专利名称：普罗托品在制备治疗老年性痴呆症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学技术领域，具体地说，涉及普罗托品在制备治疗老年性痴呆症药物中的应用。
随着社会老龄化的日渐加剧，越来越多的人将受到各种记忆障碍的折磨。尤其老年性痴呆症(阿尔茨海默氏症)，当今没有有效的治疗方法，目前全世界有约1200万人受老年性痴呆症的困扰，老年性痴呆症能打乱大脑的正常工作，损害大脑中控制思维、记忆和语言的部分。如果没有有效的治疗方法，25年后全球预计将有2200万人患上老年性痴呆症，到2050年患此疾病的人数将达4500万，老年性痴呆症将成为人类社会的流行病。目前用于老年性痴呆症治疗的药物主要是胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐(Donepezil)、石杉碱甲(Huperzine-A)，都有显著改善记忆的作用，但也存在一定副作用。另一类改善记忆的药物是吡咯烷酮类化合物，如吡拉西坦、阿尼西坦和奥拉西坦等，相比之下，对改善血管性痴呆更好些。天然产物银杏提取物(ginkgo biloba)有显著改善痴呆患者记忆功能和生活自理能力的效果。研究结果表明银杏叶提取物和吡咯烷酮类化合物没有胆碱酯酶抑制作用，但对神经细胞钠、钾和钙电流有抑制作用。迄今，现有技术中没有用既有胆碱酯酶抑制作用又有非选择性离子通道阻断作用的普罗托品制备老年性痴呆症药物的报道。
本发明的目的在于提供普罗托品在制备老年性痴呆症药物的中的应用。
为实现本发明的目的，选用从滇产植物紫金龙中用现有技术提取的纯天然产物普罗托品，通过用普罗托品对小鼠记忆获得障碍、胆碱酯酶、小鼠神经细胞钠、钾和钙离子通道的影响的研究，发现普罗托品能显著改善东莨菪碱所致的记忆获得障碍、抑制胆碱酯酶活性、抑制神经细胞钙内流，可逆性阻断神经细胞钠和钾离子通道。具有作为制备老年性痴呆症药物的用途。
附
图1为普罗托品对小鼠脑和肝脏胆碱酯酶的影响，图中○-○脑，●-●肝Mean±SD，n＝4附图2为普罗托品对KCl诱发的分离新生小鼠神经细胞内钙升高的影响，n＝4-5附图3为尼莫地平对KCl诱发的分离新生小鼠神经细胞内钙升高的影响，n＝4-5附图4至10为普罗托品对小鼠神经细胞钠和钾电流的抑制作用。其中附图4为原始记录图，图中a示对照，b示普罗托品50μM，c示冲洗后；附图5为对钾电流的作用时程；附图6为对钠电流的作用时程；附图7为普罗托品50μM对钠电流I-V关系曲线的影响，图中○-○示对照，●-●示普罗托品50μM，口-口是示冲洗后；附图8为普罗托品50μM对钾电流I-V关系曲线的影响，图中○-○示对照，●-●示普罗托品50μM，口-口示冲洗后；附图9为50μM普罗托品对钠电流的抑制作用；附图10为50μM普罗托品对钾电流的抑制作用，图中*P＜0.05，**P＜0.01。
下面通过详述用罗托品对小鼠记忆获得障碍、胆碱酯酶、小鼠神经细胞钠、钾和钙离子通道的影响的研究，说明罗托品具有作为制备老年性痴呆症药物的用途。
1).普罗托品对小鼠记忆获得障碍的改善作用(步入法)采用美国Gemini两用回避系统的被动回避反应控制装置进行实验。该装置分明暗两室，明室顶部置一40w的灯泡，暗室底部为可通电流的铜栅，明暗两室间有一可自动控制开关的门，实验开始门自动打开，将小鼠头部背对门放入明室，小鼠进入暗室后门自动关闭，立即受到电击(可无电流)，记录小鼠从明室进入暗室的潜伏期。实验第一天，不给电击，将所试小鼠放入装置中进行适应。第二天，进行训练，实验设盐水组、东莨菪碱组和药物组，训练前1小时给小鼠口服不同剂量的药物，45min后腹腔注射东莨菪碱，15min后将小鼠放入装置中训练，给小鼠0.33-0.35mA的电流刺激，进入暗室的潜伏期不大于100秒。训练后24小时重测试，记录小鼠进入暗室的潜伏期，大于300秒按300秒计算，比较各组小鼠的潜伏期长短，观察药物对小鼠记忆获得障碍的影响。实验结果见表1，东莨菪碱显著损伤小鼠的记忆获得，而普罗托品0.5mg/kg与石杉碱甲一样，显著抑制东莨菪碱对小鼠记忆获得的损伤作用，表明普罗托品具有改善记忆障碍的作用。表1.普罗托品对东莨菪碱所致小鼠记忆障碍(步入法)的影响(mean±SD)实验处理 进入暗室的潜伏期生理盐水 228.1±117.1东莨菪碱0.3mg/kg 78.30±58.2a东莨菪碱+普罗托品0.1mg/kg 82.40±84.9普罗托品0.5mg/kg 134.6±72.5*东莨菪碱+石杉碱甲0.005mg/kg 189.5±116.6*a与生理盐水对照组比较有显著差异，P＜0.05.*与东莨菪碱组比较有显著差异，P＜0.052).抑制胆碱酯酶活性ICR小鼠，脑和肝匀浆。ICR小鼠，22-25g，脱颈处死，取大脑半球和适量肝脏，放于预冷的匀浆介质中(0.01M蔗糖，0.01M Tris-HCL，0.0001MEDTA2Na溶液，pH7.47)，用内切式组织匀浆器制成10％组织匀浆(匀浆时间10秒/次，间隙20秒，连续4次，在冰水中进行)，将匀浆液以3500r/min离心15分钟，取上清液进行胆碱酯酶测定，胆碱酯酶用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定。结果见图1和表2，普罗托品对肝和脑的胆碱酯酶均有显著的抑制作用，IC50值分别为121.99和42.10，表明普罗托品改善记忆的作用与其对胆碱酯酶的抑制有关，与石杉碱甲类似。
表2.普罗托品对ICR小鼠脑和肝胆碱酯酶的抑制作用IC50(μM)脑121.99(95％可信限92.43-161.02)肝 42.10(95％可信限22.89-77.99)
3).神经细胞钙内流的影响取0-1天的新生小鼠，经左心室进行灌流，清除血液后，取大脑皮质置冰冷的Hank’S(mMNaCl 137，KCl 5.0，CaCl21.3，MgSO4·7H2O 0.8，Na2HPO40.6，KH2PO40.4，NaHCO33.0，Glucos 10，pH7.4)液，仔细分离去除脑膜和血管后，洗2次，剪成糜状，加入0.125％胰蛋白酶，于37℃轻轻搅拌消化15分钟，用冰冷的含10％血清的DMEM培养液终止消化，用火抛光的吸管轻轻吹打，使细胞分散。静置3-5分钟，取上层细胞悬液，用不锈钢网(200目)过滤，1000r/min离心5分钟，弃上清液，用冰冷的含10％小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，再1000r/min离心5分钟，弃上清液，用含10％小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞。制备好的细胞悬液，按5μM Fura-2加入，37℃孵育45分钟，1000r/min离心5分钟，弃上清，用Hank’S液洗二次，将细胞悬浮在Hank’s液中，调整细胞浓度在每ml含2×106个细胞。测定前细胞预先于37℃复温3分钟。取细胞悬液3ml于荧光比色杯中，37℃，用PE LS-50B型发光分光光度计测荧光。激发光栅为10nm，发射光栅为10nm，发射光波长500nm。用340/380nM交替测定荧光强度比值，稳定后，加入普罗托品10分钟后，加入40mM的KCl，反应平稳后，加入0.1％TritonX-100测最大荧光值(Rmax)，加入10mM的EGTA，测最小荧光值(Rmin)，反应平稳后停止，按下式计算细胞内钙浓度。i＝Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)(Fa2/Fb2)nMKd为Fura-2-Ca+2的解离常数，37C时为224nm，R、Rmax和Rmin为测定的荧光、最大和最小比值。Fa2和Fb2分别为零钙和钙饱和时380nm激发光产生的荧光强度，Ca+2浓度的单位为nM.结果见图2和图3，普罗托品与钙拮抗剂尼莫地平一样，显著抑制高钾诱发的钙内流，普罗托品和尼莫地平IC50值分别为为55.94μM和0.07μM，表明普罗托品对钙通道有显著抑制作用。
4).抑制神经细胞钠和钾离子通道取0-1天的新生小鼠，经左心室用0.2ml Hank’s液灌流，清除大脑血液后，取大脑皮质置冰冷的Hank’S液中，仔细分离去除脑膜和血管后，洗2次，剪成糜状，加入0.125％胰蛋白酶，于37℃轻轻搅拌消化15分钟，用冰冷的含10％小牛血清的DMEM培养液终止消化，用火抛光的吸管轻轻吹打，使细胞分散。静置3-5分钟，取上层细胞悬液，用不锈钢网(200目)过滤，1000r/min离心5分钟，弃上清液，用冰冷的含10％小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，再1000r/min离心5分钟，弃上清液，用DMEM(含20％小牛血清，青霉素G100U/ml，链霉素100μg/ml)悬浮细胞，将细胞密度调整为1.5×106/ml左右，接种于预先用多聚赖氨酸过夜浸泡过的盖玻片上，放于6孔组织培养板中，接种体积为1.5ml。于37℃，5％CO2条件下培养，24小时后更换培养液，加入Arc-C 10μM培养48小时，以抑制非神经细胞的生长，以后每3天换一次培养液，继续培养至8-10天开始实验。实验在全细胞记录电压钳下进行。
实验系统由倒置相差显微镜、微操纵器、灌流系统、示波器、滤波器、微型计算机、Lab master A/D，D/A数据转换器、NIHON KOHDEN CEZ-2300(Tokyo，Japan)膜片钳放大器组成，所有实验在pClamp 5.51程序控制下进行。
取上述含有培养细胞的盖玻片放入25mm直径的组织培养皿中，用细胞外液(mMKCl 5，NaCl 145，MgCl20.8，CaCl21.8，Hepes 20，Glucose 30)洗3次，进行实验。实验在室温(20-25℃)下进行。将培养皿固定于倒置相差显微镜的平台上，在细胞外液灌流下，使灌有电极内液的电极与细胞表面接触，轻吸，电极与细胞膜形成高阻抗封接(R＞2MΩ)，再吸，将电极尖端下的细胞膜吸破，形成全细胞记录模式。然后在pClamp 5.51程序控制下，通过由微型计算机控制的CEZ-2300膜片箝放大器将细胞箝位于所需电压，给于细胞去极化电压，观察测试电压诱发的跨膜电流。
膜片钳微电极用玻璃毛细管拉制(OD1.5mm)，拉制器为Narishige PB-83(Tokyo，Japan)，分两步拉制，第一次拉长7-10mm，直径小于200μm，在此基础上进行第二次拉制，最终使尖端直径为1-2μm。用Narishige抛光器抛光(Tokyo，Japan)，电极阻抗为2-5mΩ，电极内液为(mM)KCl140，MgCl20.5，EGTA10，Hepes10，K2ATP2，pH7.3)。记录钠电流，用等量的CsCl替换KCl。
灌流系统为自制的前端安有一直径约为100μm的毛细管的U型管，U型管的一端浸在试管内的细胞外灌流液中，另一端联有一阀门控制的负压瓶，打开阀门可更换U型管中的溶液，灌流液可由重力的作用从毛细管的尖端流出，流速约为0.1ml/min。在实验时，毛细管的尖端离细胞约100μm，细胞完全浸在从毛细管中流出的溶液中，有较好的灌流效果。出水管为一根一端浸在培养皿里的溶液中，另一端可上下微调的细塑料管，通过虹吸作用可将培养皿中溶液控制在一定水平。连接电位和瞬时电容用放大器消除。
结果见图4至图10，普罗托品50μM显著抑制培养小鼠神经细胞钠和钾电流，容易被洗脱掉，表明普罗托品对神经细胞钠和钾通道具有阻断作用，并且是可逆的。
实验表明，普罗托品具有胆碱酯酶抑制作用和非选择性离子通道阻断作用，即具有胆碱酯酶抑制剂、吡咯烷酮类化合物和银杏叶提取物的优点，对老年性痴呆症等各种记忆障碍会有更好的治疗作用。普罗托品具有作为制备治疗老年性痴呆症等各种记忆障碍药物的用途。
权利要求
一种普罗托品在制备治疗老年性痴呆症药物中的应用，其特征在于选用从滇产植物紫金龙中用现有技术提取的纯天然产物普罗托品作为在制备治疗老年性痴呆症药物中的应用。
全文摘要
本发明属生物医学技术领域,具体地说,涉及普罗托品在制备治疗老年性痴呆症药物中的应用。本发明选用从滇产植物紫金龙中用现有技术提取的纯天然产物普罗托品,通过用普罗托品对小鼠记忆获得障碍、胆碱酯酶、小鼠神经细胞钠、钾和钙离子通道的影响的研究,表明普罗托品具有胆碱酯酶抑制作用和非选择性离子通道阻断作用,即具有胆碱酯酶抑制剂、吡咯烷酮类化合物和银杏叶提取物的优点,对老年性痴呆症等各种记忆障碍会有更好的治疗作用。普罗托品具有作为制备治疗老年性痴呆症等各种记忆障碍药物的用途。
文档编号A61K31/395GK1385157SQ0110842
公开日2002年12月18日 申请日期2001年5月10日 优先权日2001年5月10日
发明者陈必义, 蔡景霞, 陈植和, 李朝翠, 刘小初, 李玲 申请人:中国科学院昆明动物研究所