专利名称：含硒环糊精及其在制备治疗白内障药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于高活性人工酶领域，特别涉及用环糊精制备具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的含硒环糊精。
在分子水平上模拟酶活性部位的微环境，吸收酶中对催化起主导作用的因素，设计和合成较天然酶简单得多的非蛋白分子，作为人工模拟酶是当今自然科学领域中的前沿课题之一。生物学家一直在利用化学模拟方法来阐明自然界中酶的催化行为。鉴于人工酶分子可能具有与天然酶相媲美的专一性和催化功能，而本身又相当稳定，预示着它在化工、酶学、医药学等领域具有广阔的应用前景。为此，美国和欧洲国家都把对酶的人工模拟列入未来研究的发展规划。近年来，人们已建立起许多小分子仿酶体系，如环糊精、冠醚、环番，环芳烃和卟啉等。
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内重要的含硒酶。由于它具有优良的抗氧化性，对治疗和预防白内障、克山病、心血管病、炎症及癌症等具有很大潜力。但由于该酶不稳定，来源有限，分子量大会引起人体免疫反应等缺点，极大限制了此酶在医药学方面的开发和应用。而含硒人工酶可克服天然酶的弱点，因此，对此酶进行人工模拟越来越受到科学工作者的重视。称为“小分子硒酶”的GPX模拟物Ebselen(PZ51)，是人工酶的突出代表，其催化机制及生物学活性已被详细研究过。动物实验表明，PZ51具有广谱抗炎活性，对糖尿病、肿瘤、心血管疾病均有疗效(文献1、2)，目前在国外已进入临床试验阶段。但作为药物，PZ51最大缺点是活性较低、水溶性差，为了克服PZ51的弱点，解决其水溶性差，进一步提高其活性，我们选用环糊精来模拟GPX。
本发明的目的在于提供一种工艺简单、产率高、稳定性和活性高的GPX人工酶。
本发明的原理是利用环糊精的疏水空腔作为酶的底物结合部位，用化学法活化环糊精上的羟基，再以NaHSe取代，则将羟基变成硒氢基，从而在环糊精上引入酶的催化基团，再经氧化得到具有GPX活性的产品——含硒环糊精(见合成路线图)。
环糊精有三种α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精。无论哪一种都可用上述原理(合成路线)制成含硒环糊精。但是，环糊精上被活化的羟基的位置不同，最后所制得的含硒环糊精的GPX活性也不同。我们发现，活化β-环糊精的2位羟基所得到的含硒环糊精的GPX活性较高。
下面以β-环糊精的2位羟基制备含硒环糊精来举例说明制备过程1．双硒桥联环糊精的合成路线1)将β-环糊精的2位羟基用对甲苯基磺酰氯活化制成β-环糊精-2位羟基苯基磺酸酯；2)β-环糊精-2位羟基苯基磺酸酯的硒化用硒氢基取代苯基磺酸酯基；3)硒氢基在空气中氧化硒氢基在空气氧化生成双硒桥联环糊精。2．双硒桥联环糊精的制备过程是合成路线如图所示 (1)NaHSe制备(参照文献3)将81.1mg(2.15mmole)NaBH4溶解在装有1ml水的小瓶中，再将79mg(1mmole)硒粉缓慢加入到NaBH4的溶液中，盖上一插有针头的胶盖，此时可以看到水中产生大量气体，并伴随有热量放出。由于反应过于剧烈，所以需在冰浴中进行，以控制反应速度，其反应方程式如下由于NaBH4与H+反应，还伴有少量H2Se气体产生，为防中毒，必须在通风橱中反应。反应结束后，有大量盐析出。NaHSe极易氧化，故应通入N2保存。(2)β-CD 2位磺酰化(参照文献4)产物为β-CD-2-位羟基苯磺酸脂，简称2-OTs-β-CD。将2.0g(1.76mmole)β-CD溶于80ml NaOH(0.15mol/L)溶液中，室温滴加含2.0g(9.66mmole)p-TsCl的乙腈溶液5ml，滴加过程中不断加入1mol/L NaOH使溶液pH＞12.5,3h滴加完毕再搅拌1h，加入1mol/L HCl中和至中性，加入100ml甲醇，滤去不溶物，减压蒸去甲醇和大部分水至20ml，放入5℃冰箱一周后有盐析出，过滤后以水为洗脱剂经Bio-gel P-2柱层析，收集第一峰，冻干，得产物1.38g，产率为65％。(3)双硒桥联环糊精的制备将100mg(0.075mmole)2-OTs-β-CD溶于50mM磷酸缓冲液中，通高纯氮去氧，加入100μl 1mol/L NaHSe(0.10mmole),60℃反应36h，然后使反应体系充分暴露在空气中氧化，离心除硒，上清液经Bio-gel P-2柱(5.0×50cm)分离纯化，以蒸馏水为洗脱液，流速为1ml/min,254nm紫外监测收集第一峰，冻干，用丙酮洗三次，真空烘干得淡黄色粉末状双硒桥联环糊精79mg，产率为80％。3．双硒桥联β-CD的结构表征(1)元素分析表1．双硒桥联β-CD的元素分析
合成的2位双硒桥联β-CD的元素分析结果列于表1中。
从表1看出对2-SeCD的元素分析实验值与理论值基本符合，证明化合物的分子式为C84H138Se2·6H2O。(2)红外光谱分析红外光谱分析(KBr压片)结果如表2所示。
表2．双硒桥联β-CD的红外光谱
从表2分析，红外光谱出现了磺酸酯的特征吸收峰1177,1364cm-1和苯环的特征吸收峰1598,1496,845和815cm-1而在SeCD中磺酸酯和苯环的特征吸收消失，说明磺酸酯已被硒氢基(-SeH)置换下来，而CD的结构特征未变化。(3)核磁共振分析表3双硒桥联环糊精的1HNMR、13CNMR谱
利用D2O为溶剂测定了双硒桥联环糊精的。1H NMR和13C NMR，其结果列于表3中，所得数据表现出2位羟基取代的结构特征，结果表明硒氢基被引入环糊精的2位。(4)质谱分析双硒桥联环糊精的分子量由激光质谱测定为2393.7(理论值C84H138Se2.2393)，与计算值十分吻合，进一步证明合成的化合物是以硒桥联形式存在。(5)硒价态及含量分析利用X-射线光电子能谱技术，以镁(MgKα)作靶，测定了模拟物中硒的价态为-1价。标准物硒代胱氨酸(Se-Cyss)的电子能谱图的Se(3d,5/2)电子结合能为55.1eV，模拟物的电子结合能为54.9eV，表明硒的价态与标准物很接近。进一步确证了模拟物的硒结合形式与硒代胱氨酸一致，为硒桥联形式。
综合上述结构分析，确定双硒桥联环糊精的结构如下
4．双硒桥联环糊精酶活性及稳定性(1)硒桥联环糊精的GPX活力[5]测活体系700μL，含50mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.0,1mmol/L叠氮钠，1mmol/L谷胱甘肽，0.25mmol NADPH,1U谷胱甘肽还原酶，加入0.5mmol/L H2O2启动反应，在340nm处监测NADPH被氧化的吸光度的变化。测定酶活力时，以蒸馏水代替人工酶为空白对照。模拟酶活力单位定义为每分钟每微摩尔人工酶消耗1微摩尔NADPH为一个活力单位。
表4双硒桥联环糊精的酶活力
(2)双硒桥联环糊精的稳定性双硒桥联环糊精在pH7.0,50mmol/L PBS溶液中保存半年活力保持92％，干粉酶活力保持不变。5．双硒桥联环糊精治疗白内障的效果取32只患先天性白内障的大鼠，分两组治疗组和对照组，每组16只。治疗组每天滴眼0.33U(GPX活性单位)的双硒桥联环糊精，15天后，14只鼠眼的白内障消逝，另两只鼠眼的白内障也有很大程度的减轻。对照组每天用同样量的未硒化的环糊精滴眼，15天后，白内障程度没有减轻。经15天试验后的大鼠，反应灵敏、健康状况良好。由此可见，双硒桥联环糊精可有效治疗白内障。
本发明有如下特点1．制备方法简单，合成步骤少，产率高，可扩大生产。
2．人工酶模型简单，以环糊精空腔为底物结合部位，以双硒桥为催化基团。
3．本发明制备的含硒环糊精GPX活力高，为世界上最好的小分子GPX模拟物PZ51的7倍。
4．双硒桥联环糊精作为药物可克服天然GPX不稳定，来源有限，分子量大会引起人体免疫反应，不易过膜等缺点。
5．双硒桥联环糊精稳定。
6．它具有优良的抗氧化性，对治疗和预防白内障、心血管病、炎症及癌症等具有非常大的应用潜力。
综上所述，本发明所述的含硒环糊精制备工艺简单，产率高，可大量生产，且含硒环糊精GPX活性高、稳定性好、能有效治疗白内障。同时可克服天然酶用作药物产生的免疫原性大，过膜困难，不稳定等缺点。因此，在医药上具有巨大的应用潜力。
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5)Wilson SR,Zucker PA,Spcetor AR,J.Am.Chem.Soc.,1989,111:593权利要求
1.一种由合成路线(1)所制取的含硒环糊精，其特征在于所述的环糊精可以为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精中的任何一种，用化学法活化环糊精上的羟基，再以NaHSe取代羟基变成硒氢基，在环糊精上引入酶的催化基团，经氧化得到具有GPX活性的含硒环糊精； (1)
2.一种如权利要求1所述的含硒环糊精，其特征在于活化β-环糊精的2位羟基所得到的含硒环糊精结构式如(2)所示； (2)
3.如权利要求1或2所述的含硒环糊精，其特征在于具有较高的谷胱甘肽过氧化物酶活性；
4.权利要求1或2或3所述的含硒环糊精在制备治疗白内障药品中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种含硒环糊精。采用简单的化学合成法,以环糊精疏水空腔作为酶的底物结合部位,以双硒桥为催化基团,将催化基团与结合部位配置在一起,成功制备出具有较高谷胱甘肽过氧化物酶活性的小分子含硒环糊精。本发明所述含硒环糊精具有制备工艺简单、产率高、可大量生产、谷胱甘肽过氧化物酶活性高、稳定性好等特点,在治疗白内障等方面具有巨大的应用潜力。
文档编号A61P27/00GK1306009SQ00133040
公开日2001年8月1日 申请日期2000年11月17日 优先权日2000年11月17日
发明者罗贵民, 刘俊秋, 任晓君, 阎岗林, 牟颖, 杨同书, 沈家骢 申请人:吉林大学