专利名称：Zq生物膜制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学的软组织组织工程支架材料，具体地涉及一种ZQ生物膜制备方法。
背景技术：
目前软组织组织工程支架材料采用PLA、PGA及经表面修饰的合成材料或胶原材料作为支架接种复合细胞用于组织工程技术，但普遍存在组织亲合性差，降解产物为酸性，不利于组织细胞生长存活，胶原降解过快等缺点。
发明内容
针对现有软组织组织工程支架材料与细胞亲合性差，降解产物不利细胞生长；胶原材料降解过快，不能维持到再生组织替代时间等不足之处，本发明利用天然组织结构加工制备成ZQ生物膜，不仅有良好的细胞亲合性，而且分解产物对细胞无毒害作用、降解速度与组织再生速度比较适应。
本发明采取制备ZQ生物膜的技术方案包括以下步骤1.原材料准备原材料包括a.足月顺产人胎儿羊膜b.0.01％～10％浓度的氨水c.抗菌素d.平衡盐液e.胰酶溶液f.1％～30％浓度的PLLA溶液g.培养液
h.Co60放射源2.选取无传染病及系统性疾病的健康适龄产妇第一胎产后5min～24h内的胎盘；3.无菌条件下将羊膜自胎盘上钝性分离；4.将羊膜置于含青霉素80万u/500ml、链霉素100万u/500ml的平衡盐液中，摇动振洗3次，每次5min，洗去血污及粘液，取出膜，置于平衡盐液中，-4℃～-75℃冻存，备用；5.37℃恒温摇床解冻；6.将解冻之膜置于0.01％～10％浓度的氨水中摇动振洗3次，每次10min；7.换用平衡盐溶液清洗直至无泡沫为止，此时膜呈洁白半透明状；8.加平衡盐抗菌素液，置于冻存管中密封保存；9.用200,000 rads～5,000,000 rads的Co60γ射线照射灭菌，并降低抗原性；10.-4℃～-75℃冻存备用；11.依需求取出，于37℃解冻；12.解冻后取出膜，置于胰酶溶液中，在温度37℃环境下保持3小时，以含血清培养液终止消化；用显微外科镊将两层结构分开，弃去胶状物；13.用玻璃片捞取膜，将之去细胞面向上平铺于以培养液湿润过的塑料培养皿底部，置于无菌操作台中风干；14.表面涂布薄层PLLA溶液，风干；15.取出制备完成的ZQ生物膜，紫外线照射2小时消毒后，即可用于接种细胞。
上述原材料中，胰酶为0.125％～0.5％浓度的溶液；抗菌素为青霉素、链霉素；培养液含2％～25％血清；平衡盐液为PBS或HANKS或生理盐水或注射用平衡盐液。
本发明的ZQ生物膜是一种与细胞具有良好复合特性的支架材料，可用于复合雪旺细胞后卷圈塑形用于外周神经移植桥接；复合韧带细胞后折叠塑形用于韧带修复；复合成骨细胞、成纤维细胞后团起充填骨或软组织空洞缺损；复合上皮细胞或粘膜细胞平铺用于皮肤或粘膜移植等，对外周神经的组织工程具有较大实际意义，具有良好的应用前景。
具体实施例方式
实施例1依本发明的技术方案，制备ZQ生物膜的方法按以下步骤进行1.原材料准备1)足月顺产人胎儿羊膜2)0.1％浓度的氨水3)抗菌素(采用青霉素、链霉素)4)平衡盐液(PBC或HANKS或生理盐水或注射用平衡盐液)5)0.25％浓度的胰酶溶液6)10％浓度的PLLA溶液7)含血清10％的DMEM培养液8)Co60放射源2.选取无传染病及系统性疾病的健康适龄产妇第一胎产后1小时内的胎盘；3.无菌条件下将羊膜自胎盘上钝性分离；4.将羊膜置于含青霉素(80万u/500m1)、链霉素(100万u/500ml)的注射用平衡盐溶液中，摇动振洗3次，每次5min，洗去血污及粘液，取出膜，置于平衡盐溶液中，-20℃冻存，备用；5.37℃恒温摇床解冻；6.将解冻之膜置于0.1％浓度的氨水中摇动振洗3次，每次10min；7.换用PBS溶液清洗直至无泡沫为止，此时膜呈洁白半透明状；8.按需求将膜分切成不同规格(大小、形态)，置于一次性冻存管中(加PBS抗菌素液)密封保存，登记规格、时间；
9.Co60γ射线(2,000,000 rads)照射灭菌，并降低抗原性；10.-20℃冻存备用；11.依需求按登记规格取出，于37℃解冻；12.解冻后取出膜，置于0.25％浓度的胰酶(1V)溶液中20cm2/2ml、37℃环境保持3小时，此时膜一面变为涕状胶样物，一面仍韧而密实。以含10％血清的DMEM培养液终止消化。用显微外科镊将两层结构分开，弃去胶状物，韧而密实的一层既是所要组织；13.用玻璃片捞取膜，将之去细胞面向上，平铺于以培养液湿润过的塑料培养皿底部，置于无菌操作台中风干；14.表面涂布薄层10％浓度的PLLA溶液，风干；15.ZQ生物膜制备完成，经紫外线照射2小时消毒后，即可用于接种细胞。
实施例2本实施例与实施例1不同点是，氨水为0.01％浓度的溶液；胰酶为0.125％浓度的溶液；用浓度为0.01％的EDTA溶液与胰酶溶液混合使用，用于方法中第12步骤替代胰酶溶液；PLLA为1％浓度的溶液(也可不使用该溶液)；DMEM培养液含2％血清；其方法、步骤均与实施例1相同，同样可以实现ZQ生物膜制备。
实施例3本实施例与实施例2不同点是，氨水为10％浓度的溶液；胰酶为0.5％浓度的溶液；EDTA为0.2％浓度的溶液；PLLA为30％浓度的溶液；DMEM培养液含25％血清；其方法、步骤均与实施例2相同，同样可以实现ZQ生物膜制备。
实施例4本实施例与实施例2不同点是，氨水为5％浓度的溶液；胰酶为0.55％浓度的溶液；EDTA为0.8％浓度的溶液；PLLA为20％浓度的溶液；DMEM培养液含15％血清；其方法、步骤均与实施例2相同，同样可以实现ZQ生物膜制备。
本发明并不限于上述实施例，经大量的实验表明，如上述所说的，抗菌素并不仅仅包含青霉素、链霉素，只要具有与青霉素、链霉素相同或相近功能的，都能够在本发明的方法步骤中使用；平衡盐液包括的品种也很多，本发明列举了一些，如PBS、HANKS、生理盐水、注射用平衡盐液等，但绝不仅仅局限于这些；培养液包含的品种也很多，也绝不局限于DMEM，上述的原材料都能够在本发明的方法步骤中使用。
本发明制备的ZQ生物膜，以105个/ml的浓度接种细胞于ZQ生物膜表面，置于37℃环境孵育2小时，再添加所需培养液，进行培养并观察细胞生长情况；待长到铺满膜表面时即可将复合有所培养细胞的ZQ生物膜支架从培养皿上揭起，依据所需形态或卷或折叠进行塑形处理，进行移植。
权利要求
1.ZQ生物膜的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)原材料准备原材料包括(1)足月顺产人胎儿羊膜(2)0.01％～10％浓度的氨水(3)抗菌素、(4)平衡盐液(5)胰酶溶液、(6)1％～30％浓度的PLLA溶液(7)培养液(8)Co60放射源2)选取无传染病及系统性疾病的健康适龄产妇第一胎产后5min～24h内的胎盘；3)无菌条件下将羊膜自胎盘上钝性分离；4)将羊膜置于含青霉素80万u/500ml、链霉素100万u/500ml的平衡盐混合溶液中，摇动振洗3次，每次5min，洗去血污及粘液，取出膜，置于平衡盐溶液中，-4℃～-75℃冻存，备用；5)37℃恒温摇床解冻；6)将解冻之膜置于0.01％～10％浓度的氨水中摇动振洗3次，每次10min；7)换用平衡盐溶液清洗直至无泡沫为止，此时膜呈洁白半透明状；8)加平衡盐抗菌素液，置于冻存管中密封保存；9)用200,000 rads～5,000,000 rads的Co60γ射线照射灭菌，并降低抗原性；10)-4℃～-75℃冻存备用；11)依需求规格取出，于37℃解冻；12)解冻后取出膜，置于胰酶溶液中，在温度37℃环境下保持3小时，以含血清培养液终止消化；用显微外科镊将两层结构分开，弃去胶状物；13)用玻璃片捞取膜，将之去细胞面向上平铺于以培养液湿润过的塑料培养皿底部，置于无菌操作台中风干；14)表面涂布薄层1％～30％浓度的PLLA溶液，风干；15)取出制备完成的ZQ生物膜，紫外线照射2小时消毒后，即可用于接种细胞。
2.根据权利要求1所述的制备ZQ生物膜的方法，其特征在于，按以下步骤进行1)原材料准备(1)足月顺产人胎儿羊膜(2)0.1％浓度的氨水(3)青霉素、链霉素(4)PBC或HANKS或生理盐水或注射用平衡盐液(5)0.25％浓度的胰酶溶液(6)10％浓度的PLLA溶液(7)含血清10％的DMEM培养液(8)Co60放射源2)选取无传染病及系统性疾病的健康适龄产妇第一胎产后1小时内的胎盘；3)无菌条件下将羊膜自胎盘上钝性分离；4)将羊膜置于含青霉素80万u/500ml、链霉素100万u/500ml的注射用平衡盐溶液中，摇动振洗3次，每次5min，洗去血污及粘液，取出膜，置于平衡盐溶液中，-20℃冻存，备用；5)37℃恒温摇床解冻；6)将解冻之膜置于0.1％浓度的氨水中摇动振洗3次，每次10min；7)用PBS溶液清洗直至无泡沫为止，此时膜呈洁白半透明状；8)按需求将膜分切成不同规格，置于一次性冻存管中，加PBS抗菌素液密封保存，登记规格、时间；9)Co60γ射线2,000,000 rads照射灭菌，并降低抗原性；10)-20℃冻存备用；11)依需求按登记规格取出，于37℃解冻；12)解冻后取出膜，置于0.25％胰酶、1V溶液中20cm2/2ml、37℃环境保持3小时，此时膜一面变为涕状胶样物，一面仍韧而密实。以含10％血清的DMEM培养液终止消化。用显微外科镊将两层结构分开，弃去胶状物，韧而密实的一层既是所要组织；13)用玻璃片捞取膜，将之去细胞面向上，平铺于以培养液湿润过的塑料培养皿底部，置于无菌操作台中风干；14)表面涂布薄层10％浓度的PLLA溶液，风干；15)ZQ生物膜制备完成，经紫外线照射2小时消毒后，即可用于接种细胞。
3.根据权利要求1所述的制备ZQ生物膜的方法，其特征在于，按以下步骤进行1)原材料准备(1)足月顺产人胎儿羊膜(2)0.01％浓度的氨水(3)青霉素、链霉素(4)PBC或HANKS或生理盐水或注射用平衡盐液(5)0.125％浓度的胰酶溶液(6)1％浓度的PLLA溶液(7)含血清2％的DMEM培养液(8)Co60放射源2)选取无传染病及系统性疾病的健康适龄产妇第一胎产后1小时内的胎盘；3)无菌条件下将羊膜自胎盘上钝性分离；4)将羊膜置于含青霉素80万u/500ml、链霉素100万u/500ml的混合注射用平衡盐溶液中，摇动振洗3次，每次5min，洗去血污及粘液，取出膜，置于平衡盐溶液中，-20℃冻存，备用；5)37℃恒温摇床角冻；6)将解冻之膜置于0.01％浓度的氨水中摇动振洗3次，每次10min；7)用PBS溶液清洗直至无泡沫为止，此时膜呈洁白半透明状；8)按需求将膜分切成不同规格，置于一次性冻存管中，加PBS抗菌素液密封保存，登记规格、时间；9)Co60γ射线2,000,000 rads照射灭菌，并降低抗原性；10)-20℃冻存备用；11)依需求按登记规格取出，于37℃解冻；12)解冻后取出膜，置于0.125％胰酶、1V和0.01％EDTA混合溶液中20cm2/2ml、37℃环境保持3小时，此时膜一面变为涕状胶样物，一面仍韧而密实。以含2％血清的DMEM培养液终止消化。用显微外科镊将两层结构分开，弃去胶状物，韧而密实的一层既是所要组织；13)用玻璃片捞取膜，将之去细胞面向上，平铺于以培养液湿润过的塑料培养皿底部，置于无菌操作台中风干；14)表面涂布薄层1％浓度的PLLA溶液，风干；15)ZQ生物膜制备完成，经紫外线照射2小时消毒后，即可用于接种细胞。
4.根据权利要求1所述的制备ZQ生物膜的方法，其特征在于，按以下步骤进行1)原材料准备(1)足月顺产人胎儿羊膜(2)10％浓度的氨水(3)青霉素、链霉素(4)PBC或HANKS或生理盐水或注射用平衡盐液(5)0.5％浓度的胰酶溶液(6)30％浓度的PLLA溶液(7)含血清25％的DMEM培养液(8)Co60放射源2)选取无传染病及系统性疾病的健康适龄产妇第一胎产后1小时内的胎盘；3)无菌条件下将羊膜自胎盘上钝性分离；4)将羊膜置于含青霉素80万u/500ml、链霉素100万u/500ml的混合注射用平衡盐溶液中，摇动振洗3次，每次5min，洗去血污及粘液，取出膜，置于平衡盐溶液中，-20℃冻存，备用；5)37℃恒温摇床解冻；6)将解冻之膜置于10％浓度的氨水中摇动振洗3次，每次10min；7)用PBS溶液清洗直至无泡沫为止，此时膜呈洁白半透明状；8)按需求将膜分切成不同规格，置于一次性冻存管中，加PBS抗菌素液密封保存，登记规格、时间；9)Co60γ射线2,000,000 rads照射灭菌，并降低抗原性；10)-20℃冻存备用；11)依需求按登记规格取出，于37℃解冻；12)解冻后取出膜，置于0.5％胰酶、1V和0.2％EDTA混合溶液中20cm2/2ml、37℃环境保持3小时，此时膜一面变为涕状胶样物，一面仍韧而密实。以含25％血清的DMEM培养液终止消化。用显微外科镊将两层结构分开，弃去胶状物，韧而密实的一层既是所要组织；13)用玻璃片捞取膜，将之去细胞面向上，平铺于以培养液湿润过的塑料培养皿底部，置于无菌操作台中风干；14)表面涂布薄层30％浓度的PLLA溶液，风干；15)ZQ生物膜制备完成，经紫外线照射2小时消毒后，即可用于接种细胞。
5.根据权利要求2所述的制备ZQ生物膜的方法，其特征在于，按以下步骤进行；1)原材料准备(1)足月顺产人胎儿羊膜(2)5％浓度的氨水(3)青霉素、链霉素(4)PBC或HANKS或生理盐水或注射用平衡盐液(5)0.55％浓度的胰酶溶液(6)20％浓度的PLLA溶液(7)含血清15％浓度的DMEM培养液(8)Co60放射源2)选取无传染病及系统性疾病的健康适龄产妇第一胎产后1小时内的胎盘；3)无菌条件下将羊膜自胎盘上钝性分离；4)将羊膜置于含青霉素80万u/500ml、链霉素100万u/500ml的混合注射用平衡盐溶液中，摇动振洗3次，每次5min，洗去血污及粘液，取出膜，置于平衡盐溶液中，-20℃冻存，备用；5)37℃恒温摇床解冻；6)将解冻之膜置于20％浓度的氨水中摇动振洗3次，每次10min；7)用PBS溶液清洗直至无泡沫为止，此时膜呈洁白半透明状；8)按需求将膜分切成不同规格，置于一次性冻存管中，加PBS抗菌素液密封保存，登记规格、时间；9)Co60γ射线2,000,000 rads照射灭菌，并降低抗原性；10)-20℃冻存备用；11)依需求按登记规格取出，于37℃解冻；12)解冻后取出膜，置于0.55％胰酶、1V和0.8％EDTA混合溶液中20cm2/2ml、37℃环境保持3小时，此时膜一面变为涕状胶样物，一面仍韧而密实。以含15％血清的DMEM培养液终止消化。用显微外科镊将两层结构分开，弃去胶状物，韧而密实的一层既是所要组织；13)用玻璃片捞取膜，将之去细胞面向上，平铺于以培养液湿润过的塑料培养皿底部，置于无菌操作台中风干；14)表面涂布薄层20％浓度的PLLA溶液，风干；15)ZQ生物膜制备完成，经紫外线照射2小时消毒后，即可用于接种细胞。
6.根据权利要求1所述的ZQ生物膜的制备方法，其特征在于所述胰酶为0.125％～0.5％溶液。
7.根据权利要求1所述的ZQ生物膜的制备方法，其特征在于所述抗菌素为青霉素、链霉素。
8.根据权利要求1所述的ZQ生物膜的制备方法，其特征在于所述培养液含2％～25％血清。
9.根据权利要求1所述的ZQ生物膜的制备方法，其特征在于所述平衡盐液为PBS或HANKS或生理盐水或注射用平衡盐液。
全文摘要
本发明公开了一种ZQ生物膜的制备方法,利用天然组织结构加工制备成ZQ生物膜,不仅有良好的细胞亲合性,而且分解产物对细胞无毒害作用、降解速度与组织再生速度比较适应,是一种与细胞具良好复合特性的支架材料,可用于复合雪旺细胞后卷圈塑形用于外周神经移植桥接;复合韧带细胞后折叠塑形用于韧带修复;复合成骨细胞、成纤维细胞后团起充填骨或软组织空洞缺损;复合上皮细胞或粘膜细胞平铺用于皮肤或粘膜移植等,对外周神经的组织工程具有较大实际意义,具有良好的应用前景。
文档编号A61L27/36GK1332017SQ01128720
公开日2002年1月23日 申请日期2001年7月18日 优先权日2001年7月18日
发明者张琪, 顾晓明, 毛天球, 雷德林, 刘彦普 申请人:张琪, 顾晓明, 毛天球, 雷德林, 刘彦普