专利名称：通过消除t－细胞表位来降低异源蛋白的免疫原性的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过消除T-细胞表位来降低肽或蛋白的免疫原性的方法。本发明还涉及一种生产T-细胞反应性降低的蛋白和肽的方法以及由此获得的所述蛋白和肽，特别是葡萄球菌激酶变体。本发明还涉及这些改构肽和蛋白在治疗、诊断和预防方面的用途。
本发明的技术背景免疫应答反应包括，一、识别外来物质(病原体/抗原)，二、激活反应来消除所述外来物质。概括地讲，可以触发两种类型的反应；一种先天性或非特异应答和一种适应性或高度抗原-特异应答反应。后一反应提高了与相同外来物质的持续接触程度。免疫系统对外来物质产生了记忆，并能更加迅速地对外来物质进行处理，从而在初次接毒后产生终生免疫。
由于淋巴细胞无论是来自组织液或血液中的宿主细胞的内部还是外部，它们都能特异识别个体病原体/抗原，所以在所有适应性免疫应答过程中，淋巴细胞起着重要的作用。事实上，存在几种不同类型的淋巴细胞，但这些淋巴细胞被分为两个基本类型T淋巴细胞(或T-细胞)和B淋巴细胞(或B-细胞)。
B-细胞通过释放特异抗体而抵抗抗原和病原体及其产物。
T-细胞可被分为不同的类型并且显示出更宽范围的活性。所谓的细胞毒T-细胞起着破坏宿主细胞的作用，该宿主细胞已经感染了病毒或其它病原体。T辅助细胞能与吞噬细胞相互作用从而能有利杀死病原体。其它T辅助细胞与调控B-淋巴细胞的形成和抗体的产生有关。
每一B-细胞由基因操纵来编码一种特异于特定抗原的特定表面受体。B-细胞识别其特异抗原后，能够进行增殖而分化为浆细胞，该浆细胞产生大量可溶形式的称作抗体的受体分子。
B-淋巴细胞识别天然抗原上的构象表位(3-D表面结构)，而T细胞识别线性氨基酸序列(T-细胞表位)。但是当T-细胞表位被称作人组织相容性白细胞抗原(HLA)分子提呈到其它细胞的细胞表面时，它们只能按照这种方式进行识别。所述抗原不能以完整蛋白的形式由HLA分子来提呈，但能以非共价结合在HLA分子的肽结合槽中的加工肽的形式来提呈。该加工过程和提呈过程可以由特定的抗原提呈细胞(APC)或被感染细胞来完成，所述抗原提呈细胞能够刺激T-细胞，所述被感染细胞后来成为细胞毒T-细胞的靶子。T-淋巴细胞能够通过称作T-细胞受体(TCR)的特定受体识别这些HLA-肽复合物。每个受体都是唯一的，它识别一种结合在特定HLA-分子槽中的特定肽。通过识别，特定T-细胞获得了一种活化信号，然后需要第二种信号诱导T-细胞产生应答，该应答包括增殖和细胞因子的产生。
如果个体接触到一种抗原，免疫系统则产生体液应答，接着顺序发生一系列的细胞和分子间的相互作用。第一种相互作用涉及抗原特异性T-细胞和APC。其结果主要操纵后面程序的进行。需要适当地触发足够数目的T-辅助细胞。接着特异T-细胞相应进行增殖而分泌细胞因子。
然后，这些被激活的T-辅助细胞与给它们提呈抗原的特异性B-细胞相互作用。该B-T-细胞与所分泌的细胞因子的结合激活了B-细胞，接着诱导增殖并分化为浆细胞。依次，浆细胞产生抗体，并且根据浆细胞收到的T-细胞信号，浆细胞通过类别转化、亲和力成熟和免疫记忆的形成得到进一步分化。
因此，由于第二次或后来的抗原接触，出现了大量的抗原-特异性B-细胞，而成为主要类型的APC，从而显著地诱导了短路的免疫应答。然而，如果T-辅助细胞没有被同时激活，则产生一种免疫耐受性，结果不进行免疫过程。
基于这些考虑，本发明人认为消除功能性T-细胞表位还将对体液应答的诱导产生重大影响。如果只有较少的或没有T-细胞被激活，由于特异肽不能再被有效地提呈，那么B-淋巴细胞的成熟将受到抑制，从而没有抗体产生。
因此本发明的第一个目的是提供一种降低基于T-细胞的肽和蛋白的免疫原性的方法。
该目的通过一种降低肽或蛋白的免疫原性的方法来实现，所述方法包括步骤(a)设计一系列的重叠测试肽，每种肽具有一种与需要降低免疫原性的肽或蛋白的部分氨基酸序列对应的氨基酸序列；(b)确定所述系列的哪个测试肽含有一个或多个T-细胞表位；(c)对含有一个或多个T-细胞表位的一个或多个测试肽的氨基酸序列进行改构；(d)针对改构的测试肽重复步骤b)并且选择性地重复步骤c)，直到最初含在其中的一个或多个T-细胞表位被明显减少或消除；(e)按照在测试肽的氨基酸序列中进行的T-细胞消除改构方法对需要降低免疫原性的肽或蛋白的氨基酸序列进行改构以便制一种备改构的肽或蛋白。
上述方法涉及最少的必需步骤。只在一个循环中有可能对测试肽进行适当的改构。如果这种改构是充分的，那么这种改构将发生在重复的步骤b)中。然后将这种改构施用于需要降低免疫原性的肽或蛋白。然而也有可能发现需要进一步进行改构的重复步骤b)。步骤c)可能涉及更多个循环的改构而不需要象在步骤b)中一样对T-细胞表位进行中期检验。
除了上述步骤外，还有更优选的步骤包括在该方法中。例如可以检测改构测试肽或改构肽或蛋白激活T-细胞和诱导人体循环系统中的T-淋巴细胞的潜力(PBMC试验)。这显示了一种离体状态并使人认识到改构对体内免疫原性的影响。
而且，可能再一次对已经改构的肽或蛋白进行全过程的鉴定、改构(步骤b)和c))和选择性的PBMC试验。
按照在测试肽的氨基酸序列中进行的T-细胞去除改构方法对需要降低免疫原性的肽或蛋白的氨基酸序列进行改构的步骤例如可以通过编码改构氨基酸序列的DNA序列在适当宿主中的表达来进行。
可以利用不同的方式对含有T-细胞表位的肽进行鉴定。在一个技术方案中，采用了功能性T-细胞分析方法，在该方法中利用一种测试肽刺激T-细胞克隆而引起一个或多个T-细胞克隆的增殖意味着所述测试肽含有一个T-细胞表位。在第二个技术方案中，使用了功能性T-细胞分析方法，在该方法中利用一种测试肽刺激PBMC而引起人体循环系统中的一个或多个T-淋巴细胞克隆的增殖(PBMC)意味着所述测试肽含有一个T-细胞表位。在这些技术方案中，使用了真实的肽，该肽是在其基于T-细胞的免疫原性需要降低的肽或蛋白的氨基酸序列的基础上被合成的。
或者，含有T-细胞表位的肽通过以下方法来进行鉴定利用计算机模拟技术测定测试肽与一个或多个HLA-DR单元型(haplotypes)的结合槽的相互作用能，其中根据测试肽适合HLA-DR结合槽的相互作用能将测试肽鉴定为含有一个T-细胞表位。在该技术方案中，实际上没有合成肽而是使用了虚拟肽。
根据本发明，优选地通过下列一组检测试验鉴定含有一个T-细胞表位的肽a)一种功能性T-细胞分析方法，在该方法中T-细胞克隆被一种测试肽刺激后所发生的一个或多个T-细胞克隆的增殖意味着所述测试肽含有一个潜在的T-细胞表位，和/或b)一种功能性T-细胞分析方法，在该方法中PBMC被一种测试肽刺激后，存在于人体循环系统(PBMC)中的一个或多个T-淋巴细胞发生了增殖，该增殖意味着所述测试肽含有一个T-细胞表位；和c)利用计算机模拟技术检测所述测试肽与一个或多个或者HLA-DR单元型(haplotypes)的结合槽的相互作用能，其中根据测试肽适合HLA-DR结合槽的相互作用能将测试肽鉴定为含有一个潜在的T-细胞表位，其中如果在试验a)和/或b)和c)中对一种测试肽进行鉴定，则认为该测试肽含有一个T-细胞表位。
在该技术方案中，一种试验是对另一个试验的检验。只有一种T-细胞分析方法能够给出有关T-细胞表位功能的信息。一种理论上适合HLA结合槽的肽不会引起T-细胞的增殖。
本发明因此涉及蛋白中的功能性人T-细胞表位(免疫原性区域)的鉴定，优选地是在将HLA-DR结合槽中的测试肽的计算机模拟结果与T-细胞分析方法结合的基础上进行鉴定。更具体地是，本发明涉及一种计算两种蛋白/肽间的相互作用能的方法。
本发明上述方法的步骤d)涉及对在改构蛋白中新引进表位进行的再次评价，优选地是通过将HLA-DR结合槽中的改构测试肽的计算机模拟结果与人T-淋巴细胞筛选改构蛋白的方法结合起来进行再评价。
上述方法的目的在于通过消除确定的免疫原性区域来降低外源蛋白的免疫原性。本发明更进一步涉及通过下列手段去除免疫原性区域的方法通过编码序列的缺失或插入，或者通过编码序列的人源化，或者通过编码序列的体外诱变使得一个或多个编码野生型氨基酸的密码子被编码另一个残基的密码子所取代，或者通过使免疫原性区域对蛋白水解内切酶更加敏感。后一类型的改构能影响T-细胞表位在抗原提呈细胞上的提呈方式。另外，使得免疫原性区域对蛋白水解酶更加敏感的改构可能会导致产生由于太短而与HLA HLA-DR槽不适应和不能与HLA-DR槽结合的肽。已知9个氨基酸适合所述槽，而结合至少需要11个氨基酸。对相对于内源性蛋白水解酶的靶位点的位置进行改变可以导致体内产生不再与HLA-DR槽结合的短肽。
本发明还涉及通过下述步骤生产本发明的改构肽和蛋白的方法制备一种编码所述肽或蛋白的至少部分结构信息的DNA片段，所述结构信息提供生物活性；突变所述DNA片段以便从中去除一个或多个T-细胞表位的编码信息；将突变的DNA片段克隆到一种合适的载体中，用该载体转化或转染一种合适的宿主细胞，然后在适合于表达所述DNA片段的条件下培养该宿主细胞。
更具体地是，本发明提供了一种生产与野生型肽或蛋白相比免疫原性降低了的肽或蛋白的方法，该方法包括下列步骤
a)提供一种编码所述肽或蛋白的至少提供其生物活性的氨基酸序列的DNA序列；b)通过下列方法鉴定含在野生型肽或蛋白的氨基酸序列中的一个或多个T-细胞表位1)设计一系列的重叠测试肽，每种测试肽具有一个与所述肽或蛋白的部分氨基酸序列相对应的氨基酸序列；2)确定所述系列的哪些测试肽含有一个或多个T-细胞表位；3)改构一个或多个含有一个或多个T-细胞表位的测试肽的氨基酸序列；4)用改构的测试肽重复步骤2)并任选地重复步骤3)直到最初含在其中的一个或多个T-细胞表位被明显地减少或消除；c)改构DNA序列以便将修饰引进由其编码的氨基酸序列中的T-细胞表位；d)将DNA序列引进一种宿主生物体中；e)在能够表达所述改构的肽或蛋白的条件下培养所述宿主生物体；和f)从宿主生物体中分离低免疫原性的肽或蛋白。
上述方法还可进一步包括上述降低肽或蛋白的免疫原性的方法步骤。
本发明生产的并且基于T-细胞的免疫源性低于其野生型对应物的肽或蛋白是新颖的并且也属于本发明的一部分。本发明用来降低来源于人或由植物、微生物或动物产生的所有类型的基于T细胞的蛋白和糖蛋白的免疫原性。目标也可以是由部分来源于产生所述蛋白的宿主的蛋白和部分目的蛋白组成的融合蛋白。用于本发明方法的其它目标是人源化蛋白。
如果一种蛋白或肽来源于人类，那么当施用于人体时该蛋白或肽仍具有免疫原性。这方面的实例是将人类个体缺乏的蛋白施用于人类个体。尽管所述蛋白来源于人类并能引起免疫应答反应，但所述个体不将所述蛋白识别为“自身的”。其它实例是人类来源的蛋白不再完全是人类的，如由大肠杆菌产生的人α-干扰素是非糖基化的并被发现具有免疫原性，或者人类来源的蛋白通过改构获得了更好的性能，如溶解性增加。具体地说，本发明被用于降低用于诊断或治疗人类疾病的基于T细胞的非人类蛋白的免疫原性，所述非人类蛋白诸如葡萄球菌激酶、链球菌激酶或来源于其它种类的抗体或其片段，或嵌合蛋白，或融合蛋白，或从头合成(de-novo)的蛋白。
如果施用于人体，所有这种以某种方式或由于某些原因具有免疫原性的肽和蛋白通过本发明的方法制备后可以具有较低的免疫原性。以葡萄球菌激酶为例来对本发明加以说明。然而本发明如上所释具有更广泛的用途并且包括以这种方式制备的所有具有较低免疫原性的蛋白和肽。按照本发明的一个具体的蛋白技术方案，葡萄球菌激酶衍生物的条件是具有低于野生型葡萄球菌激酶的基于T-细胞的免疫原性。
当为了降低其免疫原性而对一种蛋白或肽进行改构时，应当小心不要造成所述蛋白或肽的生物活性的明显降低或甚至丧失。因此优选地是生产了一种改构蛋白或肽后，应当检测其生物活性。在本技术领域中，检测所述蛋白或肽活性的试验方法通常是可以利用的。
另一方面，本发明涉及所述改构蛋白或肽在治疗、诊断或预防方面的用途以及一种改构蛋白或肽用于制备人体治疗、诊断或预防的药物组合物的用途。
本发明另外还涉及含有至少一种本发明的免疫原性较低的衍生物和一种合适的赋形剂的药物组合物，该组合物用于人类的诊断或治疗。这种组合物可通过活性化合物与药学上可接受的中性赋形剂(诸如水性或非水性溶剂、稳定剂、乳化剂、去垢剂、添加剂)的结合(例如，混合、溶解等)来进行制备。根据疾病的性质和用药方式，治疗组合物中的活性成分的浓度可以在很宽范围内进行变化。
本发明涉及所谓的“基于T-细胞的免疫原性”，是指根据本发明T-细胞表位可以被鉴定、定性和改构。在US-5695754、US-5951980和WO-9940198中记载的去除B-细胞表位的方法的基础上，本发明不涉及用于葡萄球菌激酶衍生物的鉴定、生产和使用的一般方法，所述葡萄球菌激酶衍生物与野生型葡萄球菌激酶相比抗原性较低。尽管意外发现这些专利出版物中记载的抗原区域(被抗体和B-细胞识别的)与涉及T-细胞应答(T-细胞识别)的免疫原性区域可以(部分)发生重叠，但是这些方法完全不同于而且也不是本发明的主题。
在本发明的一个具体技术方案中，改构的肽或蛋白是葡萄球菌激酶。葡萄球菌激酶，一种由金黄色葡萄球菌的特定菌株产生的蛋白，50年前就被证明具有纤维蛋白溶解特性，其对急性心肌梗塞患者似乎是一种非常有效的血栓溶解药物。葡萄球菌激酶基因被从噬菌体sakC(Sako和Tsuchida，1983)和sak42D(Behnke和Gerlach，1987)以及被从溶原性金黄色葡萄球菌菌株(Collen等，1992)的基因组DNA(sakSTAR)中克隆下来。葡萄球菌激酶基因编码163个氨基酸，其中第28位氨基酸对应于全长成熟葡萄球菌激酶的NH2-端残基。野生型变异体SakSTAR的成熟蛋白序列如
图1所示。在sakC，sak42D和基因sakSTAR的编码区域中只发现了四个核苷酸的差异，其中一个构成了一个沉默突变。
本发明更具体地涉及其中下列免疫原性区域中的一个或多个被改构从而使得含在其中的T-细胞表位被去除的葡萄球菌激酶变异体1-SSSFDKGKYKKGDDASY-17，16-SYFEPTGPYLMVNVTGV-32，56-TKEKIEYYVEWALDATA-72，71-TAYKEFRVVELDPSAKI-87，106-ITEKGFVVPDLSEHIKN-122，和120-IKNPGFNLITKVVIEKK-136。
并且，本发明还涉及T-细胞反应性低于野生型葡萄球菌激酶而仍保持其生物活性的葡萄球菌激酶变异体，该变异体的氨基酸序列如图1所示，其中在下列的免疫原性区域中具有一个或多个下述氨基酸的取代a)在含有第16-32位SakSTAR残基的免疫原性区域中的取代是Y17L；F18L；F18E；E19D；P20Y，Y24A；P20Y，Y24S；G22S；G22P，P23G；N28S；b)在含有第71-82位SakSTAR残基的免疫原性区域中的取代是F76W，V79Y，D82A；R77A，E80A；R77S，E80S；R77A，E80A，D82A；K74Q，R77S，E80S；K74Q，R77S，E80S，D82G；K74Q，R77S，E80S，D82A；K74Q，R77S，E80A，D82A；K74Q，R77A，E80S，D82A；K74Q，R77S，E80S，D82S；V79Y，D82A；c)在含有第106-122位SakSTAR残基的免疫原性区域中的取代是V112T；V112S；D115N；E118S；H119A；H119S；V89L，L116Y；V89L，L116T；V112T，H119S；V112T，H119A；V112T，E118S，H119S；d)在含有第120-136位SakSTAR残基的免疫原性区域中的取代是K130Y。
优选地是葡萄球菌激酶变异体具有一个或多个上述突变的的组合，特别优选地是下列一种组合突变；V112T，H119S，K130Y；R77E，E134R；V29L，L127V；K74Q，R77E，E80S，D82S，E134R；R77S，E80S，V112T，H119S；R77S，E80S，V112T，H119S，K130Y；R77A，E80A，V112T，H119S；R77A，E80A，V112T，H119S，K130Y；K74Q，R77S，E80S，V112T，H119S；K74Q，R77S，E80S，V112T，H119S，K130Y；K74Q，R77S，E80S，D82S，V112T，H119S；K74Q，R77S，E80S，D82S，V112T，H119S，K130Y。
优选的葡萄球菌激酶变异体选自下列一组突变SakSTAR(P20Y，Y24A)，SakSTAR(P20Y，Y24S)，SakSTAR(E19D)，SakSTAR(Y17L)，SakSTAR(F18L)，SakSTAR(F18E)，SakSTAR(G22S)，SakSTAR(G22S，P23G)，SakSTAR(N28S)，and SakSTAR(V29L，L127V)，SakSTAR(R77E，E134R)，SakSTAR(K74Q，R77E，E80S，D82S，E134R)，SakSTAR(K74Q，R77E，E80S，D82S，V112T，H119S，E134R)，SakSTAR(K74Q，R77E，E80S，D82S，V112T，H119S，E134R，K130Y)；SakSTAR(R77S，E80S，V112T，H119S)，sakSTAR(R77S，E80S，V112T，H119S，K130Y)，SakSTAR(R77A，E80A，V112T，H119S)，SakSTAR(R77A，E80A，V112T，H119S，K130Y)，sakSTAR(K74Q，R77S，E80S，V112T，H119S)，SakSTAR(K74Q，R77S，E80S，V112T，H119S，K130Y)，sakSTAR(K74Q，R77S，E80S，D82S，V112T，H119S)，SakSTAR(K74Q，R77S，E80S，D82S，V112T，H119S，K130Y)，SakSTAR(V112T，H119A)，SakSTAR(V112T，H119S)，SakSTAR(V112T，E118S，H119S)，SakSTAR(V112T，H119S，K130Y)，SakSTAR(V112T)，SakSTAR(V112S)，SakSTAR(H119A)，SakSTAR(H119S)，SakSTAR(V89L，L116Y)，SakSTAR(V89L，L116T)，SakSTAR(V112T)，SakSTAR(V112S)，SakSTAR(D115N)，SakSTAR(E118S)，SakSTAR(K130Y)。
已经发现其中至少野生型氨基酸序列的K130残基被一个Y取代的葡萄球菌激酶变异体是特别优选的。
为了检测所述变异体是否仍然保留了溶栓活性，可以采用由Collen等(1996b)记载的检测方法。
所述葡萄球菌激酶变异体可以被用于治疗、诊断或预防疾病。本发明进一步涉及葡萄球菌激酶变异体用于制备治疗、诊断或预防人体疾病的药物组合物的用途以及一种含有一种葡萄球菌激酶变异体和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
以葡萄球菌激酶作为一种具有治疗潜力的非人体免疫原性蛋白的模型，通过下列实施例来进一步阐明本发明，但该实施例对本发明的范围没有限制作用，因为几种选择应用对于本技术领域的技术人员来说将是显而易见的。因此，可以采用同样的方法对其它非人体或人体蛋白的去免疫。
所述实施例参照了以下附图图1.葡萄球菌激酶(SakSTAR)的原始序列。以单字母的代码形式表示氨基酸A，丙氨酸；D，天门冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，苷氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；N，天门冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸和Y，酪氨酸。
图2.一组典型的区域(71-87)-特定T-细胞克隆的最低限度的表位分析。所述T-细胞与抗原提呈细胞和SakSTAR肽71TAYKEFRVVELDPSAKI-87和所示的两个11链节(mer)肽(S1，S2)共同进行培养，所述15肽在71-87区域具有一个丙氨酸取代。如T-细胞克隆与相应肽的增殖水平被发现与由野生型肽(第一栏)诱导的增殖水平相当，那么就绘制黑色填方。浅灰色填方表示与采用同样浓度的SakSTAR-(71-87)肽的增殖水平相比明显降低的增殖水平，而空白方框表示没有检测到所述组合发生增殖。
图3.a含有SakSTAR的免疫原性区域的13肽(11-链节)的模型。绘制了每种具有HLA-DR1结构的肽的非键合相互作用能(kcal/mol)。较长的棒形图表示较强的HLA-DR1键合。选出的两种肽，S1和S2，以粗黑体表示。b以带状图表示的代表性肽S2的模拟结构(Koradi等，1996)。所述S2肽以浅灰色表示，HLA-DR1α-和β-链分别以中等灰色和暗灰色表示。与肽残基D82相互作用的β-链R71的侧链是高亮度的。
图4.HLA-DR7上下图中的S1(a，b，c)和S2(d，e，f)肽的丙氨酸扫描实验。a，d绘制了每一丙氨酸突变相对野生型肽的相互作用能(kcal/mol)的损失。较长的棒形图表示肽结合槽与相应肽的结合较弱。b，e相同系列肽相对于野生型SakSTAR肽所损失的接触面积(2)的棒形图。c，f结合在槽中的肽的每一残基的溶剂化程度和包埋表面积的图形。正值代表在上下图组合物中暴露给溶剂的侧链，该侧链可能用于T-细胞的识别。负值表示在编号为1至9的相应HLA-DR袋中的包埋程度。
图5.葡萄球菌激酶(SakSTAR-myc)-致敏的PBMC相对SakSTAR-myc，SakSTAR肽71-87或其肽衍生物的增殖应答反应。来自十个区域-(71-87)免疫反应性供体的PBMC被SakSTAR-myc致敏并且在有照射CD3-缺失的自体PBMC存在而没有抗原存在、有SakSTAR-myc、野生型SakSTAR(71-87)肽TAYKEFRVVELDPSAKI、五个单突变(71-87)肽(TAYAEFRWELDPSAKI，TAYKAFRWELDPSAKI，TAYKEFAWELDPSAKI，TAYKEFRVVALDPSAKI，TAYKEFRVVELAPSAKI)和四个多突变(71-87)肽(TAYKEFAWALDPSAKI，TAYKEFAWALAPSAKY，TAYQEFSWSLSPSAKI，TAYAAFAWALAPSAKI)存在下被再度刺激。将所述细胞应答反以刺激指数的形式作图。每一个点代表单个供体相对所示抗原/肽的细胞应答反应。
图6.表位-特异性T细胞克隆必需的最短序列。所述T-细胞克隆与APC一起培养并且根据T-细胞相对SakSTAR肽16-SYFEPTGPYLMVNVTGV-32(16-26和2333)，56-TKEKIEYYVEWALDATA-72(61-71)，71TAYKEFRWELDPSAKI-87(72-82，和75-85)，106ITEKGFVVPDLSEHIKN-122(110-120)，或120IKNPGFNLITKWIEKK-136(124-134)的特异性与由原始SakSTAR肽衍生的单丙氨酸取代的肽结合在一起。被分析的克隆编号标示在右栏。对于每个残基发生丙氨酸-取代的肽给出了增殖克隆的％。当所示残基变为丙氨酸时如果75％以上的表位特异性T-细胞克隆发生了增殖，那么就将框涂黑。中等灰度的框表示丙氨酸取代影响低于25％的表位-特异性T-细胞的增殖能力。浅灰色框表示只有25-50％的表位-特异性T-细胞克隆能够增殖，而白色框表示低于25％的表位-特异性T-细胞克隆发生了增殖应答。因此，框的色度愈白，由所示位点发生丙氨酸取代的肽引起的T-细胞克隆增殖的百分率愈低。总之，白色框表示所述残基对于HLA-DR结合或TCR识别来说是重要的而且所述残基将成为突变实验的目标。
通过Inno-LiPa方法(Buyse等，1993)(Innogenetics，Gent，Belgium)确定了正常健康人体是HLA-DR型的并且按照利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法的标准程序分离所述人体的外周血单核细胞(PBMC)。选出了十个健康供体，表明在美国和欧洲95％以上的是HLA-DR单元型。
为了克隆SakSTAR-特异性T-细胞克隆，来自每一供体的大约15×106PBMC被最佳浓度的SakSTAR刺激7-9天。在显微镜下收集可见T-细胞克隆，并在96孔平底板中采用作为抗原提呈细胞(APC)的自体PBMC对收集的T-细胞再度分别进行刺激。在第一天向这些孔中补加20U/ml的重组人白介素-2(IL-2)(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)并进行8-11天的培养。每8-11天在同样条件下反复进行刺激。传3至6代后，将自体PBMC换成作为抗原提呈细胞的EB病毒(EBV)-免疫的自体B-细胞系。
为了获得能够维持较长时间的自体APC，按照标准离心方法和过滤程序(Miller and Lipman，1973)从狨B95-8细胞(ATCC#CRL1612)中分离EBV。
来源于T-细胞克隆供体的浓缩PBMC用含有EBV的上清液感染2小时，然后进行稀释并以5.106PBMC/ml的密度在补充了10％FCS，10Hg/ml庆大霉素和1Ug/ml环胞菌素A的RPMI1640中进行培养。将被EBV转化的B淋巴细胞放置在培养基中并保存在液氮中。通过这些操作程序分离出100多个SakSTAR特异性T-细胞克隆(CD3’，CD4+)。
这些分析表明SakSTAR分子内存在着6个不同的免疫原性区域。下列肽(SakSTAR的残基数目和序列)被发现具有免疫原性1-SSSFDKGKYKKGDDASY-17，16-SYFEPTGPYLMVNVTGV-32，56-TKEKIEYYVEWALDATA-72，71-TAYKEFRVVELDPSAKI-87，106-ITEKGFVVPDLSEHIKN-122，和120-IKNPGFNLITKVVIEKK-136。
所采用的能量函数(Wodak等，1986)包括的常规术语有键合强度，键角弯曲度，一种扭角的周期函数，一种非键合原子对的林纳德-琼斯电势，一种10-12的氢键电势和一种带电原子的库仑函数。将电介质常数设为rij，和j原子之间的距离(Warshel和Levitt，1976)。能量参数源于CHARMM库(Brooks等，1983)。在所有显示氢原子存在的条件下，全部模拟采用了上述的能量函数，所述羧化物和咪唑基没有被质子化。
这些计算结果预测SakSTAR含有数个最适合于HLA-DR单元型的T-细胞表位。
计算出所述SakSTAR序列43HYVEFPIKPGT-53和90-TYYDKNKKKEE-100最适合HLA-DR单元型，然而，没有分离出相对于含有这些序列的肽发生增殖的T-细胞克隆。由于分离出了表位-特异性T-细胞克隆，所以其余的9个鉴定肽具有功能。
同样的计算机技术可以被用来模拟不太适合与肽-结合槽中的每一个位置结合的序列。DEE的安装启用能够计算出列举出的全部序列组合相对结合在所述槽中的9-链节肽的相互作用能。由这些结果，技术人员能够按照实施例3中记载的计算方法选出一种优选的相互作用矩阵。该矩阵包括所述肽中的每一个位置上的氨基酸与HLA-DR分子的相互作用能。该相互作用能被解释为在一个结合肽中发现一个氨基酸的可能性。
因此，结合不太牢固的残基可能会降低亲合力或者甚至会破坏所述肽与HLA分子的结合。该矩阵计算了每一个HLA-DR单元型。如果对免疫原性区域的DR限制是已知的，可以对这些表进行研究以便设计出可以替代的序列，该序列与槽的结合不太牢，但不影响所述蛋白的3-D折叠。由于不同的DR矩阵具有一个共同的模式，所以可以汇编一个通用的矩阵。如果所述的DR限制是非已知的，可以对该通用矩阵进行研究。
在位置F76，R77，V78或E80上的取代使得大多数区域(71-87)-特异性T-细胞克隆不发生增殖。通过将K74或D82突变成丙氨酸残基进行侧链的切除影响了近半数的区域(71-87)-特异性T-细胞克隆的增殖能力，而发现其中少数T-细胞克隆对Y73，E75，V79，L81或P83残基发生的丙氨酸取代敏感。
T-淋巴细胞增殖需要适当的肽提呈和T-细胞受体识别。所以，单T-细胞鉴定法不能将一个肽中的HLA-DR-结合与受体-端面残基区别开来。为了阐明这一疑点的分子基础，采用了一种起始于有效的HLA-DR1 X-射线坐标的计算机模拟方法(Brown等，1993)。延伸的免疫原性SakSTAR序列67-ALDATAYKEFRVVELDPSAKIEV-89是线性化的11-链节肽，每个肽通过单独一个残基移动，穿过HLA-DR1肽-结合槽。主链HLA-DR和所述肽的原子被固定在一起，而所有侧链利用死端消除原理(Desmet等，1992)被定位在通用的最小能量构象中。本文中的其它单元型模拟基本上产生了相同的结果。每个肽与所述槽的相互作用能被计算出来并表示在图3a中。
鉴定了两个强结合的序列AYKEFRWELD(S1；SakSTAR残基72-82)和EFRWELDPSA(S2；SakSTAR残基75-85)(Fig.3a；黑体)，将两个序列的第二个残基定位在HLA-DR袋1中。图3b中显示了结合槽中的一个典型的S2肽模型。图4c和4f分别显示了两种溶剂暴露的程度和槽中的S1肽和S2肽的每一个残基的包埋程度。大结合袋1含有一个形成包埋的芳族接触的芳族残基Y73(在S1中)或F76(在S2中)。袋4中装入了一个芳族F76(在S1中)或一个疏水残基V79(在S2中)，而疏水残基V78(在S1中)和L81(在S2中)被定位在袋6中。尽管两个残基V79(在S1中)和D82(在S2中)在袋7中包埋了它们的侧链，但对S2的相互作用能起作用的主要是由于HLA-DRβ链的残基71的静电性质，大多数的单元型中的残基71是精氨酸。L81(在S1中)对袋9的接触面积所起的相应作用不如S2肽明显并且被发现是丝氨酸。而且，这些观察结果表明当包埋的肽残基对HLA-DR结合主要起作用时，暴露的残基介导T-细胞受体识别以及与HLA-DR的结合。
图2显示了克隆Tc-1至Tc-6在受到S1肽而不是S2肽的攻击后发生了增殖。Tc-7至Tc-10识别S2肽但不识别S1肽。这些结果表明S1和S2是功能性T-细胞表位。
因此，对T-细胞增殖非常重要的(图2)以及对HLA-DR结合起作用的其它残基是定向的(图4)。在S1结合模式中发现了残基K74和E80在DR锚定和朝向TCR中的双重作用。在S2结合模式中也发现了残基R77具有所述的双重作用。而且，发现在S1和S2肽中的一个重要TCR识别位点(袋5)处，残基R77和E80分别易受溶剂的攻击。最终，确定了D82在S2结合模式中的锚定作用。
采用模板pMEX。SakSTAR-myc，通过剪接重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)(Horton等，1989)制备所述的SakSTAR-突变体，所述模板编码野生型SakSTAR序列，该序列具有附加在羧基端的三联丙氨酸，该三联丙氨酸后面接了一个myc序列(Evan等，1985)。将每一突变体的扩增产物进行纯化并连结到pMEX载体中(Schlott等，1994)。通过完整的SakSTAR-myc编码区域的序列测定证实所有构建物的结构。
所述SakSTAR-变异体被表达后，按照所记载的实验条件(Collen等，1996a)，利用superdex 75层析柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)通过大小排阻层析从转化的大肠杆菌TG1中纯化所述SakSTAR-变异体。通过SDS-PAGE测定出所述SakSTAR-变异体的纯度至少为98％。构建了下列SakSTAR突变体SakSTAR(R77A，E80A)，SakSTAR(R77A，E80A，D82A)和SakSTAR(K74Q，R77S，E80S，D82S)。所有这些突变体的特异活性是野生型SakSTAR特异活性的50％至100％。本文通过以后面带有在成熟SakSTAR序列(136个氨基酸)中的位置编号的单字母符号表示的被取代氨基酸和以单字母符号表示的取代氨基酸来识别野生型葡萄球菌激酶的变异体。
另外，SakSTAR变异体的区域69-89是直线穿过类似于图4a所示的结合槽以便分析引进新表位的可能性。重要地是任何SakSTAR-变异体没有显示新的结合基元。经检测，所有区域(71-87)-特异性T-细胞克隆在受到上述SakSTAR-突变体的攻击后都发生了增殖，而它们中的任何一个都没有表现出增殖迹象。这不属于提呈问题，因为识别不同SakSTAR表位的T-细胞克隆在受到任一区域(71-87)SakSTAR变异体的刺激后完全能够增殖。
然而，大多数人确实还能识别附加的免疫原性SakSTAR区域(在这些SakSTAR-变异体中未受影响的)，这将使得这种实验成为无效实验。因此，筛选了25个其它健康的供体用于SakSTAR免疫反应。PBMC被融解后，用1％的人血清白蛋白冲洗四次，并在潮湿的CO2培养箱中以8×106个细胞/ml的密度在添加了5％的人血清(Biowitthaker，Walkersville，马里兰州)和庆大霉素以及添加或未添加SakSTAR-myc的RPMI 1640中培养10天。收集未粘附的细胞并用无抗原、SakSTAR-myc或不同的肽再度进行刺激。为了提供抗原提呈细胞，利用CD3-M450 Dynabeads(Dynal，Compi gne，法国)按照厂商建议的操作规程使经辐射的自体PBMC成为T-细胞缺失型(FACS分析表明＞95％的非T-细胞)。将平板在37℃下于含有5％CO2的潮湿环境中培养5天，最后用BrdU脉冲标记22至24小时。
然后，收集细胞并分析它们的BrdU含量(BrdU ELISA，BoehringerMannheim，Mannheim，德国)。将从对抗原/肽应答的PBMC中得到的OD除以自发增殖(无抗原)对照的OD来计算刺激指数。大于3的值被认作阳性，表明所述特异性T一细胞相对那种特定的抗原/肽发生了增殖。
20个鉴定为SakSTAR阳性的供体中的80％被发现对SakSTAR肽(71-87)产生细胞免疫应答，从而证实了其免疫显性的特征。
来自区域(71-87)-特异性细胞应答最强的10个供体的PBMC被SakSTAR-my所致敏，然后被图5中所示的不同SakSTAR-myc或区域(71-87)-突变肽所攻击。
尽管对单丙氨酸突变肽的全部细胞应答明显低于野生型肽(P＜0.05)，但是这些肽在几个受试供体中诱导了细胞应答。在位点R77或E80上具有丙氨酸的肽阻碍了大多数供体的淋巴细胞的增殖。还发现这些残基在对区域-(71-87)-特异性T-细胞克隆进行的增殖分析中也比较重要。
然而，如果SakSTAR-myc致敏的淋巴细胞被双重(R77A，E80A)，三重(R77A，E80A，D82A)，四重(K74Q，R77S，E80S，D82S)或五重(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)突变的肽再度刺激，没有一个受试供体产生阳性的细胞免疫应答反应(P＜0.001)。这意味着人体内的区域(71-87)-特异性循环T-淋巴细胞(可能通过早期感染溶原性葡萄球菌菌株已经产生)不再能够识别任何SakSTAR变异体的突变区域71-87。因此，它们的增殖能力被减弱了并且辅助B-淋巴细胞产生抗体的能力也被减弱了。
被肽16-SYFEPTGPYLMVNVTGV-32攻击后而增殖的T-细胞克隆被分成两组，8个T-细胞克隆识别表位16-26，而10个克隆识别SakSTAR序列23-33。F18或E19位点的丙氨酸取代使得所有分离的区域(16-26)特异性T-细胞克隆不能增殖，然而如果Y17或Y24被突变为丙氨酸，大多数的T-细胞克隆不再增殖。P20或G23的侧链去除影响半数以上的该组T-细胞克隆的T细胞增殖。发现所有分离的区域(23-33)-特异性T-细胞克隆对Y24，M26或N28位点上的丙氨酸取代敏感，而T30或G31位点上的丙氨酸取代使得大多数的分离的区域(16-26)-特异性T-细胞克隆不能增殖。
在将这些数据与所计算出的残基优选矩阵结合的基础上，构建了几个SakSTAR突变体SakSTAR(P20Y，Y24A)，SakSTAR(P20Y，Y24S)，SakSTAR(E19D)，SakSTAR(Y17L)，SakSTAR(F18L)，SakSTAR(F18E)，SakSTAR(G22S)，SakSTAR(G22S，P23G)，SakSTAR(N28S)和SakSTAR(V29L，L127V)。所有这些SakSTAR-突变体对区域(16-32)特异性T-细胞克隆的免疫原性具有一个降低的趋势。
对SakSTAR肽56-TKEKIEYYVEWALDATA-72具有特异性的14个T-细胞克隆进行了分析。Y62，E65或W66位点上的丙氨酸取代导致了这些区域-特异性T-细胞克隆中的大多数丧失了增殖能力。将近半数的这些T-细胞克隆被发现对残基E61，Y63，V64，L68或D69的侧链去除敏感。在将这些数据与所计算出的残基优选矩阵结合的基础上，构建了几个SakSTAR突变体，然而所有突变体丧失了溶解血栓的活性。SakSTAR的56-72免疫原性区域是由Jespers等定义的活化表位的一部分。活化表位残基中的一个突变为其它残基类型后大都产生一个非生物活性分子(Jespers等(1999))。
还分析了对SakSTAR肽106-ITEKGFWPDLSEHIKN-122特异的9个T-细胞克隆。P114，L116，E118或H119位点上的丙氨酸取代使得大多数的区域(106-122)-特异性T-细胞克隆不能增殖。F111或D115的侧链去除影响将近半数的这些T-细胞克隆进行增殖的能力。在将这些数据与所计算出的残基优选矩阵结合的基础上，构建了几个SakSTAR突变体SakSTAR(H119A)，SakSTAR(H119S)，SakSTAR(V89L，L116Y)，SakSTAR(V89L，L116T)，SakSTAR(V112T)，SakSTAR(V112S)，SakSTAR(D115N)和SakSTAR(E118S)。所有这些SakSTAR-突变体对区域(106-122)特异性T-细胞克隆的免疫原性具有一个明显降低的趋势。尽管在位点V112上的丙氨酸改变只对11％的区域-特异性T-细胞克隆有影响，然而有趣地是，生物活性突变体SakSTAR(V112T)和SakSTAR(V112S)不能诱导任何区域(106-122)-特异性T-细胞克隆进行增殖。这是由分离的SakSTAR突变体的结构(通过测序所证实)或纯度造成的，因为其它SakSTAR-特异性T-细胞克隆的T-细胞增殖能够由这些突变体来进行诱导，相当于采用野生型SakSTAR诱导的增殖。
已经构建并且分离了下列组合突变体SakSTAR(V112T，H119A)，SakSTAR(V112T，H119S)，SakSTAR(V112T，E118S，H119S)和SakSTAR(V112T，H119S，K130Y)。这些具有溶解血栓活性的突变体丧失了它们诱导区域(106-122)-特异性T-细胞克隆增殖的能力，表明SakSTAR区域106-122的免疫原性被消除。
最后，分析了7个识别SakSTAR肽120-IKNPGFNLITKWIEKK-136的T-细胞克隆的最低序列必要条件。在G124，F125，N126或L127位点上的丙氨酸取代使得大多数的区域(120-136)-特异性T-细胞克隆不能增殖。I128，T129，K130，V131或V132的侧链去除影响了将近半数的这些克隆的增殖。在将这些数据与所计算出的残基优选矩阵结合的基础上，构建了两个具有生物活性的SakSTAR突变体。在利用几个区域(120-136)-特异性T-细胞克隆和若干个区域(71-89)-特异性T-细胞克隆进行的增殖分析中对突变体SakSTAR(R77E，E134R)进行了检测。结果发现该突变体能够协助来自两种特异性中的一些，而不是全部的T-细胞克隆进行增殖，表明两种SakSTAR区域具有一种免疫原性降低的趋势。尽管在SakSTAR120-136肽中残基K130突变为丙氨酸只对将近半数的分离的区域(120-136)-特异性T-细胞克隆起作用，但该残基是定向的。补充了残基优选矩阵的计算机模拟表明如果在表位(GFLITYVVIE)中Y取代了残基K130，那么该突变-表位与HLA-DR结合槽之间的相互作用能是如此的高，以致于不可能在槽内进行结合。因此，突变体SakSTAR(K130Y)在被构建、表达和纯化后，被发现具有类似于野生型SakSTAR的血栓溶解活性。用该SakSTAR-突变体检测区域(120136)-特异性T-细胞克隆，结果没有一个克隆发生增殖，表明所述表位不再是功能性的。因此，SakSTAR的残基K130变为Y的突变是极限突变，因为完全丧失了该再设计区域的提呈功能。
总之，这些分析结果表明一种异源蛋白的免疫源性可以通过功能性T-细胞表位的去除来降低。结果，一组免疫源性区域的去除将进一步降低所述T-细胞的反应性，因而组合突变蛋白的免疫源性被完全消除。此外，与采用数学模型进行的功能分析相结合的合理方法可以精确地去除HLA-DR锚定残基，从而影响T-细胞表位的提呈和T-细胞反应的启动。
参考文献Behnke，D.和Gerlach，D.(1987)，编码葡萄球菌激酶-一种细菌性纤溶酶原激活剂的基因再大肠杆菌、枯草杆菌和血链球菌中的克隆和表达(Cloning and expression in Escherichia coli，Bacillussubtilis，and Streptococcus sanguis of a gene forstaphylokinase--a bacterial plasminogen activator)，分子基因遗传学(Mol Gen Genet)210，528-534。Brooks，B.R.，Bruccoleri，R.，Olafson，D.，States，D.J.，Swaminathan，S.和Karplus，M.(1983)，CHARMM一种用于大分子能量、最小化和动力学计算的程序(AProgram for macromolecular energy，minimization，and dynamicscalculations)，计算机化杂志(J.Comput.Chem)4，187-217。Brown，J.H.，Jardetzky，T.S.，Gorga，J.C.，Stern，L.J.，Urban，R.G.，Strominger，J.L.和Wiley，D.C.(1993)，人II型组织相容性抗原HLA-DR1的三维结构(Three-dimensionalstructure of the human class II histocompatibility antigenHLA-DR1)，自然(Nature)364，33-39。Buyse，I.，Decorte，R.，Baens，M.，Cuppens，H.，Semana，G.，Emonds，M.P.，Marynen，P.和Cassiman，J.J.(1993)，利用聚合酶链反应和反向点印迹杂交对II型HLA抗原进行的快速DNA分类方法(Rapid DNA typing of class II HLA antigens using thepolymerase chain reaction and reverse dot blot hybridization)，组织抗原(Tissue Antigens)41，1-14。Collen，D.(1998)，葡萄球菌激酶一种有效的、独特的纤维蛋白-选择性血栓溶解剂(Staphylokinasea potent，uniquelyfibrin-selective thrombolytic agent)，自然医学(Nat Med)4，279-284。Collen，D.，Bernaerts，R.，Declerck，P.，De Cock，F.，Demarsin，E.，Jenne，S.，Laroche，Y.，Lijnen，H.R.，Silence，K.和Verstreken，M.(1996a)，免疫反应性改变的重组葡萄球菌激酶变异体I构建核定性(Recombinant staphylokinasevariants with altered immunoreactivity.IConstruction andcharacterization)，循环(Circulation)94，197206。Collen，D.，Moreau，H.，Stockx，L.和Vanderschueren，S.(1996b)，免疫反应性改变的重组葡萄球菌激酶变异体II血栓溶解特性和抗体诱导(Recombinant staphylokinase variants withaltered immunoreactivity.IIThrombolytic properties andantibody induction)，循环(Circulation)94，207-216。Collen，D.，Zhao，Z.A.，Holvoet，P.和Marynen，P.(1992)，葡萄球菌激酶的初级结构和基因结构(Primary structureand gene structure of staphylokinase)，纤维蛋白溶解(Fibrinolysis)6，226-231。De Maeyer，M.，Desmet，J.和Lasters，I.(1997)，概括一种非常详尽的旋转异构体文库提高了通过死端消除法进行的侧链模拟的精度和速度(All in onea highly detailed rotamer library improvesboth accuracy and speed in the modelling of side chains bydead-end elimination)，Fold Des 2，53-66。Delhaise，P.，Bardiaux，M.和Wodak，S.(1984).大分子相互作用的计算机动画(Interactive computer animation ofmacromolecules)，分子制图杂志(J Mol Graphics)2，103-106。Desmet，J.，De Maeyer，M.，Hazes，B.和Lasters，I.(1992)，死端消除机理及其在蛋白侧链定位中的用途(The dead-endelimination theorem and its use in protein side-chainpositioning)，自然(Nature)356，539-542。Evan，G.I.，Lewis，G.K.，Ramsay，G.和Bishop，J.M.(1985)，对人c-myc原-致癌基因产物特异的单克隆抗体的分离(Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-mycproto-oncogene product)，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)5，3610-3616。Hiemstra，H.S.，Duinkerken，G.，Benckhuijsen，W.E.，Amons，R.，de Vries，R.R.，Roep，B.O.和Drijfhout，J.W.(1997)，采用专用合成肽文库鉴定CD4+T-细胞表位(Theidentification of CD4+T-cell epitopes with dedicatedsynthetic peptide libraries)，美国国家科学院院报(Proc NatlAcad Sci U S A)94，10313-10318。Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.和Pease，L.R.(1989)，不使用限制酶的工程杂交基因利用重叠延伸进行的基因剪接(Engineering hybrid genes without the use ofrestriction enzymesgene splicing by overlap extension)，基因(Gene)77，61-68。Jespers，L.，Vanwetswinkel，S.，Li jnen，R.，Van Herzeele，N.，Van Hoef，B.，Demarsin，E.，Collen，D.和De Maeyer，M.(1999)，通过葡萄球菌激酶激活纤溶酶原的结构和功能性基础(Structural and functional basis of plasminogen activation bystaphylokinase)，血栓形成止血法(Thrombosis Hemostasis)81，479-485。Koradi，R.，Billeter，M.和Wuthrich，K.(1996)，MOLMOL用于显示和分析大分子结构的程序(MOLMOLaprogram for display andanalysis of macromolecular structures)，分子制图杂志(J MolGraphics)14，51-55。Miller，G.和Lipman，M.(1973)，通过转化的狨白细胞释放传染性EB病毒(Release of infectious Epstein-Barr virus by transformedmarmoset leukocytes)，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad SciU S A)70，190-194。Sako，T.和Tsuchida，N.(1983)，来自金黄色葡萄球菌的葡萄球菌激酶基因的核苷酸序列(Nucleotide sequence of thestaphylokinase gene from Staphylococcus aureus)，核酸研究(Nucleic Acids Res)11，7679-7693。Schlott，B.，Hartmann，M.，Guhrs，K.H.，BirchHirschfeid，E.，Pohl，H.D.，Vanderschueren，S.，Van deWerf，F.，Michoel，A.，Collen，D.和Behnke，D.(1994)，高效生产和纯化用于血栓溶解治疗的重组葡萄球菌激酶(High yieldproduction and purification of recombinant staphylokinase forthrombolytic therapy)，生物技术(纽约)(Biotechnology(NY))12，185-189。Warshel，A.和Levitt，M.(1976)，酶反应的理论研究在溶菌酶反应过程中阳碳离子的非传导性、静电性和立体化学稳定性(Theoretical studies of enzymic reactionsdielectric，electrostatic and steric stabilization of the carbonium ion inthe reaction of lysozyme)，分子生物学杂志(J Mol Biol)103，227-249。Wodak，S.J.，De Coen，J.L.，Edelstejn，S.J.，Demarne，H.和Beuzard，Y.(1986)，利用谷胱苷肽修饰人血红蛋白.III.通过计算机模拟分析的血红蛋白构象的扰动(Modification of humanhemoglobin by glutathione.III.Perturbations of hemoglobinconformation analyzed by computer modeling)，生物化学杂志(JBiol Chem)261，14717-14724。
权利要求
1.一种降低肽或蛋白的免疫原性的方法，该方法包括步骤(a)设计一系列的重叠测试肽，每种肽具有一种与需要降低免疫原性的肽或蛋白的部分氨基酸序列对应的氨基酸序列；(b)确定所述系列的哪个测试肽含有一个或多个T-细胞表位；(c)对含有一个或多个T-细胞表位的一个或多个测试肽的氨基酸序列进行改构；(d)利用改构的测试肽重复步骤b)并且选择性地重复步骤c)，直到最初含在其中的T-细胞表位被明显减少或消除；(e)按照在测试肽的氨基酸序列中进行的T-细胞消除改构方法对需要降低免疫原性的肽或蛋白的氨基酸序列进行改构以便制备一种改构的肽或蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过功能性T-细胞的分析方法对含有一个T-细胞表位的测试肽进行鉴定，在所述分析方法中利用一种测试肽刺激T-细胞克隆而引起一个或多个T-细胞克隆的增殖意味着所述测试肽含有一个T-细胞表位。
3.如权利要求1所述的方法，其中通过功能性T-细胞分析方法对含有一个T-细胞表位的测试肽进行鉴定，在所述分析方法中利用一种测试肽刺激PBMC而引起人体循环系统(PBMC)中的一个或多个T-淋巴细胞克隆的增殖意味着所述测试肽含有一个T-细胞表位。
4.如权利要求1所述的方法，其中利用计算机模拟技术测定测试肽与一个或多个HLA-DR单元型(haplotypes)的结合槽的相互作用能来对含有一个T-细胞表位的测试肽进行鉴定，其中根据测试肽适合HLA-DR结合槽的相互作用能将测试肽鉴定为含有一个T-细胞表位。
5.如权利要求1所述的方法，其中通过下列一组检测试验对含有一个T-细胞表位的测试肽进行鉴定a)一种功能性T-细胞分析方法，在该方法中T-细胞克隆被一种测试肽刺激后所发生的一个或多个T-细胞克隆的增殖意味着所述测试肽含有一个潜在的T-细胞表位，和/或b)一种功能性T-细胞分析方法，在该方法中PBMC被一种测试肽刺激后，存在于人体循环系统(PBMC)中的一个或多个T-淋巴细胞发生了增殖，该增殖意味着所述测试肽含有一个T-细胞表位；和c)利用计算机模拟技术测定所述测试肽与一个或多个HLA-DR单元型(haplotypes)的结合槽的相互作用能，其中根据测试肽适合HLA-DR结合槽的相互作用能将测试肽鉴定为含有一个潜在的T-细胞表位，其中如果在试验a)和/或b)和c)中对一种测试肽进行鉴定，则认为该测试肽含有一个T-细胞表位。
6.如权利要求1-5中任一项权利要求所述的方法，进一步包括以改构的肽或蛋白取代测试肽而进行的步骤b)至e)的一次或多次重复。
7.如权利要求1-6中任一项权利要求所述的方法，改方法包括步骤a)设计一系列的重叠测试肽，每种肽具有一种与需要降低免疫原性的肽或蛋白质的部分氨基酸序列对应的氨基酸序列；b)确定所述系列的哪个测试肽含有一个或多个T-细胞表位；c)对含有一个或多个T-细胞表位的一个或多个测试肽的氨基酸序列进行改构；d)测定改构肽激活T-细胞并诱导T-细胞克隆或存在于人体循环系统(PBMC)中的T-淋巴细胞增殖的潜力；e)按照在测试肽的氨基酸序列中进行的T-细胞消除改构方法对需要降低免疫原性的肽或蛋白质的氨基酸序列进行改构；f)在一中合适的宿主中构建并纯化所述免疫原性需要降低的改构肽或蛋白质，然后测定其生物活性；g)利用所述的改构测试肽或蛋白重复步骤c-f)直到最初含在其中的一个或多个T-细胞表位被明显减少或消除，并且测定其生物活性。
8.一种降低肽或蛋白的免疫原性的方法，该方法包括步骤a)设计一系列的重叠测试肽，每种肽具有一种与需要降低免疫原性的肽或蛋白质的部分氨基酸序列对应的氨基酸序列；b)确定所述系列的哪个测试肽含有一个或多个T-细胞表位；c)对含有一个或多个T-细胞表位的一个或多个测试肽的氨基酸序列进行改构；d)测定改构肽激活T-细胞并诱导T-细胞克隆或存在于人体循环系统(PBMC)中的T-淋巴细胞增殖的潜力；e)按照在测试肽的氨基酸序列中进行的T-细胞消除改构方法对需要降低免疫原性的肽或蛋白质的氨基酸序列进行改构；f)在一种合适的宿主中构建并纯化所述免疫原性需要降低的改构肽或蛋白质，然后测定其生物活性；g)利用所述的改构测试肽或蛋白重复步骤c-f)直到最初含在其中的一个或多个T-细胞表位被明显减少或消除，并且测定其生物活性。
9.如权利要求7获8所述的方法，其中确定所述系列的哪个测试肽含有一个或多个T-细胞表位的步骤按照权利要求2、3、或4中的记载内容进行。
10.如权利要求1-9中任一项权利要求所述的方法，其中通过最低残基/区域诱变消除T-细胞表位。
11.如权利要求1-10中任一项权利要求所述的方法，其中通过在确定的T-细胞表位中缺失或插入残基来消除T-细胞表位。
12.如权利要求1-11中任一项权利要求所述的方法，其中通过用人的序列或人的同源序列进行取代来消除T-细胞表位。
13.如权利要求1-12中任一项权利要求所述的方法，其中通过增强确定的T-细胞表位对蛋白水解内切酶的敏感性来消除T-细胞表位。
14.如权利要求1-13中任一项权利要求所述的方法，进一步包括鉴定和去除所述肽或蛋白的HLA-DR锚定残基以便降低其免疫原性。
15.如权利要求1-14中任一项权利要求所述的方法，其中在对所述蛋白或肽的氨基酸序列进行改构后检测低免疫原性的蛋白或肽的生物活性。
16.一种生产免疫原性低于野生型肽或蛋白的肽或蛋白的方法，包括下列步骤a)提供一种编码所述肽或蛋白的至少提供其生物活性的氨基酸序列的DNA序列；b)通过下列方法鉴定含在野生型肽或蛋白的氨基酸序列中的一个或多个T-细胞表位1)设计一系列的重叠测试肽，每种测试肽具有一个与所述肽或蛋白的部分氨基酸序列相对应的氨基酸序列；2)鉴定所述系列的哪些测试肽含有一个或多个T-细胞表位；3)改构一个或多个含有一个或多个T-细胞表位的测试肽的氨基酸序列；4)用改构的测试肽重复步骤2)并任选地重复步骤3)直到最初含在其中的一个或多个T-细胞表位被明显地减少或消除；c)改构DNA序列以便将修饰引进由其编码的氨基酸序列中的T-细胞表位；d)将DNA序列引进一种宿主生物体中；e)在能够表达所述改构的肽或蛋白的条件下培养所述宿主生物体；和f)从宿主生物体中分离低免疫原性的肽或蛋白。
17.一种生产免疫原性低于野生型肽或蛋白的肽或蛋白的方法，包括下列步骤a)提供一种编码所述肽或蛋白的至少提供其生物活性的氨基酸序列的DNA序列；b)通过下列方法鉴定和改构含在野生型肽或蛋白的氨基酸序列中的一个或多个T-细胞表位1)鉴定所述系列的哪些测试肽含有一个或多个T-细胞表位；2)改构一个或多个含有一个或多个T-细胞表位的测试肽的氨基酸序列；3)测定改构肽激活T-细胞并诱导T-细胞克隆或存在于人体循环系统(PBMC)中的T-淋巴细胞增殖的潜力；4)按照在测试肽的氨基酸序列中进行的T-细胞消除改构方法对需要降低免疫原性的肽或蛋白质的氨基酸序列进行改构；5)在一种合适的宿主中构建并纯化所述免疫原性需要降低的改构肽或蛋白质，然后测定其生物活性；6)用改构的测试肽或蛋白重复步骤2-5)直到最初含在其中的一个或多个T-细胞表位被明显地减少或消除，然后测定其生物活性；c)改构DNA序列以便将修饰引进由其编码的氨基酸序列中的T-细胞表位；d)将DNA序列引进一种宿主生物体中；e)在能够表达所述改构的肽或蛋白的条件下培养所述宿主生物体；和f)从宿主生物体中分离低免疫原性的肽或蛋白。
18.如权利要求16或17中所定义的编码所述改构DNA序列的DNA构建体。
19.宿主生物体，含有如权利要求18所述的DNA构建体。
20.改构肽或蛋白，其基于T-细胞的免疫原性低于野生型肽或蛋白而且其与野生型肽或蛋白至少具有一个氨基酸取代、缺失或插入的区别，所述氨基酸取代、缺失或插入导致所述肽或蛋白至少消除了一个表位但不丧失生物活性。
21.如权利要求20所述的改构肽或蛋白，其由权利要求1-17中任一项权利要求所述的方法得到。
22.如权利要求20或21所述的用于治疗、诊断或预防的改构肽或蛋白。
23.如权利要求20或21所述的改构肽或蛋白用于制备一种用于人体治疗、诊断或预防的药物组合物的用途。
24.含有一种如权利要求20或21所述的改构肽或蛋白以及一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
25.如权利要求20或21所述的改构肽或蛋白，所述蛋白是葡萄球菌激酶。
26.葡萄球菌激酶变异体，所述变异体中的下列免疫原性区域中的一个或多个被改构从而使得含在其中的T-细胞表位被去除的1-SSSFDKGKYKKGDDASY-17，16-SYFEPTGPYLMVNVTGV-32，56-TKEKIEYYVEWALDATA-72，71-TAYKEFRVVELDPSAKI-87，106-ITEKGFVVPDLSEHIKN-122，和120-IKNPGFNLITKVVIEKK-136。
27.如权利要求26所述的葡萄球菌激酶变异体，其T-细胞反应性低于野生型葡萄球菌激酶，但保留了其生物活性，该变异体的氨基酸序列如图1所示，该氨基酸序列具有在下列免疫原性区域中的一个或多个下述氨基酸取代a)在含有第16-32位SakSTAR残基的免疫原性区域中的取代是Y17L；F18L；F18E；E19D；P20Y，Y24A；P20Y，Y24S；G22S；G22P，P23G；N28S；b)在含有第71-82位SakSTAR残基的免疫原性区域中的取代是F76W，V79Y，D82A；R77A，E80A；R77S，E80S；R77A，E80A，D82A；K74Q，R77S，E80S；K74Q，R77S，E80S，D82G；K74Q，R77S，E80S，D82A；K74Q，R77S，E80A，D82A；K74Q，R77A，E80S，D82A；K74Q，R77S，E80S，D82S；V79Y，D82A；c)在含有第106-122位SakSTAR残基的免疫原性区域中的取代是V112T；V112S；D115N；E118S；H119A；H119S；V89L，L116Y；V89L，L116T；V112T，H119S；V112T，H119A；V112T，E118S，H119S；d)在含有第120-136位SakSTAR残基的免疫原性区域中的取代是K130Y。
28.如权利要求27所述的葡萄球菌激酶变异体，其具有在权利要求27中列出的一个或多个突变。
29.如权利要求28所述的葡萄球菌激酶变异体，其具有一种下列组合突变V112T，H119S，K130Y；R77E，E134R；V29L，L127V；K74Q，R77E，E80S，D82S，E134R；R77S，E80S，V112T，H119S；R77S，E80S，V112T，H119S，K130Y；R77A，E80A，V112T，H119S；R77A，E80A，V112T，H119S，K130Y；K74Q，R77S，E80S，V112T，H119S；K74Q，R77S，E80S，V112T，H119S，K130Y；K74Q，R77S，E80S，D82S，V112T，H119S；K74Q，R77S，E80S，D82S，V112T，H119S，K130Y。
30.选自下列组中的葡萄球菌激酶变异体SakSTAR(P20Y，Y24A)，SakSTAR(P20Y，Y24S)，SakSTAR(E19D)，SakSTAR(Y17L)，SakSTAR(F18L)，SakSTAR(F18E)，SakSTAR(G22S)，SakSTAR(G22S，P23G)，SakSTAR(N28S)，and SakSTAR(V29L，L127V)，SakSTAR(R77E，E134R)，SakSTAR(K74Q，R77E，E80S，D82S，E134R)，SakSTAR(K74Q，R77E，E80S，D82S，V112T，H119S，E134R)，SakSTAR(K74Q，R77E，E80S，D82S，V112T，H119S，E134R，K130Y)；SakSTAR(R77S，E80S，V112T，H119S)，sakSTAR(R77S，E80S，V112T，H119S，K130Y)，SakSTAR(R77A，E80A，V112T，H119S)，SakSTAR(R77A，E80A，V112T，H119S，K130Y)，sakSTAR(K74Q，R77S，E80S，V112T，H119S)，SakSTAR(K74Q，R77S，E80S，V112T，H119S，K130Y)，sakSTAR(K74Q，R77S，E80S，D82S，V112T，H119S)，SakSTAR(K74Q，R77S，E80S，D82S，V112T，H119S，K130Y)，SakSTAR(V112T，H119A)，SakSTAR(V112T，H119S)，SakSTAR(V112T，E118S，H119S)，SakSTAR(V112T，H119S，K130Y)，SakSTAR(V112T)，SakSTAR(V112S)，SakSTAR(H119A)，SakSTAR(H119S)，SakSTAR(V89L，L116Y)，SakSTAR(V89L，L116T)，SakSTAR(V112T)，SakSTAR(V112S)，SakSTAR(D115N)，SakSTAR(E118S)，SakSTAR(K130Y)。
31.如权利要求25-30中任一项权利要求所述的用于治疗、诊断或预防的葡萄球菌激酶变异体。
32.如权利要求25-30中任一项权利要求所述的葡萄球菌激酶变异体用于制备一种用于人体治疗、诊断或预防的药物组合物的用途。
33.含有一种如权利要求25-30中任一项权利要求所述的葡萄球菌激酶变异体以及一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
全文摘要
本发明提供了一种降低肽或蛋白的免疫原性的方法，该方法包括以下步骤设计一系列的重叠测试肽，每种肽具有一种与需要降低免疫原性的肽或蛋白的部分氨基酸序列对应的氨基酸序列；确定所述系列的哪个测试肽含有一个或多个T－细胞表位；对含有一个或多个T－细胞表位的一个或多个测试肽的氨基酸序列进行改构；利用改构的测试肽重复某些步骤，直到最初含在其中的一个或多个T－细胞表位被明显减少或消除；按照在测试肽的氨基酸序列中进行的T－细胞消除改构方法对需要降低免疫原性的肽或蛋白的氨基酸序列进行改构以便制备一种改构的肽或蛋白。本发明还涉及如此获得的改构和蛋白。
文档编号A61K39/00GK1414972SQ00817963
公开日2003年4月30日 申请日期2000年12月1日 优先权日1999年12月2日
发明者P·A·M·沃莫丹姆, S·D·N·G·H·普莱森斯, D·J·科兰, M·C·H·德梅尔 申请人:思罗姆-X股份有限公司