专利名称：具有天然样构象的氧化还原可逆hcv蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及HCV蛋白，其中半胱氨酸残基在纯化过程中受到可逆保护。最终，此纯化程序产生具有生物活性和天然样蛋白构象的HCV蛋白，呈递相应的表位。本发明还涉及使用这些HCV蛋白的药物筛选方法以及诊断和治疗应用，如疫苗和药物。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)感染在发达国家和发展中国家都是一个主要的健康问题。据估计，世界人口的1-5％受此病毒影响，HCV感染似乎是输血相关肝炎的最重要原因，时常发展为慢性肝损害。而且，有证据表明HCV可诱导肝细胞癌。因此，对于可靠的诊断方法和有效的治疗制剂便有很高的需求。对于HCV污染血制品的敏感且特异的筛选方法及HCV培养方法的改进也很必需。
HCV是正链RNA病毒，含有约9600个碱基，编码至少3个结构蛋白和6个非结构蛋白。按照序列同源性，结构蛋白从功能上分为1个单一的核心蛋白和两个包膜蛋白E1和E2。E1蛋白由192个氨基酸组成，依HCU基因型不同包含5-6个N一糖基化位点。E2蛋白由363-370个氨基酸组成，依HCV基因型不同包含9-11个N一糖基化位点(综述参见Major和Feinstone，1997；Maertens和Stuyver，1997)。E1蛋白包含多种可变区(Maertens和Stuyver，1997)，而E2蛋白则包含3个高变区，其中主要区域位于蛋白的N端(Maertens和Stuyver，1997)。这些包膜蛋白可通过重组技术从大肠杆菌、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞获得。
NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B是非结构(NS)蛋白。NS3约70kDa，具有蛋白酶和螺旋酶活性。NS3中螺旋酶活性的关键序列同时还具有RNA结合、Mg++结合和ATP结合特性。抗-NS3抗体通常首先出现在血清转化系列中。在当今各种可以买到的测定方法中，NS3蛋白的免疫反应性似乎不同。
迄今为止，已证实接种抗疾病的疫苗是控制疾病最经济有效的方法。然而，开发有效的HCV疫苗的努力却遇到重重困难。疫苗的一种功有是诱导病人体内免疫反应。因而，应当识别HCV抗原决定簇，并以恰当方式给予病人。抗原决定簇可被分为至少两种形式，即线性表位和构象表位。构象表位来自分子在三维空间的折叠，通常认为构象表位将实现最有效的疫苗，因为它与天然的HCV表位相似。然而，培养HCV似乎有不可逾越的困难，只能得到极微量的病毒颗粒。而且，重组蛋白的表达和纯化也有大量问题，通常得到非正确折叠的蛋白。因此，多数HCV蛋白的体内结构还不清楚，也没有开展关于构象表位的确实的研究。
再加之没有合适的体外培养系统和小动物模型，均严重阻碍了HCV感染的新的抗病毒药物的开发。黑猩猩是目前唯一可用来研究HCV感染、预防和治疗的动物模型，但这一模型只允许研究已选化合物。
据报道(Deleersnyder等，1997)，E1包膜蛋白需要E2包膜蛋白以达到正确折叠状态。而且，有报道表明E1和E2形成异源二聚体，构成病毒包膜的基本单位(Yi等，1997)。但是，Houghton(1997)报道用重组gpE1E2(4×25μg)对3只慢性HCV感染的黑猩猩进行重复免疫，并未诱导出有意义的免疫应答。丙肝病人抗包膜免疫应答的诱导对病人来说是理想和有益的，因为此类抗体的高水平似乎与干扰素治疗的高反应性相关，因而有助于病人清除病毒(PCT/EP 95/03031，Maertens等)。慢性HCV携带者抗E1抗体的水平位于所有HCV抗体中最低者之列，因而对于提高这些抗体的水平，增强细胞反应以及诱导宿主对于感染的控制甚至清除等都可能是有益的。而且，高水平的抗E1细胞免疫似乎与干扰素治疗的高反应性相关(Leroux-Roels等，1996)。重要的是上述研究不依赖于天然样E1肽。
NS3中HCV阳性血清检测的最关键表位与构象表位相关。显然，NS3表位散在分布于整个NS3蛋白(也参见Leroux-Roels等，1996；Rehermann等，1996，1997；Diepolder等，1995，1997)。在最初的分析中用的是NS3蛋白而非肽。
分子生物学和基因工程的发展使得利用外源表达系统生产大量蛋白产物成为可能。然而，外源宿主的应用会导致重组产物生物和/或结构特性的不同。细胞合成过程中或合成后蛋白的生化修饰以及随后的纯化中，二硫键的形成和维持是非常重要的。半胱氨酸氧化还原状态与含二硫键蛋白的正确折叠或组装有着复杂的联系。而且，通常蛋白的生物功能是由其巯基基团的氧化状态调节或至少是受其影响的。对于一些酶的活性来说是如此，其中巯基基团氧化的可逆性和时间选择被称为生理控制机制(还参见Thomas等，1995；Nakamura等，1997；Aslund和Beckwith等，1999)。
一些催化半胱氨酸氧化还原(巯基与二硫键形成)的蛋白因子已被识别(Mossner等，1998；Prinz等，1997；Loferer & Hennecke，1994)。这些蛋白因子大多属于“硫氧还蛋白超家族”，其成员的共有序列Cys-X-X-Cys(X＝任何氨基酸)中含有2个氧化还原活性半胱氨酸。该超家族依据活性位点的氧化还原电位，底物特异性或生物活性可分为不同类。另一分类法依据氧化还原活性中心的共有序列，即(i)通常以硫氧还蛋白(TRX)为代表的一类，由一些小的普遍存在的蛋白组成。其氧化还原活性中心的共有序列为Cys-X-pro-Cys，在许多物种都是高度保守的，从细菌到植物和哺乳动物(X＝任何氨基酸)。氧化状态的TRXOX在TRX-还原酶、FAD和NADPH存在时，可重新生成其还原形式。
(ii)谷氧还蛋白(GRX)通常是硫氧还蛋白超家族第二类的代表。其氧化还原活性中心的共有序列为Cys-pro-X-Cys，其中X优选芳香族氨基酸，如Tyr和Phe。GRX和TRX均可作为有二硫键的还原剂，但GRX是特异的谷胱甘肽(GSH)-混合二硫还原酶，如在巯基化蛋白的还原中。
已表明CXXC基序可能参与细胞内外的各种生化和生物功能。如巯基/二硫键转换反应、过渡金属的结合、脂质结合位点和调节活性如基因转录的控制、信号转导的调节(包括作为细胞因子发挥作用及类似情况)以及蛋白(解)巯基状态的控制。重要的是，CXXC基序可以在三级甚至四级蛋白结构发挥作用(也参见Thomas等，1995；Nakamura等，1997；Aslund和Beckwith等，1999)。
HCV蛋白包含CXXC基序。然而，迄今为止，尚无报道表明或提示这些CXXC基序的可逆氧化还原状态对HCV具有重要性。而且，已有的纯化方法不能解决CXXC基序中可逆的二硫桥。这就导致了纯化的HCV蛋白的构象及生物学活性遭受损害。
已有大量研究天然HCV蛋白的尝试。所遇到的问题是难以纯化出具有正确或天然样构象的HCV蛋白。因此，构象表位及其它依赖于天然样构象的生化和生物功能还是个谜。而且，治疗肝脏疾病和病毒性肝炎的药物靶也受到同样缺点的影响，药物筛选项目注定要失败。
发明/目的概述表达和纯化系统的缺乏或低效性似乎影响了蛋白的正确折叠或组装，如此纯化出来的蛋白通常不具生物活性和/或正确的蛋白结构。这就导致天然抗HCV抗体无法对这些蛋白上的抗原决定簇的重要亚型进行识别，参见Houghton(1997)本发明克服了这些问题，第一次描述或制备了基于半胱氨酸残基可逆氧化还原状态的具有天然样构象的HCV蛋白，因而公开了HCV蛋白的新结构。尤其是本发明还提供了纯化出具有生物活性和/或天然样构象的HCV蛋白的方法。天然样HCV蛋白会导致新型构象性和寡聚化依赖性表位。
天然样HCV蛋白的直接或间接(介导的)体外和体内活性提供了研究生化和生物途径以及级联效应如代谢、酶促、信号转导和免疫反应的可能性。活性中心、结合位点和相互作用区域(蛋白-蛋白、蛋白-糖、蛋白-核酸和蛋白-小分子)的识别可以辅助开发药物，并干预肝炎的细胞和病毒过程。
本发明的纯化和折叠方法中，去除了半胱氨酸遮蔽基因，继之以HCV蛋白半胱氨酸残基的重新折叠和氧化，从而恢复HCV蛋白的天然样构象。
目的本发明涉及HCV蛋白或任何其功能相当部分，包含具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸。本发明尤其与一种HCV蛋白相关，该蛋白包含至少两个具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸。后面的半胱氨酸可被其它氨基酸隔开。半胱氨酸优选包含在序列Cys-X1-X2-cys中，其中X1、X2均代表任何氨基酸。更优选地，X1代表Val、Leu或Ile，X2代表Pro。
另外，本发明还提供一种HCV蛋白或任何其功能相当部分，包含至少两个具有上述可逆氧化还原状态的半胱氨酸，可通过以下步骤获得(a)纯化HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中半胱氨酸残基受到化学和/或酶的可逆性保护。
(b)半胱氨酸残基可逆保护状态的解除。
(c)获得HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中的半胱氨酸残基具有可逆氧化还原状态。
另外，本发明旨在提供用作药物的上述HCV蛋白或任何其功能相当部分。
另外，本发明旨在提供上述HCV蛋白或任何其功能相当部分对生产HCV疫苗组合物，具体为治疗疫苗或预防疫苗的用途。
另外，本发明旨在提供产生特异抗体的上述HCV蛋白或任何其功能相当部分。
另外，本发明旨在提供一种通过判断HCV抗体-HCV蛋白复合物的形成而检测HCV抗体的免疫测定。
最后，本发明旨在提供一种识别调节上述HCV蛋白活性的化合物的生物测定方法，该方法通过监测氧化还原活性改变而实现。
本发明的所有目的均在以下的实施方案中有所体现。
图1在L-抗坏血酸存在下裂解后被可逆保护和不可逆封闭的Vero样品的大小排阻。
用Triton X-100在1mML-抗坏血酸存在下裂解Vero细胞。按照Maertens等在PCT EP95/03031中描述的方法将裂解物装填于LentilLectin，在pH7.2下用7.5mM DTT还原。还原的Els进行以下处理(1)用连四硫酸钠磺化，(2)用N-乙基马来酰亚胺不可逆封闭或者(3)不作处理，但将溶液pH降至6。
引入按照Maertens等在PCT EP95/03031中描述的方案得到的SEC图形作为参考。
在Superdex G200 10/30(Pharmacia)上进行凝胶过滤，除条件(3)外，均在PBS、PH7.2和3％empigen的条件下进行。条件(3)的凝胶过滤在10mM磷酸盐、150mM Nacl、pH6.0的条件下进行。
SEC图形A抗坏血酸存在下的裂解和DTT还原后的磺化B抗坏血酸存在下裂解和DTT还原后的不可逆封闭
C抗坏血酸存在下裂解和DTT还原后无进一步处理，但SEC在pH6.0下进行。
D参考DTT还原后在裂解物中用NEM/NEM.bio封闭(Maertens等，PCT EP95/03031)条带表示银染和蛋白印迹分析池。
直方图则给出了夹层ELISA结果用Mab 14H11B2(IGH207)包被，检测则用HRP标记的25C3(IGH200)。
图2在磺化剂存在下裂解后可逆保护和不可逆封闭的Vero Els的大小排阻层析。
Vero细胞用Maertens等在PCT EP95/03031中描述的方法裂解，但加入连四硫酸钠而不是NEM/NEM.bio。
Lentil上的纯化和还原按Maertens等在PCT EP95/03031中的描述进行，还原后的材料(1)用连四硫酸钠磺化或(ii)IAA处理(不可逆封闭)在此引入按照Maertens等在PCT EP95/03031中描述的方法获得的材料作为参考。
3个不同的Els样品在Superdex G200 10/30柱上分离，柱子已用PBS、3％Empigen，pH7.2平衡。
AVero细胞裂解物的磺化和DTT还原后的磺化。
BVero细胞裂解物的磺化和碘-乙酰胺的不可逆封闭C按照Maertens等在PCT EP95/0303中描述的方法用NEM/NEM.bio不可逆封闭后的Vero Els。
DSEC图形的重叠图夹层ELISA结果用直方图表示Els组分如条形图所示混合，用银染和蛋白印迹分析图3用SDS-PAGE和蛋白印迹在3％Empigen中进行的SEC组分分析。
(A)可逆保护和不可逆封闭等不同条件下获得的SEC组分通SDS-PAGE和银染进行分析。
抗坏血酸存在下裂解和pH6下进行凝胶过滤(见图1.c)后的组分或抗坏血酸存在下裂解和磺化(图1.a)后的组分的SDS-PAGE分析均在图3A.1中作为例子。
图3A.2所示为用11B7D8通过蛋白印迹对图1.c所述条件(抗坏血酸存在下裂解和DTT还原后pH6下进行的SEC)进行组分筛选。
(B)SEC池的蛋白印迹，其中用到抗-Els Mab 5E1A10，能分别识别氨基和羧基端表位。
SEC池按图1和图2所示制作。
1和6道分子量标记2和7道按照Maertens等PCT EP95/0303中的方法制备的参照物质3和8道用不可逆封闭的半胱氨酸(用碘-乙酰胺处理)制备的参照物质4和9道裂解物磺化和还原后磺化后获得的物质5和10道抗坏血酸存在下裂解和还原后磺化所获得的物质。
图4大肠杆菌表达的(his)6标记的NS3融合蛋白图解给出可逆保护后的金属亲合纯化和ELISA样品制备。
+/-AO有或无可逆保护剂(AO)图5不同包被条件下mTNF(His)6NS3融合蛋白的ELISA反应性图5A90％纯的mTNF(His)6NS3B9融合蛋白在用200mM DTT还原后，用25mM枸橼酸、1mM EDTA，在pH4的条件下脱盐。融合蛋白用脱盐缓冲液稀释至500μg/ml，然后在有或无巯基保护剂(抗氧化剂组1、组2)存在下，贮存于-70℃。
样品在有或无巯基保护剂(抗氧化剂)存在下用ELISA包被缓冲液(50mM碳酸氢盐缓冲液，pH9.6)稀释至0.5μg/ml，在有或无保护剂的条件下用PBS封闭加样孔。
在有或无10mM DTT存在下进行血清样品孵育，漂洗后，用HRP结合的兔抗人抗体(DaKo，Denmark)使ELISA显影。最后加入2N H2SO4终止反应。
对血清(17790、17826、17832、17838)进行了检测，其中17790和17832为难检测血清，因为只有用200mM DTT处理后(阳性对照)，它们才被检测为HCV阳性血清。10mM DTT处理也包含在内作为这些血清的阴性对照。血清17826和17838在用10mM DTT处理后与NS3B9蛋白反应(被认为是易检测HCV血清)。
第1组抗氧化剂1mM EDTA，1mM L-抗坏血酸，1mM还原型谷胱甘肽。
如果封闭在保护剂存在下进行，那么在ELISA过程中，给这些巯基保护剂补充加入1mM生育酚。
第2组抗氧化剂1mM硫二甘醇(TEG)，1mM噻吩羧酸(TPCB)，1mM吡咯烷酮二硫氨基甲酸酯(PDTC)、1mM二硫氨基甲酸二乙酯(DETC)。
图5B巯基化合物和NS3B9反应性ELISA按图5A所述进行，只是对单-和双巯基化合物作为可逆保护基团的作用(类型和浓度)进行了更为详细的研究。
本ELISA中，样品稀释液总在3mM DTT存在下孵育。
抗氧化剂1＝1mM EDTA，1Mm L-抗坏血酸抗氧化剂2＝1mM TPBC，1mM TEG，1mM DETC，1mM PDTC4mM DTC＝2mM DETC，2mM PDTC4mM单-SH＝2mM TPBC，2mM TEGGSH和Cys分别是还原型谷胱甘肽和半胱氨酸。
图6金属亲合层析后的纯化的可逆保护的(his)6标记的HCV蛋白的SDS-PAGE分析6A大肠杆菌表达的mTNF(His)6NS3B9(批号NS3B9 B960925II)用抗mTNF进行蛋白印迹并且在非还原条件下银染SDS-PAGE(1μg蛋白/道)。
6B啤酒糖酵母(醇母菌)表达的(his)6标记的E1s蛋白通过(a)银染；(b)抗E1s蛋白印迹或(c)GNA印迹来观察。
按照Maertens等所述(PCT EP 95/03031)方法纯化的疫苗病毒表达E1s也包含在此，作为参照。
发明详述本发明引用了已发表的工作和申请中的专利。通过实施例的方式，本工作由科学论文，专利或申请中的专利组成。所有前面或以后将要引用的出版物和专利均在此引入作为参考。
本发明涉及具有特异构象的HCV蛋白。首次产生了具有天然样构象的HCV蛋白，尤其是HCV E1蛋白。参与这些HCV蛋白构象的特异半胱氨酸键非常重要。作为一种实施例，还提供了一种新的有创新性的纯化方法，用该方法纯化出的HCV蛋白具有天然样构象。这些新的HCV蛋白不但呈递构象表位而且有生物活性，可用于多种研究，如药物筛选、生物活性、信号转导通路、细胞内外加工、HCV和/或非HCV分子的相互作用和结合、构象表位、抗体筛选、代谢和酶活性及免疫反应等。显然，这些研究可最终用于诊断和/或治疗应用。
本发明基于这样的发现，即由于半胱氨酸残基的可逆氧化还原状态，HCV蛋白具有特异的天然样构象和生物活性。
因此本发明涉及一种HCV蛋白或任何其功能相当部分，包含具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸。具体地说，本发明涉及一种HCV蛋白，该蛋白包含至少两个具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸。后面的半胱氨酸可被其它氨基酸隔开。半胱氨酸优选包含在氨基酸序列Cys-X1-X2-cys中，其中X1、X2均代表任何氨基酸。更优选地，X1代表Val、Leu或Ile，X2代表Pro。
HCV在这一点上，本发明涉及HCV和其它黄病毒属成员，如庚型肝炎病毒、登革病毒和黄热病毒。因此，“HCV”一词考虑了所有黄病毒属成员。
蛋白此处的“蛋白”一词指HCV蛋白，或任何其功能相当部分，其中的氨基酸序列中包含至少一个半胱氨酸，半胱氨酸的氧化还原状态多种多样(见下)。而且，“蛋白”一词还考虑了在其氨基酸序列中含有至少一个半胱氨酸的蛋白“域”。此处的“其功能相当部分”指的是所述HCV蛋白的一个部分或片段，其中氨基酸序列中包含至少一个氧化还原状态呈多样性的半胱氨酸。具体地说，“蛋白”和“其功能相当部分”指包含一个氧化还原活性中心的HCV蛋白及其片段，例如HCVE1蛋白。更具体地说，本发明涉及HCV E1s和HCV E1p。此处，“氧化还原活性中心”指含有共有序列CXXC的蛋白基序。
“肽”指的是源于众所周知的HCV蛋白的氨基酸(aa’s)多聚物(linnen等，1996；Maertens和stuyver，1997)。“HCV E1”是本领域中的技术人员熟知的蛋白(Wengler，1991)。HCVE1和HCVE2，以前称为非结构蛋白1(NS1)或E2/NS1，构成HCV的包膜区域。
HCVE1s(192-326)YEVRNVSGMY HVTNDCSNSS IVYEAADMIM HTPGCVPCVR ENNSSRCWVALTPTLAARNA SVPTTTIRRH VDLLVGAAAF CSAMYVGDLC GSVFLVSQLFTISPRRHETV QDCNCSIYPG HITGHRMAWD MMMNWHCV E1p(192-237)YEVRNVSGMY HVTNDCSNSS IVYEAADMIM HTPGCVPCVR ENNSSR“肽”指的是氨基酸多聚物，并不限定长度。因此，“肽”、“多肽”、“多蛋白”和“蛋白”均包含在“肽”的定义中，可互换使用。“肽”一词并不提到或排除肽的表达后修饰如糖基化、乙酰化、磷酸化。包含于肽的定义中的有含有某一氨基酸的一或多种类似物(包括例如非天然氨基酸PNA(Nielsen等，1991，1993)等)的多肽、有取代连接体和其它本领域所知修饰的肽，以上情况均可自然或人工发生。因此，肽可以是线性、环状或闭锁的(除本发明提到之外，还可以通过二硫桥环化或稳定)，由D或L-氨基酸组成；肽还可以是多聚体、有分支的，呈现在噬菌体表面或通过共价或非共价固定在不同性质的聚合物上，聚合物可以是有机物、脂类、碳水化合物、蛋白或核酸聚合物；或者肽可以存在于支架中。因此应该理解肽模拟物(peptidomimitics)或模拟表位(mimotopes)也包含于名词“多肽”，“肽”和“蛋白”。
固定于聚合物上可以通过HCV肽自身的残基实现，也可以通过融合或偶联于其它分子如组氨酸标签(Dietrich等，1996)或脂类螯合物等而实现。
“模拟表位”一词指免疫学上可以模拟上述多肽的多肽。由于HCV具有序列多样性，通过一个或多个氨基酸的改变来更好的模拟不同株的表位是很理想的。因此，不难理解，这样的“模拟表位”不需与某一特定HCV序列相似，只要受试化合物能与至少一株HCV进行免疫竞争即可。
“肽模拟物”指的是免疫学上可以模拟上述多肽，但可以包含非氨基酸成分的分子。
本发明尤其涉及通过经典化学合成制备的多肽。合成可以在均一溶液或固相中进行。例如，可以用于均一溶液中的合成技术由Houbenweyl(1974)所描述。本发明的多肽也可以通过Atherton和Shepard(1989)描述的方法固相制备。而且，通过dendrimer(Zhang & Tam，1997)、polyketide(Carreras&Santi，1998)或intein(Southworth等，1999)技术合成的HCV肽、肽模拟物和模拟表位也在本发明的范围内。
按照本发明，多肽也可通过重组DNA技术在原核或低等或高等真核生物中制备，如Sambrook等(1989)所述。“低等真核生物”指酵母菌、真菌等宿主细胞。低等真核生物通常为(但不必是)单细胞。“原核生物”指大肠杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌、沙门氏菌、链球菌、枯草杆菌或链霉菌属等宿主，这些宿也在本发明考虑之列。优选的低等真核生物是酵母菌，尤其是裂殖糖酵母属、糖酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属(如巴斯德毕赤氏酵母)、汉逊氏酵母属(如多形汉逊氏酵母)、许旺氏酵母属、裂殖糖酵母属、Yarowia、接合糖酵母属等。其中啤酒糖酵母、卡尔斯伯糖酵母和乳克鲁维化酵母是最常用的酵母宿主，也是最方便的真菌宿主。“高等真核生物”指来源于高等动物如哺乳动物、爬行动物和昆虫等的宿主细胞。目前优选的高等真核生物宿主细胞来源于中国仓鼠(如CHO)、猴(如COS和Vero细胞)、地鼠肾(BHK)、猪肾(PK15)、兔肾13细胞(RK13)、人骨肉瘤细胞系143B、人细胞系Hela、人肝细胞癌细胞系HepG 2和昆虫细胞系(如草地夜蛾)等。宿主细胞可以由悬浮或培养瓶培养、组织培养、器官培养等提供，也可以是转基因动物。
本发明的蛋白也可以从哺乳动物尤其是小鼠或如人和非人灵长目动物中提取。
本专业众所周知，氨基酸可以用全称、三字母缩写或单字母代号来表示(参见Stryer，1981)。
另外，本发明涉及上述HCV蛋白或其部分，可特异地与细胞内或细胞间宿主分子(宿主来源的分子)结合，如(i)受体蛋白，如膜联蛋白V、载脂蛋白B、微管蛋白、24kDa浆膜蛋白(Abrigani WO97/09349)、甘露糖受体、脱唾液酸基糖蛋白受体；(ii)参与氧化还原调节的分子(蛋白或非蛋白化合物)，如谷胱甘肽、TRX和GRX；(iii)伴侣蛋白，如钙联接蛋白；(iv)各种氨基葡聚糖(肽和/或糖核心)；(v)核酸或脂类。
再者，本发明涉及上述的HCV蛋白或其部分，可特异地与另一HCV蛋白或HCV核酸(HCV来源分子)或其部分结合，形成同源或异源寡聚复合物。
由上述HCV蛋白或其部分产生的与其它HCV来源的分子或宿主来源的分子结合的复合物俗称为“HCV来源复合物”。因此，“HCV来源复合物”由至少一种上述HCV蛋白和另一分子连接组成，即(HCV-蛋白)-X，其中X为宿主来源分子或HCV来源分子。
纯度此处，“纯净的”一词指一种组合物，其中需要组分如HCV包膜蛋白占总组分的至少35％。需要组分优选占至少约40％，更优选至少占约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，甚至更优选至少约80％，甚至更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，最优选占总组分的至少约98％。该组合物尚可包含其它化合物，如碳水化合物、盐类、脂类和溶剂等，不影响此处纯度的判定。“分离的”HCV蛋白指至少35％纯净的HCV蛋白组合物，应当明确“纯净的HCV蛋白”指以基本纯净形式存在的分离的HCV蛋白。“基本纯净的HCV蛋白”指可用于体外诊断方法和治疗的HCV蛋白。这些HCV蛋白基本上不含有细胞蛋白，载体来源蛋白或其它HCV病毒成分。通常这些蛋白要尽量提至最纯，纯度至少达到80％，优选85％、更优选90％、更优选95％、更优选97％、更优选98％、更优选99％、甚至更优选99.5％，最好是其中的杂蛋白用常规方法如SDS-PAGE和银染检测不到。
抗体本发明尚涉及可识别上述HCV-肽的HCV-抗体。
另外，本发明涉及上述的HCV蛋白或其功能相当部分，用以产生抗-HCV抗体，抗-HCV抗体可特异地识别HCV蛋白或其功能相当部分。
“HCV-抗体”一词指可以与本发明的HCV蛋白或HCV源复合物结合的任何多克隆或单克隆抗体。
另外，“HCV-抗体”还表示抗HCV蛋白中的构象形成的表位的特异抗体，此构象因HCV蛋白中二硫桥的存在而形成。值得注意的是，二硫桥可能是表位固有的一部分。但是，半胱氨酸的氧化还原状态(还原或氧化；巯基化或S-结合形式)可以改变或稳定蛋白构象(在或不在这些半胱氨酸残基附近)，导致出现新的含或不含这些半胱氨酸残基的表位。这些新表位也属本发明。而且，“HCV抗体”还涉及能与上述模拟表位结合的任何多克隆或单克隆抗体。
另外，“HCV-抗体”还涉及能与HCV来源复合物的特异构象形成的抗原决定簇结合的抗体，即与不出现于本发明中的HCV-肽或与HCV-肽结合的分子上的抗原决定簇结合的抗体。上述分子如来源于本发明HCV肽和非蛋白化合物如氨基葡聚糖(GAGs)、肝素、核酸、脂类和辅因子如金属离子等的相互作用的表位。而且，抗原决定簇可通过构象变化如蛋白加工、剪切或pH变化而形成。
“表位”一词是指抗原-抗体复合物中被抗体-结合位点特异结合的部分。表位可以用本领域的方法来确定，也可以用本领域的各种计算机预测模型来预测。
本发明用到的“识别”、“结合”或“抗体-蛋白复合物形成”的解释如下抗原和抗体之间的结合，即相互作用，可在考虑到抗体和抗原免疫特性的任何条件下发生。
另外，还有各种各样不同于本发明的方法可以产生HCV肽。这些方法产生的HCV肽也可能会呈递表位。可以想像，通过这些各种不同的方法获得的HCU肽可以呈递与本发明的表位相似的表位。相似表位指的是用不同于本发明的生产或纯化方法获得，但可被同一种抗体识别的表位。然而，本发明中的蛋白极为有效地呈递表位。因此，这些蛋白上的表位更具免疫原性。因此，本发明尚涉及蛋白上的表位，它们的免疫原性比不用本发明的方法产生，因而不含具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸残基的表位高出至少10倍、优选至少20倍、更优选至少50倍，更优选至少100倍，更优选至少500倍，最优选至少1000倍。本领域的技术人员应理解，用可比剂量的不同方法产生的多肽免疫哺乳动物，可以检测其免疫原性。
“HCV-抗体”一词更具体指与天然、重组或合成HCV蛋白结合的抗体，尤其是与来源于HCV的天然、重组或合成E1、E1s、E1p和/或NS3蛋白或任何其功能相当部分结合的抗体(分别是抗HCV-E1-、抗HCV-E1s、抗HCV-E1p或抗HCV-NS3-抗体)。HCV-抗体可出现于体液样品中，可以是抗HCV-E1-、抗HCV-E1s、抗HCV-E1p、抗HCV-NS3-抗体。
此处用到的“单克隆抗体”指具有均一抗体群的抗体组合物，并不局限于抗体的种类或来源，也不受产生方式的限制。因此，“抗体”也包括来源于骆驼(Arabian和Bactrian)或Lama属的抗体。
因此，“抗体”一词还涉及来源于噬菌体展示技术或药物筛选过程的抗体。
另外，“抗体”一词还可以指免疫球蛋白的至少一个骨架区来源于人免疫球蛋白序列的人源化抗体，和美国专利4,946,778所述的单链抗体以及抗体片段如Fab、F’(ab)2、Fv和其它保留亲本抗体抗原结合能力和特异性的片段。“抗体”一词还指双抗体、三抗体或多(单-、双-、四-或多价/单-、双-或多特异)抗体以及酶抗体，即有酶活性的人工抗体。抗体与其它任何提高亲合性或特异性的分子结合也在“抗体”的范畴内。另外，还包括其修饰形式(如mPEG化或多唾液酸化形式(Fernandes & Gregoriadis，1997)以及共价的或非共价的多聚物结合形式。
此外，“抗体”一词还涉及任何性质的抗体-模拟化合物，如来源于脂类、碳水化合物、核酸或类似物如PNA和aptamers(参见Jayasena，1999)。
HCV抗体可通过疫苗接种诱导产生，也可以通过注射从HCV-感染的血液或HCU疫苗接种者的血液中纯化的抗体而被动产生。
本发明还涉及包含HCV-抗体以检测上述HCV肽的试剂盒。
纯化方法本发明进一步涉及此处提到的产生HCU蛋白的纯化方法，用这样的方法得到的HCV蛋白含有至少一个具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸残基以及可以由此纯化方法获得的HCU蛋白。在纯化过程中，至少半胱氨酸残基受到化学和/或酶促方式的可逆保护(参见实施例部分)。
此处，“可逆氧化还原状态”是指半胱氨酸中的硫具有从还原状态向氧化状态转变或反之亦然的能力。氧化还原状态的改变涉及电子的转移，“氧化还原酶活性”指氧化还原活性中心的氧化还原电位，即从底物分子转移电子或转移电子到底物分子的能力。此能力依赖于底物分子的氧化还原电位和化学环境。
天然HCV蛋白有特异构象，可以呈现生物活性。用本发明的方法纯化出来的HCV蛋白具有与天然HCV蛋白相似或近乎相同(天然样)的生物活性和/或构象，本发明的纯化方法的特征在于-A-本发明的纯化方法的第一步是可逆保护半胱氨酸残基的反应性。实际上，第一步由Maerten等在PCT EP95/03031中广泛描述的方法组成，只是有一根本改变，具体说是半胱氨酸残基受到了可逆保护。
半胱氨酸残基的可逆保护可通过以下条件之一实现(i)修饰基团，或(ii)巯基和/或二硫桥的稳定。实际上，保护使HCV蛋白稳定，即硫基和/或二硫桥无反应倾向。
因而，第一步会生成有可逆保护半胱氨酸的纯化产物；-B-本发明纯化方法的第二步是恢复半胱氨酸残基的反应性。
纯化方法第一步完成后，去除使半胱酸残基受到可逆保护的条件。
这一去除将使半胱氨酸恢复可逆氧化还原状态。
最后，获得HCV肽或任何其功能相当部分，其中的半胱氨酸残基具有可逆氧化还原状态。
可逆氧化还原状态使活性HCV蛋白具有生物活性和/或天然样构象。
因此，本发明涉及HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中包含至少两个具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸，通过以下方法获得(a)纯化HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中半胱氨酸残基受到化学和/或酶促方式的可逆保护。
(b)半胱氨酸残基可逆保护状态的去除。
(c)获得HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中半胱氨酸残基具有可逆氧化还原状态。
因此，本发明尚涉及后面的方法。
还可以有选择地加入辅因子和抗氧化剂，以辅助稳定蛋白。
应该理解，可逆保护的目的是稳定HCV蛋白。尤其是可逆保护后，含硫的功能基团(如巯基和二硫化物)将处于无反应状态，因而不能与其它化合物反应，如没有形成或交换二硫键的倾向，例如
R1-5H+R2-SH -x-> R1-S-S-R2；R1-S-S-R2+R3-SH -x-> R1-S-S-R3+R2-SH；R1-S-S-R2+R3-S-S-R4-x-> R1-S-S-R3+R2-S-S-R4.
上述巯基和/或二硫基之间的反应不限于分子间，也可以发生于分子内。
此处用到的“可逆保护”不但涉及修饰剂与半胱氨酸残基的共价结合，还涉及HCV蛋白所处环境的控制，以便随后的整个纯化步骤中不破坏巯基-基团的氧化还原状态(屏蔽)。
半胱氨酸残基的可逆保护可通过化学或酶促的方式进行。
此处“通过酶促方式可逆保护”指的是由酶介导的可逆保护，如酰基转移酶，如参与催化硫-酯化反应的酰基转移酶和棕榈酰酰基转移酶(参照下述和Das等，1997)此处“通过化学方式可逆保护”包括通过以下方式进行的可逆保护(1)通过能够可逆修饰半胱氨酰(如通过磺化和硫-酯化反应)的修饰剂；磺化是一种化学反应，其中二硫桥中的巯基或半胱氨酸被修饰为S-磺酸(Andre Darbre)或(亚硫酸盐解；Kumar等，1986)。磺化的试剂有Na2SO3或连四硫酸钠。后者的使用浓度为10-200mM，更优选50-200mM。磺化还可以有选择地在Cu2+(100μM-1mM)或半胱氨酸(1-10mM)等催化剂存在下进行。
反应可以在自然条件也可以在蛋白变性和天然条件下进行(Kumar等，1985，Kumar等，1986)。
硫酯键形成或硫-酯化反应的特征如下
在化合物R’CO-X中，X优选卤化物。
(2)通过能够可逆修饰本发明中半胱酰的修饰剂，如重金属，尤其是Zn2+、Cd2+(Matts等，1991)，单-、二硫-和二硫化物化合物(如芳香基-和烷基甲硫磺酸盐、二硫吡啶、二硫吗啉、二氢硫辛酰胺、Ellmann试剂、aldrothiolTM(Aldrich)(Rein等，1996)、二硫氨基甲酸酯或巯基化试剂(如谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、半胱胺)。二硫氨基甲酸酯包含具有R1R2NC(S)SR3功能基团的一大类分子，这类分子给予它们与巯基基团反应的能力。含硫化合物的使用浓度优选0.1-50mM，更优选1-50mM，甚至更优选10-50mM；(3)通过能够保持巯基状态(稳定)的修饰剂，尤其是抗氧化剂，如DTT、二氢抗坏血酸、维生素及其衍生物、甘露醇、氨基酸、肽及其衍生物(如组氨酸、麦角硫因、肌肽、蛋氨酸)、没食子酸盐、羟基苯甲醚、羟基甲苯、羟基苯醌、羟基甲酚及其衍生物等，其浓度范围为10μM-10mM，更优选1-10mM；(4)通过使巯稳定的条件，如(i)金属离子(Zn2+、mg2+)、ATP等辅因子(ii)pH控制(如对蛋白质来说，多数情况下pH为5或pH优选使巯基pKa为2；如对反相亲合层析纯化的肽，pH为2)。
(1)(2)(3)和(4)所述的可逆保护方式组合使用，可获得相似纯度和再折叠的HCV蛋白。实际上，可以使用组合化合物，如Z103(Zn camosine)，优选浓度为1-10mM。
应当明确，可逆保护还涉及除上述修饰基团或屏蔽之外的任何可以被酶促或化学逆转的半胱氨酰保护方法，并且不破坏肽主链。在这一点上，本发明特指通过经典化学合成(见上述)制备的肽，其中的硫酯键被硫酯酶、碱性缓冲液(Beekman等，1997)或羟胺处理(Vingerhoeds等，1996)而切割。
含巯基的HCV蛋白可通过如亲合层析树脂纯化，亲合层析树脂含有(1)含二硫键的可切割连接臂(如固定化的5，5’二硫代双(2-硝基苯酸)(Jayabaskaran等，1987)和活化巯基-琼脂糖4B(Pharmacia)上的共价层析)或(2)氨基己酰-4-氨基苯胂作为固定化配体。后面的亲合基质已被用于蛋白纯化，受氧化还原调节，二巯基蛋白质是氧化应激的靶(Kalef等，1993)。
可逆保护也可用于提高溶解性和肽的提取(Pomroy&Deber，1998)。
可逆保护和巯基稳定化合物可以单体，多体或脂质体形式出现。
半胱氨酸残基可逆保护状态的去除可通过化学或酶促方式完成，如-还原剂，尤其是DTT、DTE、2-巯基乙醇、连二硫酸盐、SnCl2、硼氢化物、羟胺和TCEP等，优选浓度1-200mM，更优选50-200mM；-通过提高pH等方法，去除使巯基稳定的条件或试剂；
-酶，尤其是硫酯酶、谷氧还蛋白和硫氧还蛋白，优选浓度0.01-5μM，更为优选0.1-5μM；-上述化学和/或酶条件的联合使用。
半胱氨酸残基可逆保护状态的去除可以在体外或体内，如细胞内或机体内进行。
经过纯化方法的第二步后，半胱氨酸残基将可以或不可以被不可逆封闭，或如上所述被可逆修饰剂取代。
本发明中的还原剂指的是可使半胱氨酸残基中的硫还原的任何试剂，如“S-S”二硫桥和半胱氨酸残基的去磺化()。抗氧化剂指保持巯基状态或使“S-S”形成和/或交换最小化的任何试剂。“S-S”二硫桥的还原是使二硫键还原为巯基(-SH)的化学反应。破坏二硫桥的试剂和方法公开于WO 96/04385，在此引入作为参考。“S-S”还原可通过(1)酶级联通路或(2)还原化合物来完成。已知硫氧还蛋白、谷氧还蛋白等酶参与体内二硫键的还原，在体外“S-S”桥的还原中也有效。二硫键在pH7.0被快速切断，二级速率比相应DTT反应快约104倍。通过将蛋白溶液与1mM DTT或二氢硫辛酰胺(Holmgren，1979)预孵育，还原动力学可以有巨大提高。
能够还原蛋白二硫桥的巯基化合物如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓醇(DTE)、3-巯基乙醇、硫代氨基甲酸盐、双(2-巯基乙酰)砜和N，N’-双(巯基乙酰)肼和二硫化钠。
已有报道表明无巯基基团的还原剂如抗坏血酸或二氯亚锡(SnCl2)等在单克隆抗体二硫桥的还原中非常有用(Thakur等，1991)，也可以用于HCV蛋白的还原。而且，pH值的改变也可影响HCV蛋白的氧化还原状态。已表明硼氢化钠处理对肽中二硫桥的还原有效(Gailit，1993)。Tris(2-羟基乙基)磷化氢(TCEP)在低pH时可还原二硫键(Burns等，1991)。当DTT或硼氢化钠用作还原剂时，硒可以催化二硫键还原为巯基。一种可买到的二硒化物即硒半胱胺被用作催化剂的前体(Singh和Kats，1995)。
这里要再次强调，所有内容包括上面引用文献的所有定义均在本申请中引入作为参考。因而，上述修饰HCV蛋白氧化还原状态的方法和化合物均归入本发明。
生物活性位点本发明进一步涉及包含生物活性CXXC-基序的HCV蛋白。“生物活性”和“氧化还原活性”指HCV肽或其功能相当部分中的CXXC-位点，它具有可逆氧化还原状态，能够介导胞内和胞外的各种生化和生物功能，如巯基/二硫键转换反应、过渡金属的结合、脂质结合和调节活性(如基因转录的控制、信号转导的调节包括作为细胞因子等发挥作用以及蛋白(去)巯基化状态的控制)。
半胱氨酸氧化还原状态引起的结构或构象变化将通过生物物理方法如分光光度测定法(吸光度、圆二色散、红外线、荧光、NMR)或免疫化学方法(如ELISA、EIA及其类似)而体现，各种方法均以表位的出现或消失为基础。表位的序列可通过复合物的交联和亲合纯化后的质谱分析和测序来识别。构象或新的可检测的线性表位可能来自于三级或四级结构水平的折叠过程。活性位点的金属离子结合可通过放射活性衰变或原子吸光光谱来检测。
本发明中的HCV蛋白与其它分子(如受体、碳水化合物、脂类和核酸等，参见上述)的结合可通过如FACS、Biacore、免疫分析(蛋白印迹、EIA、ELISA等)、交联和层析方法(如亲合层析、凝胶过滤)来研究。HCV蛋白的硫氧还蛋白的酶活性可以按照Holmgren等(1979)所述方法通过分析其还原二硫桥的能力来判定。DTT或二氢硫辛酰胺等辅因子的作用也可用该方法来证实。非蛋白化合物(如Ellmann试剂、aldrothiol)和蛋白(如凝集的胰岛素)均可作为底物。
复合二硫键的形成(见下)，是与蛋白折叠和活性位点的恢复相关的行为。复合二硫键的形成可以通过不同试剂(如DTT)还原处理前后巯基基团的可逆保护或不可逆封闭来体现，如“纯化方法”所述，继之以质谱分析。
含-CXXC-蛋白的巯基基团的pKa通过pH作用(滴定)下烷基化试剂处理来定义。不同的残基保护和/或封闭及MS均提供CXXC-位点半胱氨酸残基反应起始的信息。氨基末端氨基酸测序可以提供HCV蛋白加工、剪切产物及域结构信息。
这些剪切产物的组织和细胞内分布可以通过免疫组化方法来定位。
疫苗本发明尚涉及包含上述蛋白的组合物。更具体地说本发明涉及疫苗组合物。“疫苗组合物”指能够激发部分或全部抗HCV保护的免疫源性组合物，因而包括上述的HCV肽、蛋白、多核苷酸、HCV来源分子或HCV来源颗粒。抗HCV保护特指人，但也指其它非人灵长类、trimera鼠(Zauberman等，1999)或其它哺乳动物。
本发明中的蛋白可以生物素酰化形式(见WO93/18054)和/或复合于Neutralite Avidin(Molecular probes Inc.，Eugene，OR，USA)使用。应当指出，“疫苗组合物”除包含活性物质外，还包含合适的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂，这些物质本身不会诱导对接受组合物的机体有害的抗体产生也不会激发保护。合适的载体通常是大的代谢缓慢的大分子如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。这些载体均为本领域技术人员所熟知。优选的能够增强组合物有效性的佐剂包括，但并不局限于胶体氢氧化铁(Leibl等，1999)，氢氧化铝、WO93/19780所述铝与3-O-脱酰单磷酰脂质A的组合、WO93/24148所述的磷酸铝、美国专利4,606,918所述N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰-去胞壁酰-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸2-(1’2’二棕榈酰-sn-甘油-3-羟-phosphoryloxy)乙胺和RIBI(ImmunoChem Research Inc.，Hamiton，MT，USA)，RIBI在2％的角鲨烯/Tween80乳状液中含单磷酰脂质A，去毒内毒素、海藻糖-6，6-二霉菌酸酯(MPL+TDM+CWS)。(MPL、TDM和CWS)这三个成分可以单独使用，也可以两两联合使用。另外，可以使用的佐剂有促病毒素(Cambridge Bioscience，Worcester，MA，USA)或SAF-1(syntex)、以及QS21和3-脱-O-乙酰化单磷酰脂质A的组合(WO 94/00153)、MF-59(chiron)或基于多[双(羧化苯氧基)磷腈]的佐剂(VirusResearch institute)、基于嵌段共聚物的佐剂如Optivax(Vaxcel，Cythx)或基于胰岛素的佐剂，如Algammulin和Gammalnulin(Anutech)、不完全弗氏佐剂(IFA)或Gerbu制剂(Gerbubiotechnik)。弗氏完全佐剂(CFA)可用于非人体应用和研究。“疫苗组合物”进一步包括本身无毒性和无治疗作用的赋形剂和稀释剂，如水、盐、甘油、乙醇、湿润或乳化剂、pH缓冲剂、保护剂等。本发明中HCV肽半胱氨酰残基的可逆修饰使得这些HCV肽能够与化学活化载体(如多聚体或脂质体)共价偶联，或HCV肽本身作为载体与其它HCV-相关或无关免疫原蛋白结合发挥作用(混合疫苗)。HCV肽通过硫酯键与脂质体连接的优点在于硫脂键可被宿主的硫酯酶体内水解，使抗原缓慢释放和呈递。HCV肽与多聚体或脂质体的结合也可以非共价相互作用为基础，利用配体之间的亲合性。
通常，疫苗组合物制备成可注射的脂溶液或悬浮液，也可以制成注射前可溶于或悬浮于液态载体中的固态形式。制剂也可以乳化或用胶囊包裹于脂质体中，以增强佐剂效应。多肽也可与皂甙组合，形成免疫刺激复合物，如QuilA(ISCOMS)。疫苗组合物包含免疫有效剂量的本发明的多肽以及其它上述成分。“免疫有效剂量”指单剂或作为连续给药的一部分将该剂量给予机体时，将对预防或治疗有效。这一剂量依据需要治疗的个体的健康和身体状况不同而不同，如个体的类别(如人、非人灵长目、灵长目等)、机体免疫系统积累有效免疫应答的能力、需要的保护程度、疫苗的剂型、医生的评价、感染HCV株以及其它相关因子。剂量可以通过常规试验确定，估计范围会相对较广。通常为0.01-1000μg/剂。疫苗组合物通常按胃肠外途径给予，一般是注射，如皮下或肌肉注射。另外还有适于其它途径给药的剂型包括口服剂型和栓剂。剂量处理可以是单剂方案或多剂方案。疫苗也可与其它免疫调节剂配伍使用。
DNA疫苗宿主的胞内环境可以为本发明中HCV蛋白的可逆氧化还原状态提供基础。在这一点上，应当明确，HCV DNA疫苗组合物包含质粒载体，该载体含有编码与转录调控元件可操作性连接的上述HCV蛋白的多核苷酸序列。此处，“质粒载体”指能够转运与之相连的核苷酸的核苷酸分子。优选的载体是那些能够自主复制和/或表达所连接核酸的载体。通常，质粒为圆形双链DNA环(但不限于此)，当处于载体形式时，不能与染色体结合。“多核苷酸序列”指多核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)，适当时是指核糖核酸(RNA)。此名词应当理解为还包括由核苷酸类似物构成的DNA或RNA类似物以及单(正义或反义)和双链多核苷酸。“转录调节元件”指包含基本调控元件的核苷酸序列，一旦导入脊椎动物的活细胞，便可指导细胞机制产生由多核苷酸编码的翻译产物。“可操作性连接的”指一种并列，其中各个成份的构型使得它们均可执行各自的功能。因而，转录调控元件与核苷酸序列可操作连接后，将会影响核苷酸序列的表达。本领域的技术人员可以理解，不同的转录启动子、终止子、携带载体或特异的基因序列均可成功地用于此。
本发明还涉及上述HCV蛋白对预防性诱导抗HCV免疫(预防性疫苗)的用途。有一点需要注意，疫苗还可如上所述对治疗有用，称为“治疗性疫苗”。
从以上可以清楚地看出，本发明还涉及上述蛋白或组合物对生产HCV疫苗组合物的用途。具体地说，本发明涉及上述蛋白对诱导慢性HCV携带者抗HCV免疫的用途。更具体地说，本发明涉及上述蛋白对诱导慢性HCV携带者在其它治疗之前、之时或之后的抗HCV免疫的用途，其它治疗如众所周知的与或不与病毒唑等治疗HCV的小分子药物配伍给药的干扰素治疗。这样的组合物可以在肝移植之前、之后或针刺等可能的感染之后使用。而且，本发明还涉及检测生物样品中HCV抗体的含有本发明HCV蛋白的试剂盒。
“生物样品”指从机体分离的组织或液体样品，包括但不限于，血清、血浆、淋巴液、皮肤外层、呼吸道、泌尿生殖道、卵母细胞、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官、胃分泌物、粘液、脊髓液、外分泌物如粪便、尿液、精液等。
由于本发明的HCV蛋白有高度免疫原性，能够刺激体液和细胞免疫应答，因此本发明还涉及包含本发明中的HCV蛋白的用来检测HCV相关T细胞应答的试剂盒。HCV T细胞应答可按照Leroux-Roels等在PCT/EP 94/03555中所述方法检测。有一点需要强调，即此文献的所有内容包括所有定义，均在本申请中引入作为参考。
本发明尚涉及前面所定义的组合物，包括HCV核心、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和/或NS5B蛋白，或其一部分。E1、E2和/或E1E2颗粒可以与T细胞刺激抗原如核心、P7、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和/或NS5B等组合。
而且，本发明还涉及上述蛋白的用途，或上述用来检测抗HCV蛋白抗体的组合物。此处，“检测“指本领域公知的任何适于检测的方法。具体指WO 96/13590中描述的免疫测定。
药物筛选本发明提供方法，以识别可用来治疗以HCV感染为特征(或相关的)的疾病的化合物或试剂。此处还将这些方法称为“药物筛选测定”或“生物测定”，通常包括筛选能够与HCV蛋白相互作用(如结合)，调节HCV蛋白和靶分子之间的作用和/或调节HCV核酸表达和/或HCV蛋白活性的候选/备试化合物或试剂。具备上述一/或多种能力的候选/备试化合物或试剂可以作为药物，治疗以HCV感染，HCV核酸表达和/或HCV蛋白活性为特征的疾病。候选/备试化合物如小分子，如小的有机分子和其它候选药物可以从组合和天然产品库中获得。
在一种实施方案中，本发明提供了筛选与HCV蛋白或其功能相当部分相互作用(如结合)的候选/备试化合物的测定方法。通常所用为无细胞测定方法，包括将本发明的HCV蛋白、其催化即氧化-还原酶活性，或其免疫原片段和候选/备试化合物在适当条件下结合，该条件允许候选/备试化合物与HCV蛋白或其部分相互作用(如结合)，形成复合物，然后检测复合物的形成，通过复合物中候选化合物的出现可以提示候选化合物与HCV蛋白或其部分相互作用(如结合)的能力。HCV蛋白和候选化合物间复合物的形成可通过如标准免疫测定等方法定量。
该实验中用到的HCV蛋白、其催化或免疫原性片段或其寡肽可以游离于溶液中、固定于固相支持物、位于细胞表面或定位于细胞内。
在另一种实施方案中，本发明提供了识别候选/备试化合物的筛选试验。该候选/备试化合物调节(如刺激或抑制)HCV蛋白和HCV蛋白通常作用的分子(靶分子)或特异识别HCV蛋白的抗体之间的相互作用(很可能也是HCV蛋白的活性)。这样的靶分子包括与HCV蛋白位于同一信号通路的蛋白，如在HCV蛋白通路的上游(包括活性刺激和抑制剂)或下游发挥作用的蛋白[Zn-指、蛋白酶活性、半胱氨酸氧化还原状态调节剂]。
通常所用测定方法为无细胞测定，包括将本发明的HCV蛋白、其催化性或免疫原性片段、HCV蛋白靶分子(如HCV蛋白配体)或特异抗体和候选/备试化合物在适当条件下结合，其中，除有候选化合物存在外，HCV蛋白或其生物活性部分与靶分子或抗体相互作用(如结合)，然后检测HCV蛋白和靶分子或抗体等复合物的形成，或检测HCV蛋白和靶分子或抗体的相互作用/反应。
复合物形成的检测可以包括例如通过测量HCV蛋白的诱导效应等的直接定量法。在候选化合物存在条件下(相对于候选化合物不存在时检测到的结果)，HCV蛋白和靶分子间的相互作用(如HCV蛋白和靶分子复合物的形成)的具有统计学意义的改变，如降低，提示HCV蛋白和靶分子之间的相互作用受到了调节(如刺激或抑制)。HCV蛋白和靶分子之间复合物形成的调节可以通过免疫分析等方法定量。
因此，本发明还涉及识别调节复合物中各结合成分之间相互作用的化合物的方法，其中复合物中至少一个成分是上述的HCV蛋白，方法包括(a)将备试化合物与复合物接触足够时间，以调节复合物中的相互作用，然后(b)监控复合物中相互作用的改变，一旦检测到相互作用的改变，便可识别调节相互作用的化合物。
本发明尤其涉及后面的方法，其中复合物中至少有一种成份从以下选出(i)HCV来源分子，如核酸(启动子或增强子)(包装于HCV颗粒中的HCV RNA)或蛋白(结构或非结构蛋白)。
(ii)细胞内、宿主来源分子(HCV肽氧化还原状态的调节因子TRX、GRX、硫酯酶等)(iii)细胞外宿主来源分子(受体、葡糖胺、肝素)应当明确的是被上述任何方法识别出来的复合物中各成份间相互作用的调节剂也在本发明之列。
为进行上述的药物筛选测定，将HCV蛋白或其靶分子固定化较为可行，这将有助于将复合物与一或两种蛋白的非复合形式分离，也利于适应测定的自动化。HCV蛋白和靶分子的相互作用(如结合)，无论有无候选化合物的参与，可在任何适于容纳反应物的容器中进行，如微量滴定板、试管和微量离心管。在一种实施方案中，提供了一个融合蛋白，该融合蛋白添加了一个可以使蛋白与基质结合的域。例如，HCV蛋白-His标记可以吸附于Ni-NTA微量滴定板(Paborsky等，1996)，HCV蛋白-ProtA融合可以吸附于IgG，并进一步与细胞裂解物(如(35)s-标记)和候选化合物结合，然后将混合物在利于复合物形成的条件下(如盐和pH的生理条件)孵育。孵育后，洗涤平皿，去除未结合标记物，固定化基质并直接判断放射标记，或在复合物分离后的上清液中判断。复合物还可以与基质解离，通过SDS-PAGE分离，串珠部分的HCV蛋白-结合蛋白水平可以用标准电泳技术从凝胶中定量。
其它使蛋白固定化于基质的技术也可以在本发明的药物筛选测定中使用。例如，HCV蛋白或其靶分子均可通过与生物素和链亲和素结合而固定化。生物素化的HCV蛋白分子可以用本领域熟知的技术(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford)从生物素-NHS(N-羟-琥珀酰亚胺)制备，然后固定于链亲和素包被的96孔滴定板上(Pierce Chemical)。另外，还可以将与HCV蛋白反应但并不干预蛋白与靶分子结合的抗体导入加样孔中，HCV蛋白通过与抗体结合也捕捉入孔中。如上所述，将HCV蛋白-结合蛋白和候选化合物制剂于滴定板的HCV蛋白呈递孔中孵育，然后对捕捉于孔中的复合物进行定量。检测这些复合物以及上述GST-固定化复合物的方法包括利用与HCV蛋白靶分子反应的抗体或与HCV蛋白反应而与靶分子竞争的抗体进行的复合物免疫检测以及酶联测定，后者依赖于检测与靶分子关联的酶的活性。
药物筛选的另一技术详见公开于84年9月13日的Geysen HN的WO申请84/03564“氨基酸序列抗原性的确定”，它提供了一种对与HCV蛋白有适当亲合性的化合物的高流通量筛选方法，在此引入作为参考。总之，将大量不同的小肽备试化合物在固相底物，如塑料针或其它表面上合成。这些蛋白备试化合物与HCV蛋白片段反应，然后洗脱，接着用本领域熟知的方法检测结合的HCV蛋白。纯化的HCV蛋白也可直接包被于滴定板上，用于上述的药物筛选技术。另外，可以将非中和抗体用于捕获肽并将其固定于固相支持物上。
本发明还涉及竞争性药物筛选方法的用途，其中能够与HCV蛋白结合的中和抗体特异地与备试化合物竞争结合HCV蛋白。通过这种方式，抗体可以检测与HCV蛋白具有一或多个共同抗原决定簇的蛋白。
在另一种实施方案中，本发明提供了一种识别化合物的方法(如筛选测定)。该化合物可用于治疗以HCV感染、HCV核酸表达或HCV蛋白活性为特征(或并发)的疾病。这一方法通常包括测定化合物或试剂调节HCV核酸表达或HCV蛋白活性的能力，进而识别一种治疗以HCV感染、HCV核酸表达或HCV蛋白活性为特征的疾病的化合物。
按照这些药物筛选测定识别的HCV感染、HCV蛋白活性和/或HCV核酸表达的调节剂可用于治疗如HCV感染或HCV感染相关的疾病。
这些治疗方法包括如以上述的药物组合物的形式将HCV蛋白活性和/或HCV核酸表达的调节剂给予需要这种治疗的受试者，如HCV感染者。药物的组织或细胞特异性可以通过药物导向法(参见Davis，1997)或细胞内免疫增强。肝脏导向工具有biluribin偶联药物(Kramer等，1992)、脱唾液酸糖蛋白受体或脂蛋白介导的药物转移(Vingerhoeds等，1996)。经由细胞器特异性导向标记进行DNA表达分子的细胞器导向，甚至可以对药物进行细胞内导向(Persic等，1997)。
测定化合物或试剂调节HCV感染、HCV核酸表达或HCV蛋白活性能力的方法通常以细胞为基础。然而，HCV感染动物也包括于此。例如，对还原剂或氧化剂敏感的、或者通过涉及HCV的蛋白通路转导信号的HCV感染或转染细胞可以通过诱导而过度表达HCV蛋白，无论有无候选化合物存在。
引起HCV蛋白依赖应答发生具有统计意义改变(刺激或抑制)的候选化合物可以被识别。
在一种实施方案中，靶细胞的HCV感染、HCV核酸的表达或HCV蛋白的氧化还原酶活性在细胞中受到调节，还检测了候选化合物对一些感兴趣指标(如感染率、细胞增殖或分化、氧化还原酶活性)的影响。例如，可以测定从硫基形式到S-共轭即S-S桥形式的转换率。例如，还可以测定受到HCV蛋白-依赖信号级联正或负调节的基因表达。在优选实施方案中，这些基因的调节区如5’侧翼启动子和增强子区与一个可检测的标记(如荧光酶)可操作性连接，此标记编码易于检测的基因产物。HCV蛋白或HCV蛋白靶分子的磷酸化也可以通过免疫印迹等方法检测。
因此，本发明涉及识别调节上述HCV蛋白氧化-还原酶活性的化合物的生物测定。该生物测定包括(a)将表达HCV蛋白或任何其功能相当部分的细胞暴露于至少一种化合物，这些化合物调节前述蛋白氧化-还原酶活性的能力待测，然后(b)监控前述蛋白氧化-还原酶活性的改变。
可逆保护的HCV肽可以以寡聚状态如(1)化学多抗原制剂(E1s偶联抗原不必与HCV有关，因此可用于多疾病筛选)；(2)固定化和免疫检测的靶(如生物素化、荧光)或(3)反过来可以产生超分子抗体的抗体结合(如病毒样颗粒上的抗体)用于与诊断偶联的目的。标记和抗体结合会导致由于蛋白寡聚化扩增步骤引起的敏感性的提高。
值得一提的是肽的任何反应基团(糖、氨基、羧基、巯基、组氨酸等)均可用于偶联或结合。可逆保护基团可用于增强反应的特异性，而巯基的反应性可用于去保护后结合的后续步骤/阶段。
最后，本发明涉及检测HCV抗体的免疫测定，包括(1)提供纯化的上述HCV蛋白或其功能相当部分；(2)在允许抗原-抗体复合物形成的条件下，将生物样品与HCV蛋白孵育；(3)判断是否形成了包含HCV蛋白的抗原-抗体复合物。
本发明将参考下面阐述了具体优选实施方案的实施例得到阐释，这些实例提供了优选实施方案。然而，需要注意的是这些实施方案仅仅是阐释，而不是以任何方式来限制本发明。
实施例实施例1痘苗病毒表达E1s的巯基-二硫状态的确定按照Maertens等(PCT/EP 95/03031)所述方法，用重组痘苗病毒pv-HCV11A从Vero细胞表达并纯化HCV E1s蛋白(氨基酸192-326)。所不同的是在裂解中和用DTT还原后，巯基基团的封闭用的是碘乙酰胺和N-乙基马来酰亚胺(NEM)。因而，在裂解缓冲液中，用IAA(碘乙酰胺)封闭自由巯基；用DTT还原后，用NEM烷基化。
纯化的E1s用超过滤方法浓缩(Centricon10，Millipore)，用N-糖苷酶F(PGNase F；Boehringer Mannheim)去糖基化，方法参见厂商说明书。之后，将E1s上样于15％聚丙烯酰胺微型凝胶上。SDS-PAGE方法参见Laemmli所述。大小分离和染色后，在ca.18kDa区切断蛋白条带。
蛋白用原位胰酶裂解切割，消化后的肽段进行质谱分析(MS；MALDI-TOFF)以明确不同半胱氨酸残基的衍生状态。
MS结果显示CXXC-基序中的半胱氨酸(1)在Ca.中，10％的CXXC-基序中两个半胱氨酸都以IAA衍生物出现；(2)在Ca.中，30％的CXXC-基序中一个半胱氨可用IAA封闭，另一个呈现为NEM-衍生物；
(3)在Ca.中，60％的CXXC-基序中两个半胱氨酸均以NEM-衍生物出现。
以上数据令人惊讶地表明(1)两个半胱氨酸均以完全还原(巯基)状态出现；以及(2)半胱氨酸中的任意一个包含于混合二硫桥，另一个以自由巯基形式(中间形式)出现；以及(3)两个半胱氨酸均以氧化形式出现(二硫桥)。
尽管本实验所用为HCV肽，即来源于感染性病原体，但是这三种形式与TRX超家族的-CXXC-基序的不同氧化状态有较好的相关性，与巯基氧化还原酶的活性形式相符。巯基氧化还原酶即参与细胞氧化还原环境调节的分子(Rietsch & Beckwith，1998；Loferer &Hennecke，1994；Aslund & Beckwith，1999；Huppa & Ploegh，1999)。
由于硫氧还蛋白活性位点的半胱氨酸被氧化，底物的二硫桥被还原，所以过量的氧化形式(60％)与硫氧还蛋白活性相符。令人惊讶的是，这些结果倾向于提示E1s参与(自动)折叠机制。折叠依赖于细胞内的氧化状态以便活性位点再生为还原形式。因而，通过蛋白折叠水平的干预，或者通过培养基中添加干预/影响半胱氨酸细胞内氧化还原状态的化合物，可以使由E1s、痘苗病毒和宿主蛋白组成的以-S-S-蛋白为基础的凝集减少。
实施例2半胱氨酸可逆修饰后酵母E1s-His的纯化通过微量过滤和离心收集产生his标记的HCV E1s的啤酒糖酵母细胞。细胞沉淀重悬于5倍体积的裂解缓冲液(50mM磷酸盐、6M盐酸胍，PH7.4(＝缓冲液A)，并将固体Na2SO3，Na2S4O6加入溶液，直到终浓度分别为160mM和65mM。Cu2+(100mM贮存液，氨水中)作为催化剂加入，直至浓度为100μM，然后在室温孵育过夜。裂解物贮存于-70℃，冻融循环后离心(JA20转子，27kg、4℃)使其澄清。
分别将咪唑和EmpigenTM(Albright & Wilson，UK)加入上清液，直到终浓度为20mM和1％(w/v)。然后将样品用平衡缓冲液(缓冲液A，20mM咪唑，1％Empigen)稀释，上样于Ni-IDA Sepharose FF柱(Pharmacia)。
用平衡缓冲液洗脱树脂，直至280nm的吸光度达到基线水平，然后用咪唑分级梯度将结合蛋白洗脱下来。
SDS-PAGE和蛋白印迹分析表明变性条件下亚硫酸分解和IMAC(图6B)后＞90％的纯的E1s-His蛋白出现于200mM咪唑洗脱池中。
通过加入DTT使磺化的HCVE1s去磺化，恢复硫基状态，可以形成分子内或分子间二硫桥。
实施例3大肠杆菌NS3融合蛋白的纯化和免疫反应性收集产生mTNF(His)6 NS3 B9融合蛋白的大肠杆菌细胞，重悬于缓冲液A(见实施例2)。磺化、样品制备和在Ni-IDA Sepharose FF(Pharmacia)上进行的金属层析方法同酵母(实施例2)。mTNF(His)6 NS3 b9融合蛋白出现于200mM咪唑洗脱池中。SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色和蛋白印迹表明，亚硫酸分解和IMAC后，HCV融合蛋白纯度＞90％(见图6A)。
用HCV阳性人血清通过ELISA检测融合蛋白的免疫反应性。纯化的融合蛋白用200mM DTT还原后，再用35mM醋酸盐、6M ureum，pH为4的条件下在Sephadex G25柱(Pharmacia)上脱盐。将抗氧化剂和可逆保护剂(二硫氨基甲酸酯，GSH、半胱氨酸)在NS3融合蛋白-70℃冷冻前或ELISA包被缓冲液稀释时加入，可以验证它们对NS3融合蛋白反应性的影响。
10mM或200mM DTT存在下包被的NS3融合蛋白分别作为阳性和阴性对照。血清(17790、17832)是难检测血清(HCV NS3转换血清)，而血清(17826、17838)是易检测HCV阳性血清。难检测HCV血清是(1)不与其它HCV抗原(只与NS3)反应，或反应很微弱的血清或(2)NS3-表位反应的血清，NS3表位只在用200mM DTT处理磺化NS3 b9后由抗体呈递和识别。而相比之下，只需用10mM DTT处理磺化NS3 b9就足以使易检测血清恢复免疫反应性。ELISA结果见图5A和5B。
结果表明，表位的disponibility强烈依赖于硫基氧化还原状态，即难检测HCV血清仅在以下处理后可检测到(1)在包被缓冲液中，用200mM DTT还原NS3或(2)NS3样品用含巯基的抗氧化剂和/或可逆保护剂稀释，然后在10mM或3mM DTT存在下孵育样品稀释液，用二硫氨基甲酸酯恢复免疫反应性的效果比用谷胱甘肽、半胱氨酸或噻吩羧酸(TPCB)或硫二甘醇(TEG)显著。谷胱甘肽又优于半胱氨酸或其它所试的单-SH(TEG、TPCB)产物。NS3B9融合蛋白的ELISA信号最好，NS3B9在-70℃孵育，在巯基稳定剂和可逆保护剂存在下稀释。
免疫反应性的恢复在加入含巯基化合物后还需要DTT还原步骤，这一点表明在巯基试剂和NS3B9融合蛋白的半胱氨酸残基之间形成了混合二硫桥。硫基化合物的加入已经抑制了非常稳定的分子内二硫键的再形成，只能用200mM DTT还原。这种混合二硫桥状态类似于蛋白的体内巯基化，是已知的生物活性调节剂，用最小的能量输入便可转化为(通过酶，是或‘S-S’还原剂)还原状态。
实施例4与CXXC位点半胱氨酸残基重叠的抗E1表位的单克隆抗体图鉴定了10个抗E1的单克隆抗体，均识别E1的N-末端区域。这些单抗的特征按它们的最小表位给出。为做到这一点，先合成两个多肽，然后通过评价竞争而分析每一单抗对多肽的反应性。将重组E1吸附于微量滴定板，在过量多肽存在条件下，加入单抗进行反应。按照反应结果，10个单抗可分为两组(表1)，第一组的最小表位是aa 209-227，尤其是与不含225-227氨基酸的多肽的反应性的缺乏证明，这些单抗包含了一个与硫氧还蛋白样位点交叉重叠的表位，更具体地说是与这个位点的第一个半胱氨酸重叠。第二组单抗的最小表位与硫氧还蛋白样位点无重叠，表1总结了以上结果。
表1抗E1单克隆抗体的最小表位描述第1组E1单克隆抗体IGH 198、199和200序列 aa区 IGP*结果NDCPNSSIVYEAHDAILHTP 205-224 263 无竞争Bio-GG-SNSSIVYEAADMIMHTPGCV 208-227 436 竞争第2组E1单克隆抗体IGH 201、202、203、204、205、206and208序列 aa区 IGP*结果NDCPNSSIVYEAHDAILHTP 205-224 263 竞争Bio-GG-SNSSIVYEAHDAILHTPGCV 208-227 436 竞争每一组的最小表位均用下划线表示IGP指肽编码号。
注1也有识别E1 C-末端表位的单克隆抗体(IGH207、209和210、aa 307-326，参见PCT/EP99/02154)。这些单抗可用作对照。因为它们识别的区域根本不在硫氧还蛋白样位点附近。
注2IGH 198＝23C12IGH 203＝15G6 IGH 208＝5C6IGH 199＝15B5 IGH 204＝8A8IGH 209＝5E1IGH 200＝25CF3IGH 205＝3H2IGH 210＝7D2IGH 201＝11B7 IGH 206＝7C4IGH 202＝3F3 IGH 207＝14H11因而，作为工具来明确本发明的肽的生物活性和/或构象变化的单抗是可以得到的。
实施例5Cys-残基可逆修饰后HCV E1s的纯化按照Maertens等所述(PCT EP 95/03031)裂解痘苗病毒RK13细胞，但在裂解物中加入固体的连四硫酸钠，直至65mM，而不是加入可逆巯基封闭剂N-乙基马来酰亚胺(NEM)。裂解物于4℃孵育过夜，按照Maertens等所述(PCT EP 95/03031)方法纯化(Lentil Lectin(LCA)层析、LCA洗脱液的浓缩和DTT还原)。将浓缩物分为两部分，或于4℃用Na2S4O6磺化过夜，或用N-乙基马来酰亚胺(NEM)不可逆封闭作为参照物质。然后将两种方法处理的E1s均在Empigen存在(见图1)时上样于Superdex G200(Pharmacia)，用SDS-PAGE和蛋白印迹分析E1s峰。
色谱图重叠及ELISA图形表明，不可逆保护和磺化E1s产物在Empigen存在时在SEC的表现相似。SDS-PAGE和银染表明两种产物的纯度也相似。
实施例6巯基稳定剂存在下裂解后的HCV E1s在非变性条件下的纯化按照Maertens等所述(PCT EP 95/03031)裂解痘苗病毒RK13细胞，但在裂解物中加入抗坏血酸(1mM)而不是NEM作为巯基稳定剂。将样品加于LCA树脂，用1M醋酸使LCA洗脱液酸化，直至pH5.5。然后将酸化的洗脱液浓缩，之后将pH调至7.2，并按照Maertens等所述(PCT EP 95/03031)用DTT处理。
还原的蛋白溶液按以下分组处理(1)酸化至pH6(巯基稳定条件下)或(2)用连四硫酸钠磺化(可逆保护)或(3)用NEM.bio处理(不可逆封闭)。酸化样品(pH6)的SEC也在pH6.0下进行。其它两个样品则按照Maertens等所述(PCT EP 95/03031)在Empigen存在下用Superdex G200分离。洗脱组分用ELISA、SDS-PAGE和蛋白印迹分析。
引入按照Maertens等所述(PCT EP 95/03031)制备的物质，作为SEC的参照物质。
组分分析表明纯化的E1s的回收条件不同(图3A.1和3A.2)。NEM.bio E1s的更明显的Mr、可能是由E1s上大体积封闭基团的插入引起的。
图3B所示为E1s混合物的蛋白印迹，E1s混合物来自实施例5和实施例6的不同过程。
实施例5和6表明，纯化的E1s在非变性条件下通过(1)使用可逆修饰剂或(2)在巯基稳定条件下(抗氧化剂、低pH)进行层析获得。
实施例7Vero E1s的与硫氧还蛋白等生长因子相似的加工和切割按照Maertens等所述(PCT EP 95/03031)裂解痘苗病毒感染的Vero细胞，但加入碘乙酰胺(IAA)作为不可逆封闭剂，且4℃孵育过夜后，加入抑肽酶。
LCA树脂(Pharmacia)层析，DTT还原和凝胶过滤均按前述方法进行，只是用IAA而非NEM作为不可逆封闭剂。E1s混合物用银染和蛋白印迹分析。
半纯产物的蛋白印迹分析表明除27-32kDa区的四分条带外，还有一条E1s带的分子量约为18kDa，条带通过NH2-末端氨基酸测序鉴定。
不同四分条带的主要信号序列YEVR？VSG正确加工E1s的氨基末端？ ？ VAL TPTLAA这一降解产物来源于位于CVPC-位点上游的Arg237后羧基端的特异切割。未识别出第一和第二个残基，因为半胱氨酸和色氨酸被Edman测序方法破坏。
奇怪的是，尽管E1s中还有其它碱性残基甚至二碱基序列，但是没有回收到其它降解产物。这一特异的切割模式与E1s域结构相对应，这一点已在硫氧还蛋白等生长因子的加工中描述，其中切割导致ECEF的形成(Balcewicz-Sablinska等，1991；Newman等，1994)实施例8E1s CVPC位点半胱氨酸pKa的滴定。
为了建立反应步骤的顺序，即C1VPC2-位点的哪个半胱氨酸首先反应，对这些半胱氨酸的pKa进行了滴定。E1s C1VPC2-位点的半胱氨酸的pKa通过pH作用下E1s或合成肽中半胱氨酸的修饰而确定。
修饰通过在预置pH下用IAA处理进行，然后用三氟乙酸(TFA)将pH降至2，接着加样于RPC。
为明确反应性最强的半胱氨酸，用RPC除去多余的IAA。未反应的巯基基团通过加入乙烯亚胺(EI)或溴-乙醇胺(BEA)提高pH而被修饰。
用EI或BEA处理导致引入了一个赖氨酸模拟半胱氨酸加合物，它建立了一个附加的胰蛋白酶水解位点。有了这个附加位点，便可通过指纹法和MS(也参见实施例1)识别-C1VPC2-位点中反应性最强的半胱氨酸。
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权利要求
1.一种HCV蛋白或任何其功能相当部分，包含至少两个具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸，半胱氨酸包含在氨基酸序列Cys-X1-X2-Cys中，其中氨基酸X1、X2均代表任何氨基酸。
2.权利要求1的HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中氨基酸X1代表Val、Leu或Ile，氨基酸X2代表任何氨基酸。
3.权利要求1的HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中氨基酸X1代表任何氨基酸，氨基酸X2代表Pro。
4.权利要求1的HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中氨基酸X1代表Val、Leu或Ile，氨基酸X2代表Pro。
5.权利要求1的HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中HCV蛋白选自Els或Elp。
6.权利要求1-5任何一条的HCV蛋白或任何其功能相当部分，包含至少两个具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸，通过以下步骤获得(a)纯化HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中半胱氨酸残基受到化学和/或酶促方式的可逆性保护，(b)半胱氨酸残基可逆保护状态的解除，(c)获得HCV蛋白或任何其功能相当部分，其中的半胱氨酸残基具有可逆氧化还原状态。
7.用作药物的权利要求1-6任何一条的HCV蛋白或任何其功能相当部分。
8.权利要求1-6任何一条的HCV蛋白或任何其功能相当部分在生产HCV疫苗组合物，具体为治疗疫苗组合物或预防疫苗组合物中的用途。
9.用于产生抗体的权利要求1-7任何一条的HCV蛋白或任何其功能相当部分，抗体能特异识别HCV蛋白或任何其功能相当部分。
10.检测HCV抗体的免疫测定，所述免疫测定包括(1)提供权利要求1-7任何一条的HCV蛋白或任何其功能相当部分；(2)将生物样品与所述HCV蛋白在允许HCV抗体-HCV蛋白复合物形成的条件下孵育；(3)判断HCV抗体-HCV蛋白复合物是否形成。
11.识别调节权利要求1-7的任何一条的HCV蛋白的氧化还原酶活性的化合物的生物测定，所述生物测定包括(1)将表达权利要求1-7的任何一条的HCV蛋白或任何其功能相当部分的细胞暴露于至少一种化合物，该化合物调节所述蛋白氧化还原酶活性的能力为待测；然后(2)监测所述蛋白氧化还原酶活性的改变。
全文摘要
本发明涉及HCV蛋白,其中半胱氨酸残基在纯化过程中受到可逆保护。最终,此纯化程序产生具有生物活性和天然样蛋白构象的HCV蛋白,呈递相应的表位。本发明还涉及使用这些HCV蛋白的药物筛选方法以及诊断和治疗应用,如疫苗和药物。
文档编号A61P31/14GK1384839SQ00814993
公开日2002年12月11日 申请日期2000年10月25日 优先权日1999年10月27日
发明者A·波斯曼, E·德普拉, G·梅尔滕斯 申请人:基因创新有限公司