专利名称：细胞因子基因修饰的抗原提呈细胞/肿瘤细胞偶联物、其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤医学领域。更具体地，本发明涉及抗原提呈细胞/肿瘤细胞偶联物、其制法和用途。本发明还涉及含有该偶联物的药物组合物和疫苗组合物。
背景基于接种免疫在抗感染性疾病方面所取得的巨大成功，使用肿瘤细胞作为免疫原来诱导抗肿瘤的免疫力已成为与各种人类癌症作斗争的诱人策略。然而，肿瘤细胞本身是很差的免疫原。其可能的原因包括对MHC分子的下调作用，缺乏共刺激分子，以及不能稳定地加工抗原并将抗原呈递在细胞表面。已经有多种尝试用MHC分子、共刺激分子、或特定细胞因子的cDNA来转化肿瘤细胞，以便增加肿瘤细胞的免疫原性并促进免疫应答(Pardoll，D.M.Therapeutic vaccination for cancer.Clin.Immunol.，95S44-62，2000.)。已表明，肿瘤细胞与抗原提呈细胞(APC)的融合体可诱导较强的抗肿瘤免疫力(Walden，P.Hybrid cell vaccination for cancer immunotherapy.Adv.Exp.Med.Biol.，465347-354，2000.)。尽管许多这类策略在动物模型中获得了有前景的结果，但是对人的临床试验结果总体上是令人失望的。
树突状细胞(DC)是一种独特的、高潜能的抗原提呈细胞，它能够使原初的CD4+T细胞和CD8+T细胞致敏化。随着体外分离和大规模繁殖DC成为可能，已有大量的研究努力将DC用于各种免疫治疗策略(Fong，L.，and Engleman，E.G.Dendritic cells in cancer immunotherapy.Annu.Rev.Immunol.，18245-273，2000.)。用肿瘤抗原或抗原衍生的多肽冲击致敏的DC进行免疫，可产生肿瘤特异性的免疫应答和抗肿瘤效果(Flamand，V.，Sornasse，T.，Thielemans，K.，Demanet，C.，Bakkus，M.，Bazin，H.，Tielemans，F.，Leo，O.，Urbain，J.，and Moser，M.Murinedendritic cells pulsed in vitro with tumor antigen induce tumor resistance in vivo.Eur.J.Immunol.，24605-610，1994.；Celluzzi，C.M.，Mayordomo，J.I.，Storkus，W.J.，Lotze，M.T.，and Falo，L.D.Jr.Peptide-pulsed dendritic cells induce antigen-specificCTL-mediated protective tumor immunity.J.Exp.Med.，183283-287.1996.)。因为已被鉴别并为细胞毒T淋巴细胞(CTL)所识别的肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的数目很有限，因此可以将衍生自肿瘤的蛋白提取物或RNA用作抗原的来源(Fields，R.C.，Shimizu，K.，and Mule，J.J.Murine dendritic cells pulsed with wholetumor lysates mediate potent antitumor immune responses in vitro and in vivo.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，959482-9487，1998.；Boczkowski，D.，Nair，S.K.，Nam，J.H.，Lyerly，H.K.，and Gilboa，E.Induction of tumor immunity and cytotoxic Tlymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplifiedfrom tumor cells.Cancer Res.，601028-1034，2000.)。这类策略的一个额外潜在优点是可能可以诱导针对多个肿瘤表位的免疫应答。然而，在这些情况下抗原的提呈途径以及引发CD4+和CD8+T细胞的有效性仍不清楚。
白介素18(IL-18)最初被鉴别为一种细胞因子，它可协助在内毒素诱导下的干扰素-γ的产生。IL-18是在对微生物剂作出应答过程中产生IFN-γ所必需的因子，并且IL-18可与IL-12一起作用，以促进产生IFN-γ的Th1细胞的生成。在IL-18缺陷型小鼠中，在产生Th1应答方面是有缺陷的。这些结果表明，IL-18在体内诱导Th1细胞方面起着重要作用。与Th1细胞在抗肿瘤免疫中被涉及的观点相一致，施用IL-18(同时施用或不施用IL-12)具有显著的抗肿瘤效应(Micallef，M.J.，Yoshida，K.，Kawai，S.，Hanaya，T.，Kohno，K.，Arai，S.，Tanimoto，T.，Torigoe，K.，Fujii，M.，Ikeda，M.，andKurimoto，M.In vivo antitumor effects of murine interferon-gamma-inducingfactor/interleukin-18 in mice bearing syngeneic Meth A sarcoma malignant ascites.CancerImmunol.Immunother.，43361-367，1997.；Osaki，T.，Peron，J.M.，Cai，Q.，Okamura，H.，Robbins，P.D.，Kurimoto，M.，Lotze，M.T.，and Tahara，H.IFN-gamma-inducing factor/IL-18 administration mediates IFN-gamma-and IL-12-independent antitumor effects.J.Immunol.，1601742-1749，1998.)。然而，施用IL-18时会伴有脓毒性休克样的严重毒性，这妨碍了IL-18的应用(Nakamura，S.，Otani，T.，Ijiri，Y.，Motoda，R.，Kurimoto，M.，and Orita，K.IFN-gamma-dependent and-independent mechanisms in adverse effectscaused by concomitant administration of IL-18 and IL-12.J.Immunol.，1643330-3336，2000.)。而且，有趣的是，已发现用表达IL-18(并同时表达或不表达IL-12)的肿瘤细胞进行接种免疫，可比用未转化的肿瘤细胞进行接种免疫产生更强的抗肿瘤效果(Coughlin，C.M.，Salhany，K.E.，Wysocka，M.，Aruga，E.，Kurzawa，H.，Chang，A.E.，Hunter，C.A.，Fox，J.C.，Trinchieri，G.，and Lee，W.M.F.Interleukin-12 and interleukin-18synergistically induce murine tumor regression which involves inhibition of angiogenesis.J.Clin.Invest.，1011441-1452，1998.)。这表明，表达IL-12和IL-18的疫苗可用于诱导抗肿瘤的免疫力。
因此，本领域长期以来一直需要开发有效的、特异的、并且副作用小或没有副作用的肿瘤疫苗。
发明概述在本发明的第一方面，提供了一种抗原提呈细胞/肿瘤细胞的偶联物，所述的抗原提呈细胞是被选自下组的细胞因子基因所转化白细胞介素IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18，干扰素IFNα，IFNβ，IFNγ，肿瘤坏死因子TNF，转化生长因子TGF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF；和它们的组合。
在本发明的第二方面，提供了一种制备抗原提呈细胞和肿瘤细胞的偶联物的方法，包括步骤(1)提供抗原提呈细胞和肿瘤细胞，其中所述的抗原提呈细胞被选自下组的细胞因子基因所转化白细胞介素IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18，干扰素IFNα，IFNβ，IFNγ，肿瘤坏死因子TNF，转化生长因子TGF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF；和它们的组合；(2)将所述的抗原提呈细胞和肿瘤细胞，以比例为100∶1-0.1∶1，在30-38℃下结合1-100小时，从而形成所述的偶联物。
较佳地，所述方法还包括步骤(3)对形成的偶联物进行射线照射，照射的剂量为1000-100,000Rad；或者对形成的偶联物进行化学灭活(例如用丝裂霉素)。
在本发明第三方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明上述的偶联物和药学上可接受的载体或赋形剂或佐剂。在一实施例中，所述的药物组合物是肿瘤疫苗。
在本发明的第四方面，提供了一种本发明上述抗原提呈细胞/肿瘤细胞的偶联物的用途，它被用于制造治疗肿瘤的药物或预防肿瘤的疫苗。
图1.H-2Kb/OVA257-264四聚体(tetramer)的特异性。用H-2Kb/OVA257-264四聚体分别染色OVA257-264特异性CTL杂交瘤RF33.70和TRP2180-188特异性CTL克隆。A，没有染色的对照；B，TRP2 CTL用H-2Kb/OVA257-264四聚体染色的TRP2 CTL克隆；C，用H-2Kb/OVA257-264四聚体染色的RF33.70克隆。
图2.DC与E.G7细胞之间的细胞缔合。PKH26标记的E.G7细胞与DC细胞以1∶6比例孵育6小时(上图)和24小时(下图)，然后用FITC偶联的IabMcAb进行流式细胞计数.A，D，用PKH26标记的E.G7细胞；B，E，用FITC偶联的IabMcAb标记的DC；C，孵育6小时后的DC-E.G7偶联物；F，孵育24小时后的DC-E.G7偶联物。
图3.用DC-E.G7疫苗免疫接种产生的抗肿瘤保护。
A，在用E.G7细胞侵袭前14和7天，用辐射过的DC-E.G7疫苗、DC或E.G7(单用)、肽冲击致敏的DC免疫接种的一组小鼠(n＝10)。
B，在免疫接种前或用肿瘤攻击前的4和1天，将含0.1mg单克隆抗体的抗CD4、抗CD8腹水腹腔内注射入每只小鼠。另外3次单克隆抗体注射以3天间隔进行。
C，用DC-E.G7疫苗或对照疫苗免疫的IFN-γ-R-/-或IL-4-/-小鼠中的抗肿瘤保护作用。
图4.用DC-E.G7疫苗免疫小鼠后，诱导产生肿瘤特异性CD8+T细胞。
A-F，在用下列物质处理的小鼠中四聚体+CD8+T细胞出现情况PBS(A)，TRP2180-188冲击致敏的DC(B)，OVA257-264冲击致敏的DC(C)，或DC-E.G7疫苗(野生型C57BL/6小鼠)(D)，DC-E.G7疫苗免疫IFN-γ-R-/-小鼠(E)和DC-E.G7疫苗免疫IL-4-/-小鼠(F)。淋巴细胞用PE偶联的H-2Kb/OVA 257-264四聚体和FITC偶联的CD8a McAb染色。G，在不同治疗后衍生自小鼠的淋巴细胞的肿瘤特异性CTL细胞毒性。细胞毒用标准的4-h51Cr释放测试法，以E.G7细胞为靶目标进行测定。
图5.用IL-18基因修饰的DC-E.G7细胞疫苗进行免疫治疗后小鼠的肿瘤重量。
A，用IL18DC-E.G7疫苗、DC-E.G7修饰的Lac Z基因疫苗、DC-E.G7疫苗、OVA257-264冲击致敏的DC、IL-18基因修饰的DC、DC(单用)或PBS处理的患肿瘤小鼠(每组n＝10)。
B，在接种肿瘤前的4和1天，将含0.1mgMcAb的抗CD4、抗CD8或抗NK腹水腹腔内注射入每只小鼠。另外3次McAb注射在肿瘤接种后的2、5、8天进行。
C.在接种DC-E.G7疫苗或对照治疗中野生型、IFN-γ-R-/-或IL-4-/-小鼠中的肿瘤重量。
图6.用IL18DC-E.G7疫苗免疫治疗已有肿瘤后，诱导产生肿瘤特异性CD8+T细胞。
A-F，在用下列物质处理的小鼠中四聚体+CD8+T细胞出现情况PBS(A)，OVA257-264冲击致敏的DC(B)，或DC-E.G7疫苗(C)或IL18DC-E.G7(D)，免疫野生型小鼠；IL18DC-E.G7疫苗免疫IFN-γ-R-/-小鼠(E)和IL18DC-E.G7疫苗免疫IL-4-/-小鼠(F)。淋巴细胞用PE偶联的H-2Kb/OVA 257-264四聚体和FITC偶联的CD8a McAb染色。G，在不同治疗后衍生自小鼠的淋巴细胞的肿瘤特异性CTL细胞毒性。细胞毒用标准的4-h51Cr释放测试法，以E.G7细胞为靶目标进行测定。
图7.用IL18DC-E.G7疫苗、DC-E.7疫苗、OVA257-264冲击致敏DC、或PBS处理患肿瘤小鼠后，或者在用IL18DC-E.G7疫苗处理CD4+T细胞除尽的野生型小鼠、IFN-γ-R-/-小鼠和IL-4-/-小鼠后，由脾淋巴细胞产生的细胞因子。A，IL-2的产量。B，IFN-γ的产量。C，IL-4的产量。D，IL-10的产量。用辐射过的E.G7细胞刺激后淋巴细胞上清液中的细胞因子含量，用ELISA测定。
图8.用IL18DC-E.G7疫苗、DC-E.7疫苗、OVA257-264冲击致敏的DC、或PBS处理患肿瘤小鼠后，或者在用IL18DC-E.G7疫苗处理CD4+T细胞-除尽的野生型小鼠、IFN-γ-R-/-小鼠和IL-4-/-小鼠后，对CD4+T细胞依赖型非特异的抗肿瘤免疫力的激活作用。A，用标准的4小时51Cr释放试验测定的NK活性，其中以YAC-1细胞为靶目标。B，C，在存在或不存在合成酶抑制剂L-NAME时，脾巨噬细胞的细胞毒性(B)和氮氧化物释放量(C)。巨噬细胞的细胞毒性是以L1210细胞为靶细胞进行测定，而NO含量用Gress氏试剂进行测定。
发明详述如本文所用，“抗原提呈细胞/肿瘤细胞偶联物”指由抗原提呈细胞和肿瘤细胞通过接触而形成的结合体。该术语既包括一个APC与一个或多个肿瘤细胞所形成的偶联物，也包括一个肿瘤细胞与一个或多个APC形成的偶联物。事实上，该术语还包括抗原提呈细胞/肿瘤细胞的混合物，只要混合物中至少5％，较佳地至少20％，更佳地至少50％，最佳地至少75％的APC细胞以偶联物形式存在，或者曾经与肿瘤细胞形成过偶联物。在本发明中，在形成偶联物的过程中，可以不加入任何促进偶联的物质。
可用于本发明的抗原提呈细胞没有特别限制，合适的抗原提呈细胞的包括(但并不限于)选自下组的细胞树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、内皮细胞、朗氏细胞、和它们的组合。
可用于本发明的肿瘤细胞没有特别限制，合适的肿瘤细胞包括从肿瘤组织中分离的新鲜的肿瘤细胞，和体外传代的肿瘤细胞株。较佳地，所述的肿瘤细胞选自(但并不限于)黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、白血病细胞。
在本发明的偶联物中，所述抗原提呈细胞和肿瘤细胞的比例(摩尔比)宜为100∶1-0.1∶1，较佳地为10∶1-1∶1。
用于修饰APC的细胞因子没有特别限制。代表性的细胞因子包括(但并不限于)白细胞介素IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18，干扰素IFNα，IFNβ，IFNγ，肿瘤坏死因子TNF，转化生长因子TGF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF；和它们的组合。较佳地，细胞因子选自白细胞介素IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18、干扰素IFNα，IFNβ，IFNγ，肿瘤坏死因子TNF或其组合。更佳地，细胞因子选自IL-12、IL-18、IFNα，IFNβ，IFNγ或其组合。
细胞因子的基因可以应用本领域各种常规方法引入APC细胞。例如用腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒作为载体；也可以用非病毒载体例如质粒DNA、脂质体等进行转化。
在获得了细胞因子修饰的APC细胞和肿瘤细胞后，可以通过将两者在合适温度下孵育而形成偶联物。在一实施例中，所述的偶联物是通过抗原提呈细胞和肿瘤细胞在30-38℃，较佳地35-37℃下，结合1-100小时(较佳地2-50小时)而形成的。
对于抗原提呈细胞和肿瘤细胞结合所形成的瘤苗，通常需要经过灭活措施再应用于人体。当然，在某些情况下，也可以不经过灭活措施。本领域常用的灭活肿瘤细胞的方法都可用于本发明。合适的灭活方法包括化学灭活(例如用丝裂霉素处理)和辐照处理。较佳地的灭活方法是辐照，照射剂量通常为1000-100,000Rad，较佳地为10,000-50,000Rad。
本发明偶联物的治疗效果和诱导抗原特异性杀伤性T细胞的能力可以用四聚体来检测。四聚体是由肿瘤特异性抗原多肽、携带生物素的主要组织相容性复合体-I(MHC-I)、微球蛋白和亲和素(avidin)所组成的。
本发明的抗原提呈细胞/肿瘤细胞的偶联物可用于制造治疗肿瘤的药物或预防肿瘤的疫苗。
药物组合物药物组合物包含(含有)治疗有效量的本发明的偶联物和药学上可接受的载体或赋形剂或佐剂。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是无用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
为了本发明的目的，偶联物的有效剂量为给予个体约105-108个APC细胞，较佳地106-107个APC/每次。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可能是代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体都是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中的、液体载体的固体形式。
一种具体的药物组合物是瘤苗。本发明的瘤苗作为一种新型的瘤苗，能够诱导显著的CD4+T细胞和CD8+T细胞依赖性的抗肿瘤免疫作用。该瘤苗免疫可以显著地诱导出抗原特异性CD8+T细胞。内源性Th1型细胞因子、IFN-γ和Th2型细胞因子以及IL-4在粘附瘤苗诱导抗肿瘤免疫中都具有重要作用。
本发明的瘤苗不仅可以用于各种肿瘤的治疗，还可以用于预防肿瘤的复发和转移。
在施用本发明的瘤苗时，可以单独施用，也可以和放疗、化疗、手术、或其他生物治疗方法配合使用，以取得最佳的治疗或预防肿瘤的效果。
输药方法一旦配成本发明的组合物，可将其直接施用于对象。治疗对象可以是动物，尤其可以用于治疗人。
直接施用该组合物通常可通过皮下、腹腔内、静脉内或肌内注射或输送至组织间隙来实现。组合物也可被直接输送至病灶区。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
在本发明的一个实施例中，制备了一种新的基于DC的疫苗，即DC和被OVAcDNA转化的EL4细胞(E.G7)的稳定偶联物。用DC-E.G7偶联物进行免疫，形成了可产生Th1细胞因子的细胞、抗原特异性CD8+T细胞和依赖于CD4+T细胞和CD8+T细胞的强抗肿瘤免疫力。为了进一步提高疫苗的效力，用IL-18转染的DC来制备IL18DC-E.G7偶联物。用这种偶联物进行免疫，进一步显著增高了Th1细胞因子和抗原特异性CD8+T细胞的产生数目，并且有强抗肿瘤免疫力。
本发明抗原提呈细胞/肿瘤细胞偶联物的优点在于(1)特异性强。诱导的抗肿瘤免疫只针对存在的肿瘤细胞，并产生特异性的抗肿瘤作用。
(2)副作用小。抗肿瘤作用只针对肿瘤，因此副作用小。
(3)抗肿瘤作用强。抗肿瘤效果优于不用基因修饰的偶联物、单用多肽致敏的DC、或目前其他的以DC为基础的瘤苗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例材料动物和细胞系将由中外合资SIPPR-BK实验动物公司提供的，6-8周龄的雄性或雌性野生型C57BL/6(C57BL/6，H-2b)小鼠、IL-4基因剔除小鼠(IL-4-/-)(CL57BL/6)、干扰素γ受体基因剔除小鼠(IFN-γ-R-/-)(CL57BL/6)在所有实验中安放在空调房内。将用具有编码鸡卵OVA的cDNA基因的EL4细胞(Dr.Gilboa E，Duke University提供)转染产生的MHC-II阴性的H-2bT胸腺瘤E.G7、NK敏感的YAC-1细胞和293，一种衍生自人胚肾的连续细胞系、L1210人淋巴瘤细胞维持在补充了青霉素100U/ml，链霉素100微克/ml、2-巯基乙醇50mM和10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养液中。FCS和所有培养基购自Gibco-BRL，USA。
实施例1 四聚体(tetramer)的制备将编码14个氨基酸的特异性生物素化位点(Schatz PJ.Use of peptidelibraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzymea 13residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli.Biotechnology(NY)1993；111138-1143；Altman JD，Moss PAH，Goulder PJR，Barouch DH，McHeyzer-Williams MG，Bell JI，McMichael AJ，Davis MM.Phenotypic analysisof antigen-specific T lymphocytes.Science 1996；27494-96.)的DNA与H-2Kb重链的非跨膜区(残基1-280)的COOH末端用上游引物5′CTAGCT AGCGGCCCA CAC TCG CTG AGG 3′和下游引物5′CGCGGA TCCTTA ACG ATG ATTCCA CAC CAT TTT CTG TGC ATC CAG AAT ATG ATG CAG GGA TCC AGTGGA TGG AGG AGG CTC 3′融合。将Dr.Shields MJ，NCI，NIH赠与的H-2Kb表达质粒pLKb1.1作为模板，用PCR珠(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NI，USA)进行35轮94℃1分钟，56℃1分钟和最后72℃15分钟。用NheI/Bam HI限制性酶(New England Biolabs)切割扩增的PCR产物，凝胶纯化，并连接入用NheI/Bam HI消化的pET21d载体(Novagen，Inc.，Madison，WI)。将融合的蛋白质表达载体和携带人β 2-微球蛋白(Dr.Shields MJ，NCI，NIH1998年提供)的pET3a转染入作为表达宿主的大肠杆菌BL21(DE3)。
37℃培育用融合的H-2Kb-或β2-微球蛋白表达质粒转化的细胞，并通过加入0.1mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，产生蛋白质。将收集的细胞重悬浮在含有2mM EDTA的200mM Tris-HCl，pH8.0的溶液中，22℃培育20分钟，然后超声裂解细胞沉淀。洗涤包含体4次，溶于含有0.3M DTT、100mM Tris-HCl，pH8.0和蛋白酶抑制剂的混合物的6M胍盐酸中。通过稀释，使H-2Kb/肽复合物重新折叠。从Macromolecular Resource Facility，ColoradoUniversity，USA获得了对应OVA残基257-264(SIINFEKL)或TRP2残基180-188(SVYDFFVWL)的肽(Celluzzi CM，Mayordomo JI，Storkus WJ，Lotze MT，Falo LD Jr.Peptide-pulsed dendritic cells induce antigen-specific CTL-mediatedprotective tumor immunity.J Exp Med 1996；183283-287；Bloom MB，Perry-LalleyD，Robbins PF，Li Y，el-Gamil M，Rosenberg SA，Yang JC.Identification oftyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.JExp Med 1997；185453-459)。用固相技术，使用游离氨基和羧基末端合成了这些肽，并用反相HPLC纯化，用分析级HPLC测定，纯度＞95％，溶于DMSO的这些肽在10℃的0.4M精氨酸、5mM氧化谷胱甘肽、100mM Tris、2mM EDTA中72小时后H-2Kb重链和β2-微球蛋白重新折叠在一起。在sephacryl S-200柱(Pharmacia，Sweden)上，在20mM Tris-HCl，pH8.0中凝胶过滤重新折叠的H-2Kb/肽/β2-微球蛋白复合物。
25℃下，在生物素存在下，含有1μM Bir A酶，150mM NaCl、5mM三磷酸腺苷、5mM MgCl2(AVIDITY，Boulder，CO，USA)的10mM Tris-HCl，pH7.5的溶液中对纯化的复合物进行生物素化2小时。用凝胶过滤进一步纯化该生物素化的复合物，通过以摩尔比4∶1混合H-2Kb和PE偶联的链霉亲和素(Biosource，Camarillo CA)制备了H-2Kb四聚体。然后将四聚体以浓度为1mg/ml储藏在4℃的PBS(pH7.4)中，溶于含有0.1叠氮化钠、1微克/毫升胃酶抑素、1微克/ml亮抑酶肽和1微克/ml抑蛋白酶肽的混合物中。
实施例2 重组腺病毒制备通过同源重组法，从人腺病毒血清型5构建编码β-半乳糖苷酶的复制缺陷型腺病毒AdlacZ和编码人腺病毒血清型5的AdIL18。这些基因的表达由CAG启动子(Kanai F，Lan KH，Shiratori Y，Tanaka T，Ohashi M，Okudaira T，Yoshida Y，Wakimoto H，Hamada H，Nakabayashi H，Tamaoki T，Omata M.Invivo gene therapy for alpha fetoprotein producing hepatocellular carcinoma byadenovirus mediated transfer of cytosine deaminase gene.Cancer Res 1997；57461-465)驱动。在293细胞中增殖这些腺病毒，用标准噬斑形成单位(PFU)试验测定腺病毒滴度。
实施例3 骨髓衍生DC的制备按以前Fields RC等(1998)所述的方法，并稍作修改，从骨髓制备了DC。简单说，将除去了红细胞的骨髓细胞重新悬浮在补充了重组小鼠GM-CSF(20ng/ml，Genzyme Corp.，Cambridge，MA)和IL-4(20ng/ml，纯度＞95％)的RPMI-1640培养液中。三天后，将粘着细胞重新置于新的补充了GM-CSF和IL-4的培养液中。另外3-4天后，收集松散粘着的细胞作为DC。用流动血细胞计数(数据未显示)分析时，这些DC表达CD80、CD86、CD40和Iab。
实施例4 用多肽OVA257-264冲击致敏DC为了用多肽冲击致敏DC，将DC以3×106细胞/ml重悬浮在还原的血清培养基中，在10微克/ml人β2-微球蛋白(Sigma Chmical Co.St.Louis，USA)存在下，用10微克/ml的多肽37℃冲击致敏标记3小时，每隔30分钟温和混合。然后洗涤细胞两次，以106细胞/ml重悬浮在PBS中(Specht JM，Wang G，Do MT，Lam JS，Royal RE，Reeves ME，Rosenberg SA，Hwu P.Dendritic cells retrovirallytransduced with a model antigen gene are therapeutically effective againstestablished pulmonary metastases.J Exp Med 1997；1861213-1221)。
实施例5 DC-E.G7细胞缔合和流式细胞计数分析为了分析DC-肿瘤细胞的缔合，按厂商说明书所示(Sigma Chmical Co.，St.Louis，MO，USA)，用PKH26在稀释液C中25℃标记E.G7细胞3分钟。将DC与E.G7肿瘤细胞以6∶1比例混合6小时和24小时，以形成稳定的DC-E.G7偶联物。在存在或不存在PKH26-标记的E.G7细胞时，用FITC偶联的抗-IabMcAb(PharMingen，USA)4℃，在补充了2％FCS和0.02％叠氮化钠的PBS中标记DC30分钟，然后用同一PBS洗涤2次。
实施例6 用DC-E.G7疫苗免疫为了免疫，以6∶1的比例培育DC和E.G7肿瘤细胞24小时，形成稳定的DC-E.G7偶联物，它被用作DC-E.G7疫苗(Celluzzi CM，Falo LD Jr.CuttingEdgePhysical interaction between dendritic cells and tumor cells results in animmunogen that induces protective and therapeutic tumor rejection.J Immunol1998；1603081-3085)。将DC-E.G7细胞疫苗(分别是105个DC和1.6×104个E.G7肿瘤细胞)、未培育的相同数量DC和E.G7构成的混合物，和辐照(3000Rad)后用多肽冲击致敏标记的105DC，或PBS注射入C57BL/6小鼠的右侧区，在1周后用同一材料增强接种。在最后1次免疫1周后，将105个E.G7细胞皮下注射入免疫小鼠的后腿，以引起肿瘤攻击。每两周观察肿瘤的发生，将小于0.5厘米的肿瘤直径当成是无肿瘤。
实施例7 用IL-18基因修饰的DC-E.G7疫苗免疫治疗为了免疫治疗形成的E.G7肿瘤，通过皮下接种105个E.G7细胞建立了患有肿瘤的小鼠。用AdIL18以MOI(感染复数)为10∶1转染DC12小时，然后用RPMI-1640洗涤两次。然后以6∶1的比例培育DC和E.G7细胞，以形成稳定的IL18DC-E.G7疫苗。将辐照过的DC-E.G7细胞偶联物，AdLacZ修饰过的DC-E.G7偶联物、AdIL18修饰的DC、未培育的DC和E.G7混合物、或PBS在接种肿瘤3日后皮下注射给患有肿瘤的小鼠侧腹区，1周后重复相同的治疗。第二次免疫治疗7日后，杀死肿瘤小鼠，测定肿瘤重量。
实施例8 特定细胞亚群的体外去除从杂交瘤GK1.5(抗-CD4，ATCC TIB207)、2.43(抗-CD8，ATCC TIB210)或PK136(抗-NK1.1，ATCC HB-191)制备用来去除细胞亚群的单克隆抗体(McAb)。在免疫或用肿瘤接种前4和1日，将含有溶于0.1ml PBS的0.1毫克McAb的腹水腹腔内注射给各小鼠，并以3天间隔注射另外3次McAb。对脾细胞和外周血细胞的流式细胞计数进行的分析揭示，98％以上的靶细胞被除尽。
实施例9 用四聚体染色CD8+T细胞对于抗原特异性CD8+T细胞分析，将未粘着淋巴细胞与H-2Kb/OVA或H-2Kb/TRP2四聚体一起培育3小时。培育期最后30分钟，加入FITC偶联的抗-CD8a McAb(Biosource International，USA)进一步培育。在Becton DickinsonFACScalibur Flow Cytometer(Becton Dickinson，San Jose，CA)上分析细胞。用CellQuest软件进行数据采集和分析。
实施例10 CTL和NK细胞的细胞毒试验从肿瘤接种14或17日后杀死的小鼠中分离脾淋巴细胞。用0.83％氯化铵除去红细胞。通过将脾细胞粘在培养板上2小时，除去巨噬细胞。将未粘着的淋巴细胞用作NK效应细胞。将淋巴细胞和失活的E.G7细胞(5000Rad)在20U/ml重组人IL-2存在下，共培养7日，然后收集，作为CTL效应细胞。用标准4小时51Cr释放试验测定NK活性和CTL活性。用200μCiNa51CrO4(Amersham，Arlington Heights，USA)标记在含有20％FCS的0.5mlRPMI-1640的2×106个YAC-1或E.G7胸腺瘤细胞。在无血清培养液中洗涤标记细胞3次。然后将10×103个靶细胞与效应细胞以指定比例在U-底微孔中37℃混合4小时。对于最大51Cr释放对照，在靶细胞中加入0.1ml培养液。用γ计数在1275 Minigamma Counter(LKB-Wallac，Finland)上测定51Cr释放量，如下计算了裂解的百分数NK或CTL活性(％)＝(实验cpm-自发cpm)/(最大cpm-自发cpm)×100。
实施例11 巨噬细胞毒性和NO释放试验在RPMI-1640中培养脾细胞2小时，收集粘着细胞作为巨噬细胞。对于巨噬细胞的细胞毒性试验，将粘着巨噬细胞与L1210细胞一起在96孔U-底培养板中培育，效应细胞靶细胞比为10∶1或20∶1，总体积是每孔0.1ml培养液。在37℃，5％CO2和95％相对湿度共培养20小时后，向从巨噬细胞-L1210培养物中转移出来的L1210细胞中加入10微升MTT。然后在MTT存在下，培育L1210细胞4小时，然后加入溶于0.01N HCl的0.1ml 10％SDS。将甲膜(formazan)晶体溶于10％SDS，在BIO-RAD2550型微量培养板读数仪上读取540纳米处的吸光度。如下计算相对于校正的L1210标准的细胞毒性百分数细胞毒性百分数＝1-AL1210剩余/AL1210标准。
为了测定巨噬细胞一氧化氮(NO)的释放，在NO合成酶抑制剂1μM Nω-硝基-1-精氨酸甲酯(L-NAME)存在或不存在的条件下，用10微克/ml LPS在37℃，5％CO2下刺激巨噬细胞24小时。用Griess′试剂(Amano F，Noda T.Improveddetection of nitric oxide radical(NO.)production in an activated macrophageculture with a radical scavenger，carboxy PTIO and Griess reagent.FEBS Lett1995；368425-458)测定上清液中的NO含量。
实施例12 细胞因子释放试验用辐照(5000Rad)过的E.G7细胞刺激浓度为2×106细胞/ml的非粘着脾细胞。24小时后(对于IL-2试验)，48小时后(对于IL-4和IFNγ试验)、72小时后(对于IL-10试验)收集上清液。通过ELISA分析并用相应的来自Endogen，Woburn，MA，USA的试剂盒分析细胞因子。
统计所有的试验重复3次，结果用平均值±3次测定的SD表示，或是3次独立试验的代表性数据。在各处理组之间各时间点时肿瘤平均体积的差异用独立t检验法加以比较。在不同免疫后小鼠存活时间的差异用log-rank检验法比较。其他统计分析用Students′t检验进行。将P＜0.05看成是统计学显著的。
结果H-2Kb/OVA257-264四聚体的产生已尝试过用单体MHC-多肽复合物鉴定抗原特异性T细胞，但复合物和TcR之间作用的低亲和力和高解离率使之不可能鉴定抗原特异性T细胞(Altman JD，1996)。为了增加结合亲和力，用生物素-链霉亲和素偶联物作为桥梁，构建了四聚的MHC-多肽复合物，并成功的用于染色MHC-I-和MHC-II-限制性T细胞亚群(Gutgemann I，Fahrer AM，Altman JD，Davis MM，Chien YH.Induction of rapid T cell activation and tolerance by systemic presentation of anorally administered antigen.Immunity 1998；8667-673；Gray CM，Lawrence J，Schapiro JM，Altman JD，Winters MA，Crompton M，Loi M，Kundu SK，Davis MM，Merigan TC.Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+T cells inindividuals receiving highly active antiretroviral therapy(HAART).J Immunol1999；1621780-1788；Seth A，Ourmanov I，Kuroda MJ，Schmitz JE，Carroll MW，Wyatt LS，Moss B，Forman MA，Hirsch VM，Letvin NL.Recombinant modifiedvaccinia virus Ankara-simian immunodeficiency virus gag pol elicits cytotoxic Tlymphocytes in rhesus monkeys detected by a major histocompatibility complexclass I/peptide tetramer.Proc Natl Acad Sci U S A 1998；9510112-10116)。在本发明中，构建了携带被截短的胞外H-2Kb基因(在其COOH末端融合有编码特异性生物素化位点的DNA)的质粒。在生物素化和四聚体化后，用H-2Kb-限制性CD8+T细胞杂交瘤RF33.70(它与OVA257-264反应)，或与TRP2180-188反应的CTL克隆测试H-2Kb/OVA257-264四聚体染色的特异性。
结果如图1所示，存在H-2Kb/OVA257-264四聚体与OVA257-264特异性T细胞杂交瘤RF33.70的显著结合，但不存在H-2Kb/OVA257-264四聚体和与TR2180-188反应的CTL克隆的结合。
用DC-E.G7疫苗免疫诱导了有效的抗肿瘤免疫力为了测试非融合DC-肿瘤细胞复合物的免疫原性，将这些细胞放在一起，如报道的(Celluzzi CM，1998，同上)以6∶1的比例进行培育，制备了DC-E.G7疫苗。图2中的结果证明，红色染料PKH26可有效标记肿瘤细胞E.G7，用FITC偶联的Iab抗体标记DC。在共培养标记的E.G7和DC6小时和24小时后，发现所有E.G7细胞与DC结合，而且用补充了2％ FCS的PBS洗涤2次后，该结合作用不受影响，这表明肿瘤细胞和DC细胞之间可以形成稳定的细胞缔合。
然后，用辐照过的DC-E.G7疫苗间隔1周，前后2次免疫同系C57BL/6裸鼠。免疫小鼠7日后，用E.G7肿瘤细胞进攻。图3A中的结果表示所用DC-E.G7疫苗免疫的小鼠在接种肿瘤2个月后仍无肿瘤。作为对照，用OVA257-264-冲击致敏标记的DC免疫的小鼠也显示了明显的对随后肿瘤进攻的保护作用，90％的小鼠是不再生长肿瘤的。单用PBS、DC、不相关的多肽TRP2180-188冲击致敏标记的DC、或用未经偶联的DC和E.G7进行免疫的小鼠，对E.G7细胞的进攻不显示保护。当在用DC-E.G7疫苗免疫小鼠前除尽了CD4+T细胞时，也几乎没有DC-E.G7疫苗的保护作用。当CD4+T细胞在免疫后被除尽时，DC-E.G7疫苗的保护作用也被部分除去，表明CD4+T细胞不仅在抗肿瘤免疫的诱导阶段，而且在抗肿瘤免疫的应答阶段菌起到了重要作用。在免疫前，或在肿瘤进攻前除去CD8+T细胞，显著削弱了DC-E.G7免疫的保护作用，因此表明CD8+T细胞在DC-E.G7疫苗抗肿瘤免疫中，不仅在起始阶段，而且在效应阶段(图3B)均起到了重要作用。这些数据强烈暗示，CD4+和CD8+T细胞在DC-E.G7疫苗抗肿瘤免疫中的明确作用。
为了进一步确定CD4+T细胞在抗肿瘤免疫中的作用机制，用IFN-γ-R和IL-4缺陷型小鼠证明了，在DC肿瘤疫苗抗肿瘤过程中内源型Th1和Th2细胞因子的作用。图3C中的数据显示，在IFN-γ-R-/-小鼠中，几乎完全没有DC-E.G7的保护作用，表明在该系统中，诱导抗肿瘤免疫需要IFN-γ-R介导的Th1应答。但出乎意料的是，在IL-4-/-小鼠中，DC-E.G7疫苗的保护作用也被部分削弱，提示内源IL-4对诱导抗肿瘤应答的重要作用。
肿瘤特异性CD8+T细胞诱导肿瘤特异性CTL在肿瘤疫苗的抗肿瘤免疫中起到了关键作用。已证明多肽/MHC-1四聚体能在病毒感染后有效实现对抗原特异性T细胞的直接检测。仅在最近报道了使用四聚体来染色病人中的肿瘤抗原特异性T细胞(Yee C，Savage PA，Lee PP，Davis MM，Greenberg PD.Isolation of high aviditymelanoma-reactive CTL from heterogeneous populations using peptide-MHCtetramers.J Immunol 1999；1622227-2234)。在本发明中，用H-2Kb/OVA257-264四聚体染色了非粘着淋巴细胞。图4A-F中的结果证明，在用OVA257-264-冲击致敏标记的DC或DC-E.G7疫苗免疫后，诱导显著的四聚体+CD8+T细胞，它是脾CD8+T细胞的约3-7％。用PBS、或TRP2180-188冲击致敏标记的DC免疫的小鼠衍生的淋巴中，未发现四聚体+CD8+T细胞。在用DC-E.G7疫苗免疫的IFN-γ-R基因或IL-4基因缺陷型小鼠中，抗原特异性CTL的诱导被显著削弱，表明在用DC-肿瘤疫苗免疫的小鼠中，抗肿瘤CTL的诱导同时需要内源Th1和Th2细胞因子。接着，在各种免疫接种后测定了小鼠淋巴细胞的特异性裂解活性。发现(图4G)淋巴细胞的细胞毒性和四聚体染色的结果成正比。来自DC-E.G7疫苗或OVA257-164冲击致敏标记的DC的淋巴细胞显示显著的对E.G7细胞的裂解活性。相反，衍生自对照免疫后的小鼠的淋巴细胞和IFN-γ-R-/-、IL-4-/-小鼠对靶E.G7细胞不显示明显的裂解活性。这些淋巴细胞对同系B16细胞几乎不显示裂解活性，表明裂解活性是由肿瘤抗原特异性CTL引起的。
这些数据说明用DC-E.G7疫苗免疫小鼠能诱导强大的保护性抗肿瘤免疫力。DC-肿瘤细胞缔合是偶联疫苗的免疫原性所必需的。Th1和Th2 CD4+T和CD8+T细胞在DC-E.G7疫苗诱导抗肿瘤免疫力的过程中是涉及的。
IL-18-分泌性DC-E.G7疫苗对已有的肿瘤具有更强大的抗肿瘤作用由于CD4+细胞在诱导抗肿瘤免疫力中起到了关键作用，而抗肿瘤免疫力常由CTL介导，而CTL的活化是由Th1细胞因子支持的，假设提高T细胞辅助作用能大大有益于增强DC-为基础的对肿瘤免疫治疗中的抗肿瘤应答和抗肿瘤免疫力的诱导。为该目的，选择了IL-18。在制备DC-E.G7疫苗前，将携带小鼠IL-18基因的腺病毒以10∶1的病毒细胞比转染入DC。将10×104E.G7细胞皮下接种入野生型C57BL/6小鼠、IFN-γ-R-/-或IL-4-/-小鼠。三天后，用下列制剂处理小鼠IL-18基因或对照lacZ基因修饰的DC-E.G7疫苗、DC-E.G7疫苗，OVA257-264冲击致敏标记的DC、单用IL-18基因修饰的DC、或PBS。7日后重复相同的注射，再过7日，杀死患有肿瘤的小鼠，以评估肿瘤重量并确定抗肿瘤免疫力。如图5A中所述，结果证明在预先建立的肿瘤模型中，当与用PBS处理的小鼠比较，用lacZ基因-修饰的DC-E.G7疫苗、DC-E.G7疫苗、或OVA257-264冲击致敏的DC处理的小鼠中肿瘤生长被显著抑制(P＜0.05)。当和用lacZ基因修饰的DC-E.G7疫苗、DC-E.G7疫苗、或OVA257-264肽冲击致敏的DC处理的小鼠进行比较时，在用IL-18基因修饰的DC-E.G7疫苗处理的小鼠中观察到更强大的抗肿瘤作用。用被AdIL18转染的DC免疫治疗也显示了对建立的E.G7肿瘤模型的治疗作用，它的作用可通过DC分泌的IL-18诱导。存活的无肿瘤小鼠重新用野生型E.G7细胞进攻。在5只用IL18 DC-E.G7处理的小鼠中，5只在另2个月后都无肿瘤，这表明在IL18 DC-E.G7疫苗处理的小鼠中诱导了强大的抗肿瘤免疫力(表1)。
表1 用IL-18基因修饰过的DC-E.G7瘤苗接种，再用野生型E.G7细胞侵袭后无肿瘤小鼠的数目组别 无肿瘤小鼠a无肿瘤小鼠bIL18DC-E.G7瘤苗 9/10 5/5LacZDC-E.G7瘤苗 5/10 2/5DC-E.G7瘤苗 4/10DC/OVA 257-2646/10 3/5IL18DC2/10DC1/10PBS 0/10原初小鼠c0/5a.在肿瘤接种后3个月后的无肿瘤小鼠。
b.用IL-18基因修饰过的DC-E.G7瘤苗接种，并用100,000个野生型E.G7细胞侵袭后，再经过了3个月后无肿瘤的小鼠。
c.没有接受肿瘤接种，也没有接受免疫治疗(接种)的原初小鼠。这些小鼠用E.G7细胞侵袭，以作为对照。
在肿瘤接种1日前和2、5、8日后注射了抗CD4、抗CD8和抗NK1.1抗体，来确定引起IL-18基因修饰的DC-E.G7疫苗抗肿瘤作用提高的细胞亚群。图5B的结果显示，CD4+T细胞和CD8+T细胞的除尽都阻断了60-80％的IL18DC-E.G7疫苗的治疗作用。当和未接受免疫治疗的小鼠比较时，在同时用抗CD4和抗CD8处理的小鼠中观察到IL18 DC-E.G7疫苗抗肿瘤效力的完全丧失。有趣的是，用抗-NK1.1抗体处理经受免疫治疗的小鼠也部分阻断了IL18 DC-E.G7疫苗的抗肿瘤作用。为了解释NK在抗肿瘤应答中的作用，用流式细胞计数测定了H-2Kb的表达，在E.G7细胞中观察到H-2Kb的高表达(数据未显示)。MHC-I表达的肿瘤细胞通过诱导抑制性NK受体，对NK细胞的裂解是有抑制的(Sundback J，Nakamura MC，Waldenstrom M，Niemi EC，Seaman WE，Ryan JC，Karre K.The alpha2 domain of H-2Dd restricts the allelic specificity of the murineNK cell inhibitory receptor Ly-49A.J Immunol 1998；1605971-5978)。IL-18基因修饰后产生的淋巴因子可活化NK细胞，推测淋巴因子活化的NK细胞和IL18DC-E.G7疫苗的抗肿瘤作用有关。
在野生型C57BL/6小鼠、IFN-γ-R-/-和IL-4-/-小鼠中生长的E.G7肿瘤未显示差异(图5C)。近来也报道了IL-4+/+和IL-4-/-小鼠之间相同的肿瘤生长(Schuler T et al.，Exp Med 189803-810，1999)。但当用IL18 DC-E.G7疫苗处理这些小鼠中已有的肿瘤时，发现在IFN-γ-R-/-小鼠中几乎观察不到治疗性抗肿瘤作用。虽然在IL-4-/-小鼠中观察到抗肿瘤作用，在IL-4-/-小鼠中的这些肿瘤比野生型小鼠中的显著大，表明在IL-18基因修饰的DC-肿瘤疫苗抗肿瘤应答中IFN-γ的关键作用和内源IL-4的参与作用。
IL18 DC-E.G7治疗后的抗原特异性CD8+T细胞的诱导为了测定是否IL-18基因诱导的DC-E.G7在具有预已有的肿瘤的小鼠中诱导更加肿瘤特异性的CD8+T细胞，在免疫治疗7日后用H-2Kb/OVA257-264四聚体染色淋巴细胞。图6A-F的结果证明，和用DC-E.G7疫苗、OVA257-264冲击致敏标记DC或PBS处理的小鼠比较，用IL18 DC-E.G7疫苗处理的小鼠中有更OVA-特异性的CD8+四聚体+T细胞。用DC-E.G7疫苗或OVA257-264冲击致敏标记的DC免疫治疗后，小鼠中CD8+四聚体+T细胞的百分数也比那些用PBS治疗的要显著高，这和用DC-E.G7免疫获得的结果一致。接受IL18 DC-E.G7疫苗免疫治疗的IFN-γ-R-/-和IL-4-/-小鼠中CD8+四聚体+T细胞的数目也比那些正常C57BL/6小鼠中的要显著低。用4小时51Cr释放方法分析了体外用辐照的E.G7细胞刺激后，淋巴细胞的特异性裂解。如图6G所示，和用DC-E.G7疫苗、OVA257-264冲击致敏标记的DC或PBS处理的小鼠中比较，用IL18 DC-E.G7疫苗处理的小鼠中观察到高得多的CTL活性(P＜0.05)。还注意到用DC-E.G7疫苗或OVA257-264冲击致敏标记的DC免疫治疗的小鼠中，CTL的活性比那些用PBS治疗后的要显著高(P＜0.01)。在接受了IL18 DC-E.G7疫苗免疫治疗的IFN-γ-R-/-和IL-4-/-小鼠中CTL诱导几乎完全被消灭。这些数据提示，用IL18 DC-E.G7疫苗免疫治疗后，IFN-γ和IL-4在OVA-特异性CD8+T细胞的活化增强中起到关键作用。
IL-18-分泌DC-E.G7疫苗后，衍生自小鼠脾淋巴细胞的细胞因子产生体外用辐照的E.G7细胞刺激除去了红细胞的非粘着淋巴细胞，以诱导Th1和Th2细胞因子。图7A和B的结果证明，用IL18 DC-E.G7疫苗处理的小鼠比来自用DC-E.G7疫苗、OVA257-264冲击致敏标记的DC、或PBS处理的小鼠，衍生的淋巴细胞的IL-2和IFN-γ的产生显著要高(P＜0.01)。IL18 DC-E.G7疫苗免疫治疗后，和正常小鼠比较，IFN-γ-R-/-和IL-4-/-小鼠中的淋巴细胞产生的IL-2和IFN-γ量显著少(P＜0.05)。在用PBS模拟处理的小鼠所衍生的淋巴细胞中，上清液中几乎检测不到IL-2，而且不含IFN-γ，表明E.G7刺激后的Th1细胞因子释放是抗原特异性的。还测定了各种处理后小鼠淋巴细胞产生的IL-4和IL-10，而图7C、D中的结果证明，IL-4产生和IL-2和IFN-γ的形式相似。淋巴细胞的IL-10产生不受用DC-E.G7疫苗或肽冲击致敏标记的DC对患有肿瘤的小鼠的免疫治疗的显著影响，表明IL-4和IL-10可能在IL18 DC-肿瘤疫苗的抗肿瘤免疫中具有多种作用。
用IL18 DC-E.G7疫苗免疫治疗后的NK和巨噬细胞活化与CD4+T细胞的抗病毒和抗肿瘤作用有关的机制之一主要是通过非特异性效应细胞，如NK细胞，巨噬细胞、中性粒细胞和嗜伊红粒细胞的活化。这些活性依赖于Th1细胞因子IL-2、IFN-γ或Th2细胞因子IL-4、IL-5的效应细胞，将有效杀伤靶细胞。在该研究中，观察到CD4+T细胞参与了偶联疫苗抗肿瘤免疫的效应阶段后，调查了NK和巨噬细胞在增强DC-E.G7疫苗DC-E.G7疫苗抗肿瘤应答中的作用。
图8A的结果显示，和用DC-E.G7疫苗、OVA257-264冲击致敏标记的DC或PBS免疫治疗后的小鼠比较，用IL18 DC-E.G7疫苗免疫治疗后的小鼠衍生的淋巴细胞NK活性高得多(P＜0.01)。用未经IL-18转导的DC-E.G7疫苗处理的小鼠衍生的NK细胞活性比用OVA257-264冲击致敏标记的DC处理的小鼠中高。在用IL18 DC-E.G7疫苗处理的IFN-γ-R-/-小鼠中，NK活性比野生型C57BL/6小鼠中显著低(P＜0.05)。但是在IL-4-/-小鼠中，IL18 DC-E.G7疫苗后的NK活性和正常小鼠中的几乎相同。这些数据显示，在用DC-E.G7疫苗处理的小鼠中更强的NK活性可能是在抗肿瘤应答的效应细胞阶段激活CD4+T细胞所导致。
用IL18 DC-E.G7疫苗免疫治疗后携带肿瘤小鼠中巨噬细胞更强的细胞毒性和NO的产生如图8B所示，用IL18 DC-E.G7疫苗处理的小鼠衍生的脾巨噬细胞的细胞毒性，比用其它DC为基础的疫苗和PBS处理的小鼠比较显著更高(P＜0.01)。在通过注射抗-CD4+抗体除去CD4+T细胞的小鼠中，未在用IL18 DC-E.G7疫苗处理的小鼠中观察到NK和巨噬细胞毒性的提高。当在用DC-E.G7疫苗和OVA257-164冲击致敏标记的DC处理的小鼠之间比较NK活性和巨噬细胞细胞毒性时，发现来自用DC-E.G7疫苗处理的小鼠的裂解活性比OVA257-264冲击致敏标记的DC处理的小鼠要高得多，因此提示DC-E.G7疫苗可诱导CD4+T细胞活化，而OVA257-264冲击致敏标记的DC治疗不能。在用DC-E.G7疫苗治疗的小鼠中NK和巨噬细胞活性的提高可能是由于CD4+T细胞在抗肿瘤应答效应阶段的活化。由于IL-18是IFN-γ的强大诱导物(报道它通过巨噬细胞产生NO显示肿瘤细胞裂解作用(Xie K，Bielenberg D，Huang S，Xu L，Salas T，JuangSH，Dong Z，Fidler IJ.Abrogation of tumorigenicity and metastasis of murine andhuman tumor cells by transfection with the murine IFN genepossible role of nitricoxide.Clin Cancer Res 1997；32283-2294)，还测定了巨噬细胞的NO产生，结果显示NO产生和巨噬细胞活性成正比。NO合成酶抑制剂L-NAME显著削弱巨噬细胞的细胞毒性和NO产生，表明巨噬细胞可通过产生NO引起对肿瘤细胞的裂解作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种抗原提呈细胞/肿瘤细胞的偶联物，其特征在于，所述的抗原提呈细胞是被选自下组的细胞因子基因所转化白细胞介素IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18，干扰素IFNα，IFNβ，IFNγ，肿瘤坏死因子TNF，转化生长因子TGF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF；和它们的组合。
2.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的抗原提呈细胞选自下组树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、内皮细胞、朗氏细胞和它们的组合。
3.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的肿瘤细胞包括从肿瘤组织中分离的新鲜肿瘤细胞，和体外传代的肿瘤细胞株。
4.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的肿瘤细胞选自黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、白血病细胞。
5.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述抗原提呈细胞和肿瘤细胞的比例为100∶1-0.1∶1。
6.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的偶联物是通过抗原提呈细胞和肿瘤细胞在30-38℃结合1-100小时而形成的。
7.一种制备抗原提呈细胞和肿瘤细胞的偶联物的方法，其特征在于，包括步骤(1)提供抗原提呈细胞和肿瘤细胞，其中所述的抗原提呈细胞是被选自下组的细胞因子基因所转化白细胞介素IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18，干扰素IFNα，IFNβ，IFNγ，肿瘤坏死因子TNF，转化生长因子TGF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF；和它们的组合；(2)将所述的抗原提呈细胞和肿瘤细胞，以比例为100∶1-0.1∶1，在30-38℃下结合1-100小时，从而形成所述的偶联物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括步骤(3)对形成的偶联物进行射线照射，照射的剂量为1000-100,000Rad或对形成的偶联物进行化学灭活。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的偶联物和药学上可接受的载体或赋形剂或佐剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，它是肿瘤疫苗。
11.如权利要求1所述抗原提呈细胞/肿瘤细胞的偶联物的用途，其特征在于，它被用于制造治疗肿瘤的药物或预防肿瘤的疫苗。
全文摘要
本发明提供了一种抗原提呈细胞/肿瘤细胞的偶联物,所述的抗原提呈细胞是被选自下组的细胞因子基因所转化:白细胞介素IL－2,IL－3,IL－4,IL－6,IL－12,IL－18,干扰素IFNα,IFNβ,IFNγ,肿瘤坏死因子TNF,转化生长因子TGF,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM－CSF;和它们的组合。这种偶联物可用作瘤苗,显著诱导特异性地针对肿瘤细胞的免疫力。本发明还提供了所述偶联物的制法和含该偶联物的药物组合物。
文档编号A61K39/00GK1377892SQ0110585
公开日2002年11月6日 申请日期2001年4月4日 优先权日2001年4月4日
发明者鞠佃文, 陶群, 叶丹 申请人:上海华晨生物技术研究所