具有生化活性的磁性毫微粒、其制备方法和应用的制作方法

专利名称：具有生化活性的磁性毫微粒、其制备方法和应用的制作方法
按照权利要求1、9、13、17、18、19、21和23-25的前序部分，本发明涉及磁性毫微粒及其制备和应用。
癌症是最常见的死亡原因之一。特别是，越来越多的人死于肺癌、乳腺癌和前列腺癌。因此，目前控制癌症是医学上的一个主要目的。
除了手术切除感染器官，控制肿瘤转移的常规治疗方法包括化疗，其副作用已众所周知，因为这些药物的非特异性作用它们同样会破坏健康细胞，即整个身体易受感染。
尤其是利用免疫反应治疗的新方法，它是通过下述方法完成一方面通过信使物质或细胞因子激活内生抵抗力，另一方面，蛋白质分子和/或单克隆抗体破坏肿瘤细胞。
在肿瘤细胞分离领域的新研究中已使用包括磁核的颗粒，该颗粒通过生物活性壳物质进行修饰。目前正在开发所谓的“靶向药物”，即将药物如阿霉素或其它细胞生长抑制剂偶合到磁性微球上。
周知的“微球”和“dynabeads”已被用于诊断方法，其中通过生物学相互作用将磁性微球吸附到恶性细胞的细胞膜上，然后进行磁性分离。然而，通常细胞膜的表面结构是非特异性的，因此分离率低于80％。因此，会出现许多肿瘤细胞未被分离，其仍保持形成转移的能力。通常诊断目的的分离总是在体外途径进行，即将包括要被分离细胞的体液在体外适当的容器中进行处理。分离后，可以将纯化的体液重新提供给人体。
由于不能完全分离恶性细胞，一段时间后必须要重复该程序。由于该程序无论如何都会对患者产生严重影响，因此重复治疗可能会受到一定限制。
DE 41 16 093 A1描述了一种通过对磁颗粒表面进行控制修饰获得磁性载体的方法。按照该方法描述，这些磁颗粒还可以形成磁性液体，其特征在于它们能转运杂聚阴离子和饱和或未饱和的表面活性剂。该表面修饰目的是使其中的生物活性分子如抗体结合到颗粒的表面。该生物活性分子通过硫桥(thio bridge)结合到聚硫醇上。尤其是二羧酸和羟基羧酸以及二巯基丁二酸被用作连接物质。由于铁螯合基团，这些化合物能够结合到磁颗粒上。
由于其生物相容性不足，发现这些其表面包括生物活性分子的磁颗粒不适合渗透进入细胞内隔室、以便与其中的生物大分子进行偶合的目的。
DE 196 24 426 A1描述了用于转送诊断或治疗活性物质的磁性液体。该磁性颗粒核用具有能共价结合或离子交换的反应基团的聚合物壳。在该壳中，它的确是生物相容性的，并且可由葡聚糖构成，其中，可以附着或活化新的或另外的官能团例如琥珀酸酐或氯乙酸，然后，通过异极或共价键在其上固定诊断或治疗活性物质。上述结合到磁颗粒上的药物应该以静脉给药的途径施用，并在靶区域如肿瘤或炎性组织区域内通过高梯度磁场固定，以达到其诊断或治疗效果。为了保证在磁场中传送，要求磁颗粒具有高的血管内可利用性，其粒度被要求在200-500nm。在这种情况下，由于颗粒的粒度，它们不能够渗透进入细胞内隔室。并且，这些颗粒与细胞内生物大分子的特异性结合也不可行。
本发明的目的在于提供一种毫微粒，其即使在细胞的胞内区域也能够与细胞内生物大分子进行特异性结合，因此有可能通过暴露于外部磁场进行分离。
按照本发明，通过权利要求1、9、13、17、18、19、21和23-25的特征部分可以完成所述目的。
有利地，本发明的磁性毫微粒能够渗透通过细胞膜，进入细胞内隔室以便与其中的细胞内生物大分子进行相互作用。
磁性毫微粒由铁或亚铁磁性材料构成，并具有生物活性和/或治疗有效性的壳层。一方面，它们能够渗透进入细胞的细胞膜，另一方面，它们能够高度特异结合到恶性细胞的胞内区域的靶物质上。
通常，按照本发明的毫微粒的粒度在2-100nm。该毫微粒在渗透通过细胞膜的能力及其改进的物理相容性方面具有突出性质。尽管由于它们体积小而具有相对低的磁矩，但是通过结合到细胞内靶物质生物大分子上而造成的细胞内颗粒聚集导致其浓度随要除去的恶性细胞的磁矩增加而增加，由此促进了磁性分离。
按照本发明的毫微粒的典型核材料为通常组成为MeOxFe2O3的铁氧体，其中Me为二价金属如Co、Mn或Fe。其它适合的材料为γ-Fe2O3，纯金属Co、Fe、Ni，金属化合物如碳化物和氮化物。
钴和铁的磁矩高达铁氧体的4倍，因此假定相同的粒度和磁场，这些材料能更有效地被除去。但是。必须考虑到这些材料的生物相容性较低。如果这样会对例如恶性细胞产生另外的损伤，这可能也会是一个优点。但另一方面，必需限制这些物质在健康细胞的暴露时间和浓度。
需要综合生化、医学和物理性质各方面考虑，得到特制的磁性核材料和壳层。
按照本发明，按照权利要求1的磁性毫微粒能够渗透通过细胞膜，并且该磁性毫微粒能够与细胞内靶物质生物大分子相互作用。为此，磁性毫微粒在体液内必须均匀分散，这是因为聚集的毫微粒不能渗透通过细胞膜。这就特别要求壳层具有足够的厚度，至少要达到核半径的范围，并且壳层成分具有良好的生物相容性。在壳材料中负载电荷，即增加ζ电位对其在体液内中分散有另外的益处。
按照权利要求9的分散剂是磁性毫微粒的一种特别有益于给药的剂型。
通过将毫微粒分散液调节在低浓度，可以促进按照本发明的磁性毫微粒的均匀分布。但是当毫微粒通过特异性吸附在细胞的胞内区域的靶物质生物大分子上进行浓缩，细胞内部会产生更高的浓度。在细胞内部的这种颗粒聚集是有利的。因此，磁性毫微粒的浓度越高，要分离细胞的磁矩也增加。
磁核颗粒在水相或有机相中通过成核/结晶生长过程形成。在水相中应用化学沉淀法进行制备有几个优点。在第一步中形成非修饰的磁颗粒，通过调节pH，可以使这些颗粒同时获得正电荷和负电荷。只是在第二步中吸附壳分子。吸附的有效性取决于磁核颗粒表面的电荷符号。通常，具有负电荷分子部分的壳分子优选吸附到具有正电荷的核表面。在多数情况下，要进行离子化学反应，包括羧基化合物和氨基化合物。该反应是有利的，因为一方面该吸附的壳分子完全覆盖核表面，而另一方面又牢牢地固着在其上。
通常，已知对于多糖，生物相容性基质S的配位结合不足以牢牢固着。
亚铁磁金属核颗粒的制备主要通过应用在有机相中相应的羰基金属进行热解而进行。为此，要加入溶于有机相的表面活性剂或聚合物进行稳定。在第一个反应步骤中，形成均匀分散在有机相中的核颗粒。在第二个反应步骤中，将核颗粒转移到水相载体液体中。如果该壳层包括修饰的氨基酸，所述核颗粒的转移在通过加入碱性载体水溶液完全除去有机溶剂后进行。该壳层转化成氨基酸的水溶性盐，这能导致磁核颗粒的分散。随后，通过进一步反应可以制成磁性毫微粒。
按照本发明，磁性毫微粒包括通式为M-S-L-Z(I)的化合物，在S和L、L和Z之间的连接位点具有共价结合的官能团，其中M表示磁核颗粒；S表示固定到M上的生物相容性基质；L表示连接基团；和Z表示由核酸、肽或蛋白质或其衍生物组成的基团，该基团具有至少一个能够特异性结合到细胞内生物大分子的结合区的结构。
该磁核颗粒由通式为MeOxFe2O3(其中Me为二价金属如钴、锰、铁)的磁铁矿、磁赤铁矿、铁氧体，或钴、铁、镍、碳化铁或一氮化二铁构成。在本发明进一步的实施方案中，核颗粒的粒度在2-100nm。
在本发明的一个实施方案中，基质S通过下列化合物形成，例如聚-或寡糖或其衍生物如葡聚糖、羧甲基葡聚糖、淀粉、双醛淀粉、甲壳质、海藻酸盐、纤维素、羧甲基纤维素，蛋白质或其衍生物如白蛋白、肽，合成聚合物如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸酯，双官能团羧酸及其衍生物如巯基丁二酸或羟基羧酸。
在本发明的另一个实施方案中，连接基团L的形成是通过反应化合物如聚-和二羧酸、多羟基羧酸、二胺、氨基酸、肽、蛋白质、类脂、脂蛋白、糖蛋白、凝集素、寡糖、多糖、寡核苷酸及其烷基化衍生物，和以单链或双链形式存在的核酸(DNA，RNA，PNA)及其烷基化衍生物，其中该化合物包括至少两个相同或不同的官能团。
在本发明的另一个实施方案中，提供了作为示例的官能团，按照本发明，其可以用作基质S、连接基团L和基团Z的连接基团。化合物(I)的特征在于共价键，这是至关重要的。
通式为S-L-Z(II)的生化活性化合物特别适合于制备按照本发明的磁性毫微粒。
分步进行磁性毫微粒制备。通过本身已知的方法制备磁核颗粒，在优选的实施方案中，直接与生化活性化合物(II)进行反应。
在本发明另一个实施方案中，该磁核颗粒按照下述方法制备a.通过本身已知的方法制备磁核颗粒；b.将磁核颗粒与生物相容性基质S反应；和c.将形成的化合物M-S与化合物L-Z反应；其中为了制备L-Z，化合物如聚-和二羧酸、多羟基羧酸、二胺、氨基酸、肽、蛋白质、类脂、脂蛋白、糖蛋白、凝集素、寡糖、多糖、寡核苷酸及其烷基化衍生物，和以单链或双链形式存在的核酸(DNA，RNA，PNA)及其烷基化衍生物，其中该化合物包括至少两个相同或不同的官能团，与具有至少一个官能团并且包括至少一个能够特异性结合到细胞内生物大分子结合区的结构的核酸、肽和/或蛋白质或其衍生物反应。
用于制备生化活性化合物(II)的过程是先制备化合物L-Z，然后L-Z与基质S反应。
按照本发明的毫微粒可以用于细胞的分离、恶性细胞的分离和细胞内生物大分子的分离。尤其，作为分子标记物的染色体的融合区意欲作为与细胞内生物大分子相互作用的攻击点(points of attack)。例如，它们可以是某些特殊疾病的典型的分子标记物。并且，这些融合区可以导致能生产融合信使核糖核酸(融合mRNA)和融合蛋白的融合基因。可以提及作为例子的有慢性髓细胞样白血病(CML)。在CML中，出现染色体重排t(9；22) (q34；q11)，导致BCR/ABL基因产物的所谓的费城染色体。即在具有这些染色体畸变的细胞中，存在其它体细胞没有的基因。该基因转录为信使核糖核酸(mRNA)，其导致BCR/ABL蛋白的基因。该基因转录为信使核糖核酸(mRNA)，其导致BCR/ABL蛋白的合成。BCR/ABL mRNA和BCR/ABL蛋白只在肿瘤细胞中出现。BCR/ABL mRNA有可能作为磁性毫微粒的结合区。通过核酸/核酸相互作用，按照本发明的磁性毫微粒的Z基团与mRNA上的互补序列相互作用，其中要求所述序列包含BCR/ABL融合位点(fusion site)。事先应用实验室方法确定融合点周围的每个具体序列。该相互作用发生在肿瘤细胞的细胞质中。一旦该磁性毫微粒通过Z基团结合到BCR/ABLmRNA的互补序列上，该肿瘤细胞就被标记了。
下面列举其它癌症例子血液学疾病染色体重排(融合基因产物)急性淋巴细胞性白血病t(9；22)(q34；q11)(BCR/ABL)(ALL)t(1；19)(q23；p13)(E2A/PBX)t(8；14)(q24；q32)t(2；8)(p11；q24)t(8；22)(q24；q11)(MYC，IGH，IGK，IGL)t(4；11)(q21；q23)(MLL/AF2)t(1；14)(p32；q11)del(1p32)(TAL1，TCRA)急性骨髓样白血病t(8；21)(q22；q22)(AML/ETO)(AML)t(15；17)(q21；q11)(PML/RARA)inv16(p13；q22)t(16；16) (p13；q22)(MYH11/CBFb)t(6；9)(p23；q34)(DEK/CAN)非何杰金氏淋巴瘤(14；18)(q32；q21)(BCL2/IGH)t(8；14)(q24；q32)t(2；8)(p11；q24)t(8；22)(q24；q11)(MYC，IGH，IGK，IGL)t(11；14)(q13；q32)(BCL1/IGH)
t(3；14)(q27；q32)(BCL6/IGH)尤因氏肉瘤t(11；22)(q24；q12)(FLI1/EWS)对于这些疾病，其仅表示通过该疗法治疗的可能选择的疾病，类似地使用上述程序。对于每种疾病，都有一个通过下列染色体位点明确描述的典型碱基序列。在这些疾病中，相应地，也是通过核酸/核酸相互作用，磁性毫微粒的Z基团与mRNA上的互补序列(结合区)相互作用。对于任何可能的疾病，准确的碱基序列的数量是不定的；并且仅仅对于CML，迄今已描述了超过10个的断裂区(breakage region)，并且新的断裂区不断被描述。
本发明具有很多优点。首先，在相应的细胞培养研究中发现本发明的磁性毫微粒具有高度生物相容性。这能保证其安全应用，并且该颗粒有可能在按照本发明的应用范围内完全进行体外应用。与现有的应用流式细胞光度计(FACS)和磁分离(MACS)的分离方法相比，本发明的磁性毫微粒具有非常重要的优点。通过应用本发明的磁性毫微粒，有可能到达细胞内部(即所谓的细胞质中)，实现生物大分子与相应的结构如核酸的结合区的特异性结合。同样，基于经过适当翻译形成的蛋白质被考虑用作特异性结合到通式(I)的Z基团上的靶物质生物大分子。按照目前的知识，所有这些恶性病都是基于细胞中的畸变基因组。在很多疾病中，已经详细限定了分子基础。现有基因融合形成所谓的融合基因，这导致了碱基序列中的各个特异性改变，其对于每种疾病和患者都是特异性的。按照本发明并在该过程的范围内，首先通过应用分子诊断限定了作为式(I)Z基团的特异性结合配对物的改变的基因组结构(结合区)。其后，合成作为结合区的特异性结合配对物的Z基团，随后投放临床应用。并且，应注意到健康细胞也具有详细限定的碱基序列，其为感兴趣的结合区。胚细胞可以作为一个例子，其存在于任何健康机体中，为细胞型特异性基因表达的原型，其具有不同于成年细胞的碱基序列。通过Z基团特异性结合到细胞内核酸上，在细胞内生物大分子的磁性分离中这些细胞以及恶性细胞可以被用作靶向目标。因此，显而易见的是，恶性细胞的分离只是其中的一个例子。除了从血液中分离，可能应用到任何其它体液，如脑脊髓液、淋巴液、尿液、唾液、精液，以及离解的组其它体液，如脑脊髓液、淋巴液、尿液、唾液、精液，以及离解的组织。
下面再通过慢性髓细胞样白血病的例子更详细地举例说明磁性毫微粒的创造性的应用。
很长时间以来，慢性髓细胞样白血病一直被认为是基于9和22染色体(通常称为费城染色体)间的特异性易位。但是，近年来的分子分析表明即使在某一具体疾病，也存在可能断裂位点的多样性，即不同的融合基因，这样每个患者必须单独确定。因此，没有对患有慢性髓细胞样白血病的任何患者都普遍适用的方法，而是需要如上所述先确定断裂位点(结合区域)的精确位置。有利地根据适当的表征，应用按照本发明的磁性毫微粒可以具体确定断裂位点。现在，可以标记恶性克隆的细胞，随后用所需方法分离。原则上，该方法可能适用于所有其它的疾病。正日益地理解实体肿瘤如乳腺癌或结肠癌的分子基础。从散发型可以辨别出乳腺癌和肠道癌的遗传类型，这仍代表了到目前为止大多数病例。并且，应用特定基因型式的表达，可以标记恶性细胞，分离成所需型。原则上，可能从体液和组织中提取。在这点上，再一此应该注意没有其它磁性毫微粒可以进行该特殊的方法，其代表一种利用磁性颗粒结合到生物大分子的全新的方法。
本发明将参照下列实施例更加详细地举例说明。
实施例实施例1将0.5mol FeCl2·4H2O和1mol FeCl3·6H2O完全溶解于100ml水中，在搅拌下加入浓的氢氧化铵，直到pH值达到9。通过磁性方法分离分散液中的黑色颗粒，倾析上清液。其后，应用半浓盐酸将分散液的pH值调节至1-4，从而交换颗粒电荷。重复该方法，直到该颗粒开始重新分散。随后，进行离心(5,000-10,000g)，倾析上清液。将残渣置于HCl(3-10N)中，完全重复上述方法，直到在pH值4-5下电导率达到20-500μS/cm，或者将残渣再次用HCl(3-10N)透析，直到达到相同值。
形成的稳定磁铁矿/磁赤铁矿溶胶的饱和极化强度(saturationpolarization)最大为6mT。
实施例2将0.5mol FeCl2·4H2O和1mol FeCl3·6H2O完全溶解于100ml水中，在搅拌下加入浓的氢氧化铵，直到pH值达到9。通过磁性方法分离分散液中的黑色颗粒，倾析上清液。其后，加入几毫升过氧化氢(30％)，由此氧化颗粒形成磁赤铁矿。此后，如实施例1所述通过加入半浓盐酸处理颗粒。
形成的稳定磁赤铁矿溶胶的饱和极化强度最大为6mT。
实施例3向100ml如实施例1和2中描述的磁铁矿和/或磁赤铁矿溶胶中，加入溶解于20ml水中的6g CM-葡聚糖(DS0.4-2)，然后在40-80℃优选50-60℃、搅拌下加热混合物30分钟。形成稳定的溶胶，其组成为用CM-葡聚糖包覆的磁铁矿和/或磁赤铁矿颗粒，然后通过在水中透析进行纯化。
实施例4在70℃、搅拌下，向在25ml水中的0.6g CM-葡聚糖(DS0.4-2)中，逐滴缓慢加入包括2.04g FeCl2·4H2O溶于其中的13.1ml 1M氯化铁(III)溶液。其后，通过加入稀NaOH(2N)将反应混合物pH值调节至9-10，然后用稀HCl(2N)中和，在70℃下搅拌2小时，通过进一步加入稀NaOH或HCl维持溶液的pH值在大约6.5-7.5。冷却该反应混合物，然后通过离心除去不溶物，然后通过在水中透析纯化得到的磁性液体。
用CM-葡聚糖包覆的毫微粒的饱和极化强度最大为6mT。
实施例5
向100ml如实施例1和2中描述的磁铁矿和/或磁赤铁矿溶胶中，加入溶解于20ml水中的2g二巯基丁二酸，然后在70℃、搅拌下加热混合物30分钟。形成稳定的溶胶，其组成为用二巯基丁二酸包覆的磁铁矿和/或磁赤铁矿颗粒，然后通过在水中透析进行纯化。饱和极化强度为1-8mT，优选3-6mT。
实施例6向100ml如实施例1和2中描述的磁铁矿和/或磁赤铁矿溶胶中，加入溶解于100ml水中的6g牛白蛋白，然后在70℃、搅拌下加热混合物30分钟。形成稳定的溶胶，其组成为用白蛋白包覆的磁铁矿和/或磁赤铁矿颗粒，然后通过在水中透析进行纯化。
实施例7将100ml按照实施例1或2制备的分散液与含有7g N-油酰基肌氨酸(BASF公司的Korantin SH)的碱性溶液混合，在50-80℃、优选65℃下搅拌30分钟。混合后该颗粒成团，但是当维持pH值在碱性范围、优选8-9下，其重新稳定。该颗粒在酸性下沉淀，但在碱性范围下重新分散。
实施例8将1mg丁二酸溶于10ml水中，在搅拌下加入等摩尔量的水溶性碳二亚胺(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，在5-10℃下搅拌30分钟。随后加入溶于50μl磷酸盐缓冲液(pH 7.0)的10μg氨基官能团的寡核苷酸(5′-H2N-ACTGGCCGCTGAAGGGCTTCTGCGTCTCCA-OH-3′)，将该混合物维持在5-10℃24小时。为了除去副产物和非反应性原料，将其在水中透析，并冻干该反应产物。
实施例9
在搅拌下，向溶于100μl磷酸盐缓冲液(pH7.0)的按照实施例8的10μg官能团化的寡核苷酸中，加入20μg水溶性碳二亚胺(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，将其维持在5-10℃30分钟。然后将该溶液加入到溶于20ml磷酸盐缓冲液中的200mg白蛋白中，将该混合物维持在5-10℃ 24小时。为了除去副产物和非反应性原料，将其在水中透析，并冻干该反应产物。
实施例10将1ml如实施例1和2中描述的磁铁矿和/或磁赤铁矿溶胶以1∶10的比例用水稀释，通过加入稀NaOH将pH值调节至7。随后加入溶于10ml磷酸盐缓冲液(pH7.0)的按照实施例9的60mg官能团化的白蛋白，将其在40℃、搅拌下加热大约30分钟。然后将得到的磁性液体离心，将该溶液通过在水中透析进行纯化。
实施例11在搅拌下，向溶于100μl磷酸盐缓冲液(pH 7.0)的按照实施例8的10μg官能团化的寡核苷酸中，加入20μg水溶性碳二亚胺(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，将其维持在5-10℃30分钟。然后将该溶液加入到按照实施例6制备的10ml磁性液体中，以1∶10的比例用水稀释，将该混合物维持在5-10℃ 24小时，然后通过在水中透析进行纯化。
实施例12将1ml按照实施例3或4制备的磁性液体以1∶10的比例用水稀释，，加入20mg水溶性碳二亚胺(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，将其在5-10℃下搅拌大约3分钟。其后，加入10mg肽(H-Ala-Ala-Ala-Ala-OH)，将混合物维持在5-10℃ 24小时。为了除去副产物和非反应性原料，将其在水中透析。
实施例13
向实施例12描述的10ml溶液中，加入20mg水溶性碳二亚胺(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，将其在5-10℃下搅拌30分钟，加入溶于50μl磷酸盐缓冲液(pH7.0)的10μg氨基官能团的寡核苷酸(参见实施例7)。将该混合物维持在5-10℃ 24小时，然后在水中透析。
权利要求
1.具有生化活性的磁性毫微粒，其由磁核颗粒和固定到核颗粒的壳层构成，其特征在于所述磁性毫微粒包括通式为M-S-L-Z(I)的化合物，在S和L、L和Z之间的连接位点具有共价结合的官能团，其中M表示所述的磁核颗粒；S表示固定到M上的生物相容性基质；L表示连接基团；和Z表示由核酸、肽或蛋白质或其衍生物组成的基团，该基团具有至少一个能够特异性结合到细胞内生物大分子结合区的结构。
2.按照权利要求1的磁性毫微粒，其特征在于所述核颗粒由通式为MeOxFe2O3的磁铁矿、磁赤铁矿、铁氧体组成，其中Me为二价金属如钴、锰、铁，或由钴、铁、镍、碳化铁或一氮化二铁组成。
3.按照权利要求1或2的磁性毫微粒，其特征在于所述核颗粒的粒度在2-100nm。
4.按照权利要求1-3中任何一个的磁性毫微粒，其特征在于所述生物相容性基质S为一种化合物，例如聚-或寡糖或其衍生物如葡聚糖、羧甲基葡聚糖、淀粉、双醛淀粉、甲壳质、海藻酸盐、纤维素、羧甲基纤维素，蛋白质或其衍生物如白蛋白，肽，合成聚合物如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸酯，双官能羧酸及其衍生物如巯基丁二酸或羟基羧酸。
5.按照权利要求1-4中任何一项的磁性毫微粒，其特征在于所述连接基团L的形成是通过反应化合物如聚-和二羧酸、多羟基羧酸、二胺、氨基酸、肽、蛋白质、类脂、脂蛋白、糖蛋白、凝集素、寡糖、多糖、寡核苷酸及其烷基化衍生物，和以单链或双链形式存在的核酸(DNA，RNA，PNA)及其烷基化衍生物，其中该化合物包括至少两个相同或不同的官能团。
6.按照权利要求1-5中任何一个的磁性毫微粒，其特征在于所述官能团为例如-CHO、-COOH、-NH2、-SH、-NCS、-NCO、-OH、-COOR的基团，其中R表示烷基、酰基或芳基残基，和
7.按照权利要求1-6中任何一项的磁性毫微粒，其特征在于所述S和M相互间共价连接。
8.按照权利要求1-7中任何一项的磁性毫微粒，其特征在于在M和S间形成静电键。
9.一种分散体，其由按照权利要求1的磁性毫微粒和载体液体组成。
10.按照权利要求9的分散体，其特征在于所述载体液体包括极性和/或非极性溶剂。
11.按照权利要求9或10的分散体，其特征在于所述载体液体包括水和/或能与水混溶的溶剂。
12.按照权利要求9-11中任何一项的分散体，其特征在于其包括生理添加剂。
13.一种通式为S-L-Z(II)的生化活性化合物，在S和L、L和Z之间的连接位点具有共价结合的官能团，其中S表示固定到M上的生物相容性基质；L表示生物相容性连接基团；和Z表示由核酸、肽和/或蛋白质或其衍生物组成的基团，该基团具有至少一个能够特异性结合到细胞内生物大分子的结合区的结构。
14.按照权利要求13的生化活性化合物，其特征在于所述生物相容性基质S为一种化合物，例如聚-或寡糖或其衍生物如葡聚糖、羧甲基葡聚糖、淀粉、双醛淀粉、甲壳质、海藻酸盐、纤维素、羧甲基纤维素，蛋白质或其衍生物如白蛋白，肽，合成聚合物如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸酯，双官能羧酸及其衍生物如巯基丁二酸或羟基羧酸。
15.按照权利要求13或14的生化活性化合物，其特征在于所述连接基团L的形成是通过反应化合物如二羧酸、二胺、氨基酸、肽、蛋白质、类脂、脂蛋白、糖蛋白、凝集素、寡糖、多糖、寡核苷酸及其烷基化衍生物，和以单链或双链形式存在的核酸(DNA，RNA，PNA)及其烷基化衍生物，其中该化合物包括至少两个相同或不同的官能团。
16.按照权利要求13-15中任何一项的生化活性化合物，其特征在于所述官能团为如-CHO、-COOH、-NH2、-SH、-NCS、-NCO、-OH、-COOR的基团，其中R表示烷基、酰基或芳基残基，和
17.一种制备按照权利要求1的磁性毫微粒的方法，其特征在于包括以下步骤a.通过本身已知的方法制备磁核颗粒；b.将该磁核颗粒与化合物S-L-Z(II)反应，形成化合物M-S-L-Z(I)。
18.一种制备按照权利要求1的通式(I)的化合物的方法，其特征在于包括以下步骤a.通过本身已知的方法制备磁核颗粒；b.将磁核颗粒与生物相容性基质S反应；和c.将形成的化合物M-S与化合物L-Z反应；其中为了制备L-Z，化合物如聚-和二羧酸、多羟基羧酸、二胺、氨基酸、肽、蛋白质、类脂、脂蛋白、糖蛋白、凝集素、寡糖、多糖、寡核苷酸及其烷基化衍生物，和以单链或双链形式存在的核酸(DNA，RNA，PNA)及其烷基化衍生物，其中该化合物包括至少两个相同或不同的官能团，与具有至少一个官能团并且包括至少一个能够特异性结合到细胞内生物大分子结合区的结构的核酸、肽和/或蛋白质或其衍生物反应。
19.一种制备按照权利要求1的通式(I)的化合物的方法，其特征在于包括以下步骤a.通过本身已知的方法制备磁核颗粒；b.将磁核颗粒与生物相容性基质S反应；和c.将形成的化合物M-S与化合物，如聚-和二羧酸、多羟基羧酸、二胺、氨基酸、肽、蛋白质、类脂、脂蛋白、糖蛋白、凝集素、寡糖、多糖、寡核苷酸及其烷基化衍生物，和以单链或双链形式存在的核酸(DNA，RNA，PNA)及其烷基化衍生物反应，其中该化合物包括至少两个相同或不同的官能团；d.将形成的化合物M-S-L与具有至少一个官能团并且包括至少一个能够特异性结合到细胞内生物大分子结合区的结构的核酸、肽和/或蛋白质或其衍生物反应。
20.按照权利要求17-19的方法，其特征在于所述化合物S、L和Z通过官能团如-CHO、-COOH、-NH2、-SH、-NCS、-NCO、-OH、-COOR连接，其中R表示烷基、酰基或芳基残基，和
21.一种制备按照权利要求13的生化活性化合物的方法，其特征在于包括以下步骤a.制备化合物L-Z，b.将L-Z与生物相容性基质S反应，其中为了制备L-Z，化合物如聚-和二羧酸、多羟基羧酸、二胺、氨基酸、肽、蛋白质、类脂、脂蛋白、糖蛋白、凝集素、寡糖、多糖、寡核苷酸及其烷基化衍生物，和以单链或双链形式存在的核酸(DNA，RNA，PNA)及其烷基化衍生物，其中该化合物包括至少两个相同或不同的官能团，与具有至少一个官能团并且包括至少一个能够特异性结合到细胞内生物大分子结合区的结构的核酸、肽和/或蛋白质或其衍生物反应。
22.按照权利要求21的方法，其特征在于所述化合物S、L和Z通过官能团如-CHO、-COOH、-NH2、-SH、-NCS、-NCO、-OH、-COOR连接，其中R表示烷基、酰基或芳基残基，和
23.按照权利要求1的磁性毫微粒在分离细胞中的应用。
24.按照权利要求1的磁性毫微粒在分离恶性细胞中的应用。
25.按照权利要求1的磁性毫微粒在分离细胞内生物大分子中的应用。
全文摘要
本发明涉及磁性毫微粒、其制备方法及其应用。本发明的目的在于提供一种即使在细胞的胞内区域也能够与细胞内生物大分子进行特异性结合的毫微粒,因此有可能通过外部磁场的作用进行分离。其通过具有生化活性的磁性毫微粒完成,其中所述磁性毫微粒由磁核颗粒和固定到核颗粒的壳层构成。该毫微粒包括通式为M－S－L－Z(I)的化合物,在S和L、L和Z的连接位点具有共价结合的官能团。M表示磁性核颗粒;S表示固定到M上的生物相容性基质;L表示连接基团;和Z表示由核酸、肽或蛋白质或其衍生物组成的基团,该基团具有至少一个能够特异性结合到细胞内生物大分子结合区的结构。
文档编号A61K49/00GK1379687SQ00813707
公开日2002年11月13日 申请日期2000年9月14日 优先权日1999年9月14日
发明者米夏埃尔·K·贝尔, 季米特里·别尔科夫, 诺贝特·布斯克, 约阿希姆·克莱门特, 彼得·格纳特, 克劳斯·赫夫肯, 凯－奥利弗·克利希, 托马斯·克贝尔, 马蒂亚斯·施纳贝劳奇, 塞巴斯蒂安·福格特, 谢斯廷·瓦格纳, 克里斯蒂安·甘绍 申请人:生物医学阿佩则系统有限公司