专利名称：田旋花的高分子量提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过收集旋花材料的均相水溶液的高分子量成分获得纯化的旋花提取物。我们意外地发现这些高分子量提取物能抑制小鼠中两种不同恶性肿瘤的生长。被治疗动物肿瘤中白细胞的肿瘤侵润以及诱导淋巴细胞增生的证据证明了这些提取物具有免疫增强作用。在雏鸡绒毛尿囊膜检测中进一步显示它们具有抗血管生成性质。提取方法能除去已知具有毒性的植物材料来源的小分子，包括生物碱。旋花提取物可被用作人和动物的低毒性抗癌药物。
背景技术：
最近应用生物反应变更因子(BRMs)的概念已被考虑用于治疗癌症。一些BRMs不直接对肿瘤细胞产生细胞毒性，但是具有改变生物体环境的性能。免疫刺激和新血管生长的抑制是潜在治疗癌症的两种生物反应变更策略。已知抗肿瘤活性的免疫刺激物的例子为多糖K，β-1，3-葡聚糖和Mamyame疫苗。所有这些都含有高分子量多糖和/或蛋白质。血管生成抑制分子的例子包括TMP-470，和angiostatin，其已被证明具有抗肿瘤活性。在研究具有抗肿瘤活性的田旋花的提取物的过程中，我们开始试图分离低分子量生物碱，其已知具有毒性，并且我们猜想其具有常规的化学治疗或肿瘤细胞毒性。
我们发现，含有毒性生物碱的低分子量提取物显示出很小的抗肿瘤活性，而不包括该毒性生物碱的高分子量提取物通过用作生物反应变更因子而具有明显的抗肿瘤活性。
发明概述本发明的一个目的是提供一种组成为田旋花(Convolvulus arvensis)高分子量提取物的药物组合物，其对正常细胞具有低的毒性，并能诱导动物中抗肿瘤效应，抑制血管生长，提高哺乳动物的免疫机能。优选该高分子量提取物除去分子量小于大约500道尔顿的成分。更优选该除去的成分分子量小于大约1,000道尔顿，更加优选该除去的成分小于大约3,000道尔顿。更加优选地，该除去的成分分子量小于大约5000道尔顿，更优选小于大约10,000道尔顿。
本发明的一个实施方案是应用分子量过滤器或者用硫酸铵沉淀分离田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物。
本发明进一步的目的是提供一种用于分离田旋花(Convolvulusarvensis)的高分子量提取物的方法，其由于除去了粗提取物中毒性的低分子量成分而具有低的毒性。优选除去分子量小于大约3,000道尔顿的成分。更优选除去分子量小于大约6,500道尔顿的成分。更加优选除去分子量小于大约10,000道尔顿的成分。
本发明的一个实施方案是应用分子量过滤器或用硫酸铵沉淀除去田旋花(Convolvulus arvensis)的低分子量提取物。
本发明进一步的目的是提供一种应用田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物的方法，其对动物的正常细胞具有低的毒性，并能诱导抗肿瘤的效应。
本发明进一步的目的是提供一种应用田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物的方法，其能抑制血管生长。
本发明进一步的目的是提供一种应用田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物的方法，其能使动物产生免疫提高的效应。
通过参照后面提出的材料和方法，本发明的这些和其它的目的是显而易见的。
优选实施方案的详细描述我们发现田旋花的高分子量提取物出人意料地对正常细胞具有低的毒性，并能诱导抗肿瘤效应，抑制血管生长，提高哺乳动物的免疫机能。我们还发现田旋花提取物的低分子量成分含有分子量在300-500道尔顿的生物碱，其对肿瘤细胞和正常细胞都有毒性。为了除去毒性的低分子量成分，我们使用分子筛。通常本发明用于获得田旋花的高分子量提取物的方法在于在水性溶液中煮沸新鲜的或老化的旋花，以获得棕色茶状混合物。然后将混合物离心或过滤，除去固体物质，得到一种溶液。为了除去对正常细胞的毒性，只需要除去分子量300-500的成分。然而，我们发现低分子量成分可能非特异性地粘附到膜上，之后又脱落下来。因此，优选使用更大分子量的分子筛-1000道尔顿级别，更优选3000道尔顿级别，更加优选5000道尔顿级别。我们发现即使当分子量达10,000的成分被除去后，该提取物仍保留其在动物中抗肿瘤的效应、其抑制血管生长的能力、以及其提高哺乳动物免疫机能的能力。在下面的实施例中，在水性溶液中煮沸新鲜的或老化的旋花以获得棕色茶状混合物后，然后将该溶液通过分子量过滤装置，以获得高分子量保留物(BWR)，或者应用硫酸铵沉淀，以分离高分子量沉淀(BWP)。之后冻干高分子量提取物，或浓缩。随后检测该提取物的抗肿瘤、免疫提高和抗血管生成活性。
然后应用SDS-Page、IEF和蛋白质检测以进一步确定提取物的成分。应用已知分子量标准并使用Superose12-HR排阻柱(PharrnaciaBiotech)检测该提取物的分子量。
当一起考虑后附的附图
和权利要求书，参照优选实施方案的详细描述，本发明的进一步特征和优点对于本领域普通技术人员是显而易见的。
尽管本发明在实践和测试中可以使用类似于或等价于本文描述的那些材料和方法的其它材料和方法，优选的方法和材料是目前描述的那些。实施例1描述了制备旋花的高分子量提取物所需的步骤。
在实施例2和3中，对该高分子量提取物进行鉴定和毒性测试。
在实施例4-10高分子量提取物的效果实验中，分析了BWP和BWR的抗血管生成活性、抗肿瘤活性和对免疫机能的影响。
检测了BWR的抗血管生成活性。通过将2mm含有10mcg肝素的甲基纤维素片放置于11天的鸡蛋绒毛尿囊膜上，在鸡蛋绒毛尿囊膜上诱导血管生成。BWR的200、100和50mcg三个剂量同时加入到含有肝素的片上，分三组，每组6个鸡蛋。4天后，在绒毛尿囊膜上开个大口，计数每个鸡蛋上新血管的数量。
按照下列公式得到血管生成的抑制百分比血管生成的抑制百分比(％)＝(1-测试组新血管的平均数/对照组新血管的平均数)×100结果如表1所示，发现血管生成或新血管的诱导通过给药BWR被明显抑制，并具有剂量依赖性特征。
表1血管生成的抑制
实施例5BWR的抗肿瘤活性如上所述进行制备，检测了BWR的抗肿瘤作用。每组10个6周雌雄混合的昆明小鼠用作测试动物。随后将S-180纤维肉瘤钟形物(bells)皮下移植到左腹股沟区。在14天的每天中，将BWR皮下注射到右腹股沟区。在移植后15天，切除肿瘤，称重。按照下列公式得到肿瘤生长的抑制百分比肿瘤生长的抑制百分比(％)＝(1-测试组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量)×100结果如下表2所示，发现肿瘤生长通过给药BWR被明显抑制。
表2
实施例6BWP的抗肿瘤活性另外检测了BWP的抗肿瘤作用。每组10个6周雌雄混合的昆明小鼠用作测试动物。随后将S-180纤维肉瘤钟形物(bells)皮下移植到左腹股沟区。在14天的每天中，将BWP皮下注射到右腹股沟区。在移植后15天，切除肿瘤，称重。按照下列公式得到肿瘤生长的抑制百分比肿瘤生长的抑制百分比(％)＝(1-测试组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量)×100结果如下表3所示，发现肿瘤生长通过给药BWP被明显抑制。
表3
实施例7BWP进一步的抗肿瘤效果另外进一步检测了BWP的抗肿瘤作用。每组10个6周C57雌雄混合的昆明小鼠用作测试动物。随后将LLC，Lewis肺癌细胞皮下移植到左腹股沟区。在21天的每天中，将BWR皮下注射到右腹股沟区。在移植后第22天，切除肿瘤，称重。按照下列公式得到肿瘤生长的抑制百分比肿瘤生长的抑制百分比(％)＝(1-测试组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量)×100结果如下表4所示，发现肿瘤生长通过给药BWP被明显抑制。
表4
实施例8BWR进一步的抗肿瘤效果进一步检测了BWR的抗肿瘤作用。每组10个6周雌雄混合的昆明小鼠用作测试动物。随后将S-180细胞皮下移植到左腹股沟区。在14天的每天中，将BWP腹膜内注射。在移植后第15天，切除肿瘤，称重。按照下列公式得到肿瘤生长的抑制百分比肿瘤生长的抑制百分比(％)＝(1-测试组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量)×100结果如下表5所示，发现肿瘤生长通过给药BWR被明显抑制。
表5
将该研究的肿瘤放入到石蜡中，染色，显微镜下进行检测。发现从治疗组切除的肿瘤含有大量的淋巴细胞和单核细胞，只有10％的肿瘤组织。因此，在治疗组肿瘤组织中得到的肿瘤组织重量只是纪录的10％，即是0.08克，而不是0.8克。因此，实际抑制为96.8％。这些结果还表明BWR具有提高对肿瘤组织免疫反应的性能。
淋巴细胞的增加百分比(％)＝(测试组淋巴细胞的平均数/对照组淋巴细胞的平均数×100)-100得到的结果如下表6所示。发现BWR和BWP诱导淋巴细胞增生，并具有剂量依赖性特征。
表6
实施例10BWR和BWP对人吞噬细胞活性的影响检测了BWR和BWP对人吞噬细胞活性的影响。通过含有两个受试者的抗凝结人血液的离心管制备两个buffy涂层样品。然后将该样品分成两份。向每个受试者的一个buffy涂层样品中加入2微克BWR和BWP。每个测试者的一个buffy涂层样品作为对照。将所有样品培养5小时。然后将30微克新鲜再水合的发面酵母加入到所有样品中。1小时后，将吖啶橙色着色剂2x储备液加入到每个样品中。将每个样品的一部分置于显微镜玻片上。纪录每个样品的含有细胞内发面酵母的吞噬细胞百分比。
结果表明与对照相比，治疗样品中含有细胞内发面酵母的吞噬细胞百分比平均增加85％。这证明了通过BWR和BWP刺激免疫系统的另一机理。
权利要求
1.一种用于治疗癌症、抑制新血管生长和/或提高哺乳动物免疫机能的药物组合物，所述组合物含有有效量的田旋花提取物，其中已除去分子量小于大约500道尔顿的成分，和药物可接受的载体。
2.按照权利要求1的药物组合物，其中分子量小于大约1,000道尔顿的成分已被除去。
3.按照权利要求2的药物组合物，其中分子量小于大约3,000道尔顿的成分已被除去。
4.按照权利要求3的药物组合物，其中分子量小于大约5,000道尔顿的成分已被除去。
5.按照权利要求4的药物组合物，其中分子量小于大约10,000道尔顿的成分已被除去。
6.一种用于制备非毒性田旋花提取物的方法，其特征在于除去分子量小于大约500道尔顿的成分。
7.按照权利要求6的方法，其中分子量小于大约1,000道尔顿的成分被除去。
8.按照权利要求7的方法，其中分子量小于大约3,000道尔顿的成分被除去。
9.按照权利要求8的方法，其中分子量小于大约5,000道尔顿的成分被除去。
10.按照权利要求9的方法，其中分子量小于大约10,000道尔顿的成分被除去。
11.按照权利要求6的方法，其中通过应用分子量过滤器除去所述成分。
12.按照权利要求6的方法，其中通过用硫酸铵沉淀除去所述成分。
13.权利要求1的组合物在制备用于治疗癌症的医药中的应用。
14.权利要求1的组合物在制备用于延缓或阻止血管生长的医药中的应用。
15.权利要求1的组合物在制备用于提高哺乳动物免疫机能的医药中的应用。
16.按照权利要求15的应用，其中所述免疫机能选自淋巴细胞生长和吞噬细胞活性。
全文摘要
纯化的旋花提取物用于抑制肿瘤细胞生长、抑制血管生长和提高免疫机能。该旋花提取物通过除去田旋花的毒性低分子量成分而制备。
文档编号A61P37/04GK1338941SQ00803339
公开日2002年3月6日 申请日期2000年1月27日 优先权日1999年2月16日
发明者孟小龙, 休·D·赖尔登, 尼尔·H·赖尔登 申请人:人机能改善中心国际有限公司