切口。
3.组织学检查用0.5％甲硝唑和3％H2O2消毒处理的两组植入角夹粉，植入后28天和56天组织学检查未见明显差异，见图108～图112。植入角夹粉均与周围组织相容良好，未见炎性细胞浸润，脓肿和积液。肌袋内肌肉细胞变小，致密，可见多量细胞核。随机计肌袋内细胞密集程度为肌袋外的3.92倍。另有两只动物在正常肌组织与植入角夹粉之间出现白色鞘膜纤维组织将植入角夹粉包裹，其包裹的部分中角夹粉与肌细胞的分布与其他受试动物没有差别。
4.大体标本观察术后28天、56天分别处死各组动物一半(3只)，肉眼观察植入处取出的肌袋角夹粉与周围肌肉组织融合良好，A、B两组均未见炎症与脓肿，少数(2只)动物在植入物处长出一较完整的白色鞘膜样纤维组织将植入角夹粉包裹，其余未见明显包被膜。
权利要求
1.一种骨移植内固定内置入促进骨愈合修复骨缺损的天然衍生水牛角的角夹角胎，包括角夹(1)、角胎(2)，其特征在于a、水牛角的角夹(1)，为水牛角的外层，又称水牛角鞘，呈灰黑色或黑色，主要成分是紧密排列的角蛋白，用清水或纯净水冲洗干净，晾干，分别加工成不同几何形状和不同的厚度、粒度及任意需要的形状，b、角胎(2)，又名角腮，新鲜时呈鲜红色，结构呈海绵状或蜂窝状微孔，质坚，将宰杀2小时内角胎(2)从水牛角夹1内剥离，用清水或纯净水冲洗干净，晾干，分别加工成不同几何形状和不同的厚度、粒度及任意需要的形状。放入1∶1的氯仿-甲醇液中脱脂10小时，再放入30％的过氧化氢(H2O2)部分脱蛋白48小时后，用蒸馏水洗净，再移入0.6mol/l盐酸中部分脱钙2分钟，用蒸馏水冲洗，在80℃烘干4小时备用，术前煮沸20分钟再用灭菌生理盐水漂洗。
2.据权利要求1所述的角夹角胎，其特征在于角夹(1)、角胎(2)作为节段性骨缺损材料，其体积应<缺损骨，直径<缺损骨，中空、两端稍细台阶状的立方体三维结构。
3.据权利要求1所述的角夹角胎，其特征在于用角夹角胎作接骨植入材料时，选用医用不锈钢丝(3)作双“8”字固定，沿长骨纵轴张力侧和压力侧各一个，夹住移植材料，置钢丝钻孔在缺损骨两端适宜部位同一平面各钻1孔，用适当型号钢丝一条或两条贯穿成两个相对应的“8”字。
4.据权利要求1所述的角夹角胎作填充用时，其特征在于将水牛角夹(1)锯成小块，洗净，用植物样品粉碎机粉碎，其颗粒直径为0.08～0.8mm，角粉用两种方法处理A组用0.5％甲硝唑溶液浸泡12小时；B组用3％过氧化氢(H2O2)溶液浸泡12小时，然后分别移入灭菌生理盐水中漂洗。由于角粉分散，为便于植入，用少量动物明胶溶化后角夹粉拌入其中，80℃，4小时烘干，将其分割为100mg左右的小块备用。
5.据权利要求3所述的角夹角胎，其特征在于双“8”字内固定时，使两断端全面接触，可加用角胎块或片充填或垫。
6.据权利要求3或5所述的角夹角胎，其特征在于如骨折段长，“8”字身长固定不牢时，可在双“8”字之间外加钢丝环绕。
7.据权利要求3所述的角夹角胎，其特征在于“8”字内固定钢丝应扭结在钻孔进出口处，且两个“8”字钢丝张力尽可能一致。
全文摘要
本发明涉及骨移植内固定内置入促进骨愈合修复骨缺损的天然衍生水牛角的角夹角胎,属于骨科生物医用材料,将角夹1、角胎2加工成不同几何形状和不同的厚度、粒度及任意需要的形状,用于骨移植、骨折内固定或内置入及整形材料。有良好的化学稳定性和生物组织相容性,与宿主骨有高度组织亲和性和结合力,病人不需要再进行二次手术取出。
文档编号A61B17/68GK1339323SQ00113118
公开日2002年3月13日 申请日期2000年8月17日 优先权日2000年8月17日
发明者唐兴礼, 孙乾, 达天武, 郭琛琨, 黄勇, 詹友达, 段海平, 栾汉林 申请人:泸西县人民医院